WO2013032052A1 - 중간엽 줄기세포 기본 배양 배지 조성방법, 중간엽 줄기세포 기본 배양 배지 및 이를 이용하여 배양분화된 세포치료제 - Google Patents

중간엽 줄기세포 기본 배양 배지 조성방법, 중간엽 줄기세포 기본 배양 배지 및 이를 이용하여 배양분화된 세포치료제 Download PDF

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장동일
최민정
김장훈
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Definitions

  • the present invention relates to a mesenchymal stem cell basic culture medium derived from bone marrow and fat, and in particular, mesenchymal stem cells using a conventionally commercialized medium in the process of culturing mesenchymal stem cells derived from bone marrow and fat in vitro.
  • mesenchymal stem cells using a conventionally commercialized medium in the process of culturing mesenchymal stem cells derived from bone marrow and fat in vitro.
  • the present invention relates to a method for forming a multi-differentiable mesenchymal stem cell basic culture medium, a mesenchymal stem cell basic culture medium, and a cell therapeutic agent cultured using the same.
  • stem cells in regenerative medicine using tissue engineering has been proposed as a new field for the treatment of intractable disease.
  • the interest in stem cell research is increasing, and stem cells capable of forming tissues through proliferation and differentiation are recognized to be able to solve tissue damage as well as treat most diseases.
  • Stem cells have branching ability in undifferentiated state and have the property of differentiating into specific cells under appropriate conditions. Stem cells can be divided into embryonic stem cells and adult stem cells, depending on their origin. Since human embryonic stem cells are obtained from embryos that can occur in human life, they have excellent cell proliferation and differentiation but have bioethical problems. Adult stem cells are limited in their differentiation capacity compared with embryonic stem cells, but cells already existing in various organs of the human body are collected from bone marrow, blood, brain, and skin, and developed into stem cells.
  • Mesenchymal stem cells were first isolated from adult bone marrow (Y. Jiang et al ., Nature , 418: 41, 2002) and then mesenchymal stems such as bone marrow from skin, blood vessels, muscle and brain tissue. Cells were identified (JG Toma et al ., Nat. Cell Biol. , 3: 778, 2001; M. Sampaloesi et al ., Science , 301: 487, 2003; Y. Jiang et al ., Hematol ., 30 : 896, 2002). In addition, adipose-derived stem cells, which have differentiation potential as bone marrow, have recently been identified from adipose tissue (B.
  • mesenchymal stem cells are very rarely present in adult tissues such as bone marrow and adipose tissue, and these cells have low proliferation rate in undifferentiated state and are difficult to maintain for a long time in undifferentiated state.
  • the disadvantage is that it is difficult to do.
  • Mammalian cell culture medium consists of about 50 kinds of components, which are largely used for the biosynthesis of cells, the parts used for biological energy metabolism, as a catalyst for various metabolism or physiological phenomena in cells. It can be divided into parts used to control.
  • the medium used for cell culture is composed of isotonic solution components, buffer components, nutrients including amino acids, vitamins, and inorganic salts as energy sources, and various other supplements.
  • the cell by supplying about 5 to 20% of serum according to the characteristics of the cell, it supplies various hormones, growth factors, fats, and vitamins suitable for cell proliferation, inhibits protease activity, and acts as a buffer for pH control. Promotes the growth and activity of mammalian cells.
  • the components constituting the medium for culturing mammalian cells vary depending on the type of medium in terms of concentration as well as its composition. In this way, around 1950 Morgan (Morgan et al .) Made M119 medium based on the composition of the humor and cultured the primary chick (Morgan, et al ., 1950).
  • Types of culture media are largely the Minimal essential medium (MEM) (Eagle, 1955), Rosewel Park Memorial Institute (RPMI) -1640 (Moore et al ., 1967), and Dulbecco's modification of Eagle's medium (DMEM) (Dulbecoo, et al. , 1959) and more complex media such as Iscove's modification of DMEM (IMDM), Ham's F-12 (Ham, 1965), and Connaught Medical Research Laboratories (CMRL) -1666. It can be divided into media enriched in various components.
  • MEM Minimal essential medium
  • RPMI Rosewel Park Memorial Institute
  • DMEM Dulbecco's modification of Eagle's medium
  • IMDM Iscove's modification of DMEM
  • Ham's F-12 Ham's F-12
  • CMRL Connaught Medical Research Laboratories
  • the growth curve of mammalian cells usually has a Lag phase of 2 to 3 days and the concentration of viable cells decreases rapidly from the end of the delay phase due to the accumulation of ammonium glutamine and lactic acid, a glucose metabolite. .
  • Glucose and glutamine are the main carbon and energy sources for mammalian cells.
  • glucose is metabolized by mammalian cells, it passes through glycolysis to become pyrubic acid.
  • the nucleic acid is synthesized by making a pentose sugar by the pentose phosphate pathway.
  • the pyruvic acid produced in glycolysis is decomposed into carbon dioxide and water by the TCA cycle, into lactic acid, and also fatty acid.
  • Glutamine is a part of the metabolic process, which becomes glutamate, and glutamate enters the TCA cycle, creating a carbon skeleton for the synthesis of other amino acids.
  • Important excreta from mammalian cells are lactic acid and ammonia, and the release of alanine is also important. Lactate and ammonia are toxic to cells because they change the pH of the cells and the lysosomes. As such, since the physiological mechanism and nutritional requirements are different depending on the type of cells cultured, the type of medium used for cell culture should also vary according to characteristics.
  • the composition of the medium suitable for the growth conditions of undifferentiated mesenchymal stem cells will be different.
  • Patent document 1 mass production method of growth factors using mesenchymal stem cells
  • DMEM mesenchymal stem cells
  • Ham's F-12 is added to promote differentiation of growth factors from mesenchymal stem cells to significantly increase human growth factors.
  • Serum-free medium that is engineered to synthesize is described, but this is based on basic fibroblast growth factor, vascular endothelial growth factor, or mesenchymal stem cell growth from mesenchymal stem cells rather than proliferation of mesenchymal stem cells in basal medium containing DMEM and Ham's F-12. It is for mass production of human transformation growth factor-beta.
  • Patent document 2 (medium composition for in vitro proliferation of cord blood-derived mesenchymal stem cells containing soy protein hydrolyzate) is a component of the stem cell culture medium in order to reduce the amount of fetal bovine serum soy protein hydrolyzate to fetal bovine serum It relates to a technique of adding to the low glucose DMEM medium contained.
  • Patent document 3 (method of producing dermal papilla tissue using mesenchymal stem cells) and patent document 4 (method of preparing dermal papilla tissue using mesenchymal stem cells) are described in DMEM medium, DMEM / F- 12, F-12, McCoy's 5A, RPMI 1640 medium, William's medium E (Williams' medium E) or IMDMve's Modified Dulbecco's Modification (IMDM) medium, and then cultured as a technique for inducing differentiation into dermal papilla tissue
  • the present invention relates to a medium in which hydrocortisone, insulin, insulin, transferrin, and sodium selenite are added to the culture medium.
  • Patent document 5 (mesenchymal stem cell culture medium and a method for culturing mesenchymal stem cells using the same) is based on a medium in which a nutrient mixture (Nutrient Mixture) is mixed with a commercially available medium, and additionally, a growth factor of mesenchymal stem cells It is a technology for culturing by adding insulin, hydrocortisone, EGF, LIF, GM-CSF, etc., and is a culture technology for mixing a nutrient mixture in a commercially available culture medium.
  • a nutrient mixture Nutrient Mixture
  • Patent Document 6 Multipotent Stem Cells Derived from Human Adipose Tissue and Cell Therapeutic Agents Containing It Proliferates mesenchymal stem cells by adding Keratinocyte-SFM medium containing NAC, rEGF, BPE, insulin, etc. based on DMEM medium
  • Keratinocyte-SFM medium containing NAC, rEGF, BPE, insulin, etc.
  • the basic cell culture medium is DMEM medium.
  • Patent Document 7 pharmaceutical prevention or treatment pharmaceutical composition comprising a culture of adult stem cells or fractions thereof
  • Patent Document 8 isolated pluripotent adult stem cells and methods for their isolation and culture
  • DMEM / Ham's F-12 It is a technique for culturing mesenchymal stem cells using a mixed medium, DMEM medium and DMEM / F-12.
  • the conventional techniques are limited to a technique of culturing by adding an additive such as a growth factor based on a commercially available medium.
  • Patent Document 9 (cartilage cell specific culture method for early culturing cartilage cells) applied and registered by the present applicant has developed a culture medium in which additives such as growth factors are not added to conventional commercialized media.
  • ABSM-C early chondrocyte culture medium
  • Patent Document 1 Republic of Korea Patent Registration 10-0899329
  • Patent Document 2 Republic of Korea Patent Publication 10-2009-0090850
  • Patent Document 3 Republic of Korea Patent Registration 10-1022032
  • Patent Document 4 Republic of Korea Patent Publication 10-2010-0110905
  • Patent Document 5 Republic of Korea Patent Registration 10-0908481
  • Patent Document 6 Republic of Korea Patent Registration 10-0679642
  • Patent Document 7 Republic of Korea Patent Publication 10-2009-0121541
  • Patent Document 8 Republic of Korea Patent Publication 10-2006-0010847
  • Patent Document 9 Republic of Korea Patent Registration 10-1037002
  • an object of the present invention is to provide a mesenchymal stem cell basic culture medium capable of proliferating and culturing large numbers of undifferentiated mesenchymal stem cells derived from adult tissues such as human bone marrow and adipose tissue at a rapid growth rate.
  • Another object of the present invention is to differentiate the undifferentiated mesenchymal stem cells derived from adult tissues in vitro into osteoblasts, chondrocytes, and adipocytes using mesenchymal stem cell basic culture medium to differentiate into undifferentiated cells.
  • mesenchymal stem cell basic culture medium to differentiate into undifferentiated cells.
  • An object of the present invention described above is to analyze the types of components of the commercialized culture medium, and then to prepare a variety of candidate base culture medium composition by combining two or more types of culture medium, and intermediate candidate candidate culture medium composition
  • Mesenchymal stem cell basics comprising screening the basic culture medium composition suitable for the early culture of mesenchymal stem cells by analyzing the proliferation rate of mesenchymal stem cells in the complete medium containing 10-20% fetal bovine serum of mesenchymal stem cells It is achieved by the culture medium composition method.
  • an object of the present invention is a basal medium and DMEM high glucose, RPMI-1640, and Ham's F- mixed with commercially available culture medium DMEM high glucose, RPMI-1640, and Ham's F-12 in a 1: 1: 1 ratio. Comparing each medium of 12, DMEM high glucose medium components as a base component, duplicated components of each medium to select a high concentration, if the component is not included in the DMEM high glucose medium, DMEM high glucose medium, The components contained in only one medium of each medium are maintained at the same concentration. If the ingredients are not included in the DMEM high glucose medium, they are included in the DMEM high glucose medium, and the components of the same source are selected from the components of each medium.
  • one of the selected components is a duplicate of each medium, select a high concentration. If the component is not included in the DMEM high glucose medium, it is included in the DMEM high glucose medium and included in ABM-M (Advanced Basic Media). -Mesenchymal stem cell) is achieved by the mesenchymal stem cell basal culture medium prepared.
  • the components contained in the DMEM high glucose medium is L-Alanine, L-Asparagine Anhydrous, L-Aspartic acid, L-Glutamic acid, L-Hydroxy in amino acids -L-proline, L-Proline, Inorganic Salts are Cupric Sulfate Pentahydrate, Ferrous Sulfate Heptahydrate, Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous, Zinc Sulfate Heptahydrate, and Vitamins (Vitamins) are D-Biotin, P-Aminobenzoic Acid (PABA) ), Vitamine B12, and other components (Hypoxanithine, L-Glutathione Reduced, Linoleic acid, Putrescine + 2HCL, Thioctic Acid, Thymindine).
  • PABA P-Aminobenzoic Acid
  • the ABM-M medium further includes one or more of fetal, calf, horse or human serum, L-glutamine, antibiotics, and antifungal agents.
  • ABM-M medium further comprises 10-20% fetal bovine serum and 2-4mM L-glutamine.
  • one component selected from the same source component is L-Arginine Monobydrochloride, L-Asparatic acid, L-Cystine Dibydrochloride, L-Histidine Monobydrochloride Monobydrate in amino acids.
  • Inorganic salts are Calcium Chloride Dihydrate, Ferrous Sulfate Heptabydrate, Magnesium Sulfate Anbydrous, Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous, and Vitamin (Vitamins) is characterized in that it is Pyridoxal Hydrochloride.
  • ABM-M medium expresses at least 80% of CD166, CD105, CD90, CD44, CD29, CD73, HLA-ABC positive surface markers, but CD44, CD105, CD90, CD73 And CD166 positive surface markers are expressed in more than 95%, CD14, CD31, CD34, CD45, CD80 and HLA-DR negative surface markers characterized in that less than 5%.
