WO2016027850A1 - 間葉系幹細胞用培地 - Google Patents

間葉系幹細胞用培地 Download PDF

Info

Publication number
WO2016027850A1
WO2016027850A1 PCT/JP2015/073349 JP2015073349W WO2016027850A1 WO 2016027850 A1 WO2016027850 A1 WO 2016027850A1 JP 2015073349 W JP2015073349 W JP 2015073349W WO 2016027850 A1 WO2016027850 A1 WO 2016027850A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
less
mesenchymal stem
medium
stem cells
medium according
Prior art date
Application number
PCT/JP2015/073349
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
永輝 金
育恵 原田
将 千田
弘樹 小澤
小林　幹
淳也 戸口田
真 池谷
Original Assignee
味の素株式会社
国立大学法人京都大学
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 味の素株式会社, 国立大学法人京都大学 filed Critical 味の素株式会社
Priority to KR1020177007657A priority Critical patent/KR102415441B1/ko
Priority to JP2016544246A priority patent/JP6940837B2/ja
Priority to EP15833662.8A priority patent/EP3184627B1/en
Priority to CA2958533A priority patent/CA2958533C/en
Priority to CN201580044799.7A priority patent/CN106715683A/zh
Publication of WO2016027850A1 publication Critical patent/WO2016027850A1/ja
Priority to US15/435,705 priority patent/US10947508B2/en

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C12N5/0663—Bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/55—Glands not provided for in groups A61K35/22 - A61K35/545, e.g. thyroids, parathyroids or pineal glands
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/56—Materials from animals other than mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0653—Adipocytes; Adipose tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K2035/124—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells the cells being hematopoietic, bone marrow derived or blood cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/32—Amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/70—Undefined extracts
    • C12N2500/80—Undefined extracts from animals
    • C12N2500/84—Undefined extracts from animals from mammals

