JPS61271985A - 培地 - Google Patents

培地

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JPS61271985A
JPS61271985A JP60112285A JP11228585A JPS61271985A JP S61271985 A JPS61271985 A JP S61271985A JP 60112285 A JP60112285 A JP 60112285A JP 11228585 A JP11228585 A JP 11228585A JP S61271985 A JPS61271985 A JP S61271985A
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JP
Japan
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glutamine
culture medium
medium
cells
sterilized
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JP60112285A
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Yoshiki Minamoto
源 良樹
Koji Mitsuki
光木 浩司
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National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
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Agency of Industrial Science and Technology
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、動物細胞を培養するための培地に関するO C置来の技術〕 動物、特にヒト細胞全培養して、その培養上清潰もしく
は細胞から、有用な生理活性物質を得ることを目的とし
た研究が活発化しておシ、特にインターフェロン(IF
N )やモノクロナール抗体の開発については、癌の予
防、治療への可能性を秘−めていることからその進捗に
は著しいものがある。
しかしながら、細胞培養上清液から生理活性物質を大量
に得、それを精製して利用するためには技術的に大きな
問題がある。
その一つに、培地上メンプラン・フィルターなどのフィ
ルターを用いて濾過滅菌しなければならないという問題
がある。この濾過滅菌法では通常0.2ないし0.5m
μやポアサイズをもつフィルターを使うが、この濾過法
ではバクテリアより小さな微生物、例えば動物細胞の培
養において障害をもたらすことが知られているマイコプ
ラズマ、ウィルスなどは除去することが、困難である。
また、濾過滅菌は、フィルターを加圧または減圧下で行
わなければならず、フィルターの材質によっては、培地
の微量有効成分が吸着して失なわれたり、膜にかかる圧
力や材質の不均一性のために、微量の細菌が漏出するこ
とも稀にみもれるので、濾過滅1して調製した培地は各
種の検定tしなければなルない。特に大量細胞培養では
上記の問題点は深IJで、さ61C展や装置のランニン
グコストも大きくなる。
これらの間@全解決するためには加熱殺菌すればヱい。
これまでに加熱殺菌し得る培地の調製方mとして、−が
4.0ないし4.5でオートクレーブ、般舊し得る培地
のV#製方法が知られている(Proc。
”S’oc 、 E!P、 Biol 、 Mad、 
、 127巻335頁1968年)。
しかしながら、これらの培地では、L−グルタミンと重
炭酸ナトリウムが加熱殺菌できず、依然としてL−グル
タミ/は濾過滅菌する必要があった。
加熱に対して安定なL−アラニル−し−グルタミン等の
L−グルタミン誘導体が知られているが、(J、 Ap
pl、 Bioah@m、 4巻、280頁、1982
年)、動物細胞にL−グルタミンとして利用されるかど
うか不明であった。
〔発明が解決しようとする問題点〕
従ってこの発明の目的は、加熱に対して安定であり、か
つ動物細胞にL−グルタミンとして利用されるL−グル
タミン誘導体を見い出し、これによって加熱殺菌するこ
とができる動物細胞用培地を見出すことにある。
〔問題点を解決するための手段〕
叙上のような状況下において本発明者らは、X−L−グ
ルタミン(XはL−アミノ酸である)で″であることを
見出した。
、本発明の培地は、弱酸性で加熱殺菌できる栖“地、I
炭酸ナトリウムとL−グルタミンを除き、かつX−L−
グルタミンを添加したものである。
これらの培地として、血清または血清代替物としての各
種増殖因子を含む血清添加培地又は無血清培地もtすれ
る。
本発明のX−L−グルタミンであられされるジペプチド
のXは、グリシン、L又はDL−アラニン。
L−アスノぐラギン醸、L−グルタミン酸、L −バリ
ン、L−ロイシン、L−セリン、L−1)’)ン、L−
フェニルアラニンなどでおるが、その原料価格の点から
グリシン、L又はDL−アラニンが好適である。
本発明において用いられる動物細胞としては、例えばW
I −38、H・L息%L%UMCL%BALL −1
、X−5563X−5563l、末梢血リン・譬球、各
掘ハイツリドーマ等があげられる。
X−L−グルタミンは、本来、添加すべきL−グルタミ
ンと同モル濃度(1から4 mM )となるように溶解
し、通常の加熱殺菌(120℃、20分)を6行なうの
がよい。ま九、X−L−グルタミンのみをその添加濃度
の100から500倍の水溶液と′し、加熱殺菌した後
培養液にその1/l OOかも1/soo 11: f
:添加して114製することもできる。
このように調製した培地に10%の重炭酸ナトリウム水
溶液金加熱殺菌後培地中所定諷となるように添加するこ
としよって全ての低分子培地成分上加熱殺菌によって調
製できる。
〔発明の効果0作用〕 この発明の動物細胞培養用培地は、総ての低分子培地成
分が加熱殺菌できる点で勝れている。
さらに培地全長期間保存できるという利点がある・ また、本発明によるX−L−グルタミンのXは、細胞の
要求性に合わせたアミノ酸金選ぶことができる。これら
のジペプチドは、溶解性が高まるので溶解度が低いアミ
ノ酸、例えばチロシンなどや細胞による消費の大きいア
ミノ酸を高濃度で添加することによって細胞培養におい
て、必要なアミノ酸金供給することができる。加えて、
これらアミノ酸t−ジペプチドとして供給することによ
