JPS6087785A - 動物細胞用無血清培地の殺菌調製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は動物細胞を培養する培地の殺菌調製方法に関す
る。現在ヒト細胞を宮む動物細胞を培養して、インター
フェロン、抗体、酵素、リンフ才力インなどの有用活性
物質を腫生じ、これを取得することが実施され、あるい
は検討されている。

しかるにこれらの有用活性物質の産生は極めて微址であ
るので、有用活性物質を生産し取得するためには、大量
の細胞を培養する必要がある。しかも従来の動物細胞用
培地には牛胎児血清や分生血清などの動物血清を添加す
ることが必要であった。

しかしながら、これらの血清は非富に高価であること、
原因不明のロット差があること、また生産された有用物
質の精製において血清由来の成分が混入してくるので和
製が困難になることなどが大きな問題点であった。それ
がため、これまでに、真情代替物として各種増殖因子１
代謝中間体・重゛架属などを含むいくつかの無血清培地
が開発され・田、きた・ 二′一方、この血清及び細胞培養用培地は使用する、前
に滅菌する必要があるが、これらの培地にはほと・先ど
すべて濾過滅菌法が用いられている。この濾過量には制
限がある上、バクテリヤより小さいウィルスやマイコグ
ラズマの汚染防止をすることができないので特に大量の
培地を調製、滅菌するには大きな問題点であシ、微生物
の培養の場合と同様に加熱殺菌できる動物培養用の培地
が待望されている。

これまでに加熱殺菌し得る培地として、イーグル最少必
要培地（ＭＥＭ　）やＲＰＭＩ　１６４０培地などの改
良培地が知られているが（１，Ｙａｍａｎｅ　ｅｔａｌ
。

Ｐｒｏｃ、　Ｓｏｃ、　Ｅｘｐ、　Ｂｉｏｌ、　Ｍｅｄ
、＋　１２Ｌ　３３５−３９９（１９６８））、これら
の培地では−１４〜５に調製した培地の主成分を加熱殺
菌した後に濾過滅菌した重曹、グルタミンの高濃度液を
添加して培地を調製しており、さらＫＩＩＢ胞を増殖さ
せるためＫは、加熱殺菌が不可能である多量の血清を加
える必要があった。

ｉ需１また熱不安定成分である重留やグルタばンは粉）
ｉｌｌｉ躾ａ　Ｋ−Ｃ密栓し、加あ殺菌し得、。ヨ、（
ｓ、ｃ。

、’４ｇ１ｅ、Ａｐｐ１．　Ｍｉｃｒｏｂｌｏｌ　、　
１６，５３−５５　、１９６８　）１．１＠”地を加熱
殺菌する方法も報告されている（　Ｌ。

Ｋｅａｙ″Ｃｅ１ｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ　ａｎｄ　ｉｔ
ｓ　ＡｐｐＨｃａｔｌｏｎ”Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅ
ｓｓｓ　Ｎ、Ｙ−ｅ　ｐｐ、５１３−５３２　＋　１９
７７　）。

これらの培地ではウシ血清やペプトン、酵母エキス等を
用いるので、原因不明のロット差がある上、特にヒト細
胞によるヒトの有用微散物質を精製する際、異種高分子
が混入してくるので、依然として問題が残されている・ 本発明者らは血清やその代替物として多量のタン・ぞり
を含まない無血清培地を加熱殺菌可能培地とするために
鋭意検討し、血清代替成分中の熱不安定成分を窒素ガス
封入下において加熱殺菌することができることを見出し
、本発明を完成した。

すなわち本発明では、無血清培地のＰＩ４４〜５に調整
した熱安定成分および一緩衝剤の水溶液をオートクレー
ブ殺菌し、熱不安定成分は粉末状態にて、貨素ガス封入
下で〃ｕ熱殺菌して、別にオートクレー２７４菌した水
を加えて溶解せしめた溶液となし、ｊ’−ｊ４ｊｊ！十
の培地成分液を１ｇｔ定の濃度となるような比率Ｍ”￥
Ｅｌ’％合して培地を１．ｊｌ製することにエリ加熱殺
菌し”ＳＱｋ地を作成することにある。

ｉ４ｉ’＋゛・本発明者らは実験例に示すごとく、血清
代替成＋’　：ｌ”ｌ　Ｉｔ １分として各種非必須アミノ酸、ビタミン、代謝中間体
、ホルモン、重金践塩、α−サイクロデキス７Ｊ尻疏す
るリンパ芽球様細胞であるＵＭＣＬ、細胞（Ｔ。

