JPS6045535A - B型肝炎ウイルスワクチンの製造法 - Google Patents
B型肝炎ウイルスワクチンの製造法Info
- Publication number
- JPS6045535A JPS6045535A JP14877483A JP14877483A JPS6045535A JP S6045535 A JPS6045535 A JP S6045535A JP 14877483 A JP14877483 A JP 14877483A JP 14877483 A JP14877483 A JP 14877483A JP S6045535 A JPS6045535 A JP S6045535A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- hbsag
- cell
- cultured
- cell line
- culture
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
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- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、B型肝炎つィルス表面抗原()(BSAg
)の新規な製法に関する。
)の新規な製法に関する。
)(B sAgは、B型肝炎ウィルス(HBV )によ
る疾病に有効なワクチンであることが知られている。H
BsAgの供給は、)IBVの細胞培養による増殖が成
功していないため、現在のところ、ヒト保菌者血液に頼
っている。しかしながら、ヒI・保菌者血液は有限であ
り、ワクチン需要を/ij/iノーし得ない状態である
。一方、HBsAgを、遺伝子工学手法を用いて大腸菌
や酵母によって、あるいは培養細胞によって、大量生産
しようとする試みがなされているが、いまだ十分な成果
が得られていない。
る疾病に有効なワクチンであることが知られている。H
BsAgの供給は、)IBVの細胞培養による増殖が成
功していないため、現在のところ、ヒト保菌者血液に頼
っている。しかしながら、ヒI・保菌者血液は有限であ
り、ワクチン需要を/ij/iノーし得ない状態である
。一方、HBsAgを、遺伝子工学手法を用いて大腸菌
や酵母によって、あるいは培養細胞によって、大量生産
しようとする試みがなされているが、いまだ十分な成果
が得られていない。
本発明は、B型肝炎つィルス表面抗原([3SAl!、
)を高産生するヒト肝癌細胞系を培養し、培養液からH
B S A gを採取することを特徴とする、B型肝炎
ウィルスワクチンの製造法である。
)を高産生するヒト肝癌細胞系を培養し、培養液からH
B S A gを採取することを特徴とする、B型肝炎
ウィルスワクチンの製造法である。
本発明に用いられるヒト肝癌細胞系は、ヒト肝癌組織を
血清添加培養液中で培養することにより得られる。
血清添加培養液中で培養することにより得られる。
培養液としては、アミノ酸、ビタミン、無機塩類などを
含有する細胞培養のための一般的な培地が用いられる。
含有する細胞培養のための一般的な培地が用いられる。
血清としては牛脂児血清が好ましく・。
HBsAgの収率を向上させるためには、ヒト−肝癌細
胞系を例えば限界希釈法によりクローニングすることが
好ましい。すなわち肝癌細胞系から単一細胞を分離し、
各細胞を培養してHBsAgを多量に産生ずる細胞を選
別して用いることにより、培養液中のHBsAg濃度を
著しく高めることができる。
胞系を例えば限界希釈法によりクローニングすることが
好ましい。すなわち肝癌細胞系から単一細胞を分離し、
各細胞を培養してHBsAgを多量に産生ずる細胞を選
別して用いることにより、培養液中のHBsAg濃度を
著しく高めることができる。
肝癌細胞系としては、huSPと呼ばれる細胞系を用い
ることが好まし℃・。husP細胞系は、ヒトの肝癌組
織由来のHBsAg産生肝癌細胞系であり、HBsAg
を多量に産生ずることを特色とする新規な細胞株である
。huSPは一70℃でほぼ永久的に凍結保存可能であ
って、財団性人癌研究会研究所に登録保管されており、