Definitions

  • the present invention relates to a mesenchymal stem cell culture medium, a mesenchymal stem cell culture method, and the like.
  • a mesenchymal stem cell is a type of somatic stem cell that exists in adult bone marrow, etc., and is defined as an adherent cell having the ability to differentiate into bone, cartilage, and adipocyte.
  • embryonic stem cells such as embryonic stem (ES) cells and induced pluripotent stem (iPS) cells
  • ES embryonic stem
  • iPS induced pluripotent stem
  • Non-Patent Document 1 reports that the senescence of human mesenchymal stem cells (hMSC) can be suppressed by culturing under low oxygen partial pressure, but the amino acid composition of the medium is senescent of human mesenchymal stem cells. It is completely unknown what kind of effect it has on growth.
  • Patent Documents 1 and 2 disclose examples of stem cell culture techniques by removing specific amino acids from the medium. These are technologies related to pluripotent stem cells such as ES cells and iPS cells, which selectively kill and remove undifferentiated cells remaining at the time of differentiation induction, and increase the purity of those differentiated in the cell composition. is there. To date, in any stem cell, regardless of whether it is a somatic stem cell or a pluripotent stem cell, there are known examples in which the removal of a specific amino acid from the medium suppresses aging of the cell or promotes its proliferation. Not.
  • an object of the present invention is to provide a means for proliferating mesenchymal stem cells, particularly human mesenchymal stem cells, for a longer period of time than before without using a special device or equipment.
  • the present inventors have found that glycine, alanine, serine, proline, asparagine, aspartic acid, and glutamic acid are reduced between humans in a culture solution in which the amount of seven non-essential amino acids such as glutamic acid is reduced. It has been found that when cultivating mesenchymal stem cells, it becomes possible to proliferate and culture for a longer period of time than when cultured in a normal culture solution in which the amount of the non-essential amino acids is not reduced, and more mesenchymal stem cells can be obtained. It was.
  • the present invention has been completed based on the above findings. That is, the present invention is as follows.
  • [1] Mesenchymal stem cells in which the concentration of at least one amino acid is less than 5 ⁇ M glycine, less than 5 ⁇ M alanine, less than 3 ⁇ M serine, less than 5 ⁇ M proline, less than 1 ⁇ M aspartate, less than 2 ⁇ M aspartate, and / or less than 3 ⁇ M glutamate Medium.
  • [3] The medium according to [1] above, wherein glycine is less than 1 ⁇ M.
  • Glycine is less than 1 ⁇ M
  • alanine is less than 1 ⁇ M
  • serine is less than 0.7 ⁇ M
  • proline is less than 1 ⁇ M
  • asparagine is less than 0.1 ⁇ M
  • aspartic acid is less than 0.5 ⁇ M
  • glutamic acid is less than 0.7 ⁇ M.
  • the culture method according to [24], wherein the step of culturing mesenchymal stem cells is a step of growing mesenchymal stem cells over 70 days or more.
  • the cell composition according to [26] which is positive for at least one marker selected from the group consisting of CD73, CD90, and CD105.
  • the above [26] which is positive for at least one marker selected from the group consisting of CD73, CD90 and CD105, and is negative for CD45, CD34, CD14, CD11b, CD79, CD19 and HLA-DR The cell composition described.
  • arginine, cysteine, glutamine, and tyrosine are further added.
  • the present invention it is possible to proliferate and culture mesenchymal stem cells over a long period of time, which has been difficult until now. Therefore, more mesenchymal stem cells can be easily obtained, and a large amount of mesenchymal stem cells can be supplied for use in research, medical treatment, and the like.
  • FIG. 1 is a graph showing the effect of promoting cell proliferation in a 7-day culture of human mesenchymal stem cells (lot number: OF3825) using the medium of the present invention.
  • FIG. 2 is a graph showing the effect of promoting cell proliferation in culture of human mesenchymal stem cells (lot number: OF3825) for about 70 days by the medium of the present invention.
  • FIG. 3 is a diagram showing the cell proliferation promoting effect of human mesenchymal stem cells (lot numbers: OF3853 and OF4266) in about 30 days by the medium of the present invention.
  • FIG. 4 is a graph showing the effect of promoting cell proliferation in 109 days from the first passage of human mesenchymal stem cells (lot number: BM103) by the medium of the present invention.
  • FIG. 5 is a graph showing the differentiation-promoting effect of human mesenchymal stem cells (lot numbers: BM103PN2 (FIG. 5A) and BM105PN2 (FIG. 5B)) cultured in the medium of the present invention into adipocytes.
  • the present invention relates to a mesenchymal stem cell medium (hereinafter referred to as “the present invention”) in which the amount of at least one amino acid selected from the group consisting of glycine, alanine, serine, proline, asparagine, aspartic acid and glutamic acid is reduced. May be abbreviated as “medium”. More specifically, the concentration of at least one amino acid is less than 5 ⁇ M glycine, less than 5 ⁇ M alanine, less than 3 ⁇ M serine, less than 5 ⁇ M proline, less than 1 ⁇ M asparagine, less than 2 ⁇ M aspartate, and / or less than 3 ⁇ M glutamate.
  • a medium for leaf stem cells is provided.
  • the amino acid described in this specification means any of L-form, D-form and DL-form, and means not only a free form of each amino acid but also a salt form.
  • salt forms include acid addition salts and salts with bases, and are preferably salts that do not exhibit cytotoxicity and are acceptable as pharmaceuticals.
  • acids that form such salts include inorganic acids such as hydrogen chloride, hydrogen bromide, sulfuric acid, and phosphoric acid, and organic acids such as acetic acid, lactic acid, citric acid, tartaric acid, maleic acid, fumaric acid, and monomethyl sulfuric acid.
  • bases that form such salts include metal hydroxides or carbonates such as sodium, potassium, and calcium, inorganic bases such as ammonia, ethylenediamine, propylenediamine, ethanolamine, Examples include organic bases such as monoalkylethanolamine, dialkylethanolamine, diethanolamine, and triethanolamine.
  • the salt may be a hydrate (hydrated salt).
  • At least one amino acid selected from the group consisting of glycine, alanine, serine, proline, asparagine, aspartic acid and glutamic acid are collectively referred to as “the present invention.
  • the amount of amino acids to be reduced may be reduced.
  • “reduced” means less than the amount used in a general medium, and to the extent that long-term growth culture of mesenchymal stem cells is possible. It means that the content is kept low.
  • Examples of the amount used in a general medium include 133 to 667 ⁇ M for glycine, 50 to 400 ⁇ M for alanine, 238 to 400 ⁇ M for serine, 150 to 400 ⁇ M for proline, and asparagine. 50 to 400 ⁇ M, 50 to 400 ⁇ M for aspartic acid, and 50 to 510 ⁇ M for glutamic acid.
  • the basal medium used in preparing the medium of the present invention and the additives added thereto do not contain the reduced amino acids of the present invention or are reduced according to the present invention. It is preferable that an operation for removing low molecules such as amino acids is performed.
  • the medium of the present invention is substantially free of at least one of the amino acids to be reduced of the present invention, more preferably all seven.
  • “Substantially free” means using a basal medium and an additive thereof that do not contain the amino acid to be reduced of the present invention or have been subjected to an operation for removing small molecules such as the amino acid to be reduced of the present invention.
  • This means that the final concentration of the reduced amino acid of the present invention in the medium of the present invention is kept as low as possible, and preferably the concentration in the medium of the present invention is the detection limit.
  • concentrations are:
  • the amino acid can be detected by an amino acid analysis method based on the ninhydrin method (see, for example, Clinical Chemistry (1997), Vol. 43, No.
  • the “concentration below the detection limit” means a concentration that cannot be detected by the amino acid analysis method based on the ninhydrin method.
  • concentration of each amino acid in the reduced amino acids of the present invention include glycine less than 5 ⁇ M, preferably less than 1 ⁇ M, more preferably less than 0.8 ⁇ M, alanine less than 5 ⁇ M, preferably less than 1 ⁇ M, more preferably Is less than 0.8 ⁇ M, serine is less than 3 ⁇ M, preferably less than 0.7 ⁇ M, more preferably less than 0.4 ⁇ M, proline is less than 5 ⁇ M, preferably less than 1 ⁇ M, more preferably less than 0.7 ⁇ M, and asparagine is less than 1 ⁇ M, preferably Is less than 0.1 ⁇ M, more preferably less than 0.06 ⁇ M, aspartic acid is less than 2 ⁇ M, preferably less than
  • the amount thereof is reduced for 1, 2, 3, 4, 5, 6 or 7 of the 7 amino acids to be reduced of the present invention. Any combination of amino acids may be used when the amount of amino acids is reduced. In a preferred embodiment, the amount of all seven amino acids is reduced in the medium of the present invention.
  • the content of amino acids other than the amino acid to be reduced in the present invention in the medium of the present invention is not particularly limited as long as it does not inhibit the growth of mesenchymal stem cells, and the concentration used for normal cell culture is appropriately adopted. obtain.
  • the medium of the present invention may be a basal medium known per se and is not particularly limited as long as it does not inhibit the growth of mesenchymal stem cells.
  • DMEM fetal calf serum
  • EMEM fetal calf serum
  • IMDM Scove's Modified Dulbecco's Medium
  • GMEM Glasgow's MEM
  • RPMI-1640 ⁇ -MEM
  • a medium modified for mesenchymal stem cell culture a mixture of the above basal medium and another medium, or the like may be used. If desired, the medium may be subjected to an operation for removing low molecules such as the reduced amino acids of the present invention.
  • the medium of the present invention can contain additives known per se.
  • the additive is not particularly limited as long as it does not inhibit the proliferation of mesenchymal stem cells.
  • a growth factor such as insulin
  • an iron source such as transferrin
  • a polyamine such as putrescine
  • a mineral For example, sodium selenate, etc.
  • sugars eg, glucose, etc.
  • organic acids eg, pyruvic acid, lactic acid, etc.
  • amino acids other than the amino acids to be reduced eg, L-glutamine, etc.
  • reducing agents eg, 2-mercapto) Ethanol, etc.
  • vitamins eg ascorbic acid, d-biotin etc.
  • steroids eg ⁇ -estradiol, progesterone etc.
  • antibiotics eg streptomycin, penicillin, gentamicin etc.
  • buffers eg HEPES etc.
  • additives known per se that have been conventionally used for culturing mesenchymal stem cells can also be included as appropriate. Each additive is preferably contained within a concentration range known per se.
  • the medium of the present invention may contain serum.
  • the serum is not particularly limited as long as it is an animal-derived serum, as long as it does not inhibit the growth of mesenchymal stem cells, but is preferably a mammal-derived serum (eg, fetal bovine serum, human serum, etc.), and more Human serum is preferable.
  • the serum concentration may be within a concentration range known per se.
  • mesenchymal stem cells after culture are used for medical purposes, other animal-derived components may become infection sources of blood-borne pathogens and heterologous antigens, so a medium that does not contain serum is also preferably used. obtain.
  • serum In the case where serum is not included, an alternative additive of serum (for example, Knockout Serum Replacement (KSR) (Invitrogen), Chemically-defined Lipid concentrated (Gibco), etc.) may be used. It is preferable that the serum and the serum replacement additive are those that do not contain the amino acid to be reduced of the present invention or that have been subjected to an operation for removing low molecules such as the amino acid to be reduced of the present invention.
  • KSR Knockout Serum Replacement
  • Sibco Chemically-defined Lipid concentrated
  • “medium mesenchymal stem cell culture medium containing serum or serum substitute that has been subjected to low-molecular removal treatment without adding the reduced amino acid of the present invention” can be mentioned.
  • An amino acid other than the amino acid to be reduced of the present invention specifically, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, phenylalanine, threonine, tryptophan, and valine may be optionally added to the medium. It is preferable that Further, arginine, cysteine, glutamine and tyrosine may be added if desired, and it is preferable to add them.
  • the medium of the present invention is not suitable because it may cause infection with pathogenic bacteria or become a heterologous antigen. More preferably, no human animal-derived component is contained.
  • the above “operation for removing low molecules such as reduced amino acids of the present invention” can be performed as long as the reduced amino acids of the present invention can be removed while maintaining the desired effect of the sample subjected to the operations.
  • Any method such as dialysis and gel filtration may be used.
  • a reagent used for medium preparation that contains medium components other than amino acids (salts, vitamins, etc.), and an amino acid other than the amino acid to be reduced according to the present invention is necessary for the growth of mesenchymal stem cells.
  • Stem cell means an immature cell having self-renewal ability and differentiation / proliferation ability.
  • Stem cells include subpopulations such as pluripotent stem cells, multipotent stem cells, unipotent stem cells, and the like, depending on differentiation ability.
  • a pluripotent stem cell means a cell having an ability to differentiate into all tissues and cells constituting a living body.
  • a multipotent stem cell means a cell having the ability to differentiate into multiple types of tissues and cells, although not all types.
  • a unipotent stem cell means a cell having the ability to differentiate into a specific tissue or cell.
  • the mesenchymal stem cells targeted in the present invention are a kind of multipotent stem cells that can differentiate into adipocytes, bone cells, chondrocytes, muscle cells, hepatocytes, nerve cells, and the like, such as ES cells and iPS cells. Unlike pluripotent stem cells, it is known as a cell having a low possibility of forming a tumor when transplanted into a living body.
  • the mesenchymal stem cell in the present invention may be a mesenchymal stem cell collected from bone marrow, and may preferably be positive for one or more mesenchymal stem cell markers (eg, CD73, CD90, CD105, etc.), more preferably.
  • molecules that are positive for the marker and that are not expressed in mesenchymal stem cells May be negative for the expression of molecules that are positive for the marker and that are not expressed in mesenchymal stem cells.
  • molecules that are not expressed in mesenchymal stem cells include CD45, CD34, CD14, CD11b, CD79, CD19, HLA-DR, and the like.
  • the medium of the present invention can be suitably used for the growth of mesenchymal stem cells derived from any animal.