  • ⁇ -MEM fetal bovine serum
  • Dexamethasone ß-Glycerophosphate
  • Ascorbic acid after culturing the mesenchymal stem cells in ABM-M (Advanced Basic Media-Mesenchymal stem cell) medium
  • ABM-M Advanced Basic Media-Mesenchymal stem cell
  • an object of the present invention is DMEM low containing Dexamethasone, Ascorbic acid and Sodium pyruvate, TGF- ⁇ , BMP-2 after the mesenchymal stem cells are cultured in ABM-M (Advanced Basic Media-Mesenchymal stem cell) medium It is achieved by a cell therapy for osteoarthritis treatment, characterized in that the culture medium is differentiated again in glucose medium to differentiate into chondrocytes.
  • ABM-M Advanced Basic Media-Mesenchymal stem cell
  • an object of the present invention is cultured in the ⁇ -MEM medium containing fetal bovine serum, Ddexamethasone, Indomethacin, Insulin after culturing mesenchymal stem cells in ABM-M (Advanced Basic Media-Mesenchymal stem cell) medium It is achieved by a cell therapy for adipocytes, characterized in that the differentiation into adipocytes.
  • mesenchymal stem cell basic culture medium of the present invention it is possible to mass-proliferate and culture the undifferentiated mesenchymal stem cells, which are human adult stem cells, at a rapid growth rate, and to maintain the cell karyotype even after prolonged culture growth for 1 month or more. It can be used as a cell therapy by differentiating into derivatives of bone forming cells, chondrocytes, and adipocytes.
  • 1 is a medium containing bone marrow-derived mesenchymal stem cells containing an additive and 10% fetal bovine serum in MSC-BM as a control group, and a medium containing an additive and 10% fetal bovine serum in ABM-M medium of the present invention. Inoculated at a concentration of 375,000 cells in a T75 flask incubated for 10 days, a graph showing the growth of mesenchymal stem cells.
  • Figure 3 is bone marrow-derived mesenchymal stem cells were grown in a medium containing the additive and 10% fetal calf serum in MSC-BM control group and the medium containing the additive and 10% fetal calf serum in ABM-M medium of the present invention Graph showing the proliferation rate of mesenchymal stem cells.
  • Figure 4 is a graph showing the passage-specific proliferation of mesenchymal stem cells propagated in adipose derived mesenchymal stem cells control medium containing ADSCGM and 10% fetal bovine serum in ABM-M medium of the present invention.
  • Figure 5 is bone marrow or fat-derived mesenchymal stem cells cultured in the control group MSCGM medium or ADSCGM medium and bone marrow or fat cultured in a culture medium containing 10% fetal bovine serum and 2mM L-glutamine in ABM-M of the present invention
  • SS derived mesenchymal stem cells
  • Figure 6 is a graph showing the histogram for the immunological cellular characteristics analysis of bone marrow-derived mesenchymal stem cells cultured in a medium containing 10% fetal bovine serum and 2mM L-glutamine in ABM-M medium of the present invention.
  • Figure 7 is a graph showing the histogram for the analysis of immunological cellular characteristics of adipose derived mesenchymal stem cells cultured in a medium containing 10% fetal bovine serum and 2mM L-glutamine in ABM-M medium of the present invention.
  • ABM-M medium 8 is a culture medium for bone marrow cell differentiation after culturing bone marrow and fat-derived mesenchymal stem cells cultured in a medium containing 10% fetal bovine serum and 2 mM L-glutamine in ABM-M medium of the present invention (10 ALPase and von Kossa staining after 2-3 weeks of differentiation and differentiation in ⁇ -MEM medium containing fetal calf serum, 10 mM ⁇ -glycerol phosphate, 50 uM ascorbic acid and 10 -7 M dexamethasone.
  • Figure 9 after culturing the bone marrow and fat-derived mesenchymal stem cells cultured in a medium containing 10% fetal bovine serum and 2mM L-glutamine in ABM-M medium of the present invention, adipocyte differentiation medium (10% right Oil Red-O staining after two weeks of culture differentiation in fetal serum, ⁇ -MEM medium containing 10 -7 M dexamethasone, 100 uM indomethacin and 10 ug / mL insulin.
  • adipocyte differentiation medium (10% right Oil Red-O staining after two weeks of culture differentiation in fetal serum
  • ⁇ -MEM medium containing 10 -7 M dexamethasone 100 uM indomethacin and 10 ug / mL insulin.
  • Figure 10 after culturing bone marrow-derived mesenchymal stem cells cultured in a medium containing 10% fetal bovine serum and 2mM L-glutamine in ABM-M medium of the present invention, to induce differentiation into chondrocytes 5 10 5 Cells were centrifuged at 300 g for 5 minutes to form cell masses, followed by DMEM high glucose medium containing 10 -7 M dexamethasone, 50 uM ascorbic acid, 1 nM sodium pyruvate, 10 ng / mL TGF- ⁇ and 100 ng / mL BMP-2.
  • FIG. 11 is a photograph showing analysis of karyotype after 10 passages of bone marrow-derived mesenchymal stem cells cultured in a medium containing 10% fetal bovine serum and 2 mM L-glutamine in ABM-M medium of the present invention.
  • FIG. 12 is a photograph showing analysis of karyotype after 10 passages of adipose derived mesenchymal stem cells cultured in a medium containing 10% fetal bovine serum and 2 mM L-glutamine in ABM-M medium of the present invention.
  • Figure 13 is a picture of morphological abnormality and adhesion loss of mesenchymal stem cells during cell culture of mesenchymal stem cells in conventional ABM-C medium.
  • the present invention provides a mesenchymal stem cell basic culture medium derived from adult tissues such as bone marrow and adipose, and the mesenchymal stem cell basic culture medium of the present invention is analyzed after analyzing the kinds of components of the commercialized medium, Combining the above medium to prepare a variety of candidate basal culture medium composition, and the mesenchymal stem cells to the candidate basal culture medium composition for the growth rate of mesenchymal stem cells in the complete medium containing 10-20% fetal bovine serum Analyzing and screening a suitable basal culture medium composition of mesenchymal stem cells.
  • mesenchymal stem cell basic culture medium of the present invention prepared as described above, it is analyzed whether the mesenchymal stem cells cultured early at a rapid growth rate show immunological cellular characteristics, and then into osteoblasts, chondrocytes, and adipocytes. Analyze differentiation or differentiation capacity, and analyze cell nuclei to determine whether they can be cultured for a long period of time without mutations due to chromosomal abnormalities, to treat bone loss, to treat osteoarthritis, and to treat adipocytes through adipose tissue formation It can be used as a cell therapy product.
  • the mesenchymal stem cell basic culture medium of the present invention in order to verify whether the mesenchymal stem cell basic culture medium of the present invention can be used as a cell therapy, it is necessary to analyze immunological cell characteristics, differentiation capacity, and cell karyotype. desirable. First, analyzing the immunological cell characteristics of mesenchymal stem cells cultured with the screened medium composition; Analyzing the differentiation capacity of the mesenchymal stem cells cultured with the screened medium composition; And to verify the long-term culture of the mesenchymal stem cells cultured with the screened medium composition to verify the cell karyotype.
  • ABM-M (Advanced Basic Media-Mesenchymal stem cell) medium of the mesenchymal stem cell basic culture medium of the present invention is a 1: 1: 1 ratio of DMEM high glucose, RPMI-1640, and Ham's F-12, which are commercially available culture media.
  • the basal medium mixed with DMEM high glucose medium was prepared, and the basal medium was compared with the medium of DMEM high glucose, RPMI-1640, and Ham's F-12 with DMEM high glucose medium as the base component.
  • the concentration is selected, if it is not included in the DMEM high glucose medium, it is included in the DMEM high glucose medium (Remarks 1 in Table 1), and the components contained in only one medium of each medium are maintained in the same concentration, and the DMEM high glucose medium is If the components are not included in the medium, DMEM high glucose medium (remarks 2 in Table 1), the components of each medium are the same source of the components of the selected one of the components of each medium is duplicated component If select a high concentration, high glucose DMEM medium supplemented with the ingredients is not included in DMEM high glucose medium (remarks of Table 1 3) to be the composition as shown in Table 1 below.
  • the components included in the DMEM high glucose medium which is a basic component of the ABM-M medium of the present invention is included in the amino acid (Amino Acids) L-Alanine, L-Asparagine Anhydrous, L-Aspartic acid, L-Glutamic acid, L-Hydroxy-L-proline, L-Proline, and Inorganic Salts, Cupric Sulfate Pentahydrate, Ferrous Sulfate Heptahydrate, Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous, Zinc Sulfate Heptahydrate, Vitamins) are D-Biotin, P-Aminobenzoic Acid (PABA), Vitamine B12, and other components are Hypoxanithine, L-Glutathione Reduced, Linoleic acid, Putrescine + 2HCL, Thioctic Acid, Thymindine.
  • amino acid Amino Acids
  • PABA P-Aminobenzoic Acid
  • Vitamine B12 and other components are Hypox
  • ABM-M Advanced Basic Media-Mesenchymal stem cell
  • the duplicated component selects a high concentration. If the component is not included in the DMEM high glucose medium, it is included in the remarks column 1 of Table 1 in the DMEM high glucose medium.
  • amino acids Glycine, L-Glutamine, L-Isoleucine, L-Leucine, L-Lysine, L-Methionine, L-Phenylalaine, L-Serine, L-Threonine, L-Tryptophan, L-Tyrosine, L-Valine By selecting the higher concentrations of the major amino acids in the protein enhanced protein synthesis and increased cell proliferation.
  • Inorganic salts Patassium Chloride and Sodium Chloride are related to the intracellular and external osmotic pressures, and the higher components were selected to maintain the proper osmotic pressure.
  • Vitamins Ascorbic Acid Phosphate, Choline Chloride, D-Biotin (in DMEM high glucose medium), D-Ca Pantothenate, Folic Acid, Myo-Inositol, Nicotinamide, Riboflavin, Thiamine Hydrochloride, Vitamine B12 (in DMEM high glucose medium) was selected as a high concentration to remove the waste produced by the high proliferation of cells with antioxidants.
  • the other component, D-Glucose Anhydrous was chosen as the main energy source and the high concentration was chosen as the energy source to maintain high proliferation.
  • Phenol Red Sodium Salt is not related to cell proliferation, but it is a waste product discharged by active cell proliferation, which changes the color of Phenol Red from red to yellow. High concentrations were selected for measurement.
  • Proline is a major component of collagen and a major component of extracellular matrix synthesis. In order to increase the synthesis of collagen in mesenchymal stem cells of high proliferation was included in DMEM high glucose medium.
  • Aspartic acid is found in most proteins and is linked to the citric acid cycle to provide amino groups for purine bases and pyrimidine bases. Therefore, the main sources of DNA synthesis of cells with high proliferation rate were included in DMEM high glucose medium as the main source of purine and pyrimidine bases.
  • L-Glutamic acid is an important amino acid of cellular metabolism and was included in DMEM high glucose medium for the active growth of cells.
  • ABM-C medium composed of DMEM and RPMI-1640 to increase the proliferation rate, cell adhesion was lost.
  • the components of DMEM high glucose medium were included to increase the synthesis of collagen and to remove the waste caused by the increased synthesis.
  • L-Alanine an amino acid involved in cell immunity and synthesis, is included to enhance the proliferation of mesenchymal stem cells, and the amino acid L-Hydroxy-L-Proline, other components Thioctic Acid and Linoleic Acid, and vitamin P -Aminobenzoic Acid (PABA) is a component of intracellular collagen and was included in DMEM high glucose medium to enhance cell adhesion by increasing the synthesis of intracellular collagen.
  • Inorganic salts Cupric Sulfate Penatahydrate and Zinc Sulfate Heptahydrate, and other ingredients, Glutathione Reduced, were included in DMEM high glucose medium to show high cell proliferation rate by further enhancing the release of various apoptosis cells with high proliferation rate as antioxidants.
  • Thymidine Thymidine
  • Putrescine + 2HCL Hypoxanthine
  • components that are the same source are selected by selecting one component and selecting a high concentration if one selected component is a duplicate of each medium, and DMEM high glucose if the component is not included in the DMEM high glucose medium. Inclusion in the medium corresponds to the remarks column 3 in Table 1.
  • L-Arginine L-Asparagine, L-Cysteine / cystine, L-Histidine, Minerals Calcium Chloride / Nitrate, Ferric Nitrage / Ferrous Sulfate, Sodium Phosphate, Vitamins Pyridoxal Hydrochloride / Pyridoxine Hydrochloride
  • the addition of two or more components may increase the osmotic pressure in the medium may adversely affect the cells, so the same components were selected at a single concentration by selecting a high concentration of components.