頒布可能な状態にある。
ることが好まし℃・。husP細胞系は、ヒトの肝癌組
織由来のHBsAg産生肝癌細胞系であり、HBsAg
を多量に産生ずることを特色とする新規な細胞株である
。huSPは一70℃でほぼ永久的に凍結保存可能であ
って、財団性人癌研究会研究所に登録保管されており、
頒布可能な状態にある。
以下に本細胞株作成の経緯を説明する。ヒト肝癌細胞h
usPは、huH−1細胞系から分離された細胞株であ
り□、huH−i細胞系は53才の日本人男性の肝癌組
織より分離されたものである(日本癌学会総会記事第6
7回120頁1978年参照)。肝癌組織標本をメス又
は鋏で細切して微小組織片を調製し、これをディスガー
ゼ1000単位、/mllを溶解した15%牛脂児血清
(Fe2 )添加培養液に加え、67℃、1時間消化し
たのち、遠心分離して肝癌細胞を集め、5%CO2濃度
の空気中で37℃の温度で2〜4か月培養を行う。顕微
鏡下で間葉系細胞のみを剥ぎ落すことを繰り返すと、最
後に肝癌細胞系(huH−1)がコロニー状となって継
代される。
usPは、huH−1細胞系から分離された細胞株であ
り□、huH−i細胞系は53才の日本人男性の肝癌組
織より分離されたものである(日本癌学会総会記事第6
7回120頁1978年参照)。肝癌組織標本をメス又
は鋏で細切して微小組織片を調製し、これをディスガー
ゼ1000単位、/mllを溶解した15%牛脂児血清
(Fe2 )添加培養液に加え、67℃、1時間消化し
たのち、遠心分離して肝癌細胞を集め、5%CO2濃度
の空気中で37℃の温度で2〜4か月培養を行う。顕微
鏡下で間葉系細胞のみを剥ぎ落すことを繰り返すと、最
後に肝癌細胞系(huH−1)がコロニー状となって継
代される。
この肝癌細胞系から限界希釈法により単一細胞を分離し
、各細胞をそれぞれ培養し、培養液中のHBsAg濃度
を測定する。最も高いHBs Ag濃度が得られた培養
液に対応する細胞をbusPと命名した。hυspの生
物学的な特色は、下記のとおりである。
、各細胞をそれぞれ培養し、培養液中のHBsAg濃度
を測定する。最も高いHBs Ag濃度が得られた培養
液に対応する細胞をbusPと命名した。hυspの生
物学的な特色は、下記のとおりである。
1)細胞の由来:ヒト肝細胞癌組織
2)細胞の形態:上皮性細胞
3)染色体数:染色体モードはる9
4)細胞の増殖温度:32〜42℃
5)凍結保存ニー70℃で長期間保存可能6)継代培養
:限界なく継代培養可能 7)血清要求性:血清要求性が高い(牛脂児血清を10
%要求する) 8) HBウィルスDNA:染色体ハブロイド当り約9
カ所に組込まれている 9) HBウィルスの遊離:認められない10) HB
sAgの遊離:培養時に培養液中へ多量に分泌する この細胞には、HBウィルスに由来するHBsAg遺伝
子が染色体に組込まれており、適当な培養液の存在下で
培養を続けると、培養液中に多量のI(BsAgを産生
する。しかし、HBウィルスそのものは培養液中に遊離
しない。
:限界なく継代培養可能 7)血清要求性:血清要求性が高い(牛脂児血清を10
%要求する) 8) HBウィルスDNA:染色体ハブロイド当り約9
カ所に組込まれている 9) HBウィルスの遊離:認められない10) HB
sAgの遊離:培養時に培養液中へ多量に分泌する この細胞には、HBウィルスに由来するHBsAg遺伝
子が染色体に組込まれており、適当な培養液の存在下で
培養を続けると、培養液中に多量のI(BsAgを産生
する。しかし、HBウィルスそのものは培養液中に遊離
しない。
HBsAgを製造するに際しては、ヒト肝癌細胞系hu
sPを、血清添加培養液に接種して培養する。
sPを、血清添加培養液に接種して培養する。
培養は高濃度の炭酸ガスを含む空気中で行うことが好ま
しい。培養温度は32〜42℃、好ましくは37℃前後
である。培養期間は7〜14日間であり、この間に培養
液中のHBsAg濃度を測定する。HB sAg濃度は
、AUSRIA 11−125ラジオイムノアツセイ
キット(ダイナボット1u研究所)を用いて測定するこ
とができる。
しい。培養温度は32〜42℃、好ましくは37℃前後
である。培養期間は7〜14日間であり、この間に培養