  • Mesenchymal stem cells that can be cultured using the medium of the present invention include, for example, rodents such as mice, rats, hamsters, and guinea pigs, rabbits such as rabbits, pigs, cows, goats, horses, sheep, and the like. It is a mesenchymal stem cell derived from a primate such as a hoofed eye, a dog or a cat, a human, a monkey, a rhesus monkey, a marmoset, an orangutan, or a chimpanzee, and preferably a mesenchymal stem cell derived from a human.
  • the medium of the present invention is preferably a medium for growth culture of mesenchymal stem cells.
  • the “medium for growth culture” is a medium that enables the cells to replicate (ie, proliferate) while maintaining the self-renewal ability and differentiation multipotency of mesenchymal stem cells. Therefore, the mesenchymal stem cells cultured in the medium of the present invention are characterized by maintaining their proliferation ability.
  • proliferative ability means that the ability to divide cells is not lost due to cell senescence or the like.
  • the majority of cells in culture (for example, 60% in the cell composition) , Preferably 70%, more preferably 80%, even more preferably 90%, most preferably 100% of cells) are negative for cell senescence markers (eg increased senescence-related ⁇ -galactosidase activity, etc.)
  • the majority of the cells in it (eg, 60%, preferably 70%, more preferably 80%, even more preferably 90%, most preferably 100% of the cells in the cell composition) are G1, S, When it belongs to either G2 or M phase, it can be said that the cell maintains the proliferative ability.
  • mesenchymal stem cells can be efficiently cultured in the long term while maintaining the proliferation ability.
  • the culture medium of the present invention enables mesenchymal stem cells to be cultured while maintaining the proliferation ability for 50 days or more, preferably 70 days or more, more preferably 87 days or more, and even more preferably 118 days or more.
  • the proliferation ability of mesenchymal stem cells is not lost, a large amount of mesenchymal stem cells can be obtained by culturing.
  • the culture medium of the present invention it is possible to obtain a larger amount of mesenchymal stem cells than in the past, and for example, it is possible to obtain mesenchymal stem cells that are 1230 times the number of cells at the start of culture.
  • the mesenchymal stem cells cultured in the medium of the present invention have the same degree of differentiation into bone cells as compared to mesenchymal stem cells cultured in the conventional medium.
  • Differentiation into bone cells is performed, for example, in a bone differentiation induction medium (for example, DMEM medium supplemented with 10 (v / v)% FBS, 100 nM dexamethasone, 50 ⁇ M L-ascorbic acid-2-phosphate, 10 mM ⁇ -glycerophosphate). It can be performed by culturing mesenchymal stem cells. Whether or not they have differentiated into bone cells can be confirmed by detecting the deposition of calcium ions in the bone tissue by Arizalin Red staining.
  • mesenchymal stem cells cultured in the medium of the present invention have the same level of differentiation ability into chondrocytes as compared to mesenchymal stem cells cultured in conventional media.
  • Differentiation into chondrocytes can be performed, for example, by adding 10 ng / mL TGF- ⁇ 3 to a cartilage differentiation kit (Lonza: PT-3003). Whether or not they have differentiated into chondrocytes can be confirmed, for example, by detecting the production of glucosaminoglycan using a commercially available glucosaminoglycan measurement kit or the like.
  • the mesenchymal stem cells cultured in the medium of the present invention can have an increased ability to differentiate into adipocytes compared to mesenchymal stem cells cultured in conventional media.
  • Differentiation into adipocytes can be achieved, for example, by adding a fat differentiation induction medium (for example, 10 (v / v)% FBS, 0.01 mg / mL insulin, 1 ⁇ M dexamethasone, 0.2 mM indomethacin, 0.5 mM isobutylmethylxanthine. It can be achieved by culturing mesenchymal stem cells in a glucose-containing DMEM medium). Whether or not they have differentiated into adipocytes can be confirmed, for example, by detecting the production of triglyceride using a commercially available triglyceride measurement kit or the like.
  • the present invention provides a method for culturing mesenchymal stem cells (hereinafter sometimes referred to as “the culture method of the present invention”), which comprises the step of culturing mesenchymal stem cells in the medium of the present invention. To do.
  • the incubator used for culturing mesenchymal stem cells is not particularly limited as long as it can cultivate mesenchymal stem cells. Flask, tissue culture flask, dish, petri dish, tissue culture dish, multi-dish , Microplates, microwell plates, multiplates, multiwell plates, microslides, chamber slides, petri dishes, tubes, trays, culture bags, and roller bottles.
  • the incubator may be cell-adhesive or non-cell-adhesive and is appropriately selected according to the purpose.
  • the cell-adhesive incubator can be coated with any cell-supporting substrate such as an extracellular matrix (ECM) for the purpose of improving adhesion with cells on the surface of the incubator.
  • ECM extracellular matrix
  • the substrate for cell support can be any substance intended for adhesion of mesenchymal stem cells, such as Matrigel using ECM, collagen, gelatin, poly-L-lysine, poly-D-lysine, laminin, fibronectin, etc. Is mentioned.
  • the culture temperature is not particularly limited, but may be about 30-40 ° C., preferably about 37 ° C.
  • the CO 2 concentration can be about 1-10%, preferably about 2-5%.
  • the oxygen concentration can be 1-20%, preferably 1-10%.
  • the culture method of the present invention may further comprise a step of growing mesenchymal stem cells over 50 days, preferably 70 days or more, more preferably 87 days or more, and even more preferably 118 days or more.
  • a large amount of mesenchymal stem cells can be obtained by performing the long-term culture. For example, cells at the start of culture It is possible to obtain mesenchymal stem cells that are 1230 times the number of cells.
  • the present invention also provides a cell composition obtained by the culture method of the present invention (hereinafter also referred to as “cell composition of the present invention”).
  • cell composition of the present invention Most of the cell composition of the present invention (for example, 60%, preferably 70%, more preferably 80%, still more preferably 90%, most preferably 100% of cells in the cell composition) is undifferentiated. It is preferably a mesenchymal stem cell. Examples of known markers for mesenchymal stem cells include CD73, CD90 and CD105. Therefore, the cell composition of the present invention is mostly composed of 60%, preferably 70%, more preferably 80%, more preferably 90%, most preferably 100% of cells in the cell composition. , CD73, CD90 and CD105, preferably any two combinations, more preferably positive for all three markers.
  • the cell composition of the present invention does not express a molecule that is not expressed in mesenchymal stem cells.
  • Molecules that are not expressed in mesenchymal stem cells include, for example, CD45 (expressed in hematopoietic stem cells), CD34 (expressed in hematopoietic stem cells), CD14 (expressed in monocytes, macrophages), CD11b (monocytes, Expressed in macrophages, NK cells, granulocytes), CD79 (expressed in B cells), CD19 (expressed in B cells) and HLA-DR (expressed in dendritic cells, B cells, monocytes, macrophages), etc. Is mentioned.
  • the cell composition of the present invention comprises a majority (eg, 60%, preferably 70%, more preferably 80%, more preferably 90%, most preferably 100% of the cell composition).
  • Cells are negative for the expression of molecules that are not expressed in mesenchymal stem cells.
  • the cells obtained by the culture method of the present invention can be suitably used for medical purposes such as cell medicine.
  • the cells can be used in an undifferentiated state or after being differentiated into bone cells, chondrocytes, fat cells or the like depending on the target disease.
  • target diseases include lunar bone non-rotating necrosis, femoral head non-rotating necrosis, intractable osteochondritis, lumbar disc herniation, ischemic heart disease, epidermolysis bullosa and the like.
  • the cells can also be used for cosmetic surgery after being differentiated into fat cells.
  • animals that are subject to cell therapy include laboratory animals such as rodents such as mice, rats, hamsters, guinea pigs, and rabbits, domestic animals such as pigs, cows, goats, horses, sheep, minks, dogs, cats, etc. Primates such as pets, humans, monkeys, rhesus monkeys, marmosets, orangutans, chimpanzees, etc., preferably humans.
  • the dose and administration method of the cells in the cell therapy are not particularly limited as long as a desired effect can be obtained, and should be appropriately set according to the disease or symptom to be treated, the animal to be administered, etc. Can do.
  • a medium composed of components (salts, vitamins, etc.) constituting DMEM (Dulbecco's modified Eagle medium, GIBCO) other than amino acids.
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle medium
  • Medium in which 20 kinds of amino acids are added hereinafter sometimes referred to as “Full medium”
  • Full medium or glycine, alanine, serine, proline, asparagine, aspartic acid and glutamic acid.
  • Medium supplemented with 13 types of amino acids hereinafter sometimes referred to as “ ⁇ 7 medium”
  • FBS fetal bovine serum, Life Technologies, Inc.
  • Table 1 shows the concentrations of the above seven amino acids after dialysis in the serum used for the culture, the final concentrations of these amino acids when used when added to the -7 medium, and the concentrations of these amino acids in a general medium. Indicates.
  • Mesenchymal stem cells were cultured in an incubator at 37 ° C. in a 5% CO 2 atmosphere.
  • a fat maintenance medium (10 (v / v)% FBS (Life Technologies: 26400-044), 0.01 mg / mL insulin (Nacalai Tesque: 19251-95) was added. High glucose-containing DMEM medium (GIBCO)) was used. Differentiation culture from mesenchymal stem cells to adipocytes and maintenance culture after differentiation were performed in an incubator at 37 ° C. in a 5% CO 2 atmosphere.
  • Adipocyte differentiation induction and differentiation efficiency measurement Mesenchymal stem cells were seeded at 2 ⁇ 10 5 cells per well of a 6-well plate and cultured until 100% confluent in a mesenchymal stem cell medium. Subsequently, the medium was changed to a fat differentiation induction medium and cultured for 3 days, and then the medium was changed to a fat maintenance medium and further cultured for 3 days. The culture for a total of 6 days with this fat differentiation induction medium and fat maintenance medium was carried out for a total of 18 days for 3 cycles. The cultured cells were fixed with 10% formalin and then subjected to oil red O staining.
  • Thesit registered trademark
  • Thesit (registered trademark) (Lauromacrogol)
  • the triglyceride amount was quantified with a serum triglyceride measurement kit (Sigma: TR0100-1KT).
  • Proteins were quantified using a BCA (bicinchoninic acid) reagent, and the differentiation efficiency for each cell was examined by comparing the amount of triglyceride per amount of protein.
  • Example 1 Effect of promoting cell proliferation of mesenchymal stem cells by short-term culture in -7 medium (FIG. 1)
  • Human mesenchymal stem cells (lot number: OF3825) were cultured in Zero medium, Full medium, or -7 medium for 7 days, and the number of cells was evaluated. The number of cells was measured by CCK assay. A commercially available kit, Cell counting kit-8 (Dojindo), was used, and the operation was performed according to the instruction manual attached to the kit. In the CCK assay, the number of cells is proportional to OD450 nm (vertical axis).
  • Each medium was evaluated in 3 wells. The value of each well was represented by ⁇ , and the average value of 3 wells was represented by ⁇ . It was found that the growth of mesenchymal stem cells was remarkably promoted in the -7 medium as compared with the culture in the Full medium.
  • Example 2 Effect of promoting cell proliferation of mesenchymal stem cells by long-term culture in -7 medium (FIG. 2)
  • Human mesenchymal stem cells (lot number: OF3825) were cultured in -7 medium or Full medium for 70 days, and the cumulative number of cells when cultured in each medium was counted.
  • the cells were detached from the culture vessel by trypsin treatment, mixed with trypan blue, and then the cell suspension was subjected to a hemocytometer to count the number of cells.
  • the number of cells was measured in the same manner in the following examples. Compared with the culture in the Full medium, the number of accumulated cells was significantly increased in the culture in the -7 medium. Therefore, it was shown that the -7 medium is a medium suitable for long-term growth culture of mesenchymal stem cells.
  • Example 3 Effect of promoting cell growth by culturing mesenchymal stem cells of different lots in -7 medium (FIG. 3) Human mesenchymal stem cells of lot number: OF3853 and lot number: OF4266 were cultured in -7 medium or full medium for 30 days, and the cumulative number of cells was counted. For both lots of human mesenchymal stem cells, a significant growth promoting effect was observed with the -7 medium.
  • Example 4 Examination of proliferative culture period in the culture of mesenchymal stem cells in Full medium (FIG. 4) Human mesenchymal stem cells (lot number: BM103) were cultured for 109 days using ⁇ 7 medium or Full medium, and the cumulative number of cells was counted. In the culture with -7 medium, the cumulative number of cells continued to grow without reaching a peak, whereas when cultured in the Full medium, the cumulative number of cells reached a peak after 70 days from the start of the culture. became. In the culture in the Full medium, the final cumulative number of cells was 1230 times the number of cells at the start of the culture by the culture until reaching the peak. Therefore, it was found that the period during which mesenchymal stem cells can be grown and cultured in the Full medium is about 70 days, and the cumulative number of cells in that case is about 1230 times the number of cells at the start of culture.
  • Reference Example 1 Promotion of differentiation of mesenchymal stem cells cultured in -7 medium into adipocytes (FIG. 5) Differentiation into adipocytes, bone cells or chondrocytes using human mesenchymal stem cells (lot numbers: BM103PN2 (FIG. 5A) and BM105PN2 (FIG. 5B)) cultured for 20 to 24 days in ⁇ 7 medium or Full medium Guidance was performed. Regarding differentiation into bone cells and chondrocytes, mesenchymal stem cells cultured in -7 medium showed similar differentiation efficiency compared to those cultured in Full medium.
  • the mesenchymal stem cells cultured in -7 medium had significantly higher differentiation efficiency than those cultured in Full medium (FIG. 5). Therefore, the ⁇ 7 medium enables differentiation into mesenchymal stem cells into bone cells and chondrocytes, while maintaining the same differentiation potential as that of the conventional medium, and enables more efficient differentiation into adipocytes. It was shown to be a culture medium.
  • mesenchymal stem cells can be proliferated and cultured for a long time without aging, and are particularly useful when a large amount of mesenchymal stem cells are required.
  • the mesenchymal stem cells cultured according to the present invention can be suitably used for applications such as cell medicine.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)

