JP5257971B2 - 胚性幹細胞から肝芽細胞を得る方法 - Google Patents
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Description
(a)胚性幹細胞から胚様体を形成する工程、及び
(b)該胚様体を下記の培地:
・該培地は、肝細胞の成育に必須である1以上の物質を実質的に含まない
・該物質は、肝細胞の細胞に存在しかつ該細胞群に含まれる肝細胞の細胞以外の細胞には存在しない代謝酵素の産物である
・該培地は、該代謝酵素が該産物を生成するための基質を含む
で胚様体形成開始4日以後に培養する工程を含む方法である。
(a)胚性幹細胞から胚様体を形成する工程、及び
(b)該胚様体を下記の培地:
・該培地は、肝細胞の成育に必須であるL−アルギニン、L−チロシン、及びピルビン酸からなる群から選ばれる1以上の物質である物質を実質的に含まない
・該培地は、さらにD−グルコースを実質的に含まず、L−プロリンを含む
・該培地は、該代謝酵素が該産物を生成するための基質を含む
で胚様体形成開始4日以後に培養する工程を含む方法である。
(a)胚性幹細胞から胚様体を形成する工程、及び
(b)該胚様体を下記の培地:
・該培地は、肝細胞の成育に必須であるL−アルギニン、L−チロシン、及びピルビン酸からなる群から選ばれる1以上の物質である物質を実質的に含まない
・該培地は、さらにD−グルコースおよびL−シスチンを実質的に含まず、L−プロリンを含む
・該培地は、該代謝酵素が該産物を生成するための基質を含む
で胚様体形成開始4日以後に培養する工程を含む方法である。
さらに加えるに、個体における肝組織を再生する方法であって、該細胞培養物を個体に投与する工程を含む方法に関する。
さらに、該細胞培養物を有効成分として含有する医薬に関する。この医薬は、個体における肝組織を再生する方法であって、該細胞培養物を有効成分として含有する医薬を個体に投与する工程を含む方法に関する。
mia inhibitory facor、LIF)を含む培地を用いるのが好ましい。その際、アミノ酸類(L−アルギニン、L−チロシン及びL−シスチンを含んでもよい)、ビタミン類、糖類(D−グルコースを含んでもよい)、無機塩類、及び血清などを含んだ培地を用いることができ、例えばGlasgow Minimum Essential Medium (GMEM)培地等の通常の培地を用いることができる。胚性幹細胞は継代培養しておくことも好ましい。
Biol., 7, 862, 1995等に記載されるhanging drop method等を用いることができる。培養は1×104細胞/ml〜1×105細胞/mlの濃度で4日行えばよい。胚様体が形成されたか否かは、例えば肉眼及び顕微鏡下の観察で確認できる。hanging drop methodを用いた場合、胚様体はhanging dropの下端に球状の細胞塊として沈降するので、肉眼では微小な白色の球状の細胞塊の形成、顕微鏡下では球状の細胞塊の形成を確認することができる。
培養は、通常の培養条件、例えば5%CO2、35〜40℃で行うことができ、例えば、1〜2日好ましくは2日に一度培地を交換しながら10日から90日間、好ましくは18日から30日間程度行えばよい。
本発明の方法により実質的に肝芽細胞のみからなる細胞培養物が得られたことは、インドシアニングリーン(ICG)が肝細胞に特異的に取り込まれることを利用した方法(Stem Cells, 20, 146, 2002等参照)や、肝芽細胞に特異的な遺伝子の発現を検出する方法等により確認することができる。なお、本発明の方法により得られた細胞は、未分化な肝細胞の性質を有するのみならず、胆管上皮細胞の性質も有するので、肝芽細胞であった。
(マウスES細胞の培養と胚様体の形成)
129/Ola系マウス由来のES細胞にE14tg2a及びそのOct3/4遺伝子座にブラストシジン耐性遺伝子を挿入し、未分化ES細胞を選択可能なEB5を、10%仔牛血清、非必須アミノ酸、1mMピルビン酸ナトリウム、0.1mM 2メルカプトエタノール及び1000U/ml、leukemia inhibitory factor
(LIF)を含むGMEM培地に定法(5%CO2、37℃)によって継代培養した。
ES細胞からの胚様体の形成は以下のように行った。ES細胞を生理食塩水(PBS)で洗浄後、0.05%トリプシン0.53mM EDTA処理、停止を行い、ピペッティングにて分散させた細胞を、1000個のES細胞を10%仔牛血清、非必須アミノ酸、1mMピルビン酸ナトリウム、0.1mM 2メルカプトエタノールを含むGMEM培地(以下ESMとする)30μlに浮遊させ、培養皿の底に付着させ、天地を反転させ(以下hanging drop methodとする)、定法にて培養し、胚様体を形成させた。