液中のHBsAg濃度を測定する。HB sAg濃度は
、AUSRIA 11−125ラジオイムノアツセイ
キット(ダイナボット1u研究所)を用いて測定するこ
とができる。
培養液中のHBsAgが所定の濃度に達したときに培養
を終了し、細胞培養上澄のみを採取し、これを軽く遠心
処理(例えば300.0.!li’、10分)して細胞
片を除く。得られた一1=澄液からHBs、Jを精製す
る方法としては、蛋白質の一般的な分離精製法、例えば
超遠心分離、塩化セ/ウム平衡遠心、イオン交換クロマ
トグラフィ、アフイニテイクロマトダラフイ、蔗糖密度
勾配遠心などの方法を組合わせて使用する。例えばHB
sAgを含む上記培養液遠心上澄液を超遠心分離してH
BsAg ’を沈殿させる。沈殿したI(BsA3を溶
解し、塩化セシウム平衡遠心にかげ、密度1゜18〜1
.2297cm3のHBsAg分画を得る。この分画を
ハイドロキシアパタイト、さらに免疫アフイニテイクロ
マトグラフイにかけて、HBsAg分画を得る。この分
画を蔗糖密度勾配遠心にかけて、目的のHBsAg溶液
を得る。こうして得られたHBsAgには、直径22
nmの粒子が認められ、分子量2.5X10’の蛋白質
及び3 X 10’の糖蛋白より成り、ヒト血液から得
られたHBsAlと同じものであることが確認された。
を終了し、細胞培養上澄のみを採取し、これを軽く遠心
処理(例えば300.0.!li’、10分)して細胞
片を除く。得られた一1=澄液からHBs、Jを精製す
る方法としては、蛋白質の一般的な分離精製法、例えば
超遠心分離、塩化セ/ウム平衡遠心、イオン交換クロマ
トグラフィ、アフイニテイクロマトダラフイ、蔗糖密度
勾配遠心などの方法を組合わせて使用する。例えばHB
sAgを含む上記培養液遠心上澄液を超遠心分離してH
BsAg ’を沈殿させる。沈殿したI(BsA3を溶
解し、塩化セシウム平衡遠心にかげ、密度1゜18〜1
.2297cm3のHBsAg分画を得る。この分画を
ハイドロキシアパタイト、さらに免疫アフイニテイクロ
マトグラフイにかけて、HBsAg分画を得る。この分
画を蔗糖密度勾配遠心にかけて、目的のHBsAg溶液
を得る。こうして得られたHBsAgには、直径22
nmの粒子が認められ、分子量2.5X10’の蛋白質
及び3 X 10’の糖蛋白より成り、ヒト血液から得
られたHBsAlと同じものであることが確認された。
精製されたHB sA gは、適当な濃度に希釈したの
ち、ミリポアフィルタ−により無菌化し、一般的なワク
チン製剤化方法によってワクチン化することができる。
ち、ミリポアフィルタ−により無菌化し、一般的なワク
チン製剤化方法によってワクチン化することができる。
本発明方法によれば、培養液中のHBsAg濃度が約1
mg7pときわめて高くなるため、分離精製操作が容易
となり、HBsAgの収率が著しく向上する。
mg7pときわめて高くなるため、分離精製操作が容易
となり、HBsAgの収率が著しく向上する。
実施例1
56オの日本人男性の肝癌組織標本を、メスで切って腫
瘍の細かく切り刻んだ組織片を調製し、これをディスガ
ーゼ1000単位/ meを溶解した15%牛脂児血清
(Fe2 )入り培養液に加え、67℃、1時間消化し
たのち、遠心分離して肝癌細胞を集め、5%CO2濃度
の空気中で37℃の温度で2〜4か月培養を行う。培養
途中の適当な時期に培養上清を新しい培養液と交換する
。顕微鏡下で間葉系細胞のみを剥ぎ落すことを繰り返す
と、最後にコロニー状となった肝癌細胞系(huH−1
)が継代される。培養液としては下記組成のDM −1
60培地(極東製薬社製)を用いた。
瘍の細かく切り刻んだ組織片を調製し、これをディスガ
ーゼ1000単位/ meを溶解した15%牛脂児血清
(Fe2 )入り培養液に加え、67℃、1時間消化し
たのち、遠心分離して肝癌細胞を集め、5%CO2濃度
の空気中で37℃の温度で2〜4か月培養を行う。培養
途中の適当な時期に培養上清を新しい培養液と交換する
。顕微鏡下で間葉系細胞のみを剥ぎ落すことを繰り返す
と、最後にコロニー状となった肝癌細胞系(huH−1
)が継代される。培養液としては下記組成のDM −1
60培地(極東製薬社製)を用いた。