Abstract

　本発明は、特別な装置、機材等を用いることなく、従来困難であった間葉系幹細胞の長期間の増殖培養を可能にする手段を提供することを課題とする。　グリシン、アラニン、セリン、プロリン、アスパラギン、アスパラギン酸およびグルタミン酸の７種の非必須アミノ酸が低減された間葉系幹細胞用培地を提供することで上記課題を解決する。

Description

間葉系幹細胞用培地
　本発明は、間葉系幹細胞用培地および間葉系幹細胞の培養方法等に関する。
　間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ；ＭＳＣ）は、成体の骨髄などに存在する体性幹細胞の一種であり、骨、軟骨、脂肪細胞への分化能を有する接着性の細胞と定義される。胚性幹（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｓｔｅｍ；ＥＳ）細胞や人工多能性幹（ｉｎｄｕｃｅｄ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ；ｉＰＳ）細胞などの胚性の幹細胞と異なり、癌化の危険性が極めて少ないと考えられており、再生医療に用いられる細胞材料として、大いに有望視されている。我が国でも、関節疾患を中心に、すでに複数の臨床研究が進められている。
　間葉系幹細胞は、一般に、「老化」する細胞として知られており、培養期間が長く（分裂回数が多く）なると、増殖速度の低下、さらには停止をきたすことが知られている（非特許文献１）。非特許文献１には、低酸素分圧下での培養により、ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）の老化が抑制できるとの報告がなされているが、培地のアミノ酸組成がヒト間葉系幹細胞の老化や増殖にどのような影響を与えるのかは、まったく知られていない。
　特許文献１および特許文献２には、培地からの特定のアミノ酸の除去による幹細胞培養技術の例が開示されている。これらは、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞といった多能性幹細胞に関する技術であり、分化誘導時に残存する未分化状態の細胞を選択的に死滅・除去せしめ、細胞組成物中で分化したものの純度を上げる技術である。今日まで、体性幹細胞、多能性幹細胞を問わず、いかなる幹細胞においても、培地中からの特定のアミノ酸除去が、細胞の老化を抑制したり、増殖を促進したりするような例は知られていない。
特開２００９－１００７０２号公報 ＷＯ２０１２／０５６９９７Ａ１
Ｊｉｎ，　Ｙ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ｒｅｓ　Ｃｏｍｍｕｎ．，　Ｖｏｌ.　３９１，　ｐ．　１４７１－１４７６．
　間葉系幹細胞は、老化する細胞であり、培養期間が長く（分裂回数が多く）なると、増殖速度の低下、さらには停止をきたすことが知られている。従って、十分な細胞数を確保することが容易ではなく、このことが、ヒト間葉系幹細胞の基礎研究、臨床応用を行う上で一つの障害となっている。そこで本発明は、間葉系幹細胞、特に、ヒト間葉系幹細胞を、特別な装置、機材等用いることなく、従来よりも長期間増殖させるための手段を提供することを目的とする。
　本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、グリシン、アラニン、セリン、プロリン、アスパラギン、アスパラギン酸およびグルタミン酸の７種の非必須アミノ酸の量が低減された培養液中でヒト間葉系幹細胞を培養すると、該非必須アミノ酸の量が低減されていない通常の培養液中で培養した場合よりも長期間の増殖培養が可能となり、より多くの間葉系幹細胞が得られることを見出した。
　以上の知見に基づき本発明が完成された。即ち、本発明は以下の通りである。
［１］少なくとも１種のアミノ酸の濃度が、グリシン５μＭ未満、アラニン５μＭ未満、セリン３μＭ未満、プロリン５μＭ未満、アスパラギン１μＭ未満、アスパラギン酸２μＭ未満、および／またはグルタミン酸３μＭ未満である、間葉系幹細胞用培地。
［２］グリシンが５μＭ未満である、上記［１］に記載の培地。
［３］グリシンが１μＭ未満である、上記［１］に記載の培地。
［４］アラニンが５μＭ未満である、上記［１］～［３］のいずれかに記載の培地。
［５］アラニンが１μＭ未満である、上記［１］～［３］のいずれかに記載の培地。
［６］セリンが３μＭ未満である、上記［１］～［５］のいずれかに記載の培地。
［７］セリンが０．７μＭ未満である、上記［１］～［５］のいずれかに記載の培地。
［８］プロリンが５μＭ未満である、上記［１］～［７］のいずれかに記載の培地。
［９］プロリンが１μＭ未満である、上記［１］～［７］のいずれかに記載の培地。
［１０］アスパラギンが１μＭ未満である、上記［１］～［９］のいずれかに記載の培地。
［１１］アスパラギンが０．１μＭ未満である、上記［１］～［９］のいずれかに記載の培地。
［１２］アスパラギン酸が２μＭ未満である、上記［１］～［１１］のいずれかに記載の培地。
［１３］アスパラギン酸が０．５μＭ未満である、上記［１］～［１１］のいずれかに記載の培地。
［１４］グルタミン酸が３μＭ未満である、上記［１］～［１３］のいずれかに記載の培地。
［１５］グルタミン酸が０．７μＭ未満である、上記［１］～［１３］のいずれかに記載の培地。
［１６］グリシンが５μＭ未満、アラニンが５μＭ未満、セリンが３μＭ未満、プロリンが５μＭ未満、アスパラギンが１μＭ未満、アスパラギン酸が２μＭ未満、およびグルタミン酸が３μＭ未満である、上記［１］に記載の培地。
［１７］グリシンが１μＭ未満、アラニンが１μＭ未満、セリンが０．７μＭ未満、プロリンが１μＭ未満、アスパラギンが０．１μＭ未満、アスパラギン酸が０．５μＭ未満、およびグルタミン酸が０．７μＭ未満である、上記［１］に記載の培地。
［１８］低分子除去処理が施された血清または血清代替物を含有する、上記［１］～［１７］のいずれかに記載の培地。
［１９］前記低分子除去処理が透析により行われる、上記［１８］に記載の培地。
［２０］血清がヒト血清である、上記［１８］または［１９］に記載の培地。
［２１］非ヒト動物由来の成分を含まない、上記［１］～［２０］のいずれかに記載の培地。
［２２］間葉系幹細胞が、ヒト間葉系幹細胞である上記［１］～［２１］のいずれかに記載の培地。
［２３］間葉系幹細胞が、骨髄より採取されたものである上記［２２］に記載の培地。
［２４］上記［１］～［２３］のいずれかに記載の培地で間葉系幹細胞を培養する工程を含む、間葉系幹細胞の培養方法。
［２５］間葉系幹細胞を培養する工程が、間葉系幹細胞を７０日以上に亘り増殖させる工程である、上記［２４］に記載の培養方法。
［２６］上記［２４］または［２５］に記載の培養方法により得られる、細胞組成物。
［２７］ＣＤ７３、ＣＤ９０およびＣＤ１０５からなる群から選択される少なくとも１つのマーカーに陽性である、上記［２６］に記載の細胞組成物。
［２８］ＣＤ７３、ＣＤ９０およびＣＤ１０５からなる群から選択される少なくとも１つのマーカーに陽性であり、かつ、ＣＤ４５、ＣＤ３４、ＣＤ１４、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ７９、ＣＤ１９およびＨＬＡ－ＤＲ陰性である、上記［２６］に記載の細胞組成物。
［２９］上記［２４］または［２５］に記載の培養方法により得られる、細胞医療用の細胞。
［３０］グリシン、アラニン、セリン、プロリン、アスパラギン、アスパラギン酸およびグルタミン酸を添加せず、低分子除去処理が施された血清または血清代替物を含有する間葉系幹細胞用培地。
［３１］ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、トレオニン、トリプトファン、およびバリンを添加する、上記［３０］に記載の培地。
［３２］アルギニン、システイン、グルタミン、およびチロシンをさらに添加する、上記［３１］に記載の培地。
　本発明によれば、これまで困難であった間葉系幹細胞の長期間に亘る増殖培養が可能となる。よって、より多くの間葉系幹細胞を簡便に得ることができ、研究や医療等に用いるために間葉系幹細胞を大量に供給することが可能となる。
図１は、本発明の培地による、ヒト間葉系幹細胞（ロット番号：ＯＦ３８２５）の７日間の培養における細胞増殖促進効果を示す図である。 図２は、本発明の培地による、ヒト間葉系幹細胞（ロット番号：ＯＦ３８２５）の約７０日間の培養における細胞増殖促進効果を示す図である。 図３は、本発明の培地による、ヒト間葉系幹細胞（ロット番号：ＯＦ３８５３およびＯＦ４２６６）の約３０日間における細胞増殖促進効果を示す図である。 図４は、本発明の培地による、ヒト間葉系幹細胞（ロット番号：ＢＭ１０３）の第一継代より１０９日間における細胞増殖促進効果を示す図である。横軸のかっこ内の数字は培養開始からの日数を示す。 図５は、本発明の培地により培養したヒト間葉系幹細胞（ロット番号：ＢＭ１０３ＰＮ２（図５Ａ）およびＢＭ１０５ＰＮ２（図５Ｂ））の、脂肪細胞への分化促進効果を示す図である。
　本発明は、グリシン、アラニン、セリン、プロリン、アスパラギン、アスパラギン酸およびグルタミン酸からなる群より選択される、少なくとも１種のアミノ酸の量が低減された、間葉系幹細胞用培地（以下、「本発明の培地」と略記する場合がある）を提供する。より具体的には、少なくとも１種のアミノ酸の濃度が、グリシン５μＭ未満、アラニン５μＭ未満、セリン３μＭ未満、プロリン５μＭ未満、アスパラギン１μＭ未満、アスパラギン酸２μＭ未満、および／またはグルタミン酸３μＭ未満である、間葉系幹細胞用培地を提供する。
　本明細書中に記載されるアミノ酸は、Ｌ－体、Ｄ－体、ＤＬ－体いずれをも意味し、またそれぞれのアミノ酸の遊離体のみならず、塩の形態をも意味する。
　塩の形態には酸付加塩や塩基との塩等を挙げることができ、細胞毒性を示さず、医薬品として許容される塩であることが好ましい。そのような塩を形成する酸としては、例えば、塩化水素、臭化水素、硫酸、リン酸等の無機酸、酢酸、乳酸、クエン酸、酒石酸、マレイン酸、フマル酸又はモノメチル硫酸等の有機酸が挙げられ、また、そのような塩を形成する塩基としては、例えば、ナトリウム、カリウム、カルシウム等の金属の水酸化物あるいは炭酸化物や、アンモニア等の無機塩基、エチレンジアミン、プロピレンジアミン、エタノールアミン、モノアルキルエタノールアミン、ジアルキルエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン等の有機塩基が挙げられる。上記塩は水和物（含水塩）であってもよい。
　本発明の培地中においては、グリシン、アラニン、セリン、プロリン、アスパラギン、アスパラギン酸およびグルタミン酸からなる群より選択される、少なくとも１種のアミノ酸（以下、これら７種のアミノ酸をまとめて、「本発明の低減されるアミノ酸」と記載する場合がある）の量が低減されている。本明細書中、「低減されている」とは、一般的な培地に使用されている量に比べ少ないことを意味し、且つ間葉系幹細胞の長期間の増殖培養を可能とする程度にその含有量が低く抑えられていることを意味する。一般的な培地に使用されている量としては、例えば、グリシンであれば１３３～６６７μＭ、アラニンであれば５０～４００μＭ、セリンであれば２３８～４００μＭ、プロリンであれば１５０～４００μＭ、アスパラギンであれば５０～４００μＭ、アスパラギン酸であれば５０～４００μＭ、グルタミン酸であれば５０～５１０μＭが挙げられる。アミノ酸の量の低減を実現するために、本発明の培地を作製する際に使用する基礎培地およびそれに添加される添加物は、本発明の低減されるアミノ酸を含まないかまたは本発明の低減されるアミノ酸等の低分子を除去する操作が施されたものであることが好ましい。また、好ましい態様において、本発明の培地は本発明の低減されるアミノ酸の少なくとも１種、より好ましくは７種全てを実質的に含有しない。「実質的に含有しない」とは、本発明の低減されるアミノ酸を含まないかまたは本発明の低減されるアミノ酸等の低分子を除去する操作が施された、基礎培地およびその添加物を用いることで、本発明の培地中における本発明の低減されるアミノ酸の培養の際の最終濃度が可能な限り低く抑えられていることを意味し、好ましくは、本発明の培地中の濃度が検出限界以下の濃度である。アミノ酸の検出は、ニンヒドリン法によるアミノ酸分析方法（例えば、Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９７）,Ｖｏｌ．４３，Ｎｏ．８，ｐ１４２１－１４２８を参照）等により行うことができる。アミノ酸の検出法としてニンヒドリン法を用いた場合、「検出限界以下の濃度」とは、ニンヒドリン法によるアミノ酸分析方法により検出できない程度の濃度を意味する。本発明の低減されるアミノ酸における各アミノ酸の濃度の具体的な例としては、グリシンが５μＭ未満、好ましくは１μＭ未満、より好ましくは０．８μＭ未満、アラニンが５μＭ未満、好ましくは１μＭ未満、より好ましくは０．８μＭ未満、セリンが３μＭ未満、好ましくは０．７μＭ未満、より好ましくは０．４μＭ未満、プロリンが５μＭ未満、好ましくは１μＭ未満、より好ましくは０．７μＭ未満、アスパラギンが１μＭ未満、好ましくは０．１μＭ未満、より好ましくは０．０６μＭ未満、アスパラギン酸が２μＭ未満、好ましくは０．５μＭ未満、より好ましくは０．１５μＭ未満、グルタミン酸が３μＭ未満、好ましくは０．７μＭ未満、より好ましくは０．５μＭ未満が挙げられる。