って。
細胞の増殖性または、ペプチダーゼ活性に合わせ工細胞
に吸収されるので、アミノ酸単体として用〜・るニジ有
効に利用される。
集施例1 表1に示す加熱殺菌可能なRPMI 1640@地(日
永製薬製)10.29とグリシル−L−グルタミン、L
−グルタミン又はN−アセチル−し−グルタミンを表2
に示す濃度となるよう蒸留水IJtF−溶解し、120
℃、15分間オートクレーブにて加熱殺菌した。別に密
栓した培地風に入れ、120℃、15分間加熱殺菌した
10%重炭酸ナトリウム液120d加えた後、ウシ胎児
血清(FBS ) 50 mを加えた。各々の培地10
0fst1に用いてtJMcL細胞及びBALL −1
細胞t−5X10個/−の初発細胞濃度となるように、
ペルコ社製10〇−用スピンナーr、p、m、でUMC
L細胞は4日間、BALL −1細胞は5日間培養した
。培養後裔々の細胞密度をエオシンY染色法と血球計算
盤にて生細胞密度を計測した。
表1 塩化ナトリウム         ・・・・・・6,0
00.0塩化カリウム         ・・・・・・
 400.0リン酸二水素ナトリウム(無水)・・・・
・・ 677.0硝酸カルシウム(無水)     ・
・・・・・  69.5硫酸マグネシウム(無水)  
 ・・・・・・ 48.8ブドウ糖         
     ・・・・・・2,000.0コハク酸ナトリ
ウム(六水塩)  ・・・・・・ 164.07パり酸
            ・・・・・・  46.OL
−アルギニン塩酸塩     ・・・・・・ 240.
OL−アスノ母ライン(−水ffl )    ・・・
・・・  56.8L−アスパラギン酸      ・
・・・・・  20.OL−システィン塩酸塩(−水塩
)・・・・・・  72.91−グヤタミ7!l!  
       ・・・・・・  20.0グルタチオン
(還元型)    ・・・・・・  1.0グリシン 
          ・・・・・・  10.OL−ヒ
スチノン塩阪塩(−水塩)・・・・・・ 20.3L−
ヒドロキシプロリン    ・・・・・・  20.O
L−インロイシン       ・・・・・・  50
.OL−リジン塩酸塩       ・・・・・・  
40.OL−メチオニン        ・・・・・・
  15.OL−スレオニン        ・・・・
・・  20.0L−トリプトファン      ・・
・・・・  5.OL−バリン         ・・
・・・・ 20.OL−ロイシン          
・・・・・・  50.OL−フェニルアラニン   
  ・・・・・・  15.OL−グロリン     
      ・・・・・・  20.OL−セリン  
       ・・・・・・ 30.OL−チロシン 
        ・・・・・・  20.Op−ビオチ
ン(結晶)      ・・・・・・  0.2ノ(ン
トテン酸カル°シウム     °””’    0.
25i化コリン            ・・・・・・
   3.Ol−イノシトール       ・・−・
−35,Op−アミノ安息番数      ・・・・・
・  1.0少1アノコバラミン        ・・
・・・・   0.005葉酸           
  ・曲・  1.0ニコチン敗アミド       
 ・・・・・・   1.0リゲフラビン      
    叫・・   0.2チアミン塩酸塩     
   ・・・・・・  1.0ピリドキシン塩&塩叫・
・   1.07エノールレツド        ・・
・・・・   5.0結果を、通常の濾過滅菌にて調製
した10%FBS添加RPMI 1640培地を対Jl
fl培地として用いた結果と比べて表2に示す。
表 2 0      2、5         5.1し一グ
ルタミン  1    5.2      8.54 
   8.1      10.1ドーアセチル  1
    3.6      6.8−L−グルタミン 
 4     6.8        7.4グリシル
−L−116,217,8 グルタミン    4    17.5      2
0.2実施例2 表3に示すRITC57−1培地(L−グルタミンを含
まない)に0.5%ウシ血清アルブミン(BSA)全添
加し、lNNa0)I液でpH’i7.4に1I11整
した培地を濾過滅菌にてi+[した。この培地に表4に
示しπL−グルタミン銹導体の濃度の100倍水m@を
調製し、その一方をミリポア社製0.22μmのメンプ
ラン・フィルターで濾過滅菌し、他方を、120C,2
0分間でオートクレーブrこて加熱殺菌した後、上記培
地に対して各々1/□00量を添加した。
各々の培地201、ファルコン社製3024フラスコに
入れ、UMCL細胞、BALL −1細胞及びX556
3細it各々4×lO個/−13X10 個/−及び1
重10個/−の初発濃度となるように加え、5sco□
、37℃にて各々4日間、5日間、4日間培養した。培
養後の生細胞密度t−実施例1と同様に測定した。結果
を表4に示す。
表3 RITC57−1培地の組成 (L−グルタミン會tまない) L−アラニン1水塩           20L−ア
スパラギン             56L−7スノ
ヤラギン酸            20L−システィ
ン塩酸l水塩         40L−グルタミン[
20 L−グロリン                20ア
スコルビン敏ナトリウム10 1オチy                  o、”
:フォルニツク酸             0.01
ビタミン812                0.
1グルコース             1000マン
ノース              500ガラクトー
ス             500レシチン    
            2.5グルクチオン    
          1.0プトレツシン2塩酸塩  
        0.1ヒポキサンチン       
      4テミノン              
  0.7デオキシシチソン            
o、03デオキシアrノシン           1
.06.8ノハイドロオキシプリン       0.
3硫駿第−鉄7水塩         0.8硫酸′!
Jj!、蛤7水塩          0.02亜セレ
ン嘔ナトリウム          0.004塩化カ
ルシウム         100結晶インシユリン 
        10ヒトトランスフエリン     
     5β−グリセロリン酸2ナトリウム   1
500北PES                 1
200重1                 1ao

