TR201802355T4 - Mezenkimal kök hücreler için bir bazik kültür ortamının hazırlanmasına yönelik yöntem, menzenkimal kök hücreler için bazik kültür ortamı ve benzerini kullanarak kültürlenmiş ve farklılaştırılmış hücre terapötik ajanı. - Google Patents

Abstract

Burada mezenkimal kök hücreler için bir bazik kültür ortamı ve immünolojik bir hücresel terapötik ajan açıklanmaktadır. Bazik kültür ortamı, insan kemik iliği ve adipoz dokusu gibi bir yetişkinin dokusundan türetilen farklılaştırılmamış mezenkimal kök hücrelerin proliferasyon oranının arttırılması ile toplama işleminden kütle kültürlenmesine kadar geçen süreyi azaltmakta ve kemik ilikleri için, kıkırdak hücreleri için ya da yağ hücreleri için kullanılan ajanların işlenmesinde çeşitli farklılaştırmalar yapabilme kabiliyetine sahiptir.

Description

TARIFNAME MEZENKIMAL KÖK HÜCRELER IÇIN BIR BAZIK KÜLTÜR ORTAMlNlN HAZIRLANMASINA YÖNELIK YÖNTEM, MENZENKIMAL KÖK HÜCRELER IÇIN BAZIK KÜLTÜR ORTAMI VE BENZERINI KULLANARAK KÜLTÜRLENMIS VE FARKLILASTIRILMIS HÜCRE TERAPÖTIK AJANI Teknik Alan Mevcut bulus mezenkimal kök hücreler için gelistirilmis bir temel kültür ortamEile ilgilidir.

Burada kemik iliginden ve yagdan türetilmis mezenkimal kök hücreler için bir bazik kültür ortami mezenkimal kök hücreler için bir bazik kültür ortamEolusturmak için bir yöntem; mezenkimal kök hücreler için bir bazik kültür ortamüve benzeri kullanüarak kültürlenmis ve farklülastmühiß olan bir hücresel terapötik ajan açüllamaktadß; söz konusu yöntem, in vitro ortamda kemik iligi ve yagdan türetilmis mezenkimal kök hücrelerin kültürleme prosedürü esnaslnda toplama isleminden kütlesel kültürlemeye kadar geçen süreyi klsaltmak amaciyla ticari ortam kullanilan mezenkimal kök hücrelerin kültürlendigi konvansiyonel teknik ile klýaslandglîida mezenkimal kök hücrelerin büyüme hîümarttlîma ve erken kültürlenmis mezenkimal kök hücrelerini osteblastlarm, kondrositlerin ve adipositlerin terapötik ajanlarE halinde çoklu-fark] IastEma kabiliyetine sahiptir. Önceki Teknik Kök hücre teknolojisi, son zamanlarda doku mühendisligi kullan [Barak rejeneratif tpta zor tedavi edilebilen hastalLk tedavisi için yeni bir alan olarak sunulmustur, DolayLdlyla, kök hücrelerin incelenmesine yönelik olarak artan bir ilgi vardir ve proliferasyon ve farklllasma yoluyla dokular olusturabilen kök hücrelerin, çogu hastallklarl, doku hasarlnl ve benzerini çözdükleri kabul edilmektedir.

Kök hücreler, farkIJhstEJInamE bir durumda otomatik replikasyon kabiliyetine sahiptir ve uygun kosullar alt Eda özel hücrelere ayr Ülilar. Kök hücreler kökenine baglEblarak embriyonik kök hücrelere ve yetiskin kök hücrelere ayrüabilmektedir. Insan embriyonik kök hücreleri, bir insana dönüsme ihtimali olan bir embriyodan elde edildigi için mükemmel hücre proliferasyonuna ve bunlari farkl]lasmas Ela ragmen biyo-etik somnlarîortaya koymaktadîl.

Yetiskin kök hücreler, embriyonik kök hücrelere kýasla sliiljfarklîasma kapasitesine sahiptir ancak çesitli insan organlarEida önceden var olan hücreler kemik iligi, kan, beyin, deri ve benzerinden toplandLgLrldan biyoetik açsmdan daha az sorunludurlar, böylece kök hücreler üretmektedirler.

Mezenkimal kök hücreler, ilk olarak yetiskin kemik iliginden izole edilmistir (Y. Jiang ve dokularîlda da kesfedilmistir (J.G. Toma ve digerleri, Nat. Cell Biol., 3:77& 200]; M.

Buna ek olarak kemik iligi gibi farklIasma kapasitesine sahip adipozdan türetilmis mezenkimal kök hücreler son olarak adipoz dokusunda kesfedilmistir (B. Cousin et al,. ve digerleri, J. Cell Physiol., .

Insan kemik iliginden mezenkimal kök hücrelerin izole edilmesine yönelik teknikler ve adipoz dokusundan mezenkimal kök hücrelerin izole edilmesine yönelik teknikler, Pittenger van, ve digerleri (J. Clin. Invest., 58: 699, 1976). Bu literatürlerde hücre kültürü için (X-MEM veya DMEM ve %10 ila 20 fetal bovin serum kullanülnßtm Bununla birlikte mezenkimal kök hücreler, kemik iligi ve adipoz dokusu gibi ve düsük büyüme hâüa sahip hücreler gibi yetiskinlerin dokularßda oldukça nadir bulunmaktadm ve uzun süre boyunca farklEasmadan muhafaza edilmeleri zordur ve buna baglüolarak in vitro ortamda proliferasyon yoluyla korunmalarjve Spesifik olarak elenmis ortam olmaksülîl kültürlenmeleri oldukça zordur.

Memeli hücre kültür ortam ;l büyük ölçüde hücresel biyosentez için kullanilanlar, biyolojik enerji metabolizmas`liçin kullanilanlar ve birçok metabolik islem için veya intraselüler fizyolojik fenomenin düzenlenmesi için katalizör olarak görev görenler olarak siîllandiîan yaklasE 50 bilesenden meydana gelmektedir. Yani kültür ortamüiçin kullanman ortam; izotonik çözelti bilesenleri, tampon çözelti bilesenleri, enerji kaynaklarîlolarak amino asitler, vitaminler ve inorganik tuzlar ve diger türlerdeki çesitli takviyeleri içeren besin bilesenlerinden meydana gelmektedir.

Buna ek olarak hücresel karakteristiklere baglj olarak yaklasEk olarak %5 ila 20 serum takviyesi; hücre proliferasyonu için uygun olan; proteaz aktivitesini inhibe eden ve büyüme ve memeli hücrelerinin aktivitesini artt hjarak pH seviyesinin ayarlanmas Lliçin bir tampon vazifesi gören çesitli hormonlarl,lbüyüme faktörlerini, yaglar lve vitaminleri temin etmektedir. Memeli hücrelerinin kültürlenmesi için kullanllan ortaml olusturan bilesenler için bilesenlerin konsantrasyonlarl've bilesimi, her ortamîi türüne dayalTolarak çesitlenmektedir. Bu yöntein arac'llg yla Morgan ve digerleri, 1950'lerde vücut slv sl lbilesimine dayanan M119 ortamin l olusturmus ve fetal hücreleri kültürlenmistir (primary chick) (Morgan, ve digerleri, 1950).

Kültür ortami minimum esansiyel ortam (MEM; Eagle, 1955), Rosewel Park Memorial (DMEM; Dulbecoo, ve digerleri, 1959) gibi hücre kültürü için basit ve yaygß olarak kullanman ortam ve DMEM ortamEiEi Iscove modifikasyonu (IMDM) Ham F12 (Ham, 1965) ve Connaught Medical Research Laboratories (CMRL)-1666 gibi daha kannask olan birçok zenginlestirilmis bilesene sahip olan ortam olarak büyük ölçüde sLnLtland nLlrnaktadJi Memeli hücrelerinin büyüme egrisi, normal olarak 2 ila 3 günlük bir gecikme evresine sahiptir ve yasayan hücrelerin konsantrasyonu, glutamin metaboliti olan amonyuin ve bir glukoz metaboliti olan laktik asit akümülasyonundan dolayügecikme evresinin bitiminden hîljbir sekilde azalmaktadE. Glukoz ve glutamin, memelilerin ana metabolik yollarßda ana karbon kaynagü ve enerji kaynagüolarak kullanErnaktadE. Glukoz, memeli hücrelerinde glikoliz yoluyla piruvik aside metabolize edilmektedir. Buna ek olarak pentoz, nükleik asit senteziyle sonuçlanan bir pentoz fosfat yolu vasEtlasßlla hazmlanmaktadEl Glikoliz yoluyla üretilen piruvik asit, karbondioksit ve suya ayrmabilir veya TCA döngüsü yoluyla laktik asit haline getirilebilmekte ve ayrkia yag asidine dönüsebilmektedir. Glutamin, memeli hücre metabolizmas nda kullan lan karbon kaynaklarlnln dldlnda benzersizdir. Metabolik proseslerde baz lglutainin, daha sonra diger amino asitleri sentezlemek amaclyla bir karbon iskeleti olusturmak üzere TCA döngüsüne giren glutamata dönüsmektedir. Memeli hücrelerin ana dEklIarülaktik asit ve amonyakti ve alanin bosaltIhEda önemlidir. Laktat ve amonyak, hücre içi pH seviyesini ve lizozomal pH seviyesini degistirmekte ve böylece hücreler üzerinde toksinler olarak etki etmektedir. Fizyolojik mekanizmalar ve beslenme gereksinimleri, kültür hücrelerinin türüne baglüolarak degistigi için, hücre kültüründe kullanElan ortamEi türünün, ortamEl özelliklerine bagl llarak da çesitlendirilmesi gerekmektedir.