上記にて胚様体の形成開始4日後、反転させた培養皿を元に戻し、培地とともに胚様体を集め、毎分3000回転4℃ 5分間遠心分離し、培地を吸引除去し、表1に示す、肝細胞選択培地(HSM、特許文献1)を追加してゼラチンコーティングした培養皿に移して、さらに定法にて培養した。
ICGを培地に添加し15分間定法にて培養し、光学顕微鏡にて、ICGを取り込んで緑色を呈する肝細胞を確認した。
(肝細胞の濃縮の確認)
0.05%トリプシン0.53mM EDTA処理、停止を行い、ピペッティングにて分散させた細胞を光学顕微鏡下にて計測、解析した。
細胞よりRNAを抽出し、逆転写酵素にて相補的DNA(cDNA)を合成し、PCR法(RT-PCR法)にてtransthyretin(TTR)、アルブミン(albumin)、 alpha-feto protein(AFP)、 tyrosine
aminotransferase(TAT)、alpha1-antitrypsin、glucose-6-phosphatase(G6P)、 phosphoenolpyruvate carboxykinase(PEPCK)、 CK8、 CK18、 CK19、 gamma-glutamyl
transpeptidase(G-GTP)、 ornithine transcarbamylase(OTC)、 phenylalanine hydroxylase(PAH)、 glycerol kinase、 galactokinase、 pyruvate kinase、 beta-actinを増幅し、2.0%アガロースゲルにて電気泳動した。
(ノザンブロット法)
細胞より抽出したRNAを、ホルムアルデヒド変成1.2%アガロースゲルにて電気泳動し、ナイロンメンブレンに転写後、CCAAT/enhancer binding protein(C/EBP)α、C/EBPβに対するプローブを用いてハイブリダイズし、定法にて解析した。
(特許文献1(特開2005-253374)開示の方法における、肝細胞の回収効率)
ゼラチンコートした6孔プレートに1孔あたり胚様体を3個移して、ESMで培養31日後、培地をHSMに変えて10日培養すると、50%のみにICG陽性の細胞を認め、肝細胞以外の細胞が多数残存していた。ICG陽性肝細胞数は、ESM、HSMともに、1.3×105個で同数であった。特許文献1(特開2005-253374)で開示した方法では、ICG陽性細胞の回収は不十分であった。
(100%肝細胞の回収)
胚様体形成4日後HSMに培地を変更後培養すると、18日で100%均一の細胞の回収に成功した。ICG陽性率は80%だが、100%の細胞がalbuminを強発現しており、100%肝細胞の回収に成功したと考えられた。ICG陽性細胞数は、HSM培養下では9.7×102個に対し、ESM培養下では7.9×102個であり、HSMの方がICG陽性細胞の効率が優れていた。
(肝芽細胞の確認)
HSMで培養した細胞は、TTR、 AFPは陽性だが、TAT、 alpha1-antitrypsin、 G6P、 PEPCKは陰性で、未分化な肝細胞の性質を有していた。CK8、 CK18は陽性なので、肝細胞としての分化した性質を有していることは明確であり、ICG陽性、albumin強陽性な結果と一致した。胆管上皮細胞のみが発現するCK19、 G-GTPが陽性なので、HSMで回収された細胞は未分化な肝細胞の性質のみならず、胆管上皮細胞の性質をも有するので、肝芽細胞と考えられる。ノザンブロット法でも、肝芽細胞で発現の見られるC/EBPα、C/EBPβの発現がみられるので、肝芽細胞としての性質を有することがさらに確認された。
Glycerol kinase、 galactokinase、 pyruvate kinaseが陽性なので、ブドウ糖、ピルビン酸がないHSMで培養中、ガラクトース、グリセロールを解糖してエネルギーとし、生存したものと考えられる。Galactokinase、 pyruvate kinaseは、ESMで培養した細胞では陰性だが、肝臓では陽性なので、HSMで培養すると、肝細胞への分化が誘導されてgalactokinase、 pyryvate kinaseが発現し、生存するメカニズムの存在が推定された。
Claims (1)
- 胚性幹細胞から肝芽細胞を分化誘導し、かつ胚性幹細胞から分化した肝芽細胞を含む細胞群から実質的に肝芽細胞群を得る方法であって、
(a)胚性幹細胞から胚様体を形成する工程、及び
(b)該胚様体を下記の表の組成の培地:
で胚様体形成開始4日以後に培養する工程を含む方法。
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