５ａｔｏ　ｅｔａｌ、　ＥＸＰ、　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅａ、
、　１３８　、１２７（１９８２））及びヒト繊維芽細
胞の増殖を指標として、−１４〜５における耐熱成分と
非耐熱成分の分別を行ない、′熱不安定成分が公知のグ
ルタミンの他にインシュ＋）　ン＊　−ｊ’　トレッシ
ン、還元屋グルタチオン、第一鉄塩・及び“−サイク°
デキ７トリ７不飽和１墾分はグルタばンに適用されたＩ 、公知の乾燥加熱殺菌法ではその細胞増殖作用を失って
しまうため（実験例１参照）新たな加熱殺菌法を検討し
た結果、これらの成分を窒素ガス封入下に乾燥加熱殺菌
すればその作用を保持していることを見出した（実験例
２参照）。

末を密封できる容器に入れ、容器中の窒素ガス濃３００
　％／／ｌのコハク酸を加えてＰＩ（４−５にＰＩＩを
調整するＪ次いで窒素がスを溶液にふきこんで窒素ガス
で置換し、密栓した後これをオートクレーブ殺菌する。

ＰＨ緩衝剤成分は、培地Ｉツ［定濃度４−１０倍に溶解
し、密栓してオートクレーブする。

かくして熱不安定成分、熱安定成分、ｐｉ（緩衝剤成分
の３溶液を所定の培地濃度となるような比率で、すなわ
ち溶解時の濃度倍数の逆数分だけ混合して培地を調製す
れば、加熱殺菌培地を得ることができる。

本発明方法によって加熱殺菌した培地１０ロツトについ
てその無菌性を各種の検出法を用いて調べたが、細菌、
マイコゾラズマ、ウィルスのいずれも陰性であシ、無菌
であることが確認された。

上述のごとく本発明による培地殺菌法を用いれば、培養
容器を蒸気殺菌する際、培地成分の大部を開始すること
ができる。

゛地調製においてそれぞれの容器及びパイプライン、糸
’Ａをも同時に殺菌し得るので、無菌性が非常に高くな
シ、培養中の微生物汚染の危険率が極めて低くなる。さ
らに高価で濾過能力に制限がありしかもそのリークを事
前に検査することが必要なメンブランフィルタ−を用い
るｐ過滅菌法に比べて、その操作及び管理ならびにコス
トの大巾な低減をはかることができるので特に工業的ス
ケールで行なわれる大量細胞培養には大きな利点をもっ
ている。

〈実験例１〉 表１に示すＲＩＴＣ５７−８培地の耐熱成分を所定の２
倍濃度に浴解し、これに２００　ｍ９／ｌのコノヘク酸
を加えＩ　Ｎ　ＮａＯＨでｐＨ４，５とした溶液を窒素
ガス置換後密栓してオートクレーブ殺菌した。次いで表
２に示すＲＩＴＣ５７−８培地のＰＨ緩衝剤をｊｇｒ定
の４倍θ度に溶解し、密栓後、オートクレーブ殺菌した
。

丑た茨３に示すＲＩＴＣ５７−８培地の蛋白１戎分を、
稗’、　；Ｌ、た。別にこの熱不安定成分を所定の４倍
濃度、＜’竺解し、これに２００　ｍ９／Ｌ　コｉ□り
酸を）Ｊｕ　エテｐＨ・−“’ｒ′＋、５とした後２つ
に分け、一方をミリｙ１２７社製ニー１．．Ｈ１ のメンブランフィルタ−（０，２２μｍ）で−過滅菌し
、他方をオートクレーブ殺菌した。

また表４に示すＲＩＴＣ５７−８培地の蛋白成分はＰＢ
Ｓ（−）（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　Ｂｕｆｆｅｒ　５ａｌ
ｉｎｅ　（−））液にて所定の１００倍濃度に溶解した
後濾過滅菌した。