  • Sodium phosphate was selected as 142.04 mg / L in order to maintain an appropriate osmotic pressure because an exceptionally high concentration could increase the total osmotic pressure of the medium, which could adversely affect the cells.
  • Magnesium Chloride Hexahydrate and Magnesium Sulfate Anhydrous are the source of Magnesium, which is the major substance for intracellular metabolism, and anhydrous Magnesium Sulfate Anhydrous was selected to reduce salt formation in the medium preparation.
  • L-Asparatic acid (20 mg / L) among L-Asparagine Monobydrate and L-Asparatic acid
  • L-Cystine Dibydrochloride (62.6 mg / L) among L-Cysteine Monobydrochloride Monobydrate and L-Cystine Dibydrochloride
  • L-Histidine Monobydrochloride Monobydrate (42 mg / L) is selected from L-Histidine and L-Histidine Monobydrochloride Monobydrate.
  • Calcium Chloride Dihydrate (265 mg / L) is selected from Calcium Chloride Dihydrate and Calcium Nitrate Tetrahydrate
  • Ferrous Sulfate Heptabydrate (0.834 mg / L) is selected from Ferric Nitrate Nonabydrate and Ferrous Sulfate Heptabydrate
  • Magnesium Sulfate Anbydrous (97.67 mg / L) is selected from Magnesium Chloride Hexabydrate and Magnesium Sulfate Anbydrous
  • Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous (142.04 mg / L) is selected from Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous and Sodium Phosphate Monobasic Anhydrous.
  • Pyridoxal Hydrochloride (4 mg / L) is selected from Pyridoxal Hydrochloride and Pyridoxine Hydrochloride.
  • the composition of the Advanced Basic Media-Mesenchymal Stem Cell (ABM-M) for culturing mesenchymal stem cells derived from adult tissues such as bone marrow and fat in vitro is DMEM high.
  • DMEM Advanced Basic Media-Mesenchymal Stem Cell
  • the composition is based on the components of DMEM high glucose.
  • the ABM-M medium of the present invention is mesenchymal stem cells are classified as adult stem cells in which the proliferation and synthesis of cells are not active, and the DMEM high glucose medium has a high concentration of amino acid DMEM high It is a medium that adjusts the concentration of constituents such as amino acids, inorganic salts and vitamins that are absent or low in glucose medium.
  • Mesenchymal stem cells refer to undifferentiated cells having multipotency derived from adult tissues of mammals including humans.
  • Adult tissues include bone marrow, blood, brain, skin, fat, umbilical cord blood and the like.
  • Mesenchymal stem cells can be separated from adult tissues such as bone marrow or adipose tissue through various methods. For example, separation method by density purchase centrifugation such as Percoll (Majumdar MK et al ., J. Cell Physiol . 176: 57, 1998; Majka SM et al ., J. Clin. Invest ., 111: 71, 2003) or by enzymatic treatment such as collagenase (collagnease) to separate the cells growing on the bottom of the culture vessel by the method of Luria et al . (Luria et al ., Transfusion, 11: 345, 1971). It can be separated easily by the separation method.
  • density purchase centrifugation such as Percoll (Majumdar MK et al ., J. Cell Physiol . 176: 57, 1998; Majka SM et al ., J. Clin. Invest ., 111: 71, 2003) or
  • the mesenchymal stem cell basic culture medium of the present invention is for culturing mesenchymal stem cells isolated from adult bone marrow, blood, brain, skin, fat, umbilical cord blood, etc., and may add one or more components as necessary.
  • Antibiotics and antifungal agents for the prevention of microbial contamination including fetal calf, horse or human serum and L-glutamine, can be used.
  • the mesenchymal stem cells are cultured in the basal culture medium of the present invention.
  • CD166, CD105, CD90, CD44, CD29, CD73, HLA-ABC positive surface markers express more than 80%, in particular CD44, CD105, CD90, CD73 and CD166 positive surface markers express at least 95%, and CD31, CD34, CD45, CD80 and HLA-DR negative surface markers exhibit immunological cellular characteristics of up to 5%.
  • the spindle exhibits the morphological characteristics of the spindle (shape) to attach to the plastic culture vessel to proliferate, and to show the characteristics of differentiating ability to proliferate in a dichotomous state.
  • the cultured mesenchymal stem cells were confirmed to be multipotent mesenchymal stem cells capable of differentiation into osteoblasts, chondrocytes and adipocytes.
  • the present invention is also cultured in mesenchymal stem cells in ABM-M (Advanced Basic Media-Mesenchymal stem cell) medium and then incubated again in ⁇ -MEM medium containing fetal bovine serum, Dexamethasone, ß-Glycerophosphate, Ascorbic acid to provide a cell therapy for the treatment of bone deletion containing mesenchymal stem cells capable of differentiating into bone forming cells.
  • ABM-M Advanced Basic Media-Mesenchymal stem cell
  • the present invention also provides a DMEM low glucose medium comprising Dexamethasone, Ascorbic acid, Sodium pyruvate, TGF- ⁇ , BMP-2 after mesenchymal stem cells are cultured in ABM-M (Advanced Basic Media-Mesenchymal stem cell) medium. It provides a cell therapy for osteoarthritis treatment containing mesenchymal stem cells that can be cultured again to differentiate into chondrocytes.
  • ABM-M Advanced Basic Media-Mesenchymal stem cell
  • the mesenchymal stem cells are cultured in ABM-M (Advanced Basic Media-Mesenchymal stem cell) medium and then cultured again in ⁇ -MEM medium containing fetal bovine serum, Ddexamethasone, Indomethacin, and Insulin to adipocytes. It provides a cell therapy for forming adipose tissue containing mesenchymal stem cells capable of differentiation.
  • ABM-M Advanced Basic Media-Mesenchymal stem cell
  • mesenchymal stem cell basic culture medium of the present invention Advanced Basic Media-Mesenchymal stem cell, ABM-M
  • ABM-M Advanced Basic Media-Mesenchymal stem cell
  • ABSM-M mesenchymal stem cell basal culture medium
  • bone marrow-derived mesenchymal stem cells and adipose derived mesenchymal stem cells frozen from Lonza were prepared.
  • Bone marrow-derived mesenchymal stem cells were purchased and cultured in Poietics MSCGM TM Bullekit, and adipose-derived mesenchymal stem cells were compared with cultured media in Poietics ADSC-GM TM Bullekit.
  • Mesenchymal stem cells derived from bone marrow purchased from Lonza were quickly thawed in a 37 ° C. hot water bath, and then placed in a 15 mL tube containing 5 mL of MSCGM TM medium and centrifuged at 300 g for 5 minutes. After centrifugation, the supernatant medium was removed and suspended in 10 mL of fresh MSCGM medium to determine cell number and cell viability.
  • Prepared cells were inoculated with 5,000 cells per cm 2 in a T25 flask and maintained at 37 ° C. and 5% CO 2 . Every 3-4 days, the culture medium was exchanged with 5 mL of MSCGM medium for each culture vessel. Subcultures were performed if cells grew more than 90% of the flask bottom area. Second, third and fourth cultures were used to prepare the test cell numbers.
  • Mesenchymal stem cells derived from adipose tissue purchased from Lonza were quickly thawed in a 37 ° C. hot water bath, and then placed in a 15 mL tube with 5 mL of ADSC-GM medium and centrifuged at 300 g for 5 minutes. After centrifugation, the supernatant medium was removed and suspended in 10 mL of fresh ADSC-GM medium to determine cell number and cell viability.
  • Prepared cells were inoculated with 5,000 cells per cm 2 in a T25 flask and maintained at 37 ° C. and 5% CO 2 . Every 3-4 days, the culture medium was exchanged with 5 mL of ADSC-GM medium containing 10% fetal bovine serum for each culture vessel. Subcultures were performed if cells grew more than 90% of the flask bottom area. Secondary, third and fourth passages were used to prepare test cell numbers.
  • MSCGM medium is composed of MSC-BM base medium and additives (consisting of 50 mL growth supplement, 10 mL L-glutamine, 0.5 mL penicillin-streptomy), and the additives were also added to the ABM-M medium (Table 2). ).
  • Proliferative medium composition of ABM-M medium and MSCGM medium of the present invention is provided.
  • the medium (MSC-BM + FBS) added with 10% fetal bovine serum (FBS) to MSC-BM did not grow for 10 days and the additive added MSC- BM MSCGM medium also showed little growth.
  • the growth of the medium (ABM-M + FBS) to which the 10% fetal bovine serum (FBS) was added to the ABM-M medium of the test group was higher than that of MSCGM and the doubling time was also faster.
  • the medium containing the additive in the ABM-M also showed higher proliferation and faster doubling time than the MSCGM, confirming that the ABM-M medium composition increased the proliferation rate of mesenchymal stem cells derived from bone marrow.
  • Bone marrow-derived mesenchymal stem cells were not grown in MSCGM medium, while bone marrow-derived mesenchymal stem cells were grown in ABM-M medium containing 10% fetal bovine serum and 2 mM L-glutamine. This shows that the proliferative capacity of mesenchymal stem cells cultured in MSCGM medium was lost, but the proliferative capacity was maintained in ABM-M medium.
  • ABM-M medium In order to confirm the sustained proliferative capacity in ABM-M medium, cells recovered in the fifth passage were inoculated with 5,000 cells per cm 2 in a T150 flask and maintained at 37 ° C. and 5% CO 2 . Every 3-4 days, culture medium was exchanged with ABM-M medium containing 10% fetal bovine serum and 2mM L-glutamine every 3-4 days, and after culturing for 10 days, the number of cells was recovered, and 3,357,500 cells were recovered and inoculated. It was confirmed that the proliferative capacity was maintained by showing 447% growth rate compared to the cell number 750,000. Therefore, the ABM-M medium of the present invention was confirmed that the proliferation ability of bone marrow-derived mesenchymal stem cells.
  • ADSC-GM medium is composed of ADSCC-BM basal medium and additives (consisting of 50 mL fetal bovine serum, 5 mL L-glutamine, 0.5 mL gentamicin-amphotercin), so that 10% fetal bovine serum in ABM-M medium of the present invention And 2mM L-glutamine was added to perform a comparative test.
  • 5,000 cells per cm 2 were inoculated into T75 flasks containing each medium and maintained at 37 ° C. and 5% CO 2 . After culturing for 7 days while replacing the culture medium with each medium for each culture vessel every 3-4 days, the cell number was measured. In addition, the recovered cells were passaged and inoculated with 5,000 cells per cm 2 in a T175 flask containing medium to maintain 37 ° C. and 5% CO 2 . After culturing for 7 days while replacing the culture medium with each medium for each culture vessel every 3-4 days, the cell number was measured.
  • the medium (ABM-M + FBS) added with 10% fetal bovine serum to ABM-M medium of the present invention which is a test group, than the control group ADSC-GM, 5th and 6th passages It showed a fast doubling time in culture and recovered a lot of cells was confirmed that the proliferation rate of fat-derived mesenchymal stem cells by the ABM-M medium of the present invention (Table 4).
  • Cells cultured in the culture medium of 1-2 and 1-3 of Example 1 were removed by treatment with TrypLE express, centrifuged at 400 g for 5 minutes to obtain cells, and then washed twice with FASC solution and washed. Dissociate 5 10 5 cells for 20 minutes with anti-CD166, CD105, CD90, CD44, CD29, CD73, HLA-ABC, CD31, CD34, CD45, CD80 and HLA-DR antibodies, and then wash and FACS solution was suspended and analyzed using a flow cytometer. The surface of the cells was analyzed to determine the phenotype of mesenchymal stem cells.
  • adipocytes Differentiation into adipocytes is shown in Figure 9, the mesenchymal stem cells pre-cultured in ABM-M medium containing 10% fetal bovine serum, 10 -7 M dexamethasone, 100uM indomethacin and 10ug / mL insulin After two weeks of culture differentiation in MEM medium, it was confirmed by staining fat droplets accumulated in cells by oil Red-O staining.
  • Differentiation-induced cartilage tissue was made through paraffin embedding to prepare 5um serial sections, and differentiated into cartilage tissue through H / E staining, safranin O staining, alcian blue staining, sirius red staining, COMP staining, collagen type II and I staining. It was confirmed.
  • Bone marrow and adipose-derived mesenchymal stem cells cultured in the ABM-M medium of the present invention were compared with a control group that did not induce multiple differentiation after two passages.
  • ALP staining and calcium infiltration induced by osteoblasts alkaline phaphatase expression and calcium deposition were confirmed, unlike the control group that did not induce differentiation.
  • oil Red-O staining by adipocytes it was confirmed that differentiation into adipocytes, unlike the control group did not induce differentiation.
  • glycosaminoglycan GAG
  • proteoglycan collagen type similar to normal cartilage through safranin O staining, alcian blue staining, sirius red staining, COMP staining, collagen type II and I staining Expression of I was confirmed.