Buna baglEolarak insan kemik iligi ve adipoz dokusu gibi yetiskin dokular lîldan türetilmis olan farklühstmülnamß mezenkimal kök hücrelerin in vitro ortamda çogaltJInas Eve kültürlenmesi amaclyla fârklülastliitltnamts mezenkimal kök hücrelerin büyüme kosullariiçin uygun olan ortam bilesimi farkli olacaktlii.

Konvansiyonel olarak mezenkimal kök hücrelerin in vitro ortamda çogaltllmasF ve kültürlenmesi için kullanllan kültür ortam lhakk nda birçok çallsma asag daki gibi gerçeklestirilmistir.

Patent Dokümanül (Method for Mass-Producing Growth Factor Using Mesenchymal Stem Cells), önemli ölçüde büyük miktarlardaki insan büyüme faktörlerinin sentezlenmesi ile mezenkimal kök hücrelerden büyüme faktörlerinin farklIast iüînasßjarttîmak için DMEM temelinde Ham F-12 ile desteklenen bir serum içermeyen ortamüaçüîlamaktadi Bununla birlikte bu; DMEM ortamBEl, bazik fibroblast büyüme faktörü, vasküler endotelyal büyüme faktörü ya da mezenkimal kök hücrelerin çogaltlrnas Lndan farklLolarak mezenkimal kök hücrelerden insan dönüstürme büyüme faktörü-betanlnl lkütlesel üretimi için Ham F-12 ile kar sltrilldlg bir bazik ortamdlr'.

Patent DokümanE 2 (Medium Composition Necessary for In Vitra Proliferation of Mesenchymal Stem Cells Derived from Umbilical Cord Blood, Containing Soy Protein Hydrolysate), fetal bovin serumu miktaruîm azaltEImas Damacgtla fetal bovin serumu içeren bir düsük glukozlu DMEM ortamßa bir kök hücre kültür ortammi bileseni olarak bir soya proteini hidrolizatElEi ilave edilmesine yönelik bir teknik ile ilgilidir.

Patent DokümanLB (Method for Preparing Dennal Papilla Tissue Using Mesenchymal Stem Cells) ve Patent Dokümanll4 (Method for Preparing Dermal Papilla Tissue Using Mesenchymal Stem Cells); DMEM, DMEM/F-IZ, F-12, McCoy,s 5A, RPMI 1640, Williams, medium E veya lscove°s modified Dulbeccoss modification (IMDM) ortamlarîlda mezenkimal kök hücrelerin kültürlenmesi ve ardlîidan derrnal papilla dokular: halinde farklflhsmanlîi indüklenmesine yönelik teknikler ile ilgilidir ve bir ticari bazik hücre kültür ortamüia hidrokortizon, insülin, transferin ve sodyum selenit ilave edilmesi ile elde edilen bir ortamE aç Üglamaktad E.

Patent Dokümanü5 (Mesenchymal Stem Cell Culture Medium and Method for Culturing Mesenchymal Stem Cells Using Same); bir baz olarak bir besin karßßijle takviye edilen bir ticari otam kullanilarak ve ek olarak mezenkimal kök hücrelerin büyüme faktörleri olan insülin, hidrokortizon, EGF, LIF, GM-CSF ve benzerinin ilave edilmesi ile mezenkimal kök hücrelerin kültürlenmcsine yönelik teknik ile ilgilidir ve ticari kültür ortam lortam lile bir besin kar s mlnln kar st ri lmas ria yönelik bir kültür teknigini aç klamaktadlri.

Patent Dokümanl |6 (Multipotent Stem Cells Derived from Human Adipose Tissue and Cellular Therapeutic Agents Comprising Same), bir baz olarak DMEM kullanarak ve bazik hücre kültür ortammîi DMEM oldugu NAC, rEGF, BPE, insülin ve benzeri ile takviye edilen Keratinosit-SF M ilave edilerek mezenkimal kök hücrelerin çogaltflinas ßa yönelik teknikler ile Patent DokümanD7 (Composition for Preventing or Treating Cancer, Containing Adult Stem Cell Culture or Fraction ThereoI) ve Patent DokümanZB (Isolated Pluripotent Adult Stem Cells and Methods for Isolating and Culturing Same), DMEM/Hamis F-12 karsm ortami DMEM ve DMEM/F-IZ kullanllarak mezenkimal kök hücrelerinin kültürlenmesine yönelik teknikler ile ilgilidir.

YukarEla belirtildigi gibi, klasik teknikler, bir haz olarak büyüme faktörleri gibi katkj maddelerinin ticari ortama ilave edilmesiyle kültürleme islemi ile 5 m m El IL AynE zamanda mevcut basvuru ile dosyalanmg ve kaydedilmis olan Patent D0kümanE9 (Chondrocyte-Specific Culture Method for Early Culture of Chondrocytes); katkü maddelerinin, konvansiyonel ticari ortamîilave edilmedigi kültür ortamßEi gelistirilmesi ile ilgilidir. Patent DokümanLl9 içerisinde kemik iligi ve adipoz dokusu gibi yetiskin dokularlndan izole edilmis mezenkimal kök hücreler, kültür gelistirilmis bazik ortam-kondrosit (ABM-C) kullan larak kültürlenmistir. Bununla birlikte Sekil 13'te gösterildigi gibi morfolojik anormallik ve hücre kültürü STasüida olusan baglanma kayb Fmeydana gelmis ve dolayßlýla mezenkimal kök hücreler, mezenkimal kök hücrelerin baglanamayacagiEve in vitro ortamda daha fazla çogalamayacag Bsekilde hücre kültür ortam ßda yüzmüstür. comparison of optimum culture conditions for upscaling of bone marrow-derived mesenchymal stem cells"; Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, say33, no. 3, 1 Mart growth of human bone marrow mesenchymal stromal cells cultivated in different media", Önceki Teknige ait Dokümanlar Teknigin Ayr it JJIJAç Itlamas E Teknik Problem Buna baglEblarak mevcut bulus yukar Ela belirtilen problemler bakEhEidan gerçeklestirilmistir ve mevcut bulusun bir yönü, yüksek büyüme hLzanda insan kemik iligi ve adipoz dokusu gibi yetiskin dokularlndan türetilmis farkl last nllmam S mezenkimal kök hücrelerinin çok büyük Ölçeklerde çogaltllmaslnl lve kültürlenmesin gerçeklestirebilen kabiliyetine sahip mezenkimal kök hücreler için bir bazik kültür ortam l'temin etmeyi amaçlamaktad IT.

Mevcut aç [Elamanîl bir diger yönü; hücresel terapötik ajan Et, farklhstmlnamß mezenkimal kök hücreleri için bazik kültür ortamEkullanarak yetiskin hücrelerinden türetilen mezenkimal kök hücrelerini 0steblastlar, kondrositler ve adipositler halinde in vitro ortamda farkllastidgj farkllastihnamß mezenkimal kök hücreler içeren bir hücresel terapötik ajan temin etmektir.

Teknik Çözüm Mevcut bulusa uygun olarak asag Ldaki tabloda verildigi üzere bilesenler ve mg/L halindeki ayri miktarlar liçeren mezenkimal kök hücreler için bir gelistirilmis bazik kültür ortaml ltemin edilmektedir: bilesen miktar [mg/1] L-arjinin monohidroklorür 211 L-asparjin anhidröz 50 L-aspartik asit 20 L-sistin dihidroklorür 62,6 L-glutamik asit 20 L-glutamin 5 84 L-histidin monohidroklorür 42 L-hidroksi-L-prolin 20 L-izolösin 105 L-lösin 105 L-lizin monohidroklorür 146 L-metiyonin 30 L-fenilanin 66 L-prolin 34,5 L-serin 42 L-treonin 95 L-triptofan 16 L-tirosin disodyum tuz dihidrat 103,79 L-Valin 94 Kalsiyum klorür dihidrat 265 Bakîl sülfat pentahidrat 0,0025 Magnezyum sülfat anhidröz 97,67 Potasyum klorür 400 Sodyum klorür 6400 Sodyum fosfat dibazik anhidröz 142,04 Askorbik asit fosfat 50 Kolin klorür 13,96 D-biyotin 0,2 D-Ca pantotenat 4 Folik asit 4 Myo-inositol 35 Nikotinamid (nikotinik asit amid) 4 p-aminobenzoik asit (PABA) 1 Piridoksal dihidroklorür 4 Ribotlavin 0,4 Tiyamin dihidroklorür 4 B12 Vitamini 1,36 D-glukoz anhidröz 4500 hipoksantin 4,08 L-glutatyon azaltÜInE 1 Linoleik asit 0,084 Fenol klrtmlzllsll sodyum tuzu 15,9 Putresin+2HC1 0,161 Sodyum piruvat 1 10 Tioktik asit 0,21 Mevcut bulusun bir yönüne uygun olarak mezenkimal kök hücrelerin olusturulmasEbir yöntem temin edilmektedir; söz konusu yöntem: ticari kültür ortam da ait bilesenlerin türünün analiz edilmesi ve ardlndan ticari kültür ortam na ait iki ya da daha fazla türün birlestirilmesi ile bazik kültür ortainl bilesimi adaylarln n hazirlanmasln lve bazik kültür ortam' [bilesimi adaylari `için büyüme hülarmîi analiz edilmesi ile mezenkimal kök hücrelerinin erken kültürü için uygun olan bir bazik kültür ortam Üilesiminin taranmasßüçermektedir.