　本発明の培地中においては、本発明の低減されるアミノ酸７種の内の１、２、３、４、５、６または７種についてその（それらの）量が低減されており、複数種のアミノ酸の量が低減されている場合は、いずれのアミノ酸の組合せであってもよい。好ましい態様において、本発明の培地中においては、７種全てのアミノ酸の量が低減されている。
　本発明の低減されるアミノ酸以外のアミノ酸の、本発明の培地における含有量に関しては、間葉系幹細胞の増殖を阻害しない限り特に限定されず、通常の細胞培養に使用される濃度を適宜採用し得る。
　本発明の培地には、自体公知の基礎培地を用いることができ、間葉系幹細胞の増殖を阻害しない限り特に限定されないが、例えば、ＤＭＥＭ、ＥＭＥＭ、ＩＭＤＭ（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ）、ＧＭＥＭ（Ｇｌａｓｇｏｗ’ｓ　ＭＥＭ）、ＲＰＭＩ－１６４０、α－ＭＥＭ、Ｈａｍ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ　Ｆ－１２、Ｈａｍ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ　Ｆ－１０、Ｈａｍ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ　Ｆ１２Ｋ、Ｍｅｄｉｕｍ　１９９、ＡＴＣＣ－ＣＲＣＭ３０、ＤＭ－１６０、ＤＭ－２０１、ＢＭＥ、Ｆｉｓｃｈｅｒ、ＭｃＣｏｙ’ｓ　５Ａ、Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ’ｓ　Ｌ－１５、ＲＩＴＣ８０－７、ＭＣＤＢ１０５、ＭＣＤＢ１０７、ＭＣＤＢ１３１、ＭＣＤＢ１５３、ＭＣＤＢ２０１、ＮＣＴＣ１０９、ＮＣＴＣ１３５、Ｗａｙｍｏｕｔｈ’ｓ　ＭＢ７５２／１、ＣＭＲＬ－１０６６、Ｗｉｌｌｉａｍｓ’　ｍｅｄｉｕｍ　Ｅ、Ｂｒｉｎｓｔｅｒ’ｓ　ＢＭＯＣ－３　Ｍｅｄｉｕｍ、Ｅ８　ｍｅｄｉｕｍ（Ｎａｔｕｒｅ　Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１１，８，４２４－４２９）、ＲｅｐｒｏＦＦ２培地（リプロセル社）、及びこれらの混合培地等が挙げられる。また、間葉系幹細胞培養用に改変された培地や、上記基礎培地と他の培地との混合物等を用いてもよい。所望により、これらの培地に対し、本発明の低減されたアミノ酸等の低分子を除去する操作を施してもよい。
　本発明の培地には、自体公知の添加物を含むことができる。添加物としては、間葉系幹細胞の増殖を阻害するものでない限り特に限定されないが、例えば、成長因子（例えばインスリン等）、鉄源（例えばトランスフェリン等）、ポリアミン類（例えばプトレシン等）、ミネラル（例えばセレン酸ナトリウム等）、糖類（例えばグルコース等）、有機酸（例えばピルビン酸、乳酸等）、本発明の低減されるアミノ酸以外のアミノ酸（例えばＬ－グルタミン等）、還元剤（例えば２－メルカプトエタノール等）、ビタミン類（例えばアスコルビン酸、ｄ－ビオチン等）、ステロイド（例えばβ－エストラジオール、プロゲステロン等）、抗生物質（例えばストレプトマイシン、ペニシリン、ゲンタマイシン等）、緩衝剤（例えばＨＥＰＥＳ等）等、脂質類（例えばリノール酸等）、核酸類（例えばチミジン等）が挙げられる。また、従来から間葉系幹細胞の培養に用いられてきた自体公知の添加物も適宜含むことができる。添加物は、それぞれ自体公知の濃度範囲内で含まれることが好ましい。
　本発明の培地には、血清が含まれていてもよい。血清としては、動物由来の血清であれば、間葉系幹細胞の増殖を阻害するものでない限り特に限定されないが、好ましくは哺乳動物由来の血清（例えばウシ胎仔血清、ヒト血清等）であり、より好ましくはヒト血清である。血清の濃度は、自体公知の濃度範囲内であればよい。更に、培養後の間葉系幹細胞を医療目的で使用する場合、他の動物由来成分は血液媒介病原菌の感染源や異種抗原となる可能性があるため、血清を含まない培地も好適に使用し得る。血清を含まない場合、血清の代替添加物（例えばＫｎｏｃｋｏｕｔ　Ｓｅｒｕｍ　Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ－ｄｅｆｉｎｅｄ　Ｌｉｐｉｄ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ（Ｇｉｂｃｏ）等）を用いてもよい。上記血清および血清代替添加物は、本発明の低減されるアミノ酸を含有しないもの、あるいは本発明の低減されるアミノ酸等の低分子を除去する操作が施されたものであることが好ましい。
　即ち、本発明の培地の一例として、「本発明の低減されるアミノ酸を添加せず、低分子除去処理が施された血清または血清代替物を含有する間葉系幹細胞用培地」が挙げられる。当該培地には、本発明の低減されるアミノ酸以外のアミノ酸、具体的には、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、トレオニン、トリプトファンおよびバリンが所望により添加されていてもよく、また添加されていることが好ましい。さらに所望によりアルギニン、システイン、グルタミンおよびチロシンが添加されていてもよく、また添加されていることが好ましい。
　本発明の培地により培養された間葉系幹細胞を細胞医療等の医療目的で使用する場合、病原菌の感染を起こしたり、異種抗原となったりする可能性があるため、本発明の培地には非ヒト動物由来成分が含まれないことがより好ましい。
　上記の「本発明の低減されるアミノ酸等の低分子を除去する操作」は、該操作に供される試料の所望の効果を維持しつつ本発明の低減されるアミノ酸を除去できるのであれば、どのように行われてもよいが、透析やゲル濾過等の操作が挙げられる。具体例として、培地作製に使用する試薬であって、アミノ酸以外の培地成分（塩類、ビタミン等）を含有する試薬に、本発明の低減されるアミノ酸以外のアミノ酸を間葉系幹細胞の増殖に必要な濃度で添加し、さらに、透析、ゲル濾過等の操作によって、本発明の低減されるアミノ酸およびその他の低分子を除去した血清等を添加する方法が挙げられる。
　「幹細胞」とは、自己複製能及び分化／増殖能を有する未熟な細胞を意味する。幹細胞には、分化能力に応じて、多能性幹細胞（pluripotent stem cell）、複能性幹細胞（multipotent stem cell）、単能性幹細胞（unipotent stem cell）等の亜集団が含まれる。多能性幹細胞とは、生体を構成する全ての組織や細胞へ分化し得る能力を有する細胞を意味する。複能性幹細胞とは、全ての種類ではないが、複数種の組織や細胞へ分化し得る能力を有する細胞を意味する。単能性幹細胞とは、特定の組織や細胞へ分化し得る能力を有する細胞を意味する。
　本発明において対象とする間葉系幹細胞は、脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞、筋細胞、肝細胞、神経細胞等に分化可能な複能性幹細胞の一種であり、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞と異なり、生体に移植した際に腫瘍を形成する可能性が低い細胞として知られている。本発明における間葉系幹細胞は、骨髄より採取された間葉系幹細胞であり得、好ましくは、１以上の間葉系幹細胞マーカー（例えば、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５等）陽性であり得、より好ましくは、該マーカー陽性であり、かつ、間葉系幹細胞で発現が認められない分子の発現が陰性であり得る。間葉系幹細胞で発現が認められない分子の例としては、ＣＤ４５、ＣＤ３４、ＣＤ１４、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ７９、ＣＤ１９、ＨＬＡ－ＤＲ等が挙げられる。
　本発明の培地は、いずれの動物由来の間葉系幹細胞の増殖にも好適に使用することができる。本発明の培地を使用して培養され得る間葉系幹細胞は、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類、ウサギ等のウサギ目、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の有蹄目、イヌ、ネコ等のネコ目、ヒト、サル、アカゲザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類等由来の間葉系幹細胞であり、好ましくは、ヒト由来の間葉系幹細胞である。
　本発明の培地は、好ましくは、間葉系幹細胞の増殖培養用培地である。「増殖培養用培地」とは、間葉系幹細胞の自己複製能や分化複能性を維持した状態で該細胞の複製（即ち、増殖）を可能にする培地である。よって、本発明の培地により培養された間葉系幹細胞は、増殖能を維持していることを特徴とする。本明細書中、「増殖能」とは、細胞老化等により細胞分裂を行う能力が失われていないことを意味し、例えば、培養中の細胞の大部分（例えば、細胞組成物中の６０％、好ましくは７０％、より好ましくは８０％、さらに好ましくは９０％、最も好ましくは１００％の細胞）が細胞老化マーカー（例えば、老化関連β－ガラクトシダーゼ活性の上昇等）陰性である場合や、培養中の細胞の大部分（例えば、細胞組成物中の６０％、好ましくは７０％、より好ましくは８０％、さらに好ましくは９０％、最も好ましくは１００％の細胞）が細胞周期のＧ１、Ｓ、Ｇ２またはＭ期のいずれかに属する場合、該細胞は増殖能を維持しているということができる。
　本発明の培地によれば、増殖能を維持したまま長期に効率よく間葉系幹細胞の培養を行うことが可能となる。例えば、本発明の培地により、５０日以上、好ましくは７０日以上、より好ましくは８７日以上、さらに好ましくは１１８日以上の間、増殖能を維持したまま間葉系幹細胞の培養が可能である。また、本発明の培地によれば、間葉系幹細胞の増殖能が失われないため、培養により多量の間葉系幹細胞を得ることが可能となる。本発明の培地を用いることで、従来に比し大量の間葉系幹細胞を得ることができ、例えば、培養開始時の１２３０倍以上の細胞数の間葉系幹細胞を得ることができる。
　本発明の培地で培養された間葉系幹細胞は、従来の培地で培養された間葉系幹細胞と比較して、同程度の骨細胞への分化能を有する。骨細胞への分化は、例えば、骨分化誘導培地（例えば、１０（ｖ／ｖ）％　ＦＢＳ、１００ｎＭ　デキサメタゾン、５０μＭ　Ｌ－アスコルビン酸－２リン酸、１０ｍＭ　β－グリセロリン酸を添加したＤＭＥＭ培地）で間葉系幹細胞を培養することにより行うことができる。骨細胞へ分化したか否かは、Ａｒｉｚａｌｉｎ　Ｒｅｄ染色により骨組織中のカルシウムイオンの沈着を検出することで確認できる。また、本発明の培地で培養された間葉系幹細胞は、従来の培地で培養された間葉系幹細胞と比較して、同程度の軟骨細胞への分化能を有する。軟骨細胞への分化は、例えば、軟骨分化キット（ロンザ社：ＰＴ－３００３）に１０ｎｇ／ｍＬ　ＴＧＦ－β３を添加して用いることにより行うことができる。軟骨細胞へ分化したか否かは、例えば、市販のグルコサミノグリカン測定キット等によりグルコサミノグリカンの産生を検出することで確認できる。さらに、本発明の培地で培養された間葉系幹細胞は、従来の培地で培養された間葉系幹細胞と比較して、脂肪細胞への分化能が亢進され得る。脂肪細胞への分化は、例えば、脂肪分化誘導培地（例えば、１０（ｖ／ｖ）％　ＦＢＳ、０．０１ｍｇ／ｍＬ　インスリン、１μＭ　デキサメタゾン、０．２ｍＭ　インドメタシン、０．５ｍＭ　イソブチルメチルキサンチンを添加した高グルコース含有ＤＭＥＭ培地）で間葉系幹細胞を培養することで成し得る。脂肪細胞へ分化したか否かは、例えば、市販のトリグリセリド測定キット等を用いてトリグリセリドの産生を検出することで確認することができる。