組 成 <my/沼)
L−アラニン 400
L−アルギニン 100
L−アスパラギン酸 25
L−アスパラギン(−水塩)28
L−システィン塩酸塩(−水塩)89
L−グルタミン酸ナトリウム(−水塩) 192L−グ
ルタミン 300 グリシン 15 L−ヒスチジン 3゜ L−インロイシン is。
ルタミン 300 グリシン 15 L−ヒスチジン 3゜ L−インロイシン is。
L−ロイシン 40[)
L−リジン塩酸塩 12O
L−メチオニン 8゜
L−フェニルアラニン 8゜
L−プロリン 12
L−セリン 8゜
L−スレオニン 100
L−)リプトファン 4゜
L−チロシン 5゜
L−バリン 85
塩酸チアミン 11
リボフラビン 1.0
塩酸ピリドキシン 1.2
ジアノコバラミン 0.005
パ/トテン酸ナトリウム 1.1
ニコチンアミド 1.0
ビオチン 0・1
重酒石酸コリン 9゜
アスコルビン酸 1.0
葉 酸 1゜
イノシトール 5.0
塩化ナトリウム 6800
塩化カリウム 400
塩化カルシウム 200
硫酸マグネシウム(無水) 977
リン酸−ナトリウム(無水) 108.7ブドウ糖 1
000 フエノールレツド 6 得られた肝癌細胞系をトリプシン処理したのち、細胞数
を数えて6個/ mlとなるように調整する。96穴の
マイクロウェルプレートニ、あらかじめ107個/ml
の濃度に調整したフィーダーセルを100μ石/ウェル
ずっ分注しておく。
000 フエノールレツド 6 得られた肝癌細胞系をトリプシン処理したのち、細胞数
を数えて6個/ mlとなるように調整する。96穴の
マイクロウェルプレートニ、あらかじめ107個/ml
の濃度に調整したフィーダーセルを100μ石/ウェル
ずっ分注しておく。
」二記の調整した細胞液を100μ石/1ウェルで、フ
ィーダーセル上に分注し、5%CO2濃度の空気中で6
7℃で静置培養する。5〜8日間培養を続けるとコロニ
ーの出現が観察される。
ィーダーセル上に分注し、5%CO2濃度の空気中で6
7℃で静置培養する。5〜8日間培養を続けるとコロニ
ーの出現が観察される。
コレラノコロニーのうち、1コロ=−/1ウーI−ルの
割合で生育したウェルの細胞をトリプシン処理後培養し
、培養液中のHBsAg濃度を測定する。最も高い濃度
の培養液に対応するコロニー(HBsAg産生肝癌細胞
系buSP )を、培養液に5 x 106個/m”)
濃度に調整し、DMSO(ジメチルスルホキシド)を1
0%添加して一70°Cで保存する。
割合で生育したウェルの細胞をトリプシン処理後培養し
、培養液中のHBsAg濃度を測定する。最も高い濃度
の培養液に対応するコロニー(HBsAg産生肝癌細胞
系buSP )を、培養液に5 x 106個/m”)
濃度に調整し、DMSO(ジメチルスルホキシド)を1
0%添加して一70°Cで保存する。
このhuSPの保存株を、10%FC8を含む培養液を
5〜3 me入れた小フラスコ(有効培養液面積’15
cm2)に接種し、5%CO2濃度の空気中67℃で
培養する。6日ごとに培養液上清を新しい培養液と交換
する。12〜14日後に、培養フラスコにトリプシンを
1■/ me a度に添力口して細胞をフラスコ面から
剥離し、遠心分離(1000,9,5分間)したのち上
清を棄てる。
5〜3 me入れた小フラスコ(有効培養液面積’15
cm2)に接種し、5%CO2濃度の空気中67℃で
培養する。6日ごとに培養液上清を新しい培養液と交換
する。12〜14日後に、培養フラスコにトリプシンを
1■/ me a度に添力口して細胞をフラスコ面から
剥離し、遠心分離(1000,9,5分間)したのち上
清を棄てる。
新しい培養液を加えて細胞を懸濁し、中フラスコ(有効
面積75 on2)に移して培養を続行する。
面積75 on2)に移して培養を続行する。
上記小フラスコで行った処理と同様の操作を行いながら
培養フラスコをさらにスケールアップして培養を続行す
る。細胞数組4 X 105個/meまで培養する。こ
の時HBsAgは、約1μ97meの濃度で培養液中に
産生される。
培養フラスコをさらにスケールアップして培養を続行す
る。細胞数組4 X 105個/meまで培養する。こ
の時HBsAgは、約1μ97meの濃度で培養液中に