Mevcut bulusun bir yönüne uygun olarak mezenkimal kök hücreler için bir bazik kültür ortam temin edilmektedir; burada bir gelistirilmis bazik ortam-mezenkimal kök hücre (ABM- M), DMEM yüksek glukoz, RPMl-1640 ve Ham F-12'nin ticari ortam olarak ayrl olarak 1:1:1 oranlîida karl-sltrlfldgîbir bazik ortam ?DMEM yüksek glukoz, RPMI-1640 ve Ham F-12 ile karsllastlrarak ve bazik bilesenler olarak DMEM yük glukozun bilesenlerini kullanarak olusturulmaktad E; burada aerortamlîi üst üste gelen bilesenleri, daha yüksek konsantrasyonlara sahip olacak sekilde seçilirken üst üste gelen bilesenlerinin, DMEM yüksek glukoz içerisinde bulunmamas Ehalinde üst üste gelen bilesenlerin DMEM yüksek glukoz içerisinde bulunmas Ba izin verilmektedir; burada ayrEortamEi sadece birinde bulunan bilesenler, burada tek bas Eta konsantrasyonlar:muhafaza etmek edecek sekilde seçilirken bilesenlerinin, DMEM yüksek glukoz içerisinde bulunmamasE halinde bilesenlerin DMEM yüksek glukoz içerisinde bulunmas îla izin verilmektedir; burada seçilen bilesen ayrEortamlîi bir üst üste gelen bileseni olmas _Jdurumunda aerlortaInLn bilesenleri aras Lndaki benzer tedarik kaynag na uygun olan bilesenlerden seçilen bir bilesen, daha yüksek konsantrasyonlara sahip olacak sekilde seçilirken üst üste gelen bilesenlerinin, DMEM yüksek glukoz içerisinde bulunmamasl | halinde seçilen bilesenin, DM EM yüksek glukoz içerisinde bulunmas lîia izin verilmektedir.

Mezenkimal kök hücreler için bazik kültür ortamida DMEM yüksek glukozuna ilave edilen bilesenler: L-alanin, L-asparjin anhidröz, L-aspartik asit, L-glutamik asit, L-hidroksi-L-prolin, ve L-prolin in görünüm film amino asitler; bak& sülfat pentahidrat, feröz sülfat heptahidrat, sodyum fosfat dibazik anhidröz, ve inorganik tuzlar bakßiüdan çinko sülfat heptahidrat; D- biyotin, P-aminobenzoik asit (PABA), ve vitaminler bakEhßdan B12 Vitamini; ve hipoksantin, azalttlmts L-glutatyon, lino'leik asit, putresin+2HCl, tioktik asit, ve diger bilesenler bakmtndan timidin içermektedir.

Mezenkimal kök hücreler için bazik kültür ortamîlda, ABM-M, ek olarak fetal bovin, ekuin veya insan serumu, L-glutamin, antibiyotik ajanlar ve mantarkianlardan en az birini içerebilmektedir.

Mezenkimal kök hücreler için bazik kültür ortamEida, ABM-M, ek olarak %10 ila 20 fetal bovin serum ve 2 ila 4 mM L-glutamin içerebilmektedir.

Mezenkimal kök hücreler için bazik kültür ortamlîida benzer tedarik kaynagüa uygun bilesenlerden seçilen bir bilesen: L-arjinin monohidroklorür, L-aspartik asit, L-sistin dihidroklorür, ve amino asitler bakLmndan L-histidin monohidroklorür monohidrat; kalsiyum klorür dihidrat, feröz sülfat heptahidrat, magnezyum sülfat anhidröz, ve inorganik tuz baklmrtdan sodyum fosfat dibazik anhidröz; ve vitaininler bak Inlndan piridoksal dihidroklorür içermektedir.

Mezenkiinal kök hücreler için bazik kültür ortamlîida ABM-M; CD166, CDIOS, CD90, CD44, CD29, CD73, ve HLA-ABC pozitif yüzey isaretleyicilerini %80 veya daha faza CD80, ve HLA-DR negatif yüzey isaretleyicilerini %5 veya daha az eksprese edebilmektedir.

Mevcut bulusun bir diger yönüne göre kemik kusurlarîiîl tedavi edilmesine yönelik kullan lan bir hücresel terapötik ajan Jtemin edilmektedir; burada mezenkimal kök hücreler, gelistirilmis bazik ortamll-mezenkimal kök hücre (ABM-M) içerisinde kültürlenmekte ve ard ndan osteblastlar olarak farklllasmamaslna izin vererek fetal bovin serum, deksametason, ß-gliserofosfat ve askorbik asit içeren (x-MEM içerisinde tekrar kültürlenmekte ve farkl Jlast Minaktad m.

Mevcut bulusun bir diger yönüne göre osteoartiriin tedavi edilmesine yönelik kullan Ian bir hücresel terapötik ajan temin edilmektedir; burada mezenkimal kök hücreler, gelistirilmis basit ortamlgmezenkimal kök hücre (ABM-M) içerisinde kültürlenmekte ve ardîldan kondrositler olarak farklüasmamas Ela izin vererek deksametason, sodyum piruvat, TGF-ß ve BMP-2 içeren a-MEM içerisinde tekrar kültürlenmekte ve farklLlastLrLlinaktad Lr.

Mevcut bulusun bir diger yönüne göre adipositlerin olusturulmasina yönelik kullan lan bir hücresel terapötik ajanTtemin edilmektedir; burada mezenkimal kök hücreler, gelistirilmis basit ortamlgmezenkimal kök hücre (ABM-M) içerisinde kültürlenmekte ve ardidan farkIJhsmamasßa izin vererek fetal bovin seium, deksametason, indoinetazin ve insülin içeren u-MEM içerisinde tekrar kültürlenmekte ve farklEIastEÜ'maktad E.

Avantaj l Etkiler Insan yetiskin kök hücreleri olan farkansmamLS mezenkimal kök hücreler, mevcut bulusa ait mezenkimal kök hücreler için yukarida belirtilen bazik kültür ortaml ile yüksek bir büyüme h 2 nda kitlesel olarak üretilebilmekte ve kültürlenebilmektedir; kültürleme ve proliferasyona ragmen bir ay veya daha uzun bir süre boyunca hücrelerin karyotipi muhafaza edilebilmektedir ve mezensimal kök hücreler, osteoblastlar, kondrositler ve adipositlerin türevlerinin farl Tastüilnas _yoluyla bir hücre terapötik ajan _blarak kullan Habilmektedir.

Sekillerin KEa Aç Elamas 3 SEKIL 1; kemik iliginden türetilmis mezenkimal kök hücreler, bir kontrol grubu olarak MSC-BM, ilave katk Emaddeleri ve %10 fetal bovin serum içeren ortam ve mevcut bulusun ABM-M, ilave katkEmaddeleri ve %10 fetal bovin serum içeren ortam içerisinde T75 siselerinde 10 günlük kültürlemeye müteakiben 375,000 hücrede inoküle edilmesinden sonra mezenkimal kök hücrelerinin büyümesini gösteren bir grafigi göstermektedir.

SEKIL 2; adipozdan türetilmis mezenkimal kök hücreler, bir kontrol grubu olarak ADSCGM ve %10 fetal bovin seruma ek olarak mevcut bulusun ABM-M'sini içeren ortam içerisinde T75 siselerinde 7 günlük kültürlemeye müteakiben 375,000 hücrede inoküle edilmesinden ve mezenkimal kök hücrelerinin, yetistirilmesi ve alt kültürlenmesi ve edilmesinden sonra mezenkimal kök hücrelerinin büyümesini gösteren bir grafigi göstermektedir.

SEKIL 3, bir kontrol grubu olarak MSC-BM, ilave katkjmaddeleri ve %10 fetal bovin serum içeren ortamda ve mevcut bulusun ABM-M'si, ilave katkdmaddeleri ve %10 fetal bovin serum içeren ortamda kemik iliginden türetilmis mezenkimal kök hücrelerin yetistirilmesi ile mezenkimal kök hücrenin büyüme hlz ni gösteren bir grafigi göstermektedir.

SEKIL 4, bir kontrol grubu olarak ADSCGM içerisindeki adipozdan türetilmis mezenkimal kök hücrelerin yetistirilmesi ile her geçit için mezenkimal kök hücrenin büyüme hâßüve ABM-M'sine ilave %10 fetal bovin serum içeren ortamEgösteren bir grafigi göstermektedir.

SEKIL 5, bir kontrol grubu olarak MSCGM veya ADSCGM içerisinde kültürlenen kemik iligi ya da adipozdan türetilmis mezenkimal kök hücreler ve mevcut bulusun ABM-M'sine ek olarak %10 fetal bovin serum serum ve 2 mM L-glutamin (SS; hücre içerisindeki granüler içerik, FS; hücre boyutu) içeren ortam kültürlenen kemik iligi ya da adipozdan türetilmis mezenkimal kök hücreler üzerinde akîsl sitometrisinin uygulanmasEile hücrelerin boyutu ve fenotipi bakLandan degisiklikleri gösteren grafikleri göstermektedir.

SEKIL 6; mevcut bulusun ABM-M'sine ek olarak %10 fetal bovin serum ve 2 mM L- glutamin içeren ortamda kemik iliginden türetilmis mezenkimal kök hücrelerin hücresel immünoloj ik karakteristiklerini gösteren histogramlar _göstermektedin SEKIL 7; mevcut bulusun ABM-M'sine ek olarak %10 fetal bovin serum ve 2 mM L- glutamin içeren ortamda adipozdan türetilmis mezenkimal kök hücrelerin hücresel immünoloj ik karakteristiklerini gösteren histogramlar :göstermektedir SEKIL 8; kemik iligi ve adipozdan türetilmis mezenkimal kök hücreler, mevcut bulusun ABM-M'sine ek olarak %10 fetal bovin serum ve 2 mM L-glutamin içeren ortamda kültürlendikten ve ard &dan 2 ila 3 haftalR osteoblast farklüast Emas Eiçin kültür ortamEida tekrar kültürlendikten ve farklEIastiEIdEktan sonra (%10 fetal bovin serum, 10 mM ß-gliserol fosfat, 50 uM askorbik asit ve ALPase ve von Kossa boyama görüntülerini göstermektedir.