　一態様において、本発明は、本発明の培地で間葉系幹細胞を培養する工程を含む、間葉系幹細胞の培養方法（以下、「本発明の培養方法」と記載する場合がある）を提供する。
　間葉系幹細胞の培養に用いられる培養器は、間葉系幹細胞の培養が可能なものであれば特に限定されないが、フラスコ、組織培養用フラスコ、ディッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウエルプレート、マルチプレート、マルチウエルプレート、マイクロスライド、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、及びローラーボトルが挙げられ得る。
　培養器は、細胞接着性であっても細胞非接着性であってもよく、目的に応じて適宜選ばれる。細胞接着性の培養器は、培養器の表面の細胞との接着性を向上させる目的で、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）等の任意の細胞支持用基質でコーティングされたものであり得る。細胞支持用基質は、間葉系幹細胞の接着を目的とする任意の物質であり得、ＥＣＭを用いたマトリゲル、あるいはコラーゲンやゼラチン、ポリ－Ｌ－リジン、ポリ－Ｄ－リジン、ラミニン、フィブロネクチン等が挙げられる。
　その他の培養条件は、適宜設定できる。例えば、培養温度は、特に限定されるものではないが約３０～４０℃、好ましくは約３７℃であり得る。ＣＯ２濃度は、約１～１０％、好ましくは約２～５％であり得る。酸素濃度は、１～２０％、好ましくは１～１０％であり得る。
　好ましい態様において、本発明の培養方法は、５０日以上、好ましくは７０日以上、より好ましくは８７日以上、さらに好ましくは１１８日以上に亘り間葉系幹細胞を増殖させる工程をさらに含み得る。本発明の培養方法によれば、間葉系幹細胞の増殖能が失われないため、前記長期間の培養を行うことで多量の間葉系幹細胞を得ることができ、例えば、培養開始時の細胞数の１２３０倍以上の細胞数の間葉系幹細胞を得ることが可能である。
　本発明は、本発明の培養方法により得られる細胞組成物（以下、「本発明の細胞組成物」とも記載する）をも提供する。本発明の細胞組成物は、その大部分（例えば、細胞組成物中の６０％、好ましくは７０％、より好ましくは８０％、さらに好ましくは９０％、最も好ましくは１００％の細胞）が未分化な間葉系幹細胞であることが好ましい。間葉系幹細胞の公知のマーカーの例として、ＣＤ７３、ＣＤ９０およびＣＤ１０５が挙げられる。従って、本発明の細胞組成物は、その大部分（例えば、細胞組成物中の６０％、好ましくは７０％、より好ましくは８０％、さらに好ましくは９０％、最も好ましくは１００％の細胞）が、ＣＤ７３、ＣＤ９０およびＣＤ１０５のいずれか１つ、好ましくはいずれか２つの組合せ、より好ましくは３つ全てのマーカーに陽性であることが好ましい。さらに、本発明の細胞組成物は、間葉系幹細胞では発現が認められない分子を発現していないことがより好ましい。間葉系幹細胞で発現が認められない分子としては、例えば、ＣＤ４５（造血幹細胞において発現する）、ＣＤ３４（造血幹細胞において発現する）、ＣＤ１４（単球、マクロファージにおいて発現する）、ＣＤ１１ｂ（単球、マクロファージ、ＮＫ細胞、顆粒球において発現する）、ＣＤ７９（Ｂ細胞において発現する）、ＣＤ１９（Ｂ細胞において発現する）およびＨＬＡ－ＤＲ（樹状細胞、Ｂ細胞、単球、マクロファージにおいて発現する）などが挙げられる。よって、好ましい態様において、本発明の細胞組成物は、その大部分（例えば、細胞組成物中の６０％、好ましくは７０％、より好ましくは８０％、さらに好ましくは９０％、最も好ましくは１００％の細胞）が、間葉系幹細胞で発現が認められない分子の発現陰性である。
　本発明の培養方法によって得られた細胞は、細胞医療等の医療用に好適に使用し得る。該細胞は、対象疾患等に応じて、未分化のまま、または骨細胞、軟骨細胞もしくは脂肪細胞等へ分化させた後に、使用することができる。対象疾患としては、例えば、月状骨無腐性壊死、大腿骨頭無腐性壊死、難断性骨軟骨炎、腰椎椎間板ヘルニア、虚血性心疾患、表皮水疱症等が挙げられる。また、該細胞は、脂肪細胞へ分化させた後、美容整形用に使用することも可能である。
　当該細胞医療の対象となる動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類やウサギ等の実験動物、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、ミンク等の家畜、イヌ、ネコ等のペット、ヒト、サル、アカゲザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類等が挙げられ、好ましくはヒトである。
　上記細胞医療における細胞の投与量および投与方法は、所望の効果が得られるのであれば特に制限されず、治療対象となる疾患や症状の程度、投与対象となる動物等に応じて適宜設定することができる。
　以下に実施例を示して、本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
（材料と方法）
１．細胞
　ＬＯＮＺＡ社より購入した、正常ヒトドナーから採取、調製されたヒト間葉系幹細胞（カタログ番号：ＰＴ－２５０１）、および本発明者らが自主採取したヒト間葉系幹細胞（ロット番号：ＢＭ１０３～１０４）を使用した。
２．間葉系幹細胞の培養
　間葉系幹細胞の培養においては、アミノ酸以外のＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ　ｍｅｄｉｕｍ、ＧＩＢＣＯ）を構成する成分（塩類、ビタミンなど）からなる培地（以下、「Ｚｅｒｏ培地」と表記される場合がある）、これに２０種類のアミノ酸を添加した培地（以下、「Ｆｕｌｌ培地」と表記される場合がある）、もしくは、グリシン、アラニン、セリン、プロリン、アスパラギン、アスパラギン酸およびグルタミン酸を除いた１３種類のアミノ酸を添加した培地（以下、「－７培地」と表記される場合がある）、それぞれの培地に、透析により低分子を除去したＦＢＳ（ｆｅｔａｌ　ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｒｕｍ、ライフテクノロジーズ社：２６４００－０４４）を１０（ｖ／ｖ）％となるように添加し、使用した。
　表１には、培養に使用した血清中における透析後の、上記７種アミノ酸の濃度、これらアミノ酸の、－７培地に添加した際の使用時の最終濃度、一般的な培地におけるこれらアミノ酸の濃度を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　間葉系幹細胞の培養は、３７℃、５％　ＣＯ２雰囲気下のインキュベーター内で行った。
３．脂肪細胞への分化培養および脂肪細胞の維持培養
　間葉系幹細胞から脂肪細胞への分化は、脂肪分化誘導培地（１０（ｖ／ｖ）％　ＦＢＳ（ライフテクノロジーズ社：２６４００－０４４）、０．０１ｍｇ／ｍＬ　インスリン（ナカライテスク社：１９２５１－９５）、１μＭ　デキサメタゾン（シグマ社：Ｄ２９１５）、０．２ｍＭ　インドメタシン（シグマ社：Ｉ７３７８）、０．５ｍＭ　イソブチルメチルキサンチン（シグマ社：Ｉ７０１８）を添加した高グルコース含有ＤＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ））を使用して行った。脂肪細胞への分化後の培養は、脂肪維持培地（１０（ｖ／ｖ）％　ＦＢＳ（ライフテクノロジーズ社：２６４００－０４４）、０．０１ｍｇ／ｍＬ　インスリン（ナカライテスク社：１９２５１－９５）を添加した高グルコース含有ＤＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ））を使用して行った。
　間葉系幹細胞から脂肪細胞への分化培養および分化後の維持培養は、３７℃、５％　ＣＯ２雰囲気下のインキュベーター内で行った。
４．脂肪細胞分化誘導と分化効率の測定
　間葉系幹細胞を、６ウェルプレートの１ウェルあたり２ｘ１０５細胞を播種し、間葉系幹細胞用培地にて１００％コンフルエントになるまで培養を行った。続いて脂肪分化誘導培地へ培地交換し、３日間培養した後に、脂肪維持培地へ培地交換し、更に３日間培養を行った。この脂肪分化誘導培地と脂肪維持培地による計６日間の培養を、３サイクル合計１８日間実施した。
　培養後の細胞を１０％　ホルマリンにて固定した後、オイルレッドＯ染色に供した。続いて細胞を０．１％　Ｔｈｅｓｉｔ（登録商標）（ラウロマクロゴール）に溶解し、血清トリグリセリド測定キット（シグマ社：ＴＲ０１００－１ＫＴ）にてトリグリセリド量を定量した。ＢＣＡ（ビシンコニン酸）試薬を用いてタンパク質を定量し、タンパク質量当たりのトリグリセリド量を比較することで、細胞ごとの分化効率を検討した。
（結果）
実施例１：－７培地での短期間培養による、間葉系幹細胞の細胞増殖促進効果（図１）
　Ｚｅｒｏ培地、Ｆｕｌｌ培地または－７培地でヒト間葉系幹細胞（ロット番号：ＯＦ３８２５）を７日間培養し、細胞数を評価した。細胞数の計測はＣＣＫアッセイにより行った。市販のキットであるCell counting kit-8 (Dojindo)を使用し、キット付属の使用説明書に順じて操作を行った。ＣＣＫアッセイでは、ＯＤ４５０ｎｍ（縦軸）に細胞数が比例する。各培地につき３ウェルで評価を行い、各ウェルの値を○で、３ウェルの平均値を●で表した。Ｆｕｌｌ培地で培養した場合に比べ、－７培地では間葉系幹細胞の増殖が顕著に促進されていることを見出した。
実施例２：－７培地での長期間培養による、間葉系幹細胞の細胞増殖促進効果（図２）
　－７培地またはＦｕｌｌ培地でヒト間葉系幹細胞（ロット番号：ＯＦ３８２５）を７０日間培養し、それぞれの培地で培養したときの累積細胞数を計測した。継代時に、細胞をトリプシン処理で培養容器から剥がし、トリパンブルーと混和した後、細胞懸濁液を血球計算盤に供し、細胞数を計測した。細胞数の計測は、以下の実施例においても同様の方法で行った。Ｆｕｌｌ培地で培養した場合に比べ、－７培地で培養した場合は累積細胞数が顕著に増大した。従って、－７培地は、間葉系幹細胞の長期に渡る増殖培養に適した培地であることが示された。
実施例３：異なるロットの間葉系幹細胞の、－７培地での培養による細胞増殖促進効果（図３）
　ロット番号：ＯＦ３８５３およびロット番号：ＯＦ４２６６のヒト間葉系幹細胞を、－７培地またはＦｕｌｌ培地において３０日間培養し、累積細胞数を計測した。両ロットのヒト間葉系幹細胞について、－７培地による顕著な増殖促進効果が認められた。
実施例４：Ｆｕｌｌ培地による間葉系幹細胞の培養における、増殖培養可能期間の検討（図４）
　－７培地またはＦｕｌｌ培地を用いて、ヒト間葉系幹細胞（ロット番号：ＢＭ１０３）を１０９日間培養し、それぞれ累積細胞数を計測した。－７培地での培養では、累積細胞数が頭打ちとはならずに、増殖し続けたのに対し、Ｆｕｌｌ培地で培養した場合は、培養開始から７０日目以降は累積細胞数がほぼ頭打ちとなった。Ｆｕｌｌ培地での培養において、頭打ちとなるまでの培養により、最終的な累積細胞数は培養開始時の細胞数の１２３０倍であった。よって、Ｆｕｌｌ培地による間葉系幹細胞の増殖培養可能な期間は、およそ７０日間で、その場合の累積細胞数は培養開始時の細胞数の１２３０倍程度であることが明らかとなった。
参考例１：－７培地で培養した間葉系幹細胞の、脂肪細胞への分化促進（図５）
　－７培地またはＦｕｌｌ培地で２０日～２４日間培養したヒト間葉系幹細胞（ロット番号：ＢＭ１０３ＰＮ２（図５Ａ）およびＢＭ１０５ＰＮ２（図５Ｂ））を用いて、脂肪細胞、骨細胞または軟骨細胞への分化誘導を行った。骨細胞および軟骨細胞への分化に関しては、－７培地で培養した間葉系幹細胞は、Ｆｕｌｌ培地で培養したものと比べ、同程度の分化効率を示した。脂肪細胞への分化に関しては、－７培地で培養した間葉系幹細胞は、Ｆｕｌｌ培地で培養したものと比べ、分化効率が顕著に高かった（図５）。よって、－７培地は、間葉系幹細胞の骨細胞および軟骨細胞への分化に関しては従来の培地と同程度の分化能を維持しつつ、従来よりも効率のよい脂肪細胞への分化を可能とする培地であることが示された。
　本発明によれば、間葉系幹細胞を老化させることなく長期間増殖培養を行うことが可能で、多量の間葉系幹細胞が必要となる場合に特に有用である。本発明により培養された間葉系幹細胞は、細胞医療等の用途に好適に使用し得る。
　本出願は、日本で出願された特願２０１４－１６８５８０（出願日２０１４年８月２１日）を基礎としておりその内容は本明細書に全て包含されるものである。

