JPS6045535A - Ｂ型肝炎ウイルスワクチンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、Ｂ型肝炎つィルス表面抗原（）（ＢＳＡｇ　
）の新規な製法に関する。

）（Ｂ　ｓＡｇは、Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ　）によ
る疾病に有効なワクチンであることが知られている。Ｈ
ＢｓＡｇの供給は、）ＩＢＶの細胞培養による増殖が成
功していないため、現在のところ、ヒト保菌者血液に頼
っている。しかしながら、ヒＩ・保菌者血液は有限であ
り、ワクチン需要を／ｉｊ／ｉノーし得ない状態である
。一方、ＨＢｓＡｇを、遺伝子工学手法を用いて大腸菌
や酵母によって、あるいは培養細胞によって、大量生産
しようとする試みがなされているが、いまだ十分な成果
が得られていない。

本発明は、Ｂ型肝炎つィルス表面抗原（［３ＳＡｌ！、
）を高産生するヒト肝癌細胞系を培養し、培養液からＨ
Ｂ　Ｓ　Ａ　ｇを採取することを特徴とする、Ｂ型肝炎
ウィルスワクチンの製造法である。

本発明に用いられるヒト肝癌細胞系は、ヒト肝癌組織を
血清添加培養液中で培養することにより得られる。

培養液としては、アミノ酸、ビタミン、無機塩類などを
含有する細胞培養のための一般的な培地が用いられる。

血清としては牛脂児血清が好ましく・。

ＨＢｓＡｇの収率を向上させるためには、ヒト−肝癌細
胞系を例えば限界希釈法によりクローニングすることが
好ましい。すなわち肝癌細胞系から単一細胞を分離し、
各細胞を培養してＨＢｓＡｇを多量に産生ずる細胞を選
別して用いることにより、培養液中のＨＢｓＡｇ濃度を
著しく高めることができる。

肝癌細胞系としては、ｈｕＳＰと呼ばれる細胞系を用い
ることが好まし℃・。ｈｕｓＰ細胞系は、ヒトの肝癌組
織由来のＨＢｓＡｇ産生肝癌細胞系であり、ＨＢｓＡｇ
を多量に産生ずることを特色とする新規な細胞株である
。ｈｕＳＰは一７０℃でほぼ永久的に凍結保存可能であ
って、財団性人癌研究会研究所に登録保管されており、
頒布可能な状態にある。

以下に本細胞株作成の経緯を説明する。ヒト肝癌細胞ｈ
ｕｓＰは、ｈｕＨ−１細胞系から分離された細胞株であ
り□、ｈｕＨ−ｉ細胞系は５３才の日本人男性の肝癌組
織より分離されたものである（日本癌学会総会記事第６
７回１２０頁１９７８年参照）。肝癌組織標本をメス又
は鋏で細切して微小組織片を調製し、これをディスガー
ゼ１０００単位、／ｍｌｌを溶解した１５％牛脂児血清
（Ｆｅ２　）添加培養液に加え、６７℃、１時間消化し
たのち、遠心分離して肝癌細胞を集め、５％ＣＯ２濃度
の空気中で３７℃の温度で２〜４か月培養を行う。顕微
鏡下で間葉系細胞のみを剥ぎ落すことを繰り返すと、最
後に肝癌細胞系（ｈｕＨ−１）がコロニー状となって継
代される。

この肝癌細胞系から限界希釈法により単一細胞を分離し
、各細胞をそれぞれ培養し、培養液中のＨＢｓＡｇ濃度
を測定する。最も高いＨＢｓ　Ａｇ濃度が得られた培養
液に対応する細胞をｂｕｓＰと命名した。ｈυｓｐの生
物学的な特色は、下記のとおりである。