SEKIL 9; kemik iligi ve adipozdan türetilmis mezenkimal kök hücreler, mevcut bulusun ABM-M'sine ek olarak %10 fetal bovin serum ve 2 mM L-glutamin içeren ortamda kültürlendikten ve ardmdan 2 haftall'll adiposit farklflastîlmasl_ için ortamda tekrar kültürlendikten ve farklüastlîüdüîtan sonra (%10 fetal bovin serum, 10'7 M deksametason, Red-O boyama görüntülerini göstermektedir.

SEKIL 10, H/E boyama, safranin O boyama, alsiyan mavisi boyama, sirius kEmâßEboyama, COMP boyama ve bir parafin gömme prosedürü yoluyla 5-um seri kREldak dokusunun kolajen tip II ve I boyama islemlerini göstermektedir; burada kEEEdak dokusu, mevcut bulusun ABM-M'sine ek %10 fetal bovin ve 2 mM L-glutamin içeren ortamda kültürlenmis kemik iliginden türetilmis mezenkimal kök hücrelerin kültürlenmesi ve ardlndan kondrositler içerisinde fark] last rman n indüklenmesi amaciyla 5 adet 105 hücrenin yaklaslk olarak 300 g'nlîl 5 dakika boyunca santrilî'ijlenmesi ve 10"7 M deksametason, 50 uM askorbik asit, l nM sodyum piruvat, 10 ng/mL TGF-ß ve 100 ng/mL BMP-2 içeren DMEM yüksek glukozlu ortamda 3 hafta boyunca kültürlenmis mezenkimal kök hücrelerin yeniden kültürlenmesi ve farklüastmüînasüle elde edilmektedir.

SEKIL 'll, mevcut bulusun ABM-M'sine ek olarak %10 fetal bovin serum ve 2 mM L- glutamin içeren ortamda kemik iliginden türetilmis mezenkimal kök hücrelerin kültüründe geçitten sonraki karyotip analiz görüntülerini göstermektedir.

SEKIL 12, mevcut bulusun ABM-M'sine ek olarak %10 fetal bovin serum ve 2 mM L- glutamin içeren ortamda adipozdan türetilmis mezenkimal kök hücrelerin kültüründe 10 geçitten sonraki karyotip analiz görüntülerini göstermektedir.

SEKIL 13, konvansiyonel ABM-C'de mezenkimal kök hücreler kültürlenirken mezenkimal kök hücrelerdeki morfolojik anormallikleri ve baglanma kaybnl gösteren bir görüntüyü göstermektedir.

Bulusun Gerçeklestirilmesi Için En Iyi Yöntem Mevcut bulus, mezenkimal kök hücreler için bir bazik kültür ortamütemin etmektedir ve mezenkimal kök hücreler için bazik kültür ortamÇ ticari kültür ortamßa ait bilesenlerin türünün analiz edilmesi ve ardmdan ticari kültür ortamßa ait iki ya da daha fazla türün birlestirilmesi ile bazik kültür ortamEbilesimi adaylarEiEi hazßlanmasEiEve bazik kültür ortam jbilesimi adaylarjiçin %10 ila 20 fetal bovin serum içeren tam bir ortam içerisinde mezenkimal kök hücrelerin büyüme hzlarhjn analiz edilmesi ile mezenkimal kök hücrelerinin erken kültürü için uygun olan bir bazik kültür ortaml lbilesiminin taranmas l adlmlar nin içerilmesi ile olusturulmaktadlr.

Bu bulusun mezensimal kök hücreleri için bu sekilde olusturulmus temel kültür ortamjyüksek bir büyüme hEEida erken kültürlenen mezenkimal kök hücrelerinin hücre immünolojik özelliklerini sergileyip sergilemedigini analiz etmek, mezenkimal kök hücrelerin osteoblastlara, kondrositlere ve adipositlere farklflaslîi farklIasmadEgma yönelik farklüasma kapasitesini analiz etmek ve mezenkimal kök hücrelerin, kromozom anormalligine baglEblarak herhangi bir mutasyona neden olmadan uzun süre kültürlenip kültürlenemeyecegini teyit etmek, dolayleyla kemik kusurlarnLn tedavi edilmesi, osteoartritin tedavi edilmesi ve adipoz dokusu formasyonu yoluyla adipositlerin tedavi edilmesi için mezenkimal kök hücrelerin bir terapötik ajan olarak kullanlllp kullanllamayacaglnl lonaylamak amaclyla hücre karyotipinin analiz edilmesi için kullan Fllnaktad li.

Burada, hücrenin immünolojik özellikleri, farkIJhsma kapasitesi ve hücre karyotipi; mevcut bulusun mezenkimal kök hücreleri için temel kültür ortamEiEl, bir hücre terapötik maddesi için kullan Iabilecegini dogrulamak için analiz edilmesi gerekmektedir ve deneyler yoluyla su sEaya göre dogrulama yapEmasEtercih edilmektedir Dogrulama: taranan ortam bilesiminde kültürlenen mezenkimal kök hücrelerin hücresel immünoloj ik hücre karakteristiklerinin analiz edilmesi admilî, taranan ortam bilesiminde kültürlenen mezenkimal kök hücrelerin farklühsma kapasitesinin analiz edilmesi adßijve taranan ortam bilesiminde kültürlenen mezenkimal kök hücrelerin uzun süre boyunca kültürlenebildiginin dogrulanmas Ltiçin hücre karyotipinin analiz edilmesi adlm ile yürütülmektedir.

Bundan sonra mevcut bulus, asag da ayrîlt lTblarak aç klanacaktm Mevcut bulusun mezenkimal kök hücreleri için bazik kültür ortamFolan gelistirilmis bazik ortam-mezenkimal kök hücreler (ABM-M), ticari kültür ortamjolan DMEM yüksek glukoz, RPMl-1640 ve Ham F-12'nin lzlzl oranßda kargtlîldtgübir bazik ortamm hazmanmasjve bazik bilesenler olarak DMEM yüksek glukozun bilesenlerinin kullanütnasj ile olusturulmaktadîl Burada, bazik ortam; ilgili ortam, DMEM yüksek glukozlu, RPMI 1640 ve Ham's F-lZ ortamlarEile kars JhstEJInSt 3. Burada ilgili ortamEl üst üste gelen bilesenleri, daha yüksek konsantrasyona sahip olacak sekilde seçilirken üst üste gelen bilesenlerinin, DMEM yüksek glukoz içerisinde bulunmamasuhalinde üst üste gelen bilesenlerin DMEM yüksek glukoz içerisinde bulunmaslna izin verilmektedir (tablo 1'in not kolonunda @); burada ilgili ortam n sadece birindeki bilesen, konsantrasyonun yerinde muhafaza edilecegi sekilde seçilirken bilesenin, DMEM yüksek glukoz içerisinde bulunmamasFlhalinde bilesenin, buraya ilave yoluyla DMEM yüksek glukozlu ortam içerisinde bulunmas Ea izin verilmektedir (tablo 1'in not kolonunda ®); burada seçilen bilesenin ilgili ortamln bir üst üste gelen bileseni olmas l durumunda ilgili ortamln bilesenleri araslndaki benzer tedarik kaynaglna uygun olan bilesenlerden seçilen bir bilesen, daha yüksek konsantrasyona sahip olacak sekilde seçilirken seçilen bilesenin, DMEM yüksek glukoz içerisinde bulunmamasjhalinde seçilen bilesenin, DMEM yüksek glukoz içerisinde bulunmaslna izin verilmektedir (tablo l'in not kolonunda ® ). Dolayîýla ortam tablo 1'de gösterildigi gibi olusturulmaktad m.

Ticari ortam ve ABM-M bilesimleri Bilesenler (mg/L) DMEM RPMI F-12 ABM-M NOT Amino Asitler Glisin 30 10 7,51 30 (D L-Alanin 9 9 ®,içerir L-Arjinin Içermeyen Baz 200 © L-Arjinin Monohidroklorür 84 211 211 L-Asparjin Anhidröz 50 50 © _ _ L-Asparjin M0n0hidrat 15,01 Bilesenler (mg/L) DMEM RPMI F-12 ABM-M NOT Amino Asitler L-Aspartik asit 20 13,3 20 ® içerir L-Sistein Monohidroklorür Monohidrat 35 © L-Sistin Dihidroklorür 62,6 65,2 62,6 L-Glutamik Asit 20 14,7 20 ® içerir L-Histidin 151 © L-Histidin Monohidroklorür 42 20,96 42 L-Hidroksi-L-Prolin 20 20 ' L-Metiyonin 30 15 4,48 30 G) L-Fenilanin 66 15 4,96 66 (D L-Serin 42 30 10,5 42 G) L-Treonin 95 20 11,9 95 ® L-Triptofan 16 5 2,04 16 G) L-Valin 94 20 11,7 94 (D Inorganik Tuzlar Kalsiyum Klorür Dihidrat 265 44,1 265 @ Kalsiyum Nitrat Tetrahidrat 100 Demir Nitrat Nonahidrat 0,] © _ i (Feröz Sülfat Heptahidrat 0,834 0,834 Magnezyum Klorür Hekzahidrat 123 © Sodyum Fosfat Monobazik Anhidröz 109 9 içerir Çinko Sülfat Heptahidrat 0,863 0,863 @D içerir Bilesenler (mg/L) DMEM RPMI F-12 ABM-M NOT Vitaminler Askorbik Asit Fosfat 50 50 500 50 G) Bilesenler (mg/L) DMEM RPMI F-12 ABM-M NOT Vitaminler Folik Asit 4 1 1,32 4 G) (Myo-inositol 7,2 35 18 35 G) Nikotinamid (Nikotinik asit amid) 4 1 0,037 4 (D P-Aminobenzoik Asit (PABA) 1 1 ® içerir Piridoksal Hidroklorür 4 4 © Tiyamin Hidroklorür 4 1 0,34 4 ® Digerler Bilesenler Hipoksantin 4,08 4,08 @5 içerir L-Glutatyon Azalt Tin Ts l 1 (2) , içerir Linoleik Asit 0,084 0,084 @, içerir Putresin+2HCL 0,161 0,161 @, içerir Sodyum Piruvat 1 10 110 110 ® Tioktik asit 0,21 0,21 ® , içerir Timidin 0,73 0,73 Q), içerir Tablo l'in not kolonunda gösterildigi üzere mevcut bulusun ABM-M baz :blan ve dolayßßtla bir ilave yoluyla DMEM yüksek glukozu ile bulunmas ßa izin verilen DMEM yüksek glukozu içerisinde mevcut olmayan bilesenler; L-Alanin (9-18 mg/L), L-Asparjin Anhidröz (1-50 (1-20 mg/L) ve amino asitler bakîhîldan L-prolin (20-34.5 mg/L); bak& sülfat pentahidrat mg/L); D-Biyotin (, ve Vitaminler azaltllns (, tioktik asit (Ol-0.21 mg/L), ve diger bilesenler bakînmdan timidindir (035-073 mg/L).