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. X−L−グルタミン(XはL−アミノ酸である)で表わ
    されるジペプチドを含有する動物細胞を培養するための
    培地。
JP60112285A 1985-05-27 1985-05-27 培地 Granted JPS61271985A (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP60112285A JPS61271985A (ja) 1985-05-27 1985-05-27 培地

Applications Claiming Priority (1)

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JP60112285A JPS61271985A (ja) 1985-05-27 1985-05-27 培地

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JPS61271985A true JPS61271985A (ja) 1986-12-02
JPS6338190B2 JPS6338190B2 (ja) 1988-07-28

Family

ID=14582864

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JP60112285A Granted JPS61271985A (ja) 1985-05-27 1985-05-27 培地

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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012017925A1 (ja) 2010-08-02 2012-02-09 協和発酵キリン株式会社 物質の製造方法
DE102017203908B3 (de) 2017-03-09 2018-05-30 Evonik Technochemie Gmbh Kulturmedium, umfassend Oligopeptide
EP3372670A1 (en) 2017-03-09 2018-09-12 Evonik Technochemie GmbH Culture media comprising n-acyl-x-glutamine dipeptides

Cited By (5)

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WO2018162352A1 (en) 2017-03-09 2018-09-13 Evonik Technochemie Gmbh Culture media comprising n-acyl-x-glutamine dipeptides
WO2018162353A1 (en) 2017-03-09 2018-09-13 Evonik Technochemie Gmbh Culture medium comprising dipeptides

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