産生される。
この培養液を軽く遠心分離(3000,?、10分間)
したのち、上清を超速、j1. (75000g、24
時間)してHBSAgを沈殿させる。沈殿したHBsA
gを溶解し、塩化センラム平衡遠ノU (150[10
19,48時間)にかけ、密度118〜122g/cM
3のHBsAg $分画を得る。コノ分画を、ハイドロ
キシアパタイト、さらに免疫アフイニテイクロマトグラ
フイにかけて、1−lBsAg分画を得る。さらにこの
分画を蔗糖密度勾配遠心(10〜60%蔗糖密度勾配置
5000CM7゜4.5時間)にかけ、02μ7nのミ
リポアフィルタ−で無菌r過し、目的のワクチンを得る
。
したのち、上清を超速、j1. (75000g、24
時間)してHBSAgを沈殿させる。沈殿したHBsA
gを溶解し、塩化センラム平衡遠ノU (150[10
19,48時間)にかけ、密度118〜122g/cM
3のHBsAg $分画を得る。コノ分画を、ハイドロ
キシアパタイト、さらに免疫アフイニテイクロマトグラ
フイにかけて、1−lBsAg分画を得る。さらにこの
分画を蔗糖密度勾配遠心(10〜60%蔗糖密度勾配置
5000CM7゜4.5時間)にかけ、02μ7nのミ
リポアフィルタ−で無菌r過し、目的のワクチンを得る
。
手 続 補 正 書(自発)
昭和59年9月2r日
特許庁長官志賀 学殿
1・事件の表示特願昭58−148774号2、J6明
f’)名称B型肝炎ウィルスワクチンの製造法38補正
をする者 事件との関係特許出願人 住 所 (名 称) 4代 理 人 5、補正命令の日刊 6、補正により増加する発明の数 7、補正の対象明細書 8、?ff+iEl’)内容 別紙訂正書のとおり訂
正 書(特願昭58−148774号)明細書中下記の
訂正を行う。
f’)名称B型肝炎ウィルスワクチンの製造法38補正
をする者 事件との関係特許出願人 住 所 (名 称) 4代 理 人 5、補正命令の日刊 6、補正により増加する発明の数 7、補正の対象明細書 8、?ff+iEl’)内容 別紙訂正書のとおり訂
正 書(特願昭58−148774号)明細書中下記の
訂正を行う。
1、第5頁終行のW遊離しなし・jの次に下記の文を加
入する。
入する。
「このhusPをクローニングすることにより得られる
huGK−14は、優れたHBsAg産生能を有するが
、huSPとの間に形態上の差異(まみられない。j 2、第6頁2行の「11uSPを、」を「例え&’l
1)usPを、jに改める。
huGK−14は、優れたHBsAg産生能を有するが
、huSPとの間に形態上の差異(まみられない。j 2、第6頁2行の「11uSPを、」を「例え&’l
1)usPを、jに改める。
6、第1頁4行ないし第2頁1行の特許請求の範囲の全
文を別紙のとおり改める。
文を別紙のとおり改める。
「特許請求の範囲
1. B型肝炎ウィルス表面抗原(HBsAg )を高
産生するヒト肝癌細胞系を培養し、培養液からHBsA
gを採取することを特徴とする、B型肝炎つイノトスワ
クチンの製造法。
産生するヒト肝癌細胞系を培養し、培養液からHBsA
gを採取することを特徴とする、B型肝炎つイノトスワ
クチンの製造法。
2、肝癌細胞系が、下記の特性
a)細胞の形態:上皮性細胞
b)細胞の由来:ヒト肝癌組織
C)染色体数:染色体モードはる9
d)HBvの染色体挿入部位二ノ・プロイド当り約9か
所 e) HBSAgの産生:多量に産生 を有するbusPから成る、特許請求の範囲第1項に記
載の方法。
所 e) HBSAgの産生:多量に産生 を有するbusPから成る、特許請求の範囲第1項に記
載の方法。
6、 ヒト肝癌細胞系をクローニングすることにより得
られるHBsAgを高産生する細胞を用いることを特徴
とする特許請求の範囲第1項に記載の方法。」 出願人 財団法人 癌 研究会 代理人 弁理士小 林 正 雄
られるHBsAgを高産生する細胞を用いることを特徴
とする特許請求の範囲第1項に記載の方法。」 出願人 財団法人 癌 研究会 代理人 弁理士小 林 正 雄
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、B型肝炎つィルス表面抗原(丁(BsAg )を高