Mevcut bulusa ait mezenkimal kök hücreler için bazik kültür ortam :blan gelismis bazik ortam- mezenkimal kök hücreye (ABM-M) göre tablo 1'deki not sütunlar :asag Ila tarif edilecektir. (1) Ilgili ortamîl üst üste gelen bileseni, daha yüksek konsantrasyona sahip olacak sekilde seçilmektedir ve üst üste gelen bilesenin, ilave yoluyla DMEM yüksek glukozu içerisinde bulunmamasî l halinde üst üste gelen bilesenin DMEM yüksek glukoz içerisinde bulunmas Ba izin verilmektedir. Bu, tablo 1'i11 not kolonundaki @isaretine uymaktad i.

Bu özellik bakßiîldan konvansiyonel teknige göre patent doküman @'daki DMEM ve RPMI- 1640'tan olusan ABM-C içerisindeki mevcut bulusa ait yetiskin kök hücrelerinden türetilmis mezenkimal kök hücrelerin kültürlenmesinin sonucunda morfolojik anormallik ve baglanma Özelligi kayb da neden olmus ve bu durumlarin kompanse edilmesi amaclyla büyüme hlZl îve hücre sentezi ile iliskili bilesenler takviye edilmistir.

Amino asitler için protein sentezinin temel amino asitleri olan glisin, L-glutamin, L-izolösin, L-lösin, L-lizin, L-metiyonin, L-Fenilalanin, L-Serin, L-treonin, L-triptofan, L-tirosin, ve L- valin, daha yüksek konsantrasyonlara sahip olacak sekilde seçilmis, böylece protein sentezi h Eland 3111 Is] ve hücrelerin proliferasyonu artt Elin @t 3.

Inorganik tuzlara gelince, intraselüler ve ekstraselüler ozmotik bas mçlarla ilgili olan potasyum klorür ve sodyum klorür, uygun ozmotik bas ßçlarj muhafaza etmek için daha yüksek konsantrasyonlara sahip olacak sekilde seçilmistir.

Vitaminler olarak antioksidanlar olan askorbik asit fosfat, kolin klorür, D-biyotin (DMEM yüksek glukozunda bulunmaslna izin verilmis), D-Ca pantotenat, folik asit, myo-inositol, nikotinamid, riboflavin, tiyamin hidroklorür, ve BIZ Vitamini (DMEM yüksek glukozunda bulunmasEia izin verilmis), hücrelerin yüksek proliferasyonundan dolayD olusan atElarß giderilmesi amac [Sila daha yüksek konsantrasyonlara sahip olacak sekilde seçilmistir.

Diger bilesenler olarak ana enerji kaynagj olan D-glikoz susuzlugu, yüksek çogalmayü sürdürmek için daha yüksek konsantrasyona sahip olacak sekilde seçilmis ve hücre içi sentezde yer alan sodyum piruvat, daha yüksek bir konsantrasyona sahip olacak sekilde seçilmistir. Buna ek olarak, fenol kanLlsodyum tuzu hücrelerin proliferasyonu ile ilgili degildir, ancak fenol k nm ztls nin rengi, hücrelerin aktif proliferasyonu nedeniyle atllan atlklar tarafindan klnmlzildan sarlya dönüsmektedir ve dolaylsyla fenol kliimlztls. lsodyum tuzu, hücrelerin yüksek proliferasyon oran lîidan dolayl'atl'lan atik miktarlîl`görsel olarak ölçmek için daha yüksek bir konsantrasyona sahip olacak sekilde seçilmistir.

Buna ek olarak, prolin, kolajenin ana bilesenidir ve hücre dis] substrat sentezinin ana bilesenidir. Yüksek proliferasyona sahip mezenkimal kök hücrelerde kolajen sentezini artt Emak için prolin, DMEM yüksek glikozunda bulunmas Ela izin verilmistir.

Buna ek olarak, aspartik asit çogu proteinde bulunmaktadm ve pürin ve pirimidin bazlarlîiß bir amino grubu tedarik kaynagEblarak islev görmek üzere sitrik asit döngüsüne baglmî Bu nedenle, purin ve pirimidin bazlardyüksek proliferasyon gösteren hücrelerin DNA sentezinin ana tedarik kaynag dlrl ve ana tedarik kaynagl !olarak purin ve pirimidin bazlar nln, DMEM yüksek glikozda bulunmaslna izin verilmistir.

Buna ek olarak, hücrelerin metabolizmaslnda önemli bir ainino asit olan L-glutamik asit, hücrelerin aktif` proliferasyonunu saglamak amaclýa DMEM yüksek glukozda buluninas ila izin verilmistir. (2) Ilgili ortami sadece birindeki bilesen, konsantrasyonun yerinde muhafaza edilecegi sekilde seçilmektedir ve bilesenin, DMEM yüksek glukoz içerisinde bulunmamaslîhalinde bilesenin, buraya ilave yoluyla DMEM yüksek glukozlu ortam içerisinde bulunmas Ela izin verilmektedir. Bu, tablo l'in not kolonundaki ® isaretine uymaktad li Büyüme oran ni larttlrimak için DMEM ve RPMI-1640'dan olusan ABM-C'deki mezenkimal kök hücreler, hücre baglanma özelligini kaybetmektedir. Bunu karsllamak amacyla DMEM yüksek glikozda bulunmayan bilesenlerin, hücre içi kolajenin sentezini arttilmak ve sentezin artmasj nedeniyle ortaya çikan atlklarü uzaklastErnak için DMEM yüksek glukozunda Hücrelerin immünite ve sentezine dahil edilen bir amino asit olarak L-alanin, mezenkimal kök hücrelerin proliferasyonunu arttmmak amacglla bulunmas Ea izin verilmistir. Bir amino asit olarak L-hidroksi-L-prolin, tioktik asit ve diger bilesenler olarak linoleik asit ve intraselüler kolajenin yap Jbirimleri olan vitamin olarak P-aminobenzoik asitin (PABA), hücre baglanma özelliginin yükseltilmesi için intraselüler kolajen sentezinin arttrillmas lamaclyla DMEM yüksek glukozunda bulunmas da izin verilmistir.

Baki sülfat pentahidrat ve inorganik tuzlar olarak çinko sülfat heptahidrat ve antioksidanlar olan diger bilesenler olarak azaltEImS glutatyonun, yüksek hücresel büyüme hîlüa sahip olmak için yüksek büyüme hîßjgösteren hücrelerdeki çesitli atRlarm atüinasüjarttîmak amac Sila DMEM yüksek glukozunda bulunmas iha izin verilmistir.

DNA sentezinde bulunan diger bilesenler olarak timidin, putresin+2HCl`nin, DNA sentezi hücre proliferasyonunu arttmmak amacgzla öncelik almasj gerektigi için DMEM yüksek glukozunda bulunmas Ela izin verilmistir. (3) Ilgili ortamin bilesenleri aras nda seçilen bilesen ayr brtam n bir üst üste gelen bileseni olmasl durumunda benzer tedarik kaynaklarlna uygun olan bilesenlerden seçilen bir bilesen, seçilen bilesen üst üste gelen bilesen olmasi-durumunda daha yüksek konsantrasyonlara sahip olacak sekilde seçilmekte ve seçilen bilesenin, DMEM yüksek glukoz içerisinde bulunmamas`halinde seçilen bilesenin, DMEM yüksek glukoz içerisinde bulunmaslîla izin verilmektedir. Bu, tablo l'in not kolonundaki @isaretine uymaktadE.

L-arjinin, L-asparjin, L-sistein/sistin ve amino asitler olarak L-Histidin; kalsiyum klorür/nitrat, demir nitrat/feröz sülfat ve inorganik tuzlar olarak sodyum fosfat ve vitaminler olarak piroksidal hidroklorür/piridoksin hidroklorüre göre ayn :tedarik kaynag îla uygun gelen iki ya da daha fazla bilesenin ilavesi; ortam içerisindeki ozmotik bas E10 Eartt Emakta, hücreleri kötü bir sekilde etkilemekte, ve dolayleyla ayn _tedarik kaynagLnLetkileyerek daha yüksek bir konsantrasyona sahip olacak sekilde sadece bir bilesenin seçilmesine izin vermektedir.

Buna ek olarak, inorganik tuzlarîl bilesenleri arasîida, ortam hazîllanîlken olusabilecek tuzlar :len aza indirmek için daha az hidratlÜoilesenler seçilmistir.

Istisnai olarak daha yüksek bir konsantrasyona sahip sodyum fosfat, hücrelerin kötü etkilenmesine neden olarak ortamdaki tüm ozmotik bas ic Jart Babilecegi için sodyum fosfat uygun bir ozmotik bas îlcîi muhafaza etmek amacßila 142.04 mg/L'lik bir konsantrasyona sahip olacak sekilde seçilmistir.