各々を滅菌した後熱安定成分液、ＰＨ緩衝剤成分液、熱
不安定成分液及び蛋白成分液を各々４９係。

２５％、２５％、１係となるよう混合して培地をＡｌｌ
！Ｉｌｌ！した。

表　１ ＣＴｎ９／ｌ） 塩化ナトリウム　６，２４０，０ 塩化カリウム　３９０゜Ｏ 塩化カル７ウム（無水）２００・Ｏ 硫酸マグネシウム（無水）　９７．７ リン酸二水素ナトリウム（二水塩）　１２５．０硝酸第
二鉄（九水塩）ｏ、１ ブドウ糖　２，０００．Ｏ Ｌトイソロイシン　１０４．８ ｉ １弓ψ Ｌ−１フエニルアラニン　６６．０ Ｌ−）リプトファン　１６．。

重酒石酸コリア　７．２ 葉　酸　４．０ ニコチン酸アミド　４．０ ノぐントテン酸カルシウム　４．０ ピリドキサール塩酸塩　４．０ リボフラビン　０．４ チアばン塩酸塩　４．Ｏ ｌ−イノシトール　７．２ フエノールレツド　５．Ｏ Ｌ−アラニン−水塩　２ｏ、Ｏ Ｌ−アスパラギン　５６．Ｏ Ｌ−アスパラギン酸　２０．Ｏ Ｌ−システィン塩酸−水塩　４０．０ ラクトース　５００．０ 舜シチン　２．５ 屯ポキサンチン　４・０ 、チミジン　０．７ ４オキシシチジン　０．０３ 乞オキシアデノシン　１．０ ：’ｓ４８ジハイドロオキシプリン　０．３硫酸亜鉛７
水塩　０．０２ 亜セレン酸ナトリウム　０．００４ 硫酸カナマイシン　６０ ＨＥＰＥＳ　１２００ Ｌ−グレタミン　５８４ グトレツシン２塩酸塩　０．１ フオルニツク酸　０．０１ グルタチオン　１．０ 硫酸第一鉄７水塩　０．８ 結晶インシユリン　１０ 頃ト血清アルブミン　１００ 対・照として旧ＴＣ５７−８培地の全成分（衣１゜２．
３．４の成分）を所定濃度で溶解した培地及びＲＰＭＩ
　１６４０培地（ＧＩＢＣＯ社爬ンをｐ過滅菌で調製し
た。ＲＰＭＩ　１６４０培地には胎児牛血清（Ｆ１３８
）を１０９６添加して培養に使用した。

このように調製した培地各々２０ｒｎｅをファルコン社
製３０２４フラスコに張り込み、ＵＭＣＬ細胞を５　Ｘ
　ｉｏ５７ｍｅの初発濃度で５１　Ｃｏ２下２下℃で４
日間培養した後エオシン染色法にて生細胞ａをヘモザイ
トメーターで計数し、その培養土消電のヒトインターフ
ェロン活性を６（１ｊ定した結果を表５に示す。ヒトイ
ンターフェロン活性は国際標準ヒトα型イ′ンターフェ
ロンを標準とし、ＦＬ細胞の■ｓｖ（Ｖｅｓｉｃｕｌａ
ｒＳｔａｍａｔｊｓ　’Ｖｉｒｕｓ　）に対する細胞変
性阻止率法にて測定した。（’Ｍ、　Ｋｏｈａａｅ　ｅ
ｔｅｌ”Ｔｈｅ　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｐｏｔａｎｔｌａ
ｌ　ｏｆ　Ｉｎｔｅｒｆｏｒｏｎｓ’　Ｕｎｉｖ。

Ｔｏｋｙｏ　Ｐｒｅｓｓ＋　Ｔｏｋｙｏｙ　１９８１　
＃　ｐｐ、２９９　）。

屈科’Ｃ５７−８ 勢安定成分（４）十緩衝剤成分（４）十蛋白成分針）十
熱不安定成分（Ｆ）　１７．５　３，２００＋熱不安定
成分（Ａ）　９．２　９３０＋熱不安定成分（Ｈ）　１
０．１　１，１０１００ＲＰ　１６４０＋１０％ＦＢＳ
　２０．１　３，５００（Ｆ）二濾過滅菌 （Ａ）：オートクレープ殺菌 （）Ｉ　）　：乾燥加熱殺菌 以上本実験例からＲＩＴＣ５７−８無血清培地の低分子
成分の中でＬ−グルタミン、インシュリン。