産生するヒト肝癌細胞系を培養し、培養液からHBsA
gを採取することを特徴とする、B型肝炎ウィルスワク
チンの製造法。 2、肝癌細胞系が、下記の特性を有するhuSPから成
る、特許請求の範囲第1項に記載の方法。 a)細胞の形態二上皮性細胞 +))細胞の由来:ヒト肝癌組織 C)染色体数:染色体モードは69 d) HBVの染色体挿入部位:ハブロイド当り約9か
所 e) HBsAgの産生:多量に産生 6 ヒト肝癌細胞系をクローニングすることにより得ら
れるHBsAgを高産生する細胞を用いることを特徴と
する特許請求の範囲第1項に記載の方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP14877483A JPS6045535A (ja) | 1983-08-16 | 1983-08-16 | B型肝炎ウイルスワクチンの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP14877483A JPS6045535A (ja) | 1983-08-16 | 1983-08-16 | B型肝炎ウイルスワクチンの製造法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS6045535A true JPS6045535A (ja) | 1985-03-12 |
JPH0585528B2 JPH0585528B2 (ja) | 1993-12-07 |
Family
ID=15460359
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP14877483A Granted JPS6045535A (ja) | 1983-08-16 | 1983-08-16 | B型肝炎ウイルスワクチンの製造法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS6045535A (ja) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0205625A1 (en) * | 1984-12-28 | 1986-12-30 | Japanese Foundation For Cancer Research | Hepatitis b virus vaccine and process for its preparation |
JPS62115278A (ja) * | 1985-09-13 | 1987-05-26 | アンステイテユ・パストウ−ル | ヒトクラス2組織適合抗原を欠く細胞系の利用方法 |
EP0888046A4 (en) * | 1996-01-29 | 2001-10-04 | Paik Kye Hyung | METHOD FOR PROTEIN PRODUCTION BY MEANS OF A MITOCHONDRIAL TRANSLATION SYSTEM. |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS56150020A (en) * | 1980-03-27 | 1981-11-20 | Merck & Co Inc | Proliferation of b type hepatitis surface antigen |
-
1983
- 1983-08-16 JP JP14877483A patent/JPS6045535A/ja active Granted
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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JPS56150020A (en) * | 1980-03-27 | 1981-11-20 | Merck & Co Inc | Proliferation of b type hepatitis surface antigen |
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