Magnezyum klorür hekzahidrat ve magnezyum sülfat anhidröz, intraselüler metabolizmanln ana materyali olan magnezyum tedarik kaynaklardln. Ortamln haz nlanmas lesnaslnda tuz olusumunu azaltmak amaciyla magnezyum sülfat anhidröz seçilmis ve magnezyum sülfat anhidröz, bir üst üste gelen bilesen oldugu için daha yüksek bir konsantrasyon seçilmistir.

Yukaeraki nedenlerden dolayjamino asitler olarak tablo 1'de gösterildigi üzere L-arjinin monohidroklorür ( ve L-arjinin monohidroklorür (DMEM ve Fl2) arasmdan seçilmektedir; L-sistin dihidroklorür (62.6 mg/L), L- monohidroklorür monohidrat ve L-sistin dihidroklorür arasßdan seçilmektedir ve L-histidin monohidroklorür monohidrat (42 mg/L), L-histidin ve L-histidin monohidroklorür monohidrat aras Eida seçilmektedir. Inorganik tuzlar olarak kalsiyum klorür dihidrat (265 mg/L), kalsiyum klorür dihidrat ve kalsiyum nitrat tetrahidrat aras ndan seçilmektedir; feröz sülfat heptahidrat (0.834 mg/L), demir nitrat nonahidrat ve feröz sülfat heptahidrat araslndan seçilmektedir; magnezyum sülfat anhidröz (97.67 mg/L), magnezyum klorür hekzahidrat ve magnezyum sülfat anhidröz araslîidan seçilmektedir ve sodyum fosfat dibazik anhidröz (142.04 ing/L), sodyuin fosfat dibazik anhidröz ve sodyum fosfat monobazik anhidröz arasindan seçilmektedir.

Vitaminler olarak piridoksal dihidroklorür (4 mg/L), piridoksal dihidroklorür ve piridoksin hidroklorür aras Ildan seçilmektedir.

YukarIla açüglandEgD üzere kemik iligi ve yag gibi yetiskin hücrelerinden türetilmis mezenkimal kök hücrelerinin in vitro ortamda kültürlenmesi için mezenkimal kök hücreleri için kullanllhn bazik kültür ortam E(gelistirilmis bazik ortam-mezenkimal kök hücreler (ABM- M)), DMEM yüksek glukoz, RPMI-1640 ve Ham F-12'den baslamakta ve burada DMEM yüksek glukozu, bazik bilesenler olarak kullan lrnaktadlr.

Yani mezenkimal kök hücreler, proliferasyonun ve sentezin inaktif oldugu yetiskin hücrelerinde türetildigi için mevcut bulusa ait ABM-M, içerisinde yüksek konsantrasyonlu amino asitlere sahip olan DMEM yüksek glukozu bilesenlerinin bazik bilesenler olarak kullanJJdEgjbir ortam içerisindedir ve DMEM yüksek glukozu içerisinde bulunmayan ya da azaltltns olan amino asit konsantrasyonlarjinorganik tuzlar ve vitaminler ayarlanmaktad m.

Mezenkimal kök hücreler terimi; insanlarjiçeren memelilerin yetiskin dokularEldan türetilmis olan ve çoklu etkiye sahip olan farklLlastnUmamLs 'hücrelere refere etmektedir ve yetiskin dokular ;lkemik iligi, kari, beyin, deri, yag, kordon kanl ive benzerini içermektedir.

Mezenkiinal kök hücreler, çesitli yöntemler yoluyla kemik iligi ve adipoz dokusu gibi yetiskin dokusundan izole edilebilmektedir. Örnek olarak mezenkimal kök hücreler, percoll ve kolajenaz gibi bir enzim ile islenerek izole edilmis hücreler için bir kültür tasýlflßmda tabana baglanan ve burada yetisen tüm hücreler, Luria ve digerlerine ait yöntem ile kolay bir sekilde Mevcut bulusa ait mezenkimal kök hücreler için bazik kültür ortamü kemik iligi, kan, beyin, cilt, yag ve kordon kan Jgibi yetiskin dokularndan izole edilmis mezenkimal kök hücrelerin kültürlenmesi içindir. Gerekli olmasl durumunda bir ya da daha fazla bilesen, buraya ilave edilebilmekte ve fetal bovin, ekuin ya da insan serumu ve L-glutaminin yanl slra mikrobiyal kontaminasyonun önlenmesi için kullanilan antibiyotik ajanlar ve mantar klîanlar, ilave edilebilmektedir. Tercihen %10 ila 20 fetal bovin serum ve 2 ila 4 mM L-glutamin ilave edilmektedir.

Mezenkimal kök hücreler için bazik kültür ortamE (ABM-M) yoluyla büyüme hîîii dogrulanmasjamacglla mezenkimal kök hücreler, mevcut bulusa ait bazik kültür ortam: içerisinde kültürlenmektedir. Bu sekilde kültürlenen mezenkimal kök hücrelerin hücresel CD29, CD73, ve HLA-ABC pozitif yüzey isaretleyicilerinin, %80 veya daha faza eksprese yüzey isaretleyicilerinin %5 veya daha az eksprese edildigi hücresel immünolojik karakteristikler sergilemektedir.

Buna ek olarak bu sekilde kültürlenmis mezenkimal kök hücreler, bir plastik kültür kab Ba baglanarak ve çogalarak kovan sekilli morfoloji sergilemekte ve farkIJhstEmama durumunda çogalmani farkllasma kapasitesine sahiptir.

Buna ek olarak kültürlenmis mezenkimal kök hücrelerin, osteblastlar, kondrositler ve adipositler olarak farklLllasabilen çoklu etkili mezenkimal kök hücreler oldugunu dogrulayabilmektedir.

Ek olarak mevcut bulus; kemik kusurlarlîilîi tedavi edilmesine yönelik kullanilan gelistirilmis bazik ortamlEmezenkimal kök hücreler (ABM-M) içerisinde kültürlenen ve fetal bovin serum, deksametason, ß-gliserofosfat ve askorbik asit içeren (l-MEM içerisinde tekrar kültürlenen böylece osteblastlar olarak farklIasmamas Ela izin veren mezenkimal kök hücreler içeren bir hücresel terapötik ajan temin etmektedir.

Ek olarak mevcut bulus; osteoartiritin tedavi edilmesine yönelik kullan Jhn gelistirilmis bazik ortamIBmezenkimal kök hücreler (ABM-M) içerisinde kültürlenen ve deksametason, askorbik asit, sodyum piruvat, TGF-ß ve BMP-2 içeren DMEM düsük glukozu içerisinde tekrar kültürlenen böylece kondrositler olarak farklLlasmamasLna izin veren mezenkimal kök hücreler içeren bir hücresel terapötik ajan temin etmektedir.

Ek olarak mevcut bulus; adipoz dokusunun tedavi edilmesine yönelik kullanilan gelistirilmis bazik ortamll-mezenkimal kök hücreler (ABM-M) içerisinde kültürlenen ve fetal bovin serum, deksametason, indoinetazin ve insülin içeren (x-MEM içerisinde tekrar kültürlenen böylece adipositler olarak farklIasmamasEia izin veren mezenkimal kök hücreler içeren bir hücresel terapötik ajan temin etmektedir.

Bulusun Gerçeklestirilmesi Için Yöntem Bundan sonra mevcut bulusa ait mezenkimal kök hücreler için bazik kültür ortamü (gelistirilmis bazik ortam-mezenkimal kök hücresi) içerisinde mezenkimal kök hücrelerin proliferasyon kapasitesi, diger ortamlar içerisinde olanlar ile karsllastlnllmlst Il ve ABM-M içerisinde kültürlenen mezenkimal kök hücrelerin hücresel immünolojik karakteristiklerine dayal`ld0grulama, ABM-M içerisinde kültürlenen mezenkimal kök hücrelerin fark] Tasma kapasitesine dayalÜdogrulama ve ABM-M içerisinde kültürlenen mezenkimal kök hücrelerin hücre karyotipinin korunmas Easagßaki örnekler yoluyla aç Elanacakt 3.

Mevcut bulusa ait mezenkimal kök hücreler için balik kültür ortam ndaki (AEM-M) proliferasyon kapasitesinin kars [[astiilmas 3 Kemik iligi ve adipoz dokusu gibi yetiskin dokularlndan türetilmis mezenkimal kök hücrelerin proliferasyon kapasitelerinin analiz edilmesi amaclýla ABM-M içerisinde dondurulmus kemik iliginden türetilmis mezenkimal kök hücreler ve adipozdan türetilmis mezenkimal kök hücreler, Lonza'dan satB alßmaktadlî. Kemik iliginden türetilmis mezenkimal kök hücreler, Poietics MSCGMTM Bullekit içerisinde kültürlenmekte ve adipozdan türetilmis mezenkimal kök hücreler, Poietics ADSC-GMTM Bullekit içerisinde kültürlenmis ve özel ortam ile kars Jhst i Jin @t i. 1-1. Kemik iligi ve adipoz dokusundan türetilmis mezenkimal kök hücrelerin hazlîlanmasü Lonza'dan satn al Lnan kemik iliginden türetilmis mezenkimal kök hücreler, 37°C'dc bir mari banyosu içerisinde çabuk bir sekilde çözündürülmüs, 5 mL MSCGMTM içeren 15 mL'lik tüpe yerlestirilmis ve ardlndan 5 dakika boyunca 300 g'da santriiîijlenmistir. Santrifüjden sonra süpernatant çkarTlnE ve hücreler, hücre saylîîilîve hücre yasama kabiliyetini ölçmek için 10 mL yeni MSCGM'de daggtllm St 11. Hazirlanan hücreler, cm2 baslna 5,000 hücrede T25 sisesinde inoküle edilmis ve 37°C'de ve %5 COz'de korunurken kültürlenmistir. Kültür sIî/l'slîl her 3 ila 4 günde bir her kültür tasS/ügîliçin 5 mL MSCGM ile degistirilmis ve hücreler, sise tabanüm %90 ya da daha fazla alan Ilda yetistiginde alt kültürleme gerçeklestirilmistir. Test için hücre suyu hazmamak için ikinci, üçüncü ve dördüncü kültürler gerçeklestirilmistir.