１）細胞の由来：ヒト肝細胞癌組織 ２）細胞の形態：上皮性細胞 ３）染色体数：染色体モードはる９ ４）細胞の増殖温度：３２〜４２℃ ５）凍結保存ニー７０℃で長期間保存可能６）継代培養
：限界なく継代培養可能 ７）血清要求性：血清要求性が高い（牛脂児血清を１０
％要求する） ８）　ＨＢウィルスＤＮＡ：染色体ハブロイド当り約９
カ所に組込まれている ９）　ＨＢウィルスの遊離：認められない１０）　ＨＢ
ｓＡｇの遊離：培養時に培養液中へ多量に分泌する この細胞には、ＨＢウィルスに由来するＨＢｓＡｇ遺伝
子が染色体に組込まれており、適当な培養液の存在下で
培養を続けると、培養液中に多量のＩ（ＢｓＡｇを産生
する。しかし、ＨＢウィルスそのものは培養液中に遊離
しない。

ＨＢｓＡｇを製造するに際しては、ヒト肝癌細胞系ｈｕ
ｓＰを、血清添加培養液に接種して培養する。

培養は高濃度の炭酸ガスを含む空気中で行うことが好ま
しい。培養温度は３２〜４２℃、好ましくは３７℃前後
である。培養期間は７〜１４日間であり、この間に培養
液中のＨＢｓＡｇ濃度を測定する。ＨＢ　ｓＡｇ濃度は
、ＡＵＳＲＩＡ　１１−１２５ラジオイムノアツセイ　
キット（ダイナボット１ｕ研究所）を用いて測定するこ
とができる。

培養液中のＨＢｓＡｇが所定の濃度に達したときに培養
を終了し、細胞培養上澄のみを採取し、これを軽く遠心
処理（例えば３００．０．！ｌｉ’、１０分）して細胞
片を除く。得られた一１＝澄液からＨＢｓ、Ｊを精製す
る方法としては、蛋白質の一般的な分離精製法、例えば
超遠心分離、塩化セ／ウム平衡遠心、イオン交換クロマ
トグラフィ、アフイニテイクロマトダラフイ、蔗糖密度
勾配遠心などの方法を組合わせて使用する。例えばＨＢ
ｓＡｇを含む上記培養液遠心上澄液を超遠心分離してＨ
ＢｓＡｇ　’を沈殿させる。沈殿したＩ（ＢｓＡ３を溶
解し、塩化セシウム平衡遠心にかげ、密度１゜１８〜１
．２２９７ｃｍ３のＨＢｓＡｇ分画を得る。この分画を
ハイドロキシアパタイト、さらに免疫アフイニテイクロ
マトグラフイにかけて、ＨＢｓＡｇ分画を得る。この分
画を蔗糖密度勾配遠心にかけて、目的のＨＢｓＡｇ溶液
を得る。こうして得られたＨＢｓＡｇには、直径２２　
ｎｍの粒子が認められ、分子量２．５Ｘ１０’の蛋白質
及び３　Ｘ　１０’の糖蛋白より成り、ヒト血液から得
られたＨＢｓＡｌと同じものであることが確認された。

精製されたＨＢ　ｓＡ　ｇは、適当な濃度に希釈したの
ち、ミリポアフィルタ−により無菌化し、一般的なワク
チン製剤化方法によってワクチン化することができる。

本発明方法によれば、培養液中のＨＢｓＡｇ濃度が約１
ｍｇ７ｐときわめて高くなるため、分離精製操作が容易
となり、ＨＢｓＡｇの収率が著しく向上する。

実施例１ ５６オの日本人男性の肝癌組織標本を、メスで切って腫
瘍の細かく切り刻んだ組織片を調製し、これをディスガ
ーゼ１０００単位／　ｍｅを溶解した１５％牛脂児血清
（Ｆｅ２　）入り培養液に加え、６７℃、１時間消化し
たのち、遠心分離して肝癌細胞を集め、５％ＣＯ２濃度
の空気中で３７℃の温度で２〜４か月培養を行う。培養
途中の適当な時期に培養上清を新しい培養液と交換する
。顕微鏡下で間葉系細胞のみを剥ぎ落すことを繰り返す
と、最後にコロニー状となった肝癌細胞系（ｈｕＨ−１
）が継代される。培養液としては下記組成のＤＭ　−１
６０培地（極東製薬社製）を用いた。