Claims (29)

  1. 　少なくとも１種のアミノ酸の濃度が、グリシン５μＭ未満、アラニン５μＭ未満、セリン３μＭ未満、プロリン５μＭ未満、アスパラギン１μＭ未満、アスパラギン酸２μＭ未満、および／またはグルタミン酸３μＭ未満である、間葉系幹細胞用培地。
  2. 　グリシンが５μＭ未満である、請求項１に記載の培地。
  3. 　グリシンが１μＭ未満である、請求項１に記載の培地。
  4. 　アラニンが５μＭ未満である、請求項１に記載の培地。
  5. 　アラニンが１μＭ未満である、請求項１に記載の培地。
  6. 　セリンが３μＭ未満である、請求項１に記載の培地。
  7. 　セリンが０．７μＭ未満である、請求項１に記載の培地。
  8. 　プロリンが５μＭ未満である、請求項１に記載の培地。
  9. 　プロリンが１μＭ未満である、請求項１に記載の培地。
  10. 　アスパラギンが１μＭ未満である、請求項１に記載の培地。
  11. 　アスパラギンが０．１μＭ未満である、請求項１に記載の培地。
  12. 　アスパラギン酸が２μＭ未満である、請求項１に記載の培地。
  13. 　アスパラギン酸が０．５μＭ未満である、請求項１に記載の培地。
  14. 　グルタミン酸が３μＭ未満である、請求項１に記載の培地。
  15. 　グルタミン酸が０．７μＭ未満である、請求項１に記載の培地。
  16. 　グリシンが５μＭ未満、アラニンが５μＭ未満、セリンが３μＭ未満、プロリンが５μＭ未満、アスパラギンが１μＭ未満、アスパラギン酸が２μＭ未満、およびグルタミン酸が３μＭ未満である、請求項１に記載の培地。
  17. 　グリシンが１μＭ未満、アラニンが１μＭ未満、セリンが０．７μＭ未満、プロリンが１μＭ未満、アスパラギンが０．１μＭ未満、アスパラギン酸が０．５μＭ未満、およびグルタミン酸が０．７μＭ未満である、請求項１に記載の培地。
  18. 　低分子除去処理が施された血清または血清代替物を含有する、請求項１～１７のいずれか１項に記載の培地。
  19. 　前記低分子除去処理が透析により行われる、請求項１８に記載の培地。
  20. 　血清がヒト血清である、請求項１８または１９に記載の培地。
  21. 　非ヒト動物由来の成分を含まない、請求項１～２０のいずれか１項に記載の培地。
  22. 　間葉系幹細胞が、ヒト間葉系幹細胞である請求項１～２１のいずれか１項に記載の培地。
  23. 　間葉系幹細胞が、骨髄より採取されたものである請求項２２に記載の培地。
  24. 　請求項１～２３のいずれか１項に記載の培地で間葉系幹細胞を培養する工程を含む、間葉系幹細胞の培養方法。
  25. 　間葉系幹細胞を培養する工程が、間葉系幹細胞を７０日以上に亘り増殖させる工程である、請求項２４に記載の培養方法。
  26. 　請求項２４または２５に記載の培養方法により得られる、細胞組成物。
  27. 　ＣＤ７３、ＣＤ９０およびＣＤ１０５からなる群から選択される少なくとも１つのマーカーに陽性である、請求項２６に記載の細胞組成物。
  28. 　ＣＤ７３、ＣＤ９０およびＣＤ１０５からなる群から選択される少なくとも１つのマーカーに陽性であり、かつ、ＣＤ４５、ＣＤ３４、ＣＤ１４、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ７９、ＣＤ１９およびＨＬＡ－ＤＲ陰性である、請求項２６に記載の細胞組成物。
  29. 　請求項２４または２５に記載の培養方法により得られる、細胞医療用の細胞。 
PCT/JP2015/073349 2014-08-21 2015-08-20 間葉系幹細胞用培地 WO2016027850A1 (ja)

Priority Applications (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020177007657A KR102415441B1 (ko) 2014-08-21 2015-08-20 간엽계 줄기 세포용 배지
JP2016544246A JP6940837B2 (ja) 2014-08-21 2015-08-20 間葉系幹細胞用培地
EP15833662.8A EP3184627B1 (en) 2014-08-21 2015-08-20 Culture medium for mesenchymal stem cells
CA2958533A CA2958533C (en) 2014-08-21 2015-08-20 Culture medium for mesenchymal stem cells
CN201580044799.7A CN106715683A (zh) 2014-08-21 2015-08-20 间充质干细胞用培养基
US15/435,705 US10947508B2 (en) 2014-08-21 2017-02-17 Culture medium for mesenchymal stem cells

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2014-168580 2014-08-21
JP2014168580 2014-08-21

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US15/435,705 Continuation US10947508B2 (en) 2014-08-21 2017-02-17 Culture medium for mesenchymal stem cells

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2016027850A1 true WO2016027850A1 (ja) 2016-02-25

Family

ID=55350791

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2015/073349 WO2016027850A1 (ja) 2014-08-21 2015-08-20 間葉系幹細胞用培地

Country Status (7)

Country Link
US (1) US10947508B2 (ja)
EP (1) EP3184627B1 (ja)
JP (2) JP6940837B2 (ja)
KR (1) KR102415441B1 (ja)
CN (1) CN106715683A (ja)
CA (1) CA2958533C (ja)
WO (1) WO2016027850A1 (ja)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017188403A1 (ja) * 2016-04-27 2017-11-02 ロート製薬株式会社 Ｃｄ２０１、ｃｄ４６、ｃｄ５６、ｃｄ１４７及びｃｄ１６５からなる群より選択される少なくとも１種の細胞表面マーカーを発現する間葉系幹細胞及びその調製方法、並びに上記間葉系幹細胞を含む医薬組成物及びその調製方法
WO2018181342A1 (ja) * 2017-03-28 2018-10-04 味の素株式会社 未分化維持培地添加剤
JP2022035915A (ja) * 2020-08-21 2022-03-04 遵義医科大学附属医院 抗ヒト間葉系幹細胞老化およびその幹細胞性特徴増強方法
WO2023127824A1 (ja) 2021-12-27 2023-07-06 住友ファーマ株式会社 神経堤細胞の培養方法及び製造方法
WO2024158058A1 (ja) * 2023-01-27 2024-08-02 株式会社Rainbow 自動培養装置における細胞増殖制御方法