Lonza'dan satEl alEian adipoz dokusundan türetilmis mezenkimal kök hücreler, 37°C'de bir mari banyosu içerisinde çabuk bir sekilde çözündürülmüs, 5 mL ADSC-GM içeren 15 mL'lik tüpe yerlestirilmis ve ardLrldan 5 dakika boyunca 300 g'da santriIüjlenmistir. Santriiî'ijden sonra süpematant çlkarllms ve hücreler, hücre saylsllnl lve hücre yasama kabiliyetini ölçmek için 10 mL yeni ADSC-GM'de dagltllmlstln Hazlrllanan hücreler, cm2 bas na 5,000 hücrede T25 sisesinde inoküle edilmis ve 37°C'dc ve %5 COz'de komnurken kültürlenmistir. Kültür sîtlgü her 3 ila 4 günde bir her kültür taslýßEEiçin 5 mL ADSC-GM ile degistirilmis ve hücreler, sise tabanEiîl %90 ya da daha fazla alanEida yetistiginde alt kültürleme gerçeklestirilmistir. Test için hücre suyu hazElamak için ikinci, üçüncü ve dördüncü alt kültürler gerçeklestirilmistir. 1-2. ABM-M içerisinde kemik iliginden türetilmis mezenkimal kök hücrelerin proliferasyonlar n n kars Llast nil-nas U Mevcut bulusa ait ABM-M içerisindeki proliferasyon kapasitesi, MSCGM içerisinde dört geçite kadar alt kültürlenmis kemik iliginden türetilmis mezenkimal kök hücreler kullan Tarak incelenmis ve burada MSCGM, bir kontrol olarak kullanllmßt E. MSCGM, bazik ortam olarak MSC-BM ve katkümaddelerinden (50 mL büyüme takviyesi, 10 mL L-glutamin ve 0.5 mL penisilin-streptomi içeren) olustugu için katkEmaddeleri, ayrßa ABM-M'ye ilave edilmis ve ard ndan bir karsElastmma testi gerçeklestirilmistir (Tablo 2).

Mevcut bulusa ait ABM-M ve MSCGM'nin proliferasyon kapasitesi için ortam bilesiini Katk Lrnaddeleri . .

MSC-BM+FBS o (4' MSC-BM+Katkl _ maddeleri ABM-M+FBS c› U ABM-M+ Katki' , maddeleri Dördüncü alt kültürden sonra hücreler, cm2 bas lîia 5,000 hücrede tablo 2'deki ortam bilesiinini içeren T75 sisesinde inoküle edilmis ve 37°C'de ve %5 COg'de korunurken kültürlenmistir.

Kültürler, her 3 ila 4 günde bir her kültür tasßmßjçin kültür süßüier ortam ile degistirilirken gün boyunca kültürlenmis ve ard mdan hücrelerin say @Chesaplanm St E.

SEKILLER 1 ve 3 arac Jlîg' Sila kontrol gruplarEla göre 10 gün boyunca %10 fetal bovin serum ile takviye edilmis MSC-BM içeren ortamda (MSC-BM+FBS) hiçbir zaman proliferasyon meydana gelmemis ve ayr da katki .maddeleri ile takviye edilmis MSC-BM olan MSCGM içerisinde nadiren meydana gelmistir.

Bununla birlikte MSCGM'ye klýasla bir test grubu olarak %10 fetal bovin serum (FBS) ile takviye edilmis mevcut bulusa ait ABM-M'yi içeren ortamda (ABM-M+FBS) proliferasyon daha yüksek olmustur ve MSCGM'ye kýasla ABM-M+F BS içerisinde iki kat Ba çEkma süresi daha hllü olmustur. Daha yüksek proliferasyon ve daha hîlü iki katEla çkma süresi, MSCGM'den ziyade katkjnaddeleri ile takviye edilmis ABM-M içeren ortamda görülmüs ve dolayElßila ABM-M'nin bilesimi, kemik iliginden türetilmis mezenkimal kök hücrelerin büyüme hâîlîarttimßtî.

Kemik iliginden türetilmis mezenkimal kök hücreler, MSCGM içerisinde çogalmamg ancak kemik iliginden türetilmis mezenkimal kök hücreleri, %10 fetal bovin serum ve 2 mM L- glutamin içeren ABM-M içerisinde çogalmlStlr'. Bu; MSCGM içerisinde kültürlenen mezenkimal kök hücrelerin proliferasyon kapasitelerinin kayboldugunu ancak ABM-M içerisinde proliferasyon kapasitelerinin korundugunu göstermektedir.

ABM-M içerisinde proliferasyon kapasitesinin korundugunun dogrulanmasEamac Sila besinci alt kültürde geri kazanllan hücreler, cm2 bas na 5,000 hücrede T150 sisesinde inoküle edilmis ve 37°C'de ve %5 COg'de korunurken kültürlenmistir. Kültür 3 V sl|,|her 3 ila 4 günde bir her kültür tas ylclsl için %10 fetal bovin serum ve 2 mM L-glutamin içeren ABM-M ile degistirilirken hücreler, 10 gün boyunca kültürlenmis ve ardindan hücrelerin saylêîhesaplanmgltm Sonuç olarak 750,000 adet inoküle edilmis hücreler ile k yaslandgnda %447 büyüme hiz l sergileyen 3,357,500 hücre geri kazanllnlg ve dolaygyla proliferasyon kapasitesinin korundugu dogrulanmgtm. Bu nedenle, mevcut bulusun ABM-M'sinin kemik iliginden türetilmis mezenkimal kök hücrelerinin mükemmel proliferasyon kapasitesine olanak sagladEgEdogrulanm Et m.

Her kültür ortamüçin kemik iliginden türetilmis mezenkimal kök hücrelerin proliferasyonlarJ-JB analiz sonuçlari Kültürün lÜ'ncu , lnoküle edilen gününde geri _ baglanan hücrelerin çfRma süresi hücre sayLdl_ kazan dan hücrelerin saylsl (gün) Kontrol MSC- maddeleri ABM+ Katki maddeleri 1-3. ABM-M içerisinde adipozdan türetilmis mezenkimal kök hücrelerin proliferasyonlarüli kars Iastßüînas E Mevcut bulusa ait ABM-M içerisindeki proliferasyon kapasitesi, ADSC-GM içerisinde dört geçite kadar alt kültürlenmis olan adipozdan türetilmis mezenkimal kök hücreler kullanllarak incelenmis ve burada ADSC-GM, bir kontrol olarak kullanllmlstln. ADSC-GM, bir bazik ortam olarak ADSCC-BM ve katkl lmaddelerinden (50 mL fetal bovin serum, 5 mL L- glutamin, olustugu için %10 fetal bovin serum ve 2 mM L-glutamin, ayrßa mevcut bulusa ait ABM-M'ye ilave edilmis ve ardidan bir kars lhstmma testi gerçeklestirilmistir. Dördüncü alt kültürden sonra hücreler, cm2 bas Ela ,000 hücrede her ortamEiçeren T75 sisesinde inoküle edilmis ve 37°C'de ve %5 COz'de korunurken kültürlenmistir. Kültürler, her 3 ila 4 günde bir her kültür taslchLsLiçin kültür silidLl her ortam ile degistirilirken 7 gün boyunca kültürlenmis ve ardlndan hücrelerin say SI | hesaplanmlstln. Ek olarak geri kazanllan hücreler, alt kültürlenmis ve ardlndan cm2 basina 5,000 hücrede her onamlîçeren Tl75 sisesinde inoküle edilmis ve 37°C'de ve %5 COZ'de korunurken kültürlenmistir. Kültürler, her 3 ila 4 günde bir her kültür taslýldlsil için kültür siWSl her ortam ile degistirilirken 7 gün boyunca kültürlenmis ve ard lîidan hücrelerin saylsFhesaplanm lêtlîrl.

SEKILLER 2 ve 4 ve tablo 5 arac llg Sila besinci ve altßc Ealt kültürde iki kat Ela çEEima süresi, bir kontrol olarak ADSC-GM'den ziyade bir test grubu olarak %10 fetal bovin serum ile takviye edilmis ABM-M (ABM-M+FBS) içerisinde daha hüljolmustur ve geri kazanühn hücreler, ADSC-GM'ye göre ABM-M+FBS içerisinde daha fazladî Buna baglEolarak mevcut bulusun ABM-M'si ile adipozdan türetilmis mezenkimal kök hücrelerinin proliferasyon kapasitesinin att nLld Lg Ldogrulanm LSt Lr (tablo 4).

Her kültür ortam Eiçin adipozdan türetilmis mezenkimal kök hücrelerin proliferasyonlarmi analiz sonuçlari ADSC-GM ABM-M+FBS Kültürün l'nci gününde baglanan hücrelerin say EE Kültürün 7'nci gününde geri kazan Han hücrelerin say BE Iki katlna çikma süresi (gün) 4.5 3.9 3.8 2.5 Mevcut bulusa ait ABM-M içerisinde kültürlenen mezenkimal kök hücrelerin immünolojik karakteristiklerinin analizi Örnek 1'in 1-2 ve 1-3 numaraljkültür OmamlarEida kültürlenmis hücreler, TrypLE ifadesi ile isleme aracllîgßlla izole edilmis ve 5 dakika boyunca 400 g'da santriûijlenmistir, böylece hücreler elde edilmistir. Daha sonra hücreler, FASC çözeltisi ile iki kez ykanms ve ykanan ardîldan su ile ykanmß ve daha sonra akljsl sitometrisi analizinden önce FACS çözeltisinde yüzinesine izin verilmistir. Hücre yüzeyi, mezenkimal kök hücrelerin fenotiplerinin belirlenmesi ainac lýla analiz edilmistir.