組　成　＜ｍｙ／沼） Ｌ−アラニン　４００ Ｌ−アルギニン　１００ Ｌ−アスパラギン酸　２５ Ｌ−アスパラギン（−水塩）２８ Ｌ−システィン塩酸塩（−水塩）８９ Ｌ−グルタミン酸ナトリウム（−水塩）　１９２Ｌ−グ
ルタミン　３００ グリシン　１５ Ｌ−ヒスチジン　３゜ Ｌ−インロイシン　ｉｓ。

Ｌ−ロイシン　４０［） Ｌ−リジン塩酸塩　１２Ｏ Ｌ−メチオニン　８゜ Ｌ−フェニルアラニン　８゜ Ｌ−プロリン　１２ Ｌ−セリン　８゜ Ｌ−スレオニン　１００ Ｌ−）リプトファン　４゜ Ｌ−チロシン　５゜ Ｌ−バリン　８５ 塩酸チアミン　１１ リボフラビン　１．０ 塩酸ピリドキシン　１．２ ジアノコバラミン　０．００５ パ／トテン酸ナトリウム　１．１ ニコチンアミド　１．０ ビオチン　０・１ 重酒石酸コリン　９゜ アスコルビン酸　１．０ 葉　酸　１゜ イノシトール　５．０ 塩化ナトリウム　６８００ 塩化カリウム　４００ 塩化カルシウム　２００ 硫酸マグネシウム（無水）　９７７ リン酸−ナトリウム（無水）　１０８．７ブドウ糖　１
０００ フエノールレツド　６ 得られた肝癌細胞系をトリプシン処理したのち、細胞数
を数えて６個／　ｍｌとなるように調整する。９６穴の
マイクロウェルプレートニ、あらかじめ１０７個／ｍｌ
の濃度に調整したフィーダーセルを１００μ石／ウェル
ずっ分注しておく。

」二記の調整した細胞液を１００μ石／１ウェルで、フ
ィーダーセル上に分注し、５％ＣＯ２濃度の空気中で６
７℃で静置培養する。５〜８日間培養を続けるとコロニ
ーの出現が観察される。

コレラノコロニーのうち、１コロ＝−／１ウーＩ−ルの
割合で生育したウェルの細胞をトリプシン処理後培養し
、培養液中のＨＢｓＡｇ濃度を測定する。最も高い濃度
の培養液に対応するコロニー（ＨＢｓＡｇ産生肝癌細胞
系ｂｕＳＰ　）を、培養液に５　ｘ　１０６個／ｍ”）
濃度に調整し、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）を１
０％添加して一７０°Ｃで保存する。

このｈｕＳＰの保存株を、１０％ＦＣ８を含む培養液を
５〜３　ｍｅ入れた小フラスコ（有効培養液面積’１５
　ｃｍ２）に接種し、５％ＣＯ２濃度の空気中６７℃で
培養する。６日ごとに培養液上清を新しい培養液と交換
する。１２〜１４日後に、培養フラスコにトリプシンを
１■／　ｍｅ　ａ度に添力口して細胞をフラスコ面から
剥離し、遠心分離（１０００，９，５分間）したのち上
清を棄てる。

新しい培養液を加えて細胞を懸濁し、中フラスコ（有効
面積７５　ｏｎ２）に移して培養を続行する。

上記小フラスコで行った処理と同様の操作を行いながら
培養フラスコをさらにスケールアップして培養を続行す
る。細胞数組４　Ｘ　１０５個／ｍｅまで培養する。こ
の時ＨＢｓＡｇは、約１μ９７ｍｅの濃度で培養液中に
産生される。