  • ABM- containing 10% fetal bovine serum and 2 mM L-glutamine by separating mesenchymal stem cells from adult tissues such as bone marrow and adipose tissue derived from different individuals, such as 1-2 and 1-3 of Example 1
  • the karyotypes of cultured mesenchymal stem cells were analyzed. Five of the fission metaphase phases were analyzed using GTG desalination, and karyotypes were designated according to the International System for Cytogenetic Nomenclature (2009). 11 shows normal 46 and XY karyotypes, and FIG. 12 shows normal 46 and XX karyotypes in all five mitotic cells observed.
  • the mesenchymal stem cell basic culture medium (ABM-M medium) of the present invention maintains the cellular characteristics and differentiation capacity of mesenchymal stem cells as compared to the conventional mesenchymal stem cell culture medium, and also promotes cell growth and proliferation.
  • This excellent medium can be used to culture mesenchymal stem cells in large quantities to obtain pure mesenchymal stem cells.

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Abstract

본 발명은 사람의 골수 및 지방조직 등 성체조직으로부터 유래된 미분화 상태의 중간엽 줄기세포의 증식률을 높여 채취에서 대량 배양까지의 시간을 단축할 수 있고, 이렇게 조기배양된 중간엽 줄기세포를 이용하여 골 형성세포, 연골세포, 및 지방세포의 치료제로 다중 분화가능한 중간엽 줄기세포 기본 배양 배지 및 이를 이용하여 배양분화된 세포치료제에 관한 것이다.

Description

중간엽 줄기세포 기본 배양 배지 조성방법, 중간엽 줄기세포 기본 배양 배지 및 이를 이용하여 배양분화된 세포치료제
본 발명은 골수 및 지방에서 유래된 중간엽 줄기세포 기본 배양 배지에 관한 것으로, 특히 골수 및 지방에서 유래된 중간엽 줄기세포를 체외에서 배양하는 과정에서 종래의 상용화된 배지를 이용하여 중간엽 줄기세포를 배양하는 것보다 중간엽 줄기세포의 증식률을 높여 채취에서 대량 배양까지의 시간을 단축할 수 있고, 이렇게 조기배양된 중간엽 줄기세포를 이용하여 골 형성세포, 연골세포, 및 지방세포의 치료제로 다중 분화가능한 중간엽 줄기세포 기본 배양 배지 조성방법, 중간엽 줄기세포 기본 배양 배지 및 이를 이용하여 배양분화된 세포치료제에 관한 것이다.
최근 조직공학을 이용한 재생의학 분야에서 줄기세포의 이용기술이 난치병 치료를 위한 새로운 분야로 제시가 되고 있다. 이에 줄기세포의 연구에 대한 관심이 높아지고, 증식과 분화를 통하여 조직을 형성할 수 있는 줄기세포가 대부분의 질병치료뿐만 아니라, 조직 훼손 등을 해결할 수 있는 것으로 인식되고 있다.
줄기세포(Stem cell)는 미분화상태에서 가지 복제 능력을 가지면서 적당한 조건하에서 특정세포로 분화하는 성질을 가지고 있다. 줄기세포는 그 기원에 따라 배아줄기세포(Embryonic stem cell)와 성체줄기세포(Adult stem cell)로 구분이 될 수 있다. 사람의 배아줄기세포는 인간 생명체로 발생할 수 있는 배아로부터 얻어지기 때문에 세포 증식 및 분화 능력이 우수하나 생명윤리적인 문제점을 가지고 있다. 성체줄기세포는 배아줄기세포에 비해 분화능력이 한정되어 있으나, 인체의 각종 장기에 이미 존재하는 세포를 골수, 혈액, 뇌, 피부 등에서 채취하여 줄기세포로 발전시킨 것으로 윤리적인 문제가 적다.
중간엽 줄기세포(Mesenchymal stem cell)는 최초 성체 골수에서 분리되었고(Y. Jiang et al., Nature, 418:41, 2002), 그 후 피부, 혈관, 근육 및 뇌 조직으로부터 골수와 같은 중간엽 줄기세포가 확인되었다(J.G. Toma et al., Nat. Cell Biol., 3:778, 2001; M. Sampaloesi et al., Science, 301:487, 2003; Y. Jiang et al., Hematol., 30:896, 2002). 또한, 최근 지방조직으로부터 골수와 같은 분화능을 가지는 지방 유래 중간엽 줄기세포(Adiopose-derived stem cell)가 확인되었다(B. Cousin et al,. BBRC., 301:1016, 2003; A. Miranville et al., Circulation, 110:349, 2004; S. Bronthos et al., J. Cell Physiol., 189:54, 2001; M.J. Seo et al., BBRC., 328:258, 2005).
인간 골수로부터 중간엽 줄기세포의 분리를 위한 기법과 지방조직에서 중간엽 줄기세포를 분리하는 기법은 각각 Pittenger 등(Science 284: 143, 1997)와 van 등(J. Clin. Invest., 58: 699, 1976)의 문헌들에 개시되어 있다. 이들 문헌에서는 세포배양을 위하여 alpha-MEM이나 DMEM 배지 및 10-20% 소태아 혈청을 사용하였다.
그러나, 골수 및 지방 조직 등의 성체조직 내에 중간엽 줄기세포는 매우 드물게 존재하고 이러한 세포들은 미분화 상태에서 증식률이 낮고 미분화 상태에서 장기간 유지가 어려워 특이적으로 스크린된 배지가 없으면 체외에서 증식 배양하여 보존하기 어렵다는 단점이 있다.
포유동물 세포배양 배지의 구성물질은 약 50 여종의 성분으로 이루어져 있으며 이들은 크게 보아 세포의 생합성에 이용되는 부분과 생물학적 에너지 대사에 이용되는 부분, 그리고 여러 가지 대사 작용의 촉매 역할을 하거나 세포 내 생리적 현상을 조절하는데 이용되는 부분 등으로 나눌 수 있다. 즉, 세포 배양에 사용되는 배지는 등장용액 성분과 완충용액 성분, 그리고 에너지 공급원인 아미노산, 비타민, 그리고 무기염류를 포함하는 영양성분과 그 외의 다양한 종류의 첨가제(supplement)들로 구성되어 있다.
또한, 세포의 특성에 따라 5∼20% 정도의 혈청을 공급해 줌으로써 세포증식에 적합한 각종 호르몬, 성장인자, 지방, 비타민들을 공급해 주고 단백질 분해효소의 활성을 억제하며, pH 조절용 완충제 역할을 하는 등의 포유동물 세포의 성장과 활성을 촉진시킨다. 포유동물 세포를 배양하기 위한 배지를 구성하는 성분들은 농도뿐만 아니라 그 조성면에서도 각 배지의 종류에 따라 달라진다. 이런 방법으로 1950년경 모건(Morgan) 등이 체액조성을 근거로 하여 M119 배지를 만들어 태아세포(primary chick)를 배양하였다(Morgan, et al., 1950).
배양 배지의 종류는 크게 Minimal essential medium(MEM)(Eagle, 1955), Rosewel Park Memorial Institute(RPMI)-1640(Moore et al., 1967), 및 Dulbecco's modification of Eagle's medium(DMEM)(Dulbecoo, et al., 1959)과 같이 보다 단순하고 세포배양에서 공통적으로 사용되는 배지와 Iscove's modification of DMEM (IMDM), Ham's F-12(Ham, 1965), 및 Connaught Medical Research Laboratories(CMRL)-1666과 같이 보다 복잡하고 여러 가지 성분이 강화된 배지로 나눌 수 있다.
포유동물 세포의 성장곡선은 보통 2∼3일 정도의 지연기(Lag phase)를 가지며 글루타민 대사 산물인 암모늄과 포도당 대사 산물인 젖산의 축적으로 인하여 지연기 말부터 살아 있는 세포의 농도가 급격히 감소한다. 포유동물 세포의 주요 대사경로에는 포도당과 글루타민(glutamine)이 주요 탄소원 및 에너지원으로 사용된다. 포유동물 세포에 의해 포도당이 대사되면 해당과정을 거쳐 피루브산(Pyrubic acid)이 된다. 또한, 인산오탄당 경로(Pentose phosphate pathway)에 의해 오탄당을 만들어 핵산을 합성한다. 해당과정에서 만들어진 피루브산은 TCA회로에 의해 이산화탄소와 물로 분해되기도 하고 젖산으로 되기도 하며, 또한 지방산이 되기도 한다. 포유동물 세포 대사에 사용되는 탄소원 중에서 특이한 것은 글루타민(Glutamine)으로서 대사과정 중에 일부는 글루타메이트(Glutamate)가 되고, 글루타메이트는 TCA 회로로 들어가 다른 아미노산 합성을 위한 탄소골격(Carbon skeleton)을 만든다. 포유동물 세포의 중요 배설물은 젖산과 암모니아이며 알라닌(Alanine)의 배출 또한 중요하다. 젖산염(lactate)과 암모니아는 세포 내부와 리소좀의 pH를 변화시키기 때문에 세포에 독성으로 작용하기도 한다. 이렇듯, 배양되는 세포의 종류에 따라 생리적 기전과 영양적 요구량이 서로 다르기 때문에 세포배양에 사용되는 배지의 종류도 특성에 따라 달라져야 한다.
따라서 사람의 골수 및 지방조직 등의 성체조직에서 유래된 미분화 상태의 중간엽 줄기세포를 체외에서 증식 배양하기 위해서는 미분화 상태의 중간엽 줄기세포의 성장조건에 맞는 배지의 조성은 다를 것이다.
종래 미분화된 상태의 중간엽 줄기세포를 체외에서 증식 배양하는 배양 배지에 관하여 아래와 같은 많은 연구가 진행되어 왔다.
특허문헌 1(중간엽 줄기세포를 이용한 성장인자의 대량 생산방법)은 DMEM을 기본으로 하고 Ham's F-12를 첨가하여 중간엽 줄기세포로부터 성장인자의 분화를 촉진하여 인간 성장인자를 현저히 많은 양으로 합성하도록 조작하는 무혈청 배지에 대해 기술하고 있으나, 이는 DMEM과 Ham's F-12를 혼합한 기본 배지에 중간엽 줄기세포의 증식보다는 중간엽 줄기세포로부터 염기성 섬유아세포 성장인자, 맥관내피세포 성장인자 또는 인간형질전환 성장인자-베타를 대량 생산하기 위한 것이다.
특허문헌 2(콩단백질 가수분해물을 포함하는 제대혈 유래 중간엽 줄기세포의 체외 증식에 필요한 배지 조성물)는 우태아 혈청의 양을 줄이기 위해 줄기세포 배양 배지의 구성 성분으로 콩 단백질 가수 분해물을 우태아 혈청이 포함된 저포도당의 DMEM 배지에 첨가하는 기술에 관한 것이다.
특허문헌 3(중간엽 줄기세포를 이용하여 모유두 조직을 제조하는 방법)과 특허문헌 4(중간엽 줄기세포를 이용하여 모유두 조직을 제조하는 방법)는 중간엽 줄기세포를 DMEM 배지, DMEM/F-12, F-12, McCoy's 5A, RPMI 1640 배지, 윌리암 배지 E(Williams' medium E) 또는 IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Modification) 배지에서 배양한 후, 모유두 조직으로의 분화를 유도하는 기술로서 상용화된 기본세포 배양 배지에 하이드로코티손(hydrocortisone), 인슐린(Insulin), 트랜스페린(Transferrin) 및 소듐셀레나이트(Sodium selenite)가 추가된 배지에 관한 것이다.
특허문헌 5(중간엽 줄기세포 배양 배지 및 이를 이용한 중간엽 줄기세포의 배양방법)는 상용화된 배지에 영양 혼합물(Nutrient Mixture)을 혼합한 배지를 기본으로 하고, 추가적으로 중간엽 줄기세포의 성장인자인 인슐린, 하이드로코티손, EGF, LIF, GM-CSF 등을 첨가하여 배양하는 기술로서 기 상용화된 배양 배지에 영양 혼합물을 혼합하는 배양기술이다.
특허문헌 6(인간 지방조직 유래 다분화능 줄기세포 및 이를 함유하는 세포치료제)는 DMEM 배지를 기본으로 하여 NAC, rEGF, BPE, insulin 등이 첨가된 Keratinocyte-SFM 배지를 첨가하여 중간엽 줄기세포를 증식하는 기술에 관한 것으로 기본세포 배양 배지는 DMEM 배지이다.
특허문헌 7(성체 줄기세포의 배양물 또는 그의 분획물을 포함하는 암예방 또는 치료용 약학 조성물)과 특허문헌 8(분리된 전분화능 성체줄기세포 및 그의 분리 및 배양방법)는 DMEM/Ham's F-12 혼합배지, DMEM 배지 및 DMEM/F-12를 이용하여 중간엽 줄기세포를 배양하는 기술이다.