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPWO2021220731A1 (ja) 2020-04-30 2021-11-04
CN112300985B (zh) * 2020-11-03 2022-07-01 中国人民解放军陆军军医大学第一附属医院 一种快速提升哺乳类动物骨髓间充质干细胞增殖效率的增殖培养基及增殖培养方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006325445A (ja) * 2005-05-24 2006-12-07 Toyobo Co Ltd 間葉系幹細胞増殖培地
EP2083071A1 (en) * 2008-01-25 2009-07-29 Cell Med Research GMBH Medium for propagating and expanding stem cells
WO2013032052A1 (ko) * 2011-08-31 2013-03-07 세원셀론텍(주) 중간엽 줄기세포 기본 배양 배지 조성방법, 중간엽 줄기세포 기본 배양 배지 및 이를 이용하여 배양분화된 세포치료제
WO2013081436A1 (ko) * 2011-12-01 2013-06-06 주식회사 알앤엘바이오 줄기세포를 젊게 만들기 위한 배지 조성물
JP2013530721A (ja) * 2010-07-16 2013-08-01 アールエヌエル バイオ カンパニー リミテッド 羊膜由来間葉幹細胞培養用の培地組成物及びこれを利用した羊膜由来間葉幹細胞の培養方法

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4211766A (en) * 1972-07-10 1980-07-08 Ab Bonnierforetagen Cancer associated polypeptide antigen compositions
DE3702197C2 (de) 1987-01-15 1993-12-23 Kuebler Siegfried Tennisschläger
WO2008049281A1 (fr) * 2006-10-27 2008-05-02 Beijing Institute Of Transfusion Medicine Procédé de construction d'une construction de génie tissulaire hépatique et construction de génie tissulaire hépatique
WO2009014272A1 (en) * 2007-07-20 2009-01-29 Dongguk University Industry-Academic Cooperation Foundation Method for the preparation of dermal papilla tissue employing mesenchymal stem cells
JP5257971B2 (ja) 2007-10-25 2013-08-07 国立大学法人 千葉大学 胚性幹細胞から肝芽細胞を得る方法
EP2186883A1 (en) * 2008-11-04 2010-05-19 Fresenius Medical Care An isolated multipotent mesenchymal stem cell from human adult glomeruli (hGL-MSC), a method of preparing thereof and uses thereof in the regenerative medicine of the kidney
EP2644694B1 (en) 2010-10-28 2018-07-11 National University Corporation Kumamoto University Method and culture medium for improving pluripotent stem cell differentiation inducing efficiency
CN101984048A (zh) * 2010-11-24 2011-03-09 中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所 一种培养间充质干细胞的培养基
US9321995B2 (en) 2012-12-20 2016-04-26 Suzhou Biowisetech Co., Ltd. Stem cell culture medium and its applications as well as a stem cell culture method
CN103060264B (zh) * 2012-12-20 2015-01-21 上海市第十人民医院 一种干细胞培养基及其应用和干细胞培养方法
CN103146755A (zh) * 2013-02-28 2013-06-12 中国人民解放军第二军医大学 体外慢病毒介导bmp-2基因诱导滑膜间充质干细胞向软骨细胞分化的方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006325445A (ja) * 2005-05-24 2006-12-07 Toyobo Co Ltd 間葉系幹細胞増殖培地
EP2083071A1 (en) * 2008-01-25 2009-07-29 Cell Med Research GMBH Medium for propagating and expanding stem cells
JP2013530721A (ja) * 2010-07-16 2013-08-01 アールエヌエル バイオ カンパニー リミテッド 羊膜由来間葉幹細胞培養用の培地組成物及びこれを利用した羊膜由来間葉幹細胞の培養方法
WO2013032052A1 (ko) * 2011-08-31 2013-03-07 세원셀론텍(주) 중간엽 줄기세포 기본 배양 배지 조성방법, 중간엽 줄기세포 기본 배양 배지 및 이를 이용하여 배양분화된 세포치료제
WO2013081436A1 (ko) * 2011-12-01 2013-06-06 주식회사 알앤엘바이오 줄기세포를 젊게 만들기 위한 배지 조성물

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHOI, KYUNG-MIN ET AL.: "Effect of essential and nonessential amino acid compositions on the in vitro behavior of human mesenchymal stem cells", KOREAN JOURNAL OF CHEMICAL ENGINEERING, vol. 24, no. 6, 2007, pages 1058 - 1063, XP009500244 *
HIGUERA, GUSTAVO A. ET AL.: "Patterns of Amino Acid Metabolism by Proliferating Human Mesenchymal Stem Cells", TISSUE ENGINEERING. PART A, vol. 18, no. 5-6, 2012, pages 654 - 664, XP055407451 *
See also references of EP3184627A4 *

Cited By (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017188403A1 (ja) * 2016-04-27 2017-11-02 ロート製薬株式会社 Ｃｄ２０１、ｃｄ４６、ｃｄ５６、ｃｄ１４７及びｃｄ１６５からなる群より選択される少なくとも１種の細胞表面マーカーを発現する間葉系幹細胞及びその調製方法、並びに上記間葉系幹細胞を含む医薬組成物及びその調製方法
JPWO2017188403A1 (ja) * 2016-04-27 2019-03-07 ロート製薬株式会社 Ｃｄ２０１、ｃｄ４６、ｃｄ５６、ｃｄ１４７及びｃｄ１６５からなる群より選択される少なくとも１種の細胞表面マーカーを発現する間葉系幹細胞及びその調製方法、並びに上記間葉系幹細胞を含む医薬組成物及びその調製方法
US11179420B2 (en) 2016-04-27 2021-11-23 Rohto Pharmaceutical Co., Ltd. Method for treating a disease, comprising administering mesenchymal stem cells or culture supernatant thereof to a subject
JP7108537B2 (ja) 2016-04-27 2022-07-28 ロート製薬株式会社 Ｃｄ２０１、ｃｄ４６、ｃｄ５６、ｃｄ１４７及びｃｄ１６５からなる群より選択される少なくとも１種の細胞表面マーカーを発現する間葉系幹細胞及びその調製方法、並びに上記間葉系幹細胞を含む医薬組成物及びその調製方法
JP2022120128A (ja) * 2016-04-27 2022-08-17 ロート製薬株式会社 Ｃｄ２０１、ｃｄ４６、ｃｄ５６、ｃｄ１４７及びｃｄ１６５からなる群より選択される少なくとも１種の細胞表面マーカーを発現する間葉系幹細胞及びその調製方法、並びに上記間葉系幹細胞を含む医薬組成物及びその調製方法
JP7407864B2 (ja) 2016-04-27 2024-01-04 ロート製薬株式会社 Ｃｄ２０１、ｃｄ４６、ｃｄ５６、ｃｄ１４７及びｃｄ１６５からなる群より選択される少なくとも１種の細胞表面マーカーを発現する間葉系幹細胞及びその調製方法、並びに上記間葉系幹細胞を含む医薬組成物及びその調製方法
WO2018181342A1 (ja) * 2017-03-28 2018-10-04 味の素株式会社 未分化維持培地添加剤
JP2022035915A (ja) * 2020-08-21 2022-03-04 遵義医科大学附属医院 抗ヒト間葉系幹細胞老化およびその幹細胞性特徴増強方法
JP7119044B2 (ja) 2020-08-21 2022-08-16 遵義医科大学附属医院 抗ヒト間葉系幹細胞老化およびその幹細胞性特徴増強方法
WO2023127824A1 (ja) 2021-12-27 2023-07-06 住友ファーマ株式会社 神経堤細胞の培養方法及び製造方法
KR20240125943A (ko) 2021-12-27 2024-08-20 스미토모 파마 가부시키가이샤 신경능 세포의 배양 방법 및 제조 방법
WO2024158058A1 (ja) * 2023-01-27 2024-08-02 株式会社Rainbow 自動培養装置における細胞増殖制御方法

Also Published As

Publication number Publication date
JP6940837B2 (ja) 2021-09-29
CA2958533A1 (en) 2016-02-25
US20170198258A1 (en) 2017-07-13
JP2020124218A (ja) 2020-08-20
JPWO2016027850A1 (ja) 2017-06-01
KR20170042367A (ko) 2017-04-18
JP6944165B2 (ja) 2021-10-06
CA2958533C (en) 2023-03-14
EP3184627A4 (en) 2018-04-18
CN106715683A (zh) 2017-05-24
US10947508B2 (en) 2021-03-16
EP3184627B1 (en) 2020-12-23
EP3184627A1 (en) 2017-06-28
KR102415441B1 (ko) 2022-07-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6944165B2 (ja) 間葉系幹細胞用培地
JP7410899B2 (ja) 間葉系幹細胞の細胞培養法
AU2011277156B2 (en) Culture medium composition for culturing amnion-derived mesenchymal stem cell, and method for culturing amnion-derived mesenchymal stem cell by using same
BR112014020119A2 (pt) cultura de células-tronco mesenquimais
CN101984048A (zh) 一种培养间充质干细胞的培养基
AU2019316431A1 (en) Method for producing dental pulp-derived cells
JP2021040551A (ja) 培地組成物、キット、間葉系幹細胞組成物の製造方法、間葉系幹細胞組成物、間葉系幹細胞、細胞培養上清および細胞外小胞
JP6634822B2 (ja) 幹細胞の培養用培地
KR101753557B1 (ko) 줄기세포 증식 향상 배지 조성물 및 줄기세포의 배양방법
JP2006325445A (ja) 間葉系幹細胞増殖培地
Wang et al. Epidermal growth factor can optimize a serum-free culture system for bone marrow stem cell proliferation in a miniature pig model
WO2020067502A1 (ja) 動物細胞の培養用添加物、培養用培地および培養方法
JP2012044914A (ja) 幹細胞の未分化維持剤及び増殖促進剤
WO2024195863A1 (ja) 間葉系幹細胞増殖促進剤、間葉系幹細胞用培地、間葉系幹細胞及び培養上清
WO2023149351A1 (en) Method for preparing cells for treating diseases, method for promoting migration ability of cells, method for promoting proliferation ability of cells, and cells obtained by these methods
WO2024117199A1 (ja) 組成物、細胞の生産方法、細胞、細胞の培養方法および組成物の生産方法
Ha et al. Research Article Human Dental Pulp-Derived Mesenchymal Stem Cell Potential to Differentiate into Smooth Muscle-Like Cells In Vitro

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 15833662

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2016544246

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2958533

Country of ref document: CA

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

REEP Request for entry into the european phase

Ref document number: 2015833662

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2015833662

Country of ref document: EP

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 20177007657

Country of ref document: KR

Kind code of ref document: A