この培養液を軽く遠心分離（３０００，？、１０分間）
したのち、上清を超速、ｊ１．　（７５０００ｇ、２４
時間）してＨＢＳＡｇを沈殿させる。沈殿したＨＢｓＡ
ｇを溶解し、塩化センラム平衡遠ノＵ　（１５０［１０
１９，４８時間）にかけ、密度１１８〜１２２ｇ／ｃＭ
３のＨＢｓＡｇ　＄分画を得る。コノ分画を、ハイドロ
キシアパタイト、さらに免疫アフイニテイクロマトグラ
フイにかけて、１−ｌＢｓＡｇ分画を得る。さらにこの
分画を蔗糖密度勾配遠心（１０〜６０％蔗糖密度勾配置
５０００ＣＭ７゜４．５時間）にかけ、０２μ７ｎのミ
リポアフィルタ−で無菌ｒ過し、目的のワクチンを得る
。

手　続　補　正　書（自発） 昭和５９年９月２ｒ日 特許庁長官志賀　学殿 １・事件の表示特願昭５８−１４８７７４号２、Ｊ６明
ｆ’）名称Ｂ型肝炎ウィルスワクチンの製造法３８補正
をする者 事件との関係特許出願人 住　所 （名　称） ４代　理　人 ５、補正命令の日刊 ６、補正により増加する発明の数 ７、補正の対象明細書 ８、？ｆｆ＋ｉＥｌ’）内容　別紙訂正書のとおり訂　
正　書（特願昭５８−１４８７７４号）明細書中下記の
訂正を行う。

１、第５頁終行のＷ遊離しなし・ｊの次に下記の文を加
入する。

「このｈｕｓＰをクローニングすることにより得られる
ｈｕＧＫ−１４は、優れたＨＢｓＡｇ産生能を有するが
、ｈｕＳＰとの間に形態上の差異（まみられない。ｊ ２、第６頁２行の「１１ｕＳＰを、」を「例え＆’ｌ　
１）ｕｓＰを、ｊに改める。

６、第１頁４行ないし第２頁１行の特許請求の範囲の全
文を別紙のとおり改める。

「特許請求の範囲 １．　Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ　）を高
産生するヒト肝癌細胞系を培養し、培養液からＨＢｓＡ
ｇを採取することを特徴とする、Ｂ型肝炎つイノトスワ
クチンの製造法。

２、肝癌細胞系が、下記の特性 ａ）細胞の形態：上皮性細胞 ｂ）細胞の由来：ヒト肝癌組織 Ｃ）染色体数：染色体モードはる９ ｄ）ＨＢｖの染色体挿入部位二ノ・プロイド当り約９か
所 ｅ）　ＨＢＳＡｇの産生：多量に産生 を有するｂｕｓＰから成る、特許請求の範囲第１項に記
載の方法。

６、　ヒト肝癌細胞系をクローニングすることにより得
られるＨＢｓＡｇを高産生する細胞を用いることを特徴
とする特許請求の範囲第１項に記載の方法。」 出願人　財団法人　癌　研究会 代理人　弁理士小　林　正　雄

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、Ｂ型肝炎つィルス表面抗原（丁（ＢｓＡｇ　）を高
   産生するヒト肝癌細胞系を培養し、培養液からＨＢｓＡ
   ｇを採取することを特徴とする、Ｂ型肝炎ウィルスワク
   チンの製造法。 ２、肝癌細胞系が、下記の特性を有するｈｕＳＰから成
   る、特許請求の範囲第１項に記載の方法。 ａ）細胞の形態二上皮性細胞 ＋））細胞の由来：ヒト肝癌組織 Ｃ）染色体数：染色体モードは６９ ｄ）　ＨＢＶの染色体挿入部位：ハブロイド当り約９か
   所 ｅ）　ＨＢｓＡｇの産生：多量に産生 ６　ヒト肝癌細胞系をクローニングすることにより得ら
   れるＨＢｓＡｇを高産生する細胞を用いることを特徴と
   する特許請求の範囲第１項に記載の方法。