이처럼 종래의 기술들을 보면 기 상용화된 배지를 기본으로 하여 성장인자 등의 첨가제를 첨가하여 배양하는 기술로 국한되어 있다.
이에 반해 본 출원인이 출원하여 등록받은 특허문헌 9(연골세포 조기배양을 위한 연골세포 특이적 배양방법)는 종래의 상용화된 배지에 성장인자 등의 첨가제를 첨가하지 않는 배양 배지를 개발한 것이다. 특허문헌 9의 연골세포 조기 배양 배지(ABM-C)를 이용하여 골수 및 지방 등의 성체조직으로부터 분리된 중간엽 줄기세포를 배양하였으나 도 13처럼 세포배양 동안 형태 이상이 발생하였으며 또한 부착성을 상실하여 세포배양 배지에 부유가 되어 체외(in vitro)에서 부착하여 증식하는 중간엽 줄기세포는 더 이상 증식하지 않았다.
[선행기술 문헌]
[특허문헌]
(특허문헌 1) 대한민국등록특허 10-0899329
(특허문헌 2) 대한민국공개특허 10-2009-0090850
(특허문헌 3) 대한민국등록특허 10-1022032
(특허문헌 4) 대한민국공개특허 10-2010-0110905
(특허문헌 5) 대한민국등록특허 10-0908481
(특허문헌 6) 대한민국등록특허 10-0679642
(특허문헌 7) 대한민국공개특허 10-2009-0121541
(특허문헌 8) 대한민국공개특허 10-2006-0010847
(특허문헌 9) 대한민국등록특허 10-1037002
따라서 본 발명의 목적은 사람의 골수 및 지방조직 등 성체조직으로부터 유래된 미분화 상태의 중간엽 줄기세포를 빠른 성장속도로 대량 증식 배양할 수 있는 중간엽 줄기세포 기본 배양 배지를 제공함에 있다.
본 발명의 다른 목적은 중간엽 줄기세포 기본 배양 배지를 이용하여 체외(in vitro)에서 성체조직으로부터 유래된 미분화상태의 중간엽 줄기세포를 골 형성세포, 연골세포, 및 지방세포로 분화시켜 미분화된 중간엽 줄기세포가 함유된 세포치료제를 제공함에 있다.
상술한 본 발명의 목적은 상용화된 배양 배지의 구성성분의 종류를 분석한 후, 2종류 이상의 배양 배지를 조합하여 여러 종류의 후보 기본 배양 배지 조성을 준비하는 단계와, 후보 기본 배양 배지 조성을 대상으로 중간엽 줄기세포를 10~20% 우태아 혈청이 포함된 완전 배지에서 중간엽 줄기세포의 증식률을 분석하여 중간엽 줄기세포의 조기 배양에 적합한 기본 배양 배지 조성을 스크린 하는 단계를 포함하는 중간엽 줄기세포 기본 배양 배지 조성방법에 의해 달성된다.
또한, 본 발명의 목적은 상용화된 배양 배지인 DMEM high glucose, RPMI-1640, 및 Ham's F-12를 1:1:1 비율로 혼합한 기본 배지와 DMEM high glucose, RPMI-1640, 및 Ham's F-12의 각 배지를 비교하되, DMEM high glucose 배지 성분을 기본성분으로 하여, 각 배지 중에서 중복된 성분은 높은 농도를 선택하는데, DMEM high glucose 배지에 포함되지 않은 성분이면 DMEM high glucose 배지에 포함하며, 각 배지 중 하나의 배지에만 들어 있는 성분들은 농도 그대로를 유지하는데, DMEM high glucose 배지에 포함되지 않은 성분이면 DMEM high glucose 배지에 포함하며, 각 배지의 성분 중에서 동일 공급원인 성분들은 하나의 성분을 선택하여 선택한 하나의 성분이 각 배지의 중복된 성분이면 높은 농도를 선택하는데, DMEM high glucose 배지에 포함되지 않은 성분이면 DMEM high glucose 배지에 포함하여 ABM-M(Advanced Basic Media-Mesenchymal stem cell) 배지를 조성한 중간엽 줄기세포 기본 배양 배지에 의해 달성된다.
본 발명의 중간엽 줄기세포 기본 배양 배지에 있어서, DMEM high glucose 배지에 포함되는 성분은 아미노산(Amino Acids)에서는 L-Alanine, L-Asparagine Anhydrous, L-Aspartic acid, L-Glutamic acid, L-Hydroxy-L-proline, L-Proline이고, 무기염(Inorganic Salts)에서는 Cupric Sulfate Pentahydrate, Ferrous Sulfate Heptahydrate, Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous, Zinc Sulfate Heptahydrate이고, 비타민(Vitamins)에서는 D-Biotin, P-Aminobenzoic Acid(PABA), Vitamine B12이고, 기타 성분(Other components)에서는 Hypoxanithine, L-Glutathione Reduced, Linoleic acid, Putrescine+2HCL, Thioctic Acid, Thymindine인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 중간엽 줄기세포 기본 배양 배지에 있어서, ABM-M 배지에는 태아, 송아지, 말 또는 사람의 혈청, L-glutamine, 항생제, 및 항진균제 중에서 하나 이상을 더 포함한다.
본 발명의 중간엽 줄기세포 기본 배양 배지에 있어서, ABM-M 배지에는 10-20% 우태아혈청과 2-4mM의 L-glutamine을 더 포함한다.
본 발명의 중간엽 줄기세포 기본 배양 배지에 있어서, 동일 공급원인 성분에서 선택되는 하나의 성분은 아미노산(Amino Acids)에서는 L-Arginine Monobydrochloride, L-Asparatic acid, L-Cystine Dibydrochloride, L-Histidine Monobydrochloride Monobydrate 이고, 무기염(Inorganic Salts)에서는 Calcium Chloride Dihydrate, Ferrous Sulfate Heptabydrate, Magnesium Sulfate Anbydrous, Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous 이며, 비타민(Vitamins)에서는 Pyridoxal Hydrochloride인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 중간엽 줄기세포 기본 배양 배지에 있어서, ABM-M 배지는 CD166, CD105, CD90, CD44, CD29, CD73, HLA-ABC 양성 표면 마커를 80% 이상 발현하되, CD44, CD105, CD90, CD73와 CD166 양성 표면 마커는 95% 이상 발현하고, CD14, CD31, CD34, CD45, CD80와 HLA-DR 음성 표면 마커를 5%이하 발현하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 목적은 ABM-M(Advanced Basic Media-Mesenchymal stem cell) 배지에서 중간엽 줄기세포가 배양된 다음에 우태아혈청, Dexamethasone, ß-Glycerophosphate, Ascorbic acid를 포함하는 α-MEM 배지에서 다시 배양분화되어 골 형성세포로 분화되는 것을 특징으로 하는 골 결실 치료용 세포치료제에 의해 달성된다.
또한, 본 발명의 목적은 ABM-M(Advanced Basic Media-Mesenchymal stem cell) 배지에서 중간엽 줄기세포가 배양된 다음에 Dexamethasone, Ascorbic acid와 Sodium pyruvate, TGF-β, BMP-2를 포함하는 DMEM low glucose 배지에서 다시 배양분화되어 연골세포로 분화되는 것을 특징으로 하는 골관절염 치료용 세포치료제에 의해 달성된다.
또한, 본 발명의 목적은 ABM-M(Advanced Basic Media-Mesenchymal stem cell) 배지에서 중간엽 줄기세포가 배양된 다음에 우태아혈청, Ddexamethasone, Indomethacin, Insulin을 포함하는 α-MEM 배지에서 다시 배양분화되어 지방세포로 분화되는 것을 특징으로 하는 지방조직 형성용 세포치료제에 의해 달성된다.
상술한 본 발명의 중간엽 줄기세포 기본 배양 배지에 의해 인간 성체 줄기세포인 미분화된 중간엽 줄기세포를 빠른 성장속도로 대량 증식 배양할 수 있고, 1개월 이상 장기 배양 증식하여도 세포의 핵형을 유지할 수 있으며, 골 형성세포, 연골세포, 및 지방세포의 유도체로 분화시켜 세포치료제로 사용할 수 있다.
도 1은 골수 유래 중간엽 줄기세포를 대조군인 MSC-BM에 첨가제와 10% 우태아혈청을 함유한 배지와 및 본 발명의 ABM-M 배지에 첨가제와 10% 우태아혈청이 함유된 배지가 들어 있는 T75 플라스크에 375,000 세포의 농도로 접종하여 10일간 배양한 후, 중간엽 줄기세포의 성장을 나타낸 그래프.
도 2는 지방유래 중간엽 줄기세포를 대조군인 ADSCGM 및 본 발명의 ABM-M 배지에 10% 우태아혈청이 함유된 배지가 들어 있는 T75 플라스크에 375,000 세포의 농도로 접종하여 7일간 배양한 후, 중간엽 줄기세포의 성장과 계대 배양하여 T175 플라스크에 875,000 세포의 농도로 접종하여 7일간 배양한 후, 중간엽 줄기세포의 성장을 나타낸 그래프.
도 3은 골수유래 중간엽 줄기세포를 대조군인 MSC-BM에 첨가제와 10% 우태하혈청을 함유한 배지와 및 본 발명의 ABM-M 배지에 첨가제와 10% 우태아혈청이 함유된 배지에서 증식된 중간엽 줄기세포의 증식률을 나타낸 그래프.
도 4는 지방유래 중간엽 줄기세포를 대조군인 ADSCGM 및 본 발명의 ABM-M 배지에 10% 우태아혈청이 함유된 배지에서 증식된 중간엽 줄기세포의 계대 배양별 증식률을 나타낸 그래프.
도 5는 대조군인 MSCGM 배지 또는 ADSCGM 배지에서 배양된 골수 또는 지방유래 중간엽 줄기세포와 본 발명의 ABM-M에 10% 우태아혈청과 2mM L-glutamine이 함유된 배양 배지에서 배양된 골수 또는 지방유래 중간엽 줄기세포를 유세포 분석을 시행하여 세포의 크기 및 표현형의 변화를 나타낸 그래프(SS;granular content within cell, FS;cell size).
도 6은 본 발명의 ABM-M 배지에 10% 우태아혈청과 2mM L-glutamine이 함유된 배지에서 배양된 골수 유래 중간엽 줄기세포의 면역학적 세포특성 분석에 대한 히스토그램을 나타낸 그래프.
도 7은 본 발명의 ABM-M 배지에 10% 우태아혈청과 2mM L-glutamine이 함유된 배지에서 배양된 지방유래 중간엽 줄기세포의 면역학적 세포특성 분석에 대한 히스토그램을 나타낸 그래프.
도 8은 본 발명의 ABM-M 배지에 10% 우태아혈청과 2mM L-glutamine이 함유된 배지에서 배양된 골수 및 지방 유래 중간엽 줄기세포를 배양한 후, 골 형성세포 분화용 배양배지(10% 우태아혈청, 10mM β-glycerol phosphate, 50uM ascorbic acid 와 10-7M dexamethasone을 포함하는 α-MEM 배지)에서 2-3주 동안 재배양 분화시킨 후 ALPase 와 von Kossa 염색 사진.
도 9는 본 발명의 ABM-M 배지에 10% 우태아혈청과 2mM L-glutamine이 함유된 배지에서 배양된 골수 및 지방 유래 중간엽 줄기세포를 배양한 후, 지방세포 분화용 배지(10% 우태아혈청, 10-7M dexamethasone, 100uM indomethacin과 10ug/mL insulin을 포함하는 α-MEM 배지)에서 2주간 재배양 분화시킨 후 oil Red-O 염색 사진.
도 10은 본 발명의 ABM-M 배지에 10% 우태아혈청과 2mM L-glutamine이 함유된 배지에서 배양된 골수 유래 중간엽 줄기세포를 배양한 후, 연골세포로 분화를 유도하기 위하여 5 105 정도의 세포를 300g에서 5분간 원심분리하여 세포덩어리를 만든 후 10-7M dexamethasone, 50uM ascorbic acid, 1nM sodium pyruvate, 10ng/mL TGF-β와 100ng/mL BMP-2를 포함하는 DMEM high glucose 배지에서 3주 동안 재배양 분화된 연골조직을 파라핀포매 과정을 거쳐 5um 연속절편을 제작하여 H/E 염색, safranin O 염색, alcian blue 염색, sirius red 염색, COMP 염색, collagen type II과 I 염색 사진.
도 11은 본 발명의 ABM-M 배지에서 10% 우태아혈청과 2mM L-glutamine이 함유된 배지에서 배양된 골수유래 중간엽 줄기세포를 10회 계대 배양한 후 핵형을 분석한 사진.