フォルニック酸、α−サイクロデキストリン抱接化合物
、ゾトレッシン、グルタチオン、第一鉄塩（以上熱不安
定成分）以外の成分は弱酸性でオートクレーブ殺菌に耐
えること、これらの熱不安定成分は同榮件のオートクレ
ーブ殺菌並びにグルタミンの殺菌法として公知の乾燥加
熱殺菌ではそれらの細胞増殖効果を失なってしまうこと
が認められた・ く実験例２〉 一；用実験ψす１と同様にオートク・・−７没菌した１
Ｔ１ｃ　５７−８培地の耐熱成分と一１緩衝剤成分及び
−Ｎ滅菌した蛋白成分液を各々調製した。

・−゛・表３に示した熱不安定成分の７成分の一つを除
Ｇた成分をまとめて所定の３．３倍濃度に溶解し１．１
こ１れら６種類の溶液を調製してｐ過滅偵した。また各
々の６種類の溶液で除いた一成分は粉末状態にてＭ素ガ
ス置換後密栓して１２０℃２０分間加熱し冷却後各々そ
の一成分を除きｐ過滅菌した溶液を加えて所定の３．３
倍になるように溶解した。各々培地成分溶液を調製した
後熱安定成分液、−緩衝剤液、熱不安定成分滅菌液、蛋
白成分液を各々４９１．２０％、３０％、１％となるよ
うに混合して培地を調製した。なお熱不安定成分の一つ
を除いて同様調製した培地、全ての成分を濾過滅菌で調
製した培地及び１０係ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ　１６４０培
地を対照培地とした。これらの培地を用いて実験例１と
同様ＵＭＣＬ細胞を培養した結果を衣６に示す０ ＲＩＴＣ５７−８合成分（Ｆ）　１８．２ＲＩＴＣ５７
−８ 熱安定成分（Ａ）十緩衝剤成分囚）十蛋白成分軒）＋熱
不安定成分−Ｌ−Ｇｉｎ　（Ｆ）　５．１＋　Ｌ−Ｇｌ
ｎ（Ｎ２Ｈ）　１７．１ ＋　〃　−インシュリン（Ｆ　）　８．５＋インシユリ
ン（Ｎ２Ｈ）　１６．８ ＋　〃　−フォルニック酸（Ｆ）　１３．８十フー二ツ
ク酸（Ｎ２Ｈ）　１７．２ ＋　〃　−α−ＣＤ−ＦＡ　（Ｆ）　１１．０＋α−Ｃ
Ｄ−ＦＡ（Ｎ２Ｈ）　１７．５＋　〃　−プトレッシン
・１藪塩（Ｆ）　９．８＋ゾトレツシン（Ｎ２Ｈ）　１
７．４ ＋　〃　−グルタチオン（Ｆ）　９．９＋グルタチオン
（Ｎ２Ｈ）　１８．０ ＋ｔｔ　Ｆ　ｅｓＯ４ａ　７Ｈ２０（Ｆ　）　７．２＋
ＦｅＳＯ４’７８２０（Ｎ２１リ　１６．８（Ｆ）：濾
過滅菌 上扉１実験例から各々の熱不安定成分はＵＭＣＬ細胞−
＝１−′培地に必須であり、これらの成分は各々窒素４
．１ニガ、ス封入下であれば、加熱殺菌が可能であるこ
と實ｌ冒で を、閣めた◎ １： ５゜）：以上の実験例に基いて本発明の実施例を下記に
示すが本発明の加熱殺菌法の適用は熱不安定な血清代替
物として、インシュリン、プトレッシン。

還元型グルタチオン、第一鉄塩、及びα−サイクロデキ
ストリン−不飽和脂肪酸抱接化合物を含む合成培地であ
れば、特に限定されない。

本発明によって調製された無血清培地は、濾過滅菌法で
調製された培地が使用し得る細胞であれば特に限定され
ないがリンパ球、繊維芽細胞、上皮性細胞及びそれらの
トランスフオーム細胞株の培養に適している。それらの
細胞の増殖又は生理活性物質産生の最大能力を引き出す
ために微量の血清アルプばンやトランスフェリンを必要
とする場合にはそれらの１００〜５００倍ａ度の溶液を
一過滅菌によって調製し、培養液に１／１００〜１１５
００敬添加してもよい。またヒト由来の細胞によシヒト
の生理活性物質を得る際、これらの微量蛋白成分として
ヒト血清アルブミン又はヒトトランスフ”ｌ顯’Ｆｌン
を使用すれば異種タンノ４りの混入はないのせ′ｌ簡１
題は少ない。