Sonuç olarak kontrol gruplarE olarak MSC-GM ve ADSC-GM içerisinde kültürlenmis mezenkimal kök hücrelere benzer sekilde %10 fetal bovin serum ve 2 mM L-glutamin içeren negatif ekspresyon sergilemistir ve dolayESlla kültürlenmis hücrelerin, mezenkimal kök hücrelerin karakteristiklerine sahip oldugu dogrulanmLstm (tablo 5).

ABM-M içerisinde kültürlenen mezenkigîlilçoölsçkücrelerin immünolojik karakteristikleri Kemik iliginden türetilmis Adipozdan türetilmis mezenkimal mezenkimal kök hücreler kök hücreler MSC-GM ABM-M ADSC-GM ABM-M CD73 N/A N/A %98,7 %98,5 CD80 %0,0 %0,l %0,2 %0,1 ABM-M içerisinde kültürlenen mezenkimal kök hücrelerin farklüasma kapasitelerinin Örnek 1'in 1-2 ve 1-3 numarall 'kültür ortamlarlnda kültürlenmis hücreler, tripleks ile isleme arac [[Eg Sila izole edilmis ve 5 dakika boyunca 400 g'da santrifüjlenmistir, böylece hücreler elde edilmistir. Daha sonra elde edilen hücrelerin çoklu etkisi, in vitro ortam kosullarida dogrulanm ISJt B.

Kültürlenen mezenkimal kök hücrelerin çoklu etkilerinin dogrulanmas :amac Sila farklIasma, asag Baki gibi Schallmoser K ve digerlerine ait yöntem ile indüklenmistir (Schallmoser K. ve digerleri, Tissue Eng Par C Method 14:185, 2008).

Osteoblastlar olarak farkltlasma ABM-M içerisinde ilk kültürlenen mezenkimal kök hücrelerin, %10 fetal bovin serum, 10 mM ß-gliserol fosfat, 50 uM askorbik asit ve 10'7 M deksametason içeren a-MEM içerisinde 2 ila 3 hafta boyunca tekrar kültürlenmesinden ve farklîüastihnasüidan sonra alkalin fosfat ekspresyonu ALPase boyama ile incelenmis ve kalsiyum akümilasyonu, SEKIL 8'de gösterildigi üzere Kossa boyamas :ile dogmlanm @tm Adipositler olarak farkllhsma ABM-M içerisinde ilk kültürlenen mezenkimal kök hücrelerin, içeren d-MEM içerisinde 2 hafta boyunca tekrar kültürlenmesinden ve farkllhstmhnas Eidan sonra yaglj KimEtEIO boyama yoluyla hücrelerde toplanan adipoz damlac Elar] dogrulanm Islt E.

Kondrositler olarak farklllasmanln indüklenmesi amac yla ABM-M içerisinde ilk kültürlenen yaklas'k 5 x 105 mezenkimal kök hücreleri, bir hücre kütlesi olusturmak için 5 dakika boyunca 300 g'da santrifüjlenmis ve ard îidan 107 M deksametason, 50 uM askobik asit, 1 nM sodyum piruvat, 10 ng/mL TGF-ß, ve 100 ng/mL BMP-2 içeren DMEM düsük glukozu içerisinde SEKIL 10'da gösterildigi üzere 3 hafta boyunca tekrar kültürlenmis ve farklEIastEÜinßtm FarklEIast Ilma ile indüklenmis kondrositler, parafin gömme prosedürü yoluyla 5-ujm seri bölmeler elde etmek için gerçeklestirilmis ve kondrositler olarak farklmasma kapasiteleri, H/E boyama, safranin boyama, safranin O boyama, alsiyan mavisi boyama, sirius kUJnaleLboyama, COMP boyama, kolajen tip II ve I boyama yoluyla dogrulanmlst ri.

Mevcut bulusa ait ABM-M içerisinde kültürlenen kemik iligi- ve adipozdan türetilmis mezenkimal kök hücreler, iki geçit ile alt kültürlenmis, çoklu kültür indüklenmis ve çoklu farkllîasma olmakslzlîi bir kontrol grubu ile karsflastlîlma gerçeklestirilmistir. Osteoblastlara indüklenmeden sonra ALP boyamasEve kalsiyum depolanmasjsonucunda alkalin fosfatazü ekspresyonu ve kalsiyum birikimi, indüklenmis farkllasma olmaksîtlîi kontrol grubundan farklj olarak dogrulanmIsltE. Ek olarak adipositler indüksiyonundan sonra KEmîtEO boyama isleminin uygulanmasj sonucu adipositlere olarak farklüasma, indüklenmis farkltîasma olmaksîü kontrol grubunda olanEi aksi olarak dogrulanmßtE. Safranin O boyama, alsiyan mavisi boyama, Sirius kEmâIsJEboyama, COMP boyama ve kolajen tip II ve I boyama yoluyla glikozaminoglikan (GAG) ekspresyonu ve proteoglikanLlkolajen tip I normal kLkmdaga benzer sekile mezenkimal kök hücre kütlesinden farkllastlr Im s kondrositler olarak dogrulamlst rL ABM-M içerisinde kültürlenen mezenkimal kök hücrelerin karyotiplerinin analizi Örnek `l'e ait 1-2 ve l-3'e benzer sekilde mezenkimal kök hücreler, kemik iligi ve adipoz dokusundan türetilmis farklîhesneler gibi yetiskin dokularîldan izole edilmekte ve %10 fetal bovin serum ve 2 mM L-glutamin içeren ABM-M içerisindeki on geçit halinde alt kültürlenmistir ve kültürlenmis mezenkimal kök hücrelerin karyotipi analiz edilmistir. GTG banding teknigi kullanllarak 20 metafaz hüceresinin besi incelenmis ve buradaki karyotipler, bes metafaz hücresinin tamam ndan SEKIL 1 l, normal 46 XY karyotipi göstermekte ve SEKIL 12, normal 46 XX karyotipi göstermektedir.

Yukarîla aç Elandgjüzere mezenkimal kök hücrelerin hücre karakteristikleri ve farklIasma kapasiteleri, konvansiyonel mezenkimal kök hücre kültür ortamjile kýaslandgida mevcut bulusa ait mezenkimal kök hücrelerin bazik kültür ortam E(ABM-M) içerisinde korunmaktad] ve mevcut bulusa ait ABM-M, mükemmel hücre büyümesi ve kütle-kültür mezenkimal kök hücrelerinin proliferasyonu için ortam olarak kullanülnaktadm, böylece saf mezenkimal kök hücreler elde edilmektedir. 1.200.000 ”30.000 MSC-BM+FBS MSC-BM+Katkiar ABM+FBS ABM+KatkEtar SEKILi .000.000 « 4.00100!! 3.000.000 2.000.000 1.000.000 ADSC-GM ABM-M+FBS Büvüme oran (%) Büyüme oranü%) MSC-BM+FBS MSC-BM+Katk lar ABM+FBS ABM+Katkmar ADSC-GM ABM-M+FBS MSCGM içinde kültürlenen kemik iliginden türetilmis mezenkimal kök hücreler ABM-M içinde kültürlenen kemik iliginden türetilmis mezenkimal kök hücreler ADSCGM içinde kültürlenen adipoz ABM'M içinde kültürlenen adipoz 8 5.95› r.l...ii..lihJI..Ji..iii 5.9.; mo Alkalin fosfataz Kalsiyum kalmtWar Von Kossa boyama Kemik iliginden türetilmis mezenkimal kök hücreler Adipose türetilmis mezenkimal kök hücreler Yag kimim Kemik iIiginden (x 100) Farkl [Ihst [ima Farklühstmna HE boya Sirius kmmIEboya

Claims (1)

ISTEMLER

1. Asag daki tabloda verildigi üzere bilesenler ve aerhniktarlaanLiçeren mezenkimal kök hücreler için bir gelistirilmis baZik kültür ortaml: bilesen miktar [mg/1] L-asparjin anhidröz 50 L-aspartik asit 20 L-sistin dihidroklorür 62,6 L-glutamik asit 20 L-glutamin 584 L-histidin monohidroklorür 42 L-hidroksi-L-prolin 20 L-izolösin 105 L-lösin 105 L-lizin monohidroklorür 146 L-metiyonin 30 L-fenilanin 66 L-prolin 34,5 L-serin 42 L-treonin 95 L-triptofan 16 L-tirosin disodyum tuz dihidrat 103,79 L-valin 94 Kalsiyum klorür dihidrat 265 Magnezyum sülfat anhidröz 97,67 Potasyum kloiür 400 Sodyum klorür 6400 Sodyum fosfat dibazik anhidröz 142,04 Askorbik asit fosfat 50 Kolin klorür 13,96 D-biyotin 0,2 D-Ca pantotenat 4 Folik asit 4 Myo-inositol 35 Nikotinamid (nikotinik asit amid) 4 p-aminobenzoik asit (PABA) l Piridoksal dihidroklorür 4 Riboflavin 0,4 Tiyamin dihidroklorür 4 B12 Vitamini 1,36 D-glukoz anhidröz 4500 hipoksantin 4,08 L-glutatyon azaltfltng 1 Linoleik asit 0,084 Fenol kmmüßîsodyum tuzu 15,9 Putresin+2HCl 0,161 Sodyum piruvat l 10 Tioktik asit 0,21 Istem l'e göre mezenkimal kök hücreler için gelistirilmis bazik kültür ortaml blup, burada pozitif yüzey isaretleyicilerinin, %80 veya daha faza eksprese edildigi, özellikle CD44, eksprese edildigi ve CD31, CD34, CD45, CD80, ve HLA-DR negatif yüzey isaretleyicilerinin %5 veya daha az eksprese edildigi hücresel immünolojik karakteristikler sergilemektedir.