도 12는 본 발명의 ABM-M 배지에서 10% 우태아혈청과 2mM L-glutamine이 함유된 배지에서 배양된 지방유래 중간엽 줄기세포를 10회 계대 배양한 후 핵형을 분석한 사진.
도 13은 종래의 ABM-C 배지에서 중간엽 줄기세포의 세포배양 동안 중간엽 줄기세포의 형태 이상 및 부착성 상실 사진.
본 발명은 골수 및 지방 등의 성체조직에서 유래된 중간엽 줄기세포 기본 배양 배지를 제공하는데, 본 발명의 중간엽 줄기세포 기본 배양 배지는 상용화된 배지의 구성성분의 종류를 분석한 후, 2종류 이상의 배지를 조합하여 여러 종류의 후보 기본 배양 배지 조성을 준비하는 단계와, 후보 기본 배양 배지 조성을 대상으로 중간엽 줄기세포를 10~20% 우태아 혈청이 포함된 완전 배지에서 중간엽 줄기세포의 증식률을 분석하여 중간엽 줄기세포의 적합한 기본 배양 배지 조성을 스크린 하는 단계를 포함하여 조성된다.
이와 같이 조성된 본 발명의 중간엽 줄기세포 기본 배양 배지를 이용하여 빠른 성장속도로 조기 배양된 중간엽 줄기세포가 면역학적 세포특성을 나타내는지를 분석하고, 골 형성세포, 연골세포, 및 지방세포로 분화되는지 분화능을 분석하며, 염색체 이상으로 돌연변이가 발생하지 않으면서 장기간의 배양할 수 있는지를 확인하기 위한 세포핵형을 분석하여 골 결실 치료용, 골관절염 치료용, 및 지방조직 형성을 통한 지방세포 치료용 세포치료제로 사용할 수 있는지를 검증하게 된다.
여기서, 본 발명의 중간엽 줄기세포 기본 배양 배지를 이용하여 세포치료제로 사용할 수 있는지를 검증하기 위해서는 면역학적 세포특성, 분화능, 및 세포핵형을 분석해야 하는데 다음과 같은 순서로 실험을 통하여 검증하는 것이 바람직하다. 먼저, 스크린 된 배지 조성으로 배양된 중간엽 줄기세포의 면역학적 세포특성을 분석하는 단계와; 스크린 된 배지 조성으로 배양된 중간엽 줄기세포의 분화능을 분석하는 단계; 및 스크린 된 배지 조성으로 배양된 중간엽 줄기세포의 장기간 배양가능 여부를 확인하기 위해 세포핵형을 분석하는 단계로 검증하는 것이다.
이하, 본 발명에 대한 구체적으로 설명하기로 한다.
본 발명의 중간엽 줄기세포 기본 배양 배지인 ABM-M(Advanced Basic Media-Mesenchymal stem cell) 배지는 상용화된 배양 배지인 DMEM high glucose, RPMI-1640, 및 Ham's F-12를 1:1:1 비율로 혼합한 기본 배지를 준비하고, DMEM high glucose 배지 성분을 기본성분으로 하여 상기 기본 배지를 DMEM high glucose, RPMI-1640, 및 Ham's F-12의 각 배지와 비교해서 각 배지 중에서 중복된 성분은 높은 농도를 선택하고, DMEM high glucose 배지에 포함되지 않은 성분이면 DMEM high glucose 배지에 포함하며(표 1의 비고란 ①), 각 배지 중 하나의 배지에만 들어 있는 성분들은 농도 그대로를 유지하고, DMEM high glucose 배지에 포함되지 않은 성분이면 DMEM high glucose 배지에 포함하며(표 1의 비고란 ②), 각 배지의 성분 중에서 동일 공급원인 성분들은 하나의 성분을 선택하여 선택한 하나의 성분이 각 배지의 중복된 성분이면 높은 농도를 선택하고, DMEM high glucose 배지에 포함되지 않은 성분이면 DMEM high glucose 배지에 포함(표 1의 비고란 ③)하여 아래 표 1과 같이 조성된다.
[표 1]
상용화된 배지의 조성 및 ABM-M 배지 조성
Figure PCTKR2011006582-appb-I000001
Figure PCTKR2011006582-appb-I000002
상기 표 1의 비고란에 개시된 바처럼, 본 발명의 ABM-M 배지의 기본성분인 DMEM high glucose 배지에 없는 성분으로 추가되어 포함되는 성분은 아미노산(Amino Acids)에서는 L-Alanine, L-Asparagine Anhydrous, L-Aspartic acid, L-Glutamic acid, L-Hydroxy-L-proline, L-Proline이고, 무기염(Inorganic Salts)에서는 Cupric Sulfate Pentahydrate, Ferrous Sulfate Heptahydrate, Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous, Zinc Sulfate Heptahydrate이고, 비타민(Vitamins)에서는 D-Biotin, P-Aminobenzoic Acid(PABA), Vitamine B12이고, 기타 성분(Other components)에서는 Hypoxanithine, L-Glutathione Reduced, Linoleic acid, Putrescine+2HCL, Thioctic Acid, Thymindine이다.
상술한 본 발명의 중간엽 줄기세포 기본 배양 배지인 ABM-M(Advanced Basic Media-Mesenchymal stem cell) 배지를 조성한 표 1의 비고란에 대하여 설명하면 다음과 같다.
(1) 각 배지 중에서 중복된 성분은 높은 농도를 선택하는데, DMEM high glucose 배지에 포함되지 않은 성분이면 DMEM high glucose 배지에 포함하는 것은 표 1의 비고란 ①에 해당한다.
이는 종래 특허문헌 9의 DMEM, RPMI-1640으로 구성된 ABM-C의 배지에서 본 발명의 성체 줄기세포로부터 유래된 중간엽 줄기세포를 배양한 결과, 세포의 형태 이상 및 부착성의 상실이 유발되어 이를 보강하기 위하여 증식률 및 세포의 합성과 관련 있는 성분들을 보강하였다.
아미노산인 Glycine, L-Glutamine, L-Isoleucine, L-Leucine, L-Lysine, L-Methionine, L-Phenylalaine, L-Serine, L-Threonine, L-Tryptophan, L-Tyrosine, L-Valine은 단백질 합성의 주요 아미노산들로 높은 쪽의 농도를 선택함으로써 단백질의 합성을 증진하고 세포의 증식을 높였다.
무기질염인 Patassium Chloride, Sodium Chloride는 세포내,외의 삼투압과 관련이 있어 적정 삼투압을 유지하기 위하여 높은 쪽의 성분을 선택하였다.
비타민류인 Ascorbic Acid Phosphate, Choline Chloride, D-Biotin(DMEM high glucose 배지에 포함), D-Ca Pantothenate, Folic Acid, Myo-Inositol, Nicotinamide, Riboflavin, Thiamine Hydrochloride, Vitamine B12(DMEM high glucose 배지에 포함)는 항산화제로 세포의 높은 증식으로 인해 생성된 노폐물을 제거하기 위하여 높은 농도를 선택하였다.
기타 성분인 D-Glucose Anhydrous은 주요 에너지원으로 높은 증식을 유지하기 위한 에너지원으로 높은 농도를 선택하였고, Sodium Pyruvate는 세포 내 합성에 관여하여 높은 쪽을 선택하였다. Phenol Red Sodium Salt는 세포의 증식과는 연관되어 있지 않지만, 세포의 증식이 활발해짐으로써 배출된 노폐물로 Phenol Red의 색깔이 붉은색에서 노란색으로 변하게 되는데, 높은 증식률로 인해 배출된 노폐물의 양을 시각적으로 측정하기 위하여 높은 농도를 선택하였다.
Proline은 콜라겐의 주성분으로 세포외 기질 합성의 주요 성분이다. 높은 증식의 중간엽 줄기세포 내 콜라겐의 합성을 증가시키기 위하여 DMEM high glucose 배지에 포함시켰다.
Aspartic acid는 대부분의 단백질에 함유되어 있으며 시트르산회로에 연결되어 푸린염기와 피리미딘 염기의 아미노기 공급체이다. 따라서 높은 증식률을 보이는 세포의 DNA 합성의 주요 공급원이 푸린과 피리미딘 염기를 주요 공급체로서 DMEM high glucose 배지에 포함시켰다.
L-Glutamic acid는 세포내 신진대사의 중요한 아미노산으로 세포의 활발한 증식을 위해 DMEM high glucose 배지에 포함시켰다.
(2) 각 배지 중 하나의 배지에만 들어 있는 성분들은 농도 그대로를 유지하고, DMEM high glucose 배지에 포함되지 않은 성분이면 DMEM high glucose 배지에 포함하는 것은 표 1의 비고란 ②에 해당한다.
DMEM 및 RPMI-1640으로 구성되어 증식률을 높인 ABM-C 배지에서의 중간엽 줄기세포의 경우, 세포 부착성이 상실이 되었다. 이를 보강하기 위하여 세포내 교원질의 합성을 높이고 높아진 합성으로 유발된 노폐물을 제거하기 위하여 DMEM high glucose 배지에 없는 성분들을 포함시켰다.
아미노산인 L-Alanine은 세포의 면역과 합성에 관여하는 아미노산으로 중간엽 줄기세포의 증식을 높이기 위해서 포함시켰고, 아미노산인 L-Hydroxy-L-Proline, 기타 성분인 Thioctic Acid와 Linoleic Acid, 비타민류인 P-Aminobenzoic Acid(PABA)는 세포내 교원질의 구성성분으로 세포내 교원질의 합성을 높여 세포의 부착성을 높이기 위하여 DMEM high glucose 배지에 포함되었다.
무기질염인 Cupric Sulfate Penatahydrate와 Zinc Sulfate Heptahydrate, 기타 성분인 Glutathione Reduced는 항산화제로 높은 증식률을 보이는 세포 내 다양한 노페물의 배출을 더욱 증진시킴으로써 높은 세포 증식률을 보이기 위하여 DMEM high glucose 배지에 포함되었다.
기타 성분인 Thymidine, Putrescine+2HCL, Hypoxanthine은 DNA 합성에 관여하는 성분으로 세포 증식을 높이기 위해서는 DNA 합성이 선행되어야 하므로 DMEM high glucose 배지에 포함시켰다.
(3) 각 배지의 성분 중에서 동일 공급원인 성분들은 하나의 성분을 선택하여 선택한 하나의 성분이 각 배지의 중복된 성분이면 높은 농도를 선택하고, DMEM high glucose 배지에 포함되지 않은 성분이면 DMEM high glucose 배지에 포함하는 것은 표 1의 비고란 ③에 해당한다.
아미노산인 L-Arginine, L-Asparagine, L-Cysteine/cystine, L-Histidine, 무기질염인 Calcium Chloride/Nitrate, Ferric Nitrage/Ferrous Sulfate, Sodium Phosphate, 비타민류인 Pyridoxal Hydrochloride/Pyridoxine Hydrochloride의 경우, 동일 공급원의 성분들을 둘 이상 추가하게 되면 배지 내 삼투압이 높아져 세포의 악영향을 줄 수 있으므로 동일 성분들은 높은 농도의 성분을 선택하여 하나의 공급원만 선택하였다.
또한, 배지 제조 시에 생성될 수 있는 염을 최소화하기 위하여 무기염에서 적은 hydrate가 붙어 있는 성분을 선택하였다.
Sodium phosphate는 예외적으로 높은 농도를 선택하게 되면 배지 전체 삼투압이 상승하게 되어 세포의 악영향을 줄 수 있으므로 적정 삼투압을 유지하기 위하여 142.04 mg/L를 선택하였다.
Magnesium Chloride Hexahydrate와 Magnesium Sulfate Anhydrous은 세포내 대사의 주요 물질인 Magnesium의 공급원으로 배지 제조시 염의 생성을 줄이기 위해 무수화의 Magnesium Sulfate Anhydrous를 선택하되, 중복된 성분이어서 높은 농도를 선택하였다.
상기와 같은 이유로 인해서 표 1에 개시된 바처럼, 아미노산(Amino Acids) 성분의 경우에는 L-Arginine Free Base(RPMI)와 L-Arginine Monobydrochloride(DMEM과 F12) 중에서 L-Arginine Monobydrochloride(211 mg/L)을 선택하고, L-Asparagine Monobydrate와 L-Asparatic acid 중에서 L-Asparatic acid(20 mg/L)을 선택하고, L-Cysteine Monobydrochloride Monobydrate와 L-Cystine Dibydrochloride 중에서 L-Cystine Dibydrochloride(62.6 mg/L)을 선택하고, L-Histidine와 L-Histidine Monobydrochloride Monobydrate 중에서 L-Histidine Monobydrochloride Monobydrate(42 mg/L)을 선택하는 것이다.