出」下実施例にて本発明を説明する・ 実施例１ １１．実験例２と同様にＲＩＴＣ５７−８培地の耐熱成
分及び′ｉ）■緩衝剤成分をオートクレーブ殺菌し、蛋
白１、成分の１００倍濃度液は濾過滅菌にて調製した。

、熱、−采。６成分は、よゎ工粉オ状態ア窒ヵ９ユ劃入
下加熱殺菌（１２０℃２０分間）後、オートクレーブ殺
菌水でＤ［定の３．３倍濃度に溶解して調製した。

各々の培地成分浴液を滅菌後、熱安定成分液、ＦＪＩ緩
衝剤成分液、蛋白成分液、熱不安定成分液を谷々４９幅
、２０％、１係、３０係となるように混合して培地を調
製した。

また、熱不安定成分をまとめてＢ［定の３．３倍濃度に
溶解し、濾過滅菌して同様に９，１製した培地（対照■
）及び全成分を濾過滅菌して調？＆した培地（対照Ｉ）
並びに１０チＦＢＳ添加ＲＰＭＩ　１６４０培地（対照
■）を対照培地とした。これらの培地を用いて、実験例
と同様に１００ＮのスピンナージャーにてＵＭＣＬ細胞
を培養し、生ａｔ胞数及びその上清液中のヒトインター
フェロン活性を測定した結果を表７に表す。

−・ＲＪＴＣ５７−８ 、“熱安定成分（至）十緩衝剤成分（３）十蛋白成分（
Ｆ）・・−１：１・１：１１十熱不安定成分（Ｆ）（対
照ｎ　）１７．５　３，５００゛十熱不安定成分ＣＮ２
Ｈ）　１７．０　４，２００ＲＰＭＩ　１６４０＋１０
％ＦＢＳ　（対照１１１）１９．５　４，２００（Ｆ）
：濾過滅菌 （Ａ）ニオートクレープ殺菌 （Ｎ２Ｈ）　：窒素ガス封入加熱段歯 実施例２ 実施例１と同様に加熱殺菌調製した各種ＲＩＴＣ５７−
８培地と対照培地としてすべての成分を瀘過殺菌したＲ
ＩＴＣ５７−８培地（対照■）および熱不安定成分を濾
過滅菌にて調製した培地（対照ｎ）並びに１０　％　Ｆ
ＢＳ添加イーグル必要最少培地（ＶＡＮ）（対照■）を
用い、ヒト胎児肺由来の繊維芽細胞をトリジシンで分散
後、ファルコン社３００６シヤーレ当、９５　Ｘ　１０
　の初発細胞数で、＋１（Ｉｌ胞を播き、ＣＯ２インキ
ユベータ−（５％ｃｏ２．３７℃）にて・−＋７７ｆｉ
間培養した。

１．・：ｌＪ％Ｊ養液を除去した後２．５％トリプシン
液で細胞、乞」赦し、細胞数を計数した結果を表８に示
す。

ＲＩＴＣ５７−８ 熱安定成分（ト）十緩衝剤成分（Ａ）十蛋白成分Ｃ）十
熱不安定成分（Ｆ）（対照１１）１．２２十熱不安定成
分（Ｎ２Ｈ）　１．２５ （Ｆ）二濾過滅菌 （Ａ）：オートクレープ殺菌 （Ｎ２Ｈ）：望素ガス封入７ＩＩＪ熱殺菌出願人　工業
技術院長 手続補正書（自発） 昭和５８年殴月３日 特許庁長官　若　杉　和　夫　殿 １、事件の表示 昭和５８年特許ｉ第（ｃ１３夕ｚ、ｉ号２、発明の名称 動物細胞用無血清培地の殺菌調製方法 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 郵便着号　１００ 明細書の発明の詳細な説明の欄 ５、補正の自答 明細１：第２頁最下行に記載の「動物培養用の培地」ヲ
「動物細胞培養用の培地」と訂正する。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ：（１）窒素ガス封入下に乾燥加熱した熱不安定成Ａと
   別に殺菌した熱安定成分とを調合することを４徴とする
   動物細胞用無血清培地の殺菌調製方法。 （２）熱不安定成分がインシュリン、！トレッシ”１シ
   ・２．グルタチオン、第一鉄塩、α−サイクロデキ１．
   ・ス１１トリン不飽和脂肪酸抱接化合物である特許請求
   範囲第１項記載の培地調製方法。