무기염(Inorganic Salts) 성분의 경우에는 Calcium Chloride Dihydrate와 Calcium Nitrate Tetrahydrate 중에서 Calcium Chloride Dihydrate(265 mg/L)를 선택하고, Ferric Nitrate Nonabydrate와 Ferrous Sulfate Heptabydrate 중에서 Ferrous Sulfate Heptabydrate(0.834 mg/L)를 선택하고, Magnesium Chloride Hexabydrate와 Magnesium Sulfate Anbydrous 중에서 Magnesium Sulfate Anbydrous(97.67 mg/L)를 선택하고, Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous와 Sodium Phosphate Monobasic Anhydrous 중에서 Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous(142.04 mg/L)을 선택하는 것이다.
비타민(Vitamins) 성분의 경우에는 Pyridoxal Hydrochloride와 Pyridoxine Hydrochloride 중에서 Pyridoxal Hydrochloride(4 mg/L)을 선택하는 것이다.
상술한 바처럼, 골수 및 지방 등의 성체조직에서 유래된 중간엽 줄기세포를 체외에서 배양하기 위한 중간엽 줄기세포 기본 배양 배지(Advanced Basic Media-Mesenchymal stem cell, ABM-M)의 조성은 DMEM high glucose, RPMI-1640, 및 Ham's F-12 배지 조성에서 출발하되, DMEM high glucose의 성분을 기본성분으로 하여 조성된다.
즉, 본 발명의 ABM-M 배지는 중간엽 줄기세포는 세포의 증식 및 합성이 활발하지 못한 성체 줄기세포로 분류가 되에 아미노산의 농도가 높은 DMEM high glucose 배지의 성분을 기본성분으로 하여 DMEM high glucose 배지에는 없거나 혹은 농도가 낮은 아미노산, 무기염, 비타민 등의 구성성분의 농도를 조정한 배지이다.
중간엽 줄기세포는 인간을 포함한 포유동물의 성체조직에서 유래된 multipotency를 가지는 미분화의 세포를 말하며, 성체조직은 골수, 혈액, 뇌, 피부, 지방, 제대혈 등을 포함한다.
상기 골수 또는 지방조직 등의 성체조직으로부터 중간엽 줄기세포를 다양한 방법을 통해 분리할 수 있다. 예를 들어, 피콜 (Percoll) 등 밀도구매 원심분리에 의한 분리방법 (Majumdar MK et al., J. Cell Physiol. 176:57, 1998; Majka SM et al., J. Clin. Invest., 111:71, 2003)을 이용하거나 콜라게나아제 (collagnease) 등의 효소처리하여 분리된 세포를 Luria 등 (Luria et al., Transfusion, 11:345, 1971)의 방법으로 배양용기 바닥에 붙어 자라는 모든 세포를 분리하는 방법 등으로 쉽게 분리할 수 있다.
본 발명의 중간엽 줄기세포 기본 배양 배지는 성체조직인 골수, 혈액, 뇌, 피부, 지방, 제대혈 등으로부터 분리된 중간엽 줄기세포를 배양하기 위한 것으로, 필요에 따라 하나 이상의 성분을 첨가할 수 있는데, 태아 송아지, 말 또는 사람의 혈청 및 L-glutamine을 비롯하여 미생물의 오염 방지를 위한 항생제 및 항진균제를 첨가하여 사용할 수 있으며, 바람직하게는 10-20% 우태아혈청과 2-4mM의 L-glutamine을 첨가하는 것이 바람직하다.
중간엽 줄기세포의 기본 배양 배지(ABM-M)를 통한 증식률을 확인하기 위하여 중간엽 줄기세포는 본 발명의 기본 배양 배지에서 배양한다. 이렇게 배양된 중간엽 줄기세포의 면역학적 세포특성을 살펴보면, CD166, CD105, CD90, CD44, CD29, CD73, HLA-ABC 양성 표면 마커는 80% 이상 발현하고, 여기서 특히 CD44, CD105, CD90, CD73와 CD166 양성 표면 마커는 95% 이상 발현하며, CD31, CD34, CD45, CD80와 HLA-DR 음성 표면 마커는 5%이하 발현하는 면역학적 세포 특성을 나타낸다.
또한, 플라스틱 배양용기에 부착하여 증식하는 나선형태(spindle-shape)의 형태학적 특징을 나타내고, 이분화 상태로 증식하여 분화능력을 가지는 특징을 나타낸다.
또한, 상기 배양된 중간엽 줄기세포는 골 형성세포, 연골세포 및 지방세포로 분화가 가능한 다분화능의 중간엽 줄기세포임을 확인할 수 있었다.
본 발명은 또한, 중간엽 줄기세포가 ABM-M(Advanced Basic Media-Mesenchymal stem cell) 배지에서 배양된 다음에 우태아혈청, Dexamethasone, ß-Glycerophosphate, Ascorbic acid를 포함하는 α-MEM 배지에서 다시 배양되어 골 형성세포로 분화할 수 있는 중간엽 줄기세포를 함유하는 골 결실 치료용 세포치료제를 제공한다.
본 발명은 또한, 중간엽 줄기세포가 ABM-M(Advanced Basic Media-Mesenchymal stem cell) 배지에서 배양된 다음에 Dexamethasone, Ascorbic acid, Sodium pyruvate, TGF-β, BMP-2을 포함하는 DMEM low glucose 배지에서 다시 배양되어 연골세포로 분화할 수 있는 중간엽 줄기세포를 함유하는 골관절염 치료용 세포치료제를 제공한다.
본 발명은 또한, 중간엽 줄기세포가 ABM-M(Advanced Basic Media-Mesenchymal stem cell) 배지에서 배양된 다음에 우태아혈청, Ddexamethasone, Indomethacin, Insulin을 포함하는 α-MEM 배지에서 다시 배양되어 지방세포로 분화할 수 있는 중간엽 줄기세포를 함유하는 지방조직 형성용 세포치료제를 제공한다.
이하, 본 발명의 중간엽 줄기세포 기본 배양 배지(Advanced Basic Media-Mesenchymal stem cell, ABM-M)에서의 중간엽 줄기세포의 증식력을 다른 배지와 비교하였고, ABM-M 배지에서 배양된 중간엽 줄기세포의 면역학적 세포특성 확인, ABM-M 배지에서 배양된 중간엽 줄기세포의 분화능 확인, 및 ABM-M 배지에서 배양된 중간엽 줄기세포의 세포핵형 유지에 대하여 아래의 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명하고자 한다.
[실시예 1]
본 발명의 중간엽 줄기세포 기본 배양 배지(ABM-M) 증식력 비교
ABM-M 배지 내에서 골수 및 지방조직 등 성체조직으로부터 유래된 중간엽 줄기세포에 대한 증식력을 분석하기 위하여 론자(Lonza)사로부터 동결 보관된 골수유래 중간엽줄기세포와 지방유래 중간엽 줄기세포를 구입하여 골수유래 중간엽 줄기세포는 Poietics MSCGMTM Bullekit에서 배양하였으며, 지방유래 중간엽 줄기세포는 Poietics ADSC-GMTM Bullekit에서 배양사의 전용배지와 비교하였다.
1-1. 골수 및 지방조직 유래 중간엽 줄기세포 준비
론자(Lonza)사로부터 구입한 골수로부터 유래된 중간엽 줄기세포를 37℃ 중탕기에서 재빨리 해동한 후, 5mL의 MSCGMTM 배지가 있는 15mL 튜브에 넣어 300g에서 5분 동안 원심 분리하였다. 원심분리 후, 상층액 배지를 제거하고 새로운 MSCGM 배지 10mL로 현탁하여 세포수 및 세포생존율을 측정하였다. 준비된 세포를 T25 플라스크에 ㎠당 5,000개의 세포를 접종하여 37℃와 5% CO2를 유지하며 배양하였다. 3-4일 마다 배양용기별로 MSCGM 배지 5mL로 배양액을 교환하며 배양하였으며 세포가 플라스크 바닥 면적의 90%이상 자라면 계대배양을 실시하였다. 2차, 3차 및 4차 배양을 하여 시험용 세포수를 준비하였다.
론자(Lonza)사로부터 구입한 지방조직으로부터 유래된 중간엽 줄기세포를 37℃ 중탕기에서 신속하게 해동한 후, 5mL의 ADSC-GM 배지가 있는 15mL 튜브에 넣어 300g에서 5분 동안 원심 분리하였다. 원심분리 후, 상층액 배지를 제거하고 새로운 ADSC-GM 배지 10mL로 현탁하여 세포수 및 세포생존율을 측정하였다. 준비된 세포를 T25 플라스크에 ㎠당 5,000개의 세포를 접종하여 37℃와 5% CO2를 유지하며 배양하였다. 3-4일 마다 배양용기별로 10% 우태아혈청이 포함된 ADSC-GM 배지 5mL로 배양액을 교환하며 배양하였으며 세포가 플라스크 바닥 면적의 90%이상 자라면 계대배양을 실시하였다. 2차, 3차 및 4차 계대 배양을 하여 시험용 세포수를 준비하였다.
1-2. ABM-M 배지에서의 골수유래 중간엽 줄기세포의 증식비교
MSCGM 배지에서 4차까지 계대 배양된 골수유래 중간엽 줄기세포를 MSCGM 배지를 대조군으로 하여 본 발명의 ABM-M 배지에서의 증식력을 조사하였다. MSCGM 배지는 MSC-BM인 기본 배지와 첨가제(50mL growth supplement, 10mL L-glutamine, 0.5mL penicillin-streptomy로 구성됨)로 구성되어 있어서 ABM-M 배지에도 첨가제를 첨가하여 비교시험을 실시하였다(표 2).
[표 2]
본 발명의 ABM-M 배지와 MSCGM 배지와의 증식력 배지 조성
Figure PCTKR2011006582-appb-I000003
4차 계대배양 후, 표 2의 배지 조성이 들어 있는 T75 플라스크에 ㎠당 5,000개의 세포를 접종하여 37℃와 5% CO2를 유지하며 배양하였다. 3-4일 마다 배양용기별로 각각의 배지로 배양액을 교환하며 10일 동안 배양한 후, 세포수를 측정하였다.
도 1과 도 3을 통해서 살펴보면 대조군의 경우, MSC-BM에 10% 우태아 혈청(FBS)이 첨가된 배지(MSC-BM+FBS)는 10일 동안 증식이 되지 않았으며 첨가제가 첨가된 MSC-BM인 MSCGM 배지 역시 거의 증식이 이루어 지지 않았다.
하지만, 시험군인 본 발명의 ABM-M 배지에 10% 우태아 혈청(FBS)이 첨가된 배지(ABM-M+FBS)의 증식이 MSCGM 보다 높은 증식을 보였으며 doubling time도 빨랐다. ABM-M에 첨가제가 포함된 배지도 역시 MSCGM보다 높은 증식과 빠른 doubling time을 보여 ABM-M 배지 조성이 골수로부터 유래된 중간엽 줄기세포의 증식률을 높인 것을 확인하였다.
MSCGM 배지에서 골수유래 중간엽 줄기세포의 증식이 이루어지지 않는 반면에, 10% 우태아혈청과 2mM L-glutamine이 함유된 ABM-M배지에서 골수유래 중간엽 줄기세포는 증식되었다. 이는 MSCGM 배지에서 배양된 중간엽 줄기세포의 증식능이 상실하였으나 ABM-M 배지에서는 증식능을 유지하고 있음을 보여주는 것이다.
ABM-M배지에서의 증식능 지속을 확인하기 위하여 5차 계대배양에서 회수된 세포를 T150 플라스크에 ㎠당 5,000개의 세포를 접종하여 37℃와 5% CO2를 유지하며 배양하였다. 3-4일 마다 배양용기별로 10% 우태아혈청, 2mM L-glutamine이 함유된 ABM-M 배지로 배양액을 교환하며 10일 동안 배양한 후, 세포수를 측정한 결과 3,357,500의 세포를 회수하여 접종세포수 750,000 대비 447% 증식률을 보여 증식능을 지속하고 있음을 확인하였다. 따라서 본 발명의 ABM-M 배지는 골수유래 중간엽 줄기세포의 증식능이 우수함을 확인하였다.
[표 3]
각 배양 배지별 골수유래 중간엽 줄기세포 증식분석결과
Figure PCTKR2011006582-appb-I000004
1-3. ABM-M 배지에서의 지방유래 중간엽 줄기세포의 증식비교
ADSC-GM 배지에서 4차까지 계대 배양된 지방유래 중간엽 줄기세포를 ADSC-GM배지를 대조군으로 ABM-M 배지에서의 증식력을 조사하였다. ADSC-GM 배지는 ADSCC-BM인 기본 배지와 첨가제(50 mL 우태아혈청, 5mL L-glutamine, 0.5mL gentamicin-amphotercin로 구성됨)로 구성되어 있어서 본 발명의 ABM-M 배지에 10% 우태아혈청과 2mM L-glutamine을 첨가하여 비교시험을 실시하였다.
4차 계대배양 후, 각각의 배지가 들어 있는 T75 플라스크에 ㎠당 5,000개의 세포를 접종하여 37℃와 5% CO2를 유지하며 배양하였다. 3-4일 마다 배양용기별로 각각의 배지로 배양액을 교환하며 7일 동안 배양한 후, 세포수를 측정하였다. 또한, 회수된 세포를 계대 배양하여 배지가 들어 있는 T175 플라스크에 ㎠당 5,000개의 세포를 접종하여 37℃와 5% CO2를 유지하며 배양하였다. 3-4일 마다 배양용기별로 각각의 배지로 배양액을 교환하며 7일 동안 배양한 후, 세포수를 측정하였다.
도 2, 도 4, 및 표 5를 통하여 살펴보면 대조군인 ADSC-GM보다 시험군인 본 발명의 ABM-M 배지에 10% 우태아 혈청이 첨가된 배지(ABM-M+FBS)가 5,6차 계대배양에서 빠른 doubling time을 보였으며 회수된 세포도 많아 본 발명의 ABM-M 배지에 의해 지방유래 중간엽 줄기세포의 증식률이 높음을 확인하였다(표 4).
[표 4]
각 배양 배지별 지방유래 중간엽 줄기세포의 증식분석결과
Figure PCTKR2011006582-appb-I000005
[실시예 2]
본 발명의 ABM-M 배지에서 배양된 중간엽 줄기세포의 면역학적 특성분석
실시예 1의 1-2와 1-3의 배양 배지에 배양된 세포를 TrypLE express를 처리하여 떼어내고, 400g에서 5분간 원심분리하여 세포를 획득한 다음, FASC 용액으로 2회 세척하고, 세척한 세포를 5 105 개씩 분주하여 anti-CD166, CD105, CD90, CD44, CD29, CD73, HLA-ABC, CD31, CD34, CD45, CD80와 HLA-DR 항체로 20분 동안 반응시킨 후, 세척하여 FACS 용액으로 부유시켜 유세포 분석기를 이용하여 분석하였다. 세포의 표면을 분석하여 중간엽 줄기세포의 표현형을 확인하였다.
그 결과, 대조군인 MSC-GM과 ADSC-GM 배지에서 배양된 중간엽 줄기세포와 동일하게 10% 우태아혈청, 2mM L-glutamine이 함유된 ABM-M 배지에서 배양된 세포에서 CD166, CD105, CD90, CD44, CD29, CD73, HLA-ABC은 양성발현을, CD14, CD31, CD34, CD45, CD80와 HLA-DR은 음성발현을 보여 중간엽 줄기세포의 특성을 가지고 있음을 확인하였다(표 5).
[표 5]
ABM-M 배지에서 배양된 중간엽 줄기세포의 면역학적 세포특성
Figure PCTKR2011006582-appb-I000006
[실시예 3]
ABM-M 배지에서 배양된 중간엽 줄기세포의 분화능 분석
실시예 1의 1-2와 1-3의 배양 배지에 배양된 세포를 triplex를 처리하여 떼어내고, 400g에서 5분간 원심분리하여 획득한 세포를 in vitro조건에서 다중분화능을 확인하였다.
배양한 중간엽 줄기세포의 다중 분화능을 확인하기 위하여 Schallmoser K등 (Schallmoser K. et al., Tissue Eng Par C Method 14:185, 2008)의 방법에 따라 다음과 같이 분화를 유도하였다.
골 형성세포로의 분화는 도 8에 도시된 바처럼, ABM-M 배지에서 조기 배양된 중간엽 줄기세포를 10% 우태아혈청, 10mM β-glycerolphosphate, 50uM ascorbic acid와 10-7M dexamethasone을 포함하는 α-MEM 배지에서 2-3주 동안 다시 배양분화시킨 후 alkaline phosphatase 발현여부는 ALPase 염색으로 측정하고, 칼슘의 축적은 von Kossa 염색으로 확인하였다.
지방세포로의 분화는 도 9에 도시된 바처럼, ABM-M 배지에서 조기 배양된 중간엽 줄기세포를 10% 우태아혈청, 10-7M dexamethasone, 100uM indomethacin과 10ug/mL insulin을 포함하는 α-MEM배지에서 2주간 다시 배양분화시킨 후 oil Red-O 염색으로 세포내 축적된 지방방울을 염색하여 확인하였다.
연골세포로 분화를 유도하기 위하여 도 10에 도시된 바처럼, ABM-M 배지에서 조기 배양된 5×105 정도의 중간엽 줄기세포를 300g에서 5분간 원심분리하여 세포덩어리를 만든 후 10-7M dexamethasone, 50uM ascorbic acid, 1nM sodium pyruvate, 10ng/mL TGF-β, 100ng/mL BMP-2를 포함하는 DMEM low glucose 배지에서 3주 동안 다시 배양분화하였다. 분화유도된 연골조직은 파라핀 포매 과정을 거쳐 5um 연속절편을 제작하여 H/E 염색, safranin O 염색, alcian blue 염색, sirius red 염색, COMP 염색, collagen type II과 I 염색을 통해 연골조직으로의 분화능을 확인하였다.
본 발명의 ABM-M 배지에서 배양된 골수 및 지방유래 중간엽 줄기세포를 2번의 계대배양 후, 다중 분화를 유도하여 유도하지 않은 대조군과 비교하였다. 골 형성세포로 유도하여 ALP 염색과 칼슘의 침작을 수행한 결과, 분화를 유도하지 않은 대조군과 달리 alkaline phaphatase의 발현 및 칼슘이 침착됨을 확인하였다. 또한, 지방세포로 유도하여 oil Red-O 염색을 수행한 결과, 분화를 유도하지 않은 대조군과 달리 지방세포로 분화됨을 확인하였다. 중간엽 줄기세포 덩어리로 연골세포로의 분화를 유도하여 safranin O 염색, alcian blue 염색, sirius red 염색, COMP 염색, collagen type II과 I 염색을 통해 정상연골과 유사한 glycosaminoglycan (GAG), proteoglycan, collagen type I의 발현이 확인되었다.
[실시예 4]
ABM-M 배지에서 배양된 중간엽 줄기세포의 핵형 분석
실시예 1의 1-2와 1-3와 같이 서로 다른 개체에서 유래된 골수 및 지방조직 등의 성체조직에서 중간엽 줄기세포를 분리하여 10% 우태아혈청과 2mM L-glutamine이 함유된 ABM-M 배지에서 10회 계대배양 후, 배양된 중간엽 줄기세포의 핵형을 분석하였다. 20개의 분열중기상 중 5개의 분열 중기상을 GTG 분염법을 이용하여 분석하였고, International System for Cytogenetic Nomenclature(2009)에 준하여 핵형을 표기하였다. 관찰한 모든 5개의 분열중기 세포에서 도 11은 정상적인 46, XY핵형을, 도 12는 정상적인 46, XX핵형을 보였다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 중간엽 줄기세포 기본 배양 배지(ABM-M 배지)는 종래의 중간엽 줄기세포 배양 배지에 비하여 중간엽 줄기세포의 세포특성 및 분화능을 유지하며, 또한 세포 성장 및 증식이 우수한 배지로 이를 이용하여 중간엽 줄기세포를 대량으로 배양하여 순수한 중간엽 줄기세포를 획득할 수 있다.

Claims (10)

  1. 상용화된 배양 배지의 구성성분의 종류를 분석한 후, 2종류 이상의 배양 배지를 조합하여 여러 종류의 후보 기본 배양 배지 조성을 준비하는 단계와,
    후보 기본 배양 배지 조성을 대상으로 중간엽 줄기세포를 10~20% 우태아 혈청이 포함된 완전 배지에서 중간엽 줄기세포의 증식률을 분석하여 중간엽 줄기세포의 조기 배양에 적합한 기본 배양 배지 조성을 스크린 하는 단계를 포함하는 중간엽 줄기세포 기본 배양 배지 조성방법.
  2. 상용화된 배양 배지인 DMEM high glucose, RPMI-1640, 및 Ham's F-12를 1:1:1 비율로 혼합한 기본 배지와 DMEM high glucose, RPMI-1640, 및 Ham's F-12의 각 배지를 비교하되,
    DMEM high glucose 배지 성분을 기본성분으로 하여
    각 배지 중에서 중복된 성분은 높은 농도를 선택하는데, DMEM high glucose 배지에 포함되지 않은 성분이면 DMEM high glucose 배지에 포함하며,
    각 배지 중 하나의 배지에만 들어 있는 성분들은 농도 그대로를 유지하는데, DMEM high glucose 배지에 포함되지 않은 성분이면 DMEM high glucose 배지에 포함하며,
    각 배지의 성분 중에서 동일 공급원인 성분들은 하나의 성분을 선택하여 선택한 하나의 성분이 각 배지의 중복된 성분이면 높은 농도를 선택하는데, DMEM high glucose 배지에 포함되지 않은 성분이면 DMEM high glucose 배지에 포함하여 ABM-M(Advanced Basic Media-Mesenchymal stem cell) 배지를 조성한 것을 특징으로 하는 중간엽 줄기세포 기본 배양 배지.
  3. 청구항 2에 있어서,
    DMEM high glucose 배지에 포함되는 성분은
    아미노산(Amino Acids)에서는 L-Alanine, L-Asparagine Anhydrous, L-Aspartic acid, L-Glutamic acid, L-Hydroxy-L-proline, L-Proline이고,
    무기염(Inorganic Salts)에서는 Cupric Sulfate Pentahydrate, Ferrous Sulfate Heptahydrate, Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous, Zinc Sulfate Heptahydrate이고,
    비타민(Vitamins)에서는 D-Biotin, P-Aminobenzoic Acid(PABA), Vitamine B12이고,
    기타 성분(Other components)에서는 Hypoxanithine, L-Glutathione Reduced, Linoleic acid, Putrescine+2HCL, Thioctic Acid, Thymindine인 것을 특징으로 하는 중간엽 줄기세포 기본 배양 배지.
  4. 청구항 2에 있어서,
    ABM-M 배지에는 태아, 송아지, 말 또는 사람의 혈청, L-glutamine, 항생제, 및 항진균제 중에서 하나 이상을 더 포함하는 중간엽 줄기세포 기본 배양 배지.
  5. 청구항 2에 있어서,
    ABM-M 배지에는 10-20% 우태아혈청과 2-4mM의 L-glutamine을 더 포함하는 중간엽 줄기세포 기본 배양 배지.
  6. 청구항 2에 있어서,
    동일 공급원인 성분에서 선택되는 하나의 성분은
    아미노산(Amino Acids)에서는 L-Arginine Monobydrochloride, L-Asparatic acid, L-Cystine Dibydrochloride, L-Histidine Monobydrochloride Monobydrate 이고,
    무기염(Inorganic Salts)에서는 Calcium Chloride Dihydrate, Ferrous Sulfate Heptabydrate, Magnesium Sulfate Anbydrous, Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous 이며,
    비타민(Vitamins)에서는 Pyridoxal Hydrochloride인 것을 특징으로 하는 중간엽 줄기세포 기본 배양 배지.
  7. 청구항 2에 있어서,
    ABM-M 배지는 CD166, CD105, CD90, CD44, CD29, CD73, HLA-ABC 양성 표면 마커를 80% 이상 발현하되, CD44, CD105, CD90, CD73와 CD166 양성 표면 마커는 95% 이상 발현하고, CD14, CD31, CD34, CD45, CD80와 HLA-DR 음성 표면 마커를 5%이하 발현하는 것을 특징으로 하는 중간엽 줄기세포 기본 배양 배지.
  8. 청구항 2의 ABM-M(Advanced Basic Media-Mesenchymal stem cell) 배지에서 중간엽 줄기세포가 배양된 다음에 우태아혈청, Dexamethasone, ß-Glycerophosphate, Ascorbic acid를 포함하는 α-MEM 배지에서 다시 배양분화되어 골 형성세포로 분화되는 것을 특징으로 하는 골 결실 치료용 세포치료제.
  9. 청구항 2의 ABM-M(Advanced Basic Media-Mesenchymal stem cell) 배지에서 중간엽 줄기세포가 배양된 다음에 Dexamethasone, Ascorbic acid와 Sodium pyruvate, TGF-β, BMP-2를 포함하는 DMEM low glucose 배지에서 다시 배양분화되어 연골세포로 분화되는 것을 특징으로 하는 골관절염 치료용 세포치료제.
  10. 청구항 2의 ABM-M(Advanced Basic Media-Mesenchymal stem cell) 배지에서 중간엽 줄기세포가 배양된 다음에 우태아혈청, Ddexamethasone, Indomethacin, Insulin을 포함하는 α-MEM 배지에서 다시 배양분화되어 지방세포로 분화되는 것을 특징으로 하는 지방조직 형성용 세포치료제.
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