KR20220135213A - 근육줄기세포 증식을 위한 인슐린을 포함하는 근육줄기세포 배양용 배지 조성물 - Google Patents

근육줄기세포 증식을 위한 인슐린을 포함하는 근육줄기세포 배양용 배지 조성물 Download PDF

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Abstract

근육줄기세포 증식을 위한 인슐린을 포함하는 근육줄기세포 배양용 배지 조성물에 관한 것으로, 일 양상에 따른 인슐린을 포함하는 근육줄기세포 배양용 배지 조성물에 의하면, 근육줄기세포를 체외에서 배양하는 경우에도 세포의 증식능 및 분화능이 저하되지 않아 근육줄기세포를 대량 배양할 수 있는 효과가 있다. 또한, 상기 인슐린을 포함하는 배지를 통해 근육줄기세포를 배양함에 따라 적절한 분화시기를 선택할 수 있어, 필요한 때 근육줄기세포를 분화시킴으로써 배양육의 품질을 향상시킬 수 있는 효과가 있다.

Description

근육줄기세포 증식을 위한 인슐린을 포함하는 근육줄기세포 배양용 배지 조성물{Media composition for culturing satellite cells containing insulin for proliferation of satellite cells}
근육줄기세포 증식을 위한 인슐린을 포함하는 근육줄기세포 배양용 배지 조성물에 관한 것이다.
줄기세포(Stem Cell)란, 아직 분화가 덜 되어 다른 세포로 될 수 있는 세포를 말하며 미분화 상태에서 자신과 동일한 세포를 지속적으로 만들어 낼 수 있는 자가재생산 능력과 적절한 조건에서 배양되면 특정한 세포로 분화하는 능력이 있다.
배양육(In vitro Meat)이란 살아있는 동물의 세포를 채취한 뒤 세포 공학 기술로 증식하여 얻게 되는 식용 고기를 의미하며, 가축을 사육하는 과정을 거치지 않고 고기를 얻는 세포 농업(cellular agriculture)의 한 분야를 의미한다. 이러한 배양육의 제조에 있어서, 근육줄기세포(Muscle stem cell)의 체외배양을 통한 제조방법이 통상적으로 이루어진다.
상기 근육줄기세포를 체외배양 할 경우 미분화상태를 유지하기 위해 배양액이나 지지액에 bFGF(basic fibroblast growth factor)를 지속적으로 첨가해야 하는데 이는 매우 많은 비용을 필요로 한다. 따라서 체외배양을 통한 줄기세포의 배양에 있어서 bFGF를 효과적으로 대체할 수 있는 물질의 개발이 필요한 상황이다.
본 발명자들은 이를 바탕으로 연구를 수행하던 중, 인슐린(insulin)을 포함하는 배지 조성물이 bFGF의 추가적인 공급 없이도 근육줄기세포의 미분화 상태를 효과적으로 유지시킬 수 있으며, 근육줄기세포의 증식을 촉진시킬 수 있음을 발견하였다. 이에 인슐린이 bFGF를 효과적으로 대체할 수 있음을 발견하고 발명을 완성하였다.
공개특허10-2021-0157121
일 양상은 인슐린을 포함하는 근육줄기세포 배양용 배지 조성물을 제공하는 것이다.
다른 양상은 근육줄기세포를 상기 배지 조성물에서 배양하는 단계를 포함하는 근육줄기세포 배양 방법을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 상기 배지 조성물을 분리된 비-인간 동물 유래 근육줄기세포에 처리하여 배양육을 제조하는 단계를 포함하는 배양육을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 상기 배양육 제조 방법에 의해 제조된 배양육을 제공하는 것이다.
일 양상은 인슐린을 포함하는 근육줄기세포 배양용 배지 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 용어, "근육줄기세포(Muscle stem cell)"는 형질전환 없는 증식, 무한증식, 자가 재생산 능력 및 근육으로의 분화할 수 있는 능력을 모두 포함하는 근육줄기세포의 특성을 갖는 세포를 의미하며, 자가 재생산능력 또는 무한증식 능력 및 근육분화 능력을 보이는 세포라면 제한 없이 포함될 수 있다. 상기 자가 재생산 능력 및 근육 분화능력은 마커로서 확인이 가능하다. 또한 상기 근육줄기세포는 예를 들면 자가 재생능과 함께, CD29, CD56, Oct4, Nanog 또는 Pax7의 발현을 보이는 세포일 수 있다. 상기 근육줄기세포는 분화능과 자기재생능을 갖는 것이라면, 그 종류 및 유래가 제한되지 아니한다. 상기 근육줄기세포는, 예를 들면, 포유동물, 인간, 원숭이, 돼지, 말, 소, 닭, 오리, 양, 개, 고양이, 마우스 또는 토끼 등으로부터 유래한 것일 수 있다. 일 구체예에 있어서, 상기 근육줄기세포는 소 또는 닭의 근육줄기세포일 수 있다.
상기 근육줄기세포는 근모세포(myoblast)로 유도되는 과정에서 Pax7 또는 MyoD의 발현을 보이는 세포일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "근모세포"는 근육세포로 분화하는 과정 중의 전구세포(precursor cell)로 근원세포와 마찬가지로 증식을 하며 세포 간에 융합이 일어나서 근육세포(myogenic cell, myocyte)로 분화할 수 있는 세포를 의미한다. 상기 "근육세포"는 근모세포의 분화 과정을 통해, 근모세포로부터 생성된 근조직을 구성할 수 있는 세포를 의미한다.
본 명세서에서 용어 "세포 배양 (cell culture)"은 조절된 조건 하에서 인공적으로 체외에서 살아있는 세포를 키우는 과정을 의미한다. 또한, 개체 조직의 일부분을 무균적으로 떼어내 효소로 세포간 연결 물질을 분해하여 유리시킨 현탁액을 병이나 페트리 접시와 같은 배양 접시의 편평한 밑부분에 도말하여 세포를 성장 및 증식시키는 것일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "배지 (culture media)"는 인 비트로 (in vitro)에서 줄기세포를 비롯한 세포의 성장 및 생존을 지지할 수 있게 하는 물질을 의미한다.
상기 배지 조성물은 인슐린을 첨가하여 세포 배양에 이용될 수 있는 것이라면, 특별히 제한되는 것은 아니며, 예를 들면, DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM (Minimal Essential Medium), BME (Basal Medium Eagle), RPMI 1640, F-10, F-12, DMEM/F12, α-MEM (α-Minimal Essential Medium), G-MEM (Glasgow's Minimal Essential Medium), IMDM (Iscove's Modified Dulbecco's Medium), MacCoy's 5A 배지, AmnioMax complete 배지, AminoMax ± complete 배지, EBM (Endothelial Basal Medium) 배지, Chang's Medium, MesenCult-XF, DMEM/HG (Dulbecco's Modified Eagle's Medium high glucose)배지, 및 MCDB+DMEM/LG (MCDB +Dulbecco's Modified Eagle's Medium low glucose) 배지로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상에 인슐린이 첨가된 것일 수 있다.
또한, 상기 배지는 아미노산류, 비타민류, 무기염류 및 기타 성분을 포함할 수 있다. 예를 들면, 비필수 아미노산 및 L-글루타민, 비타민류로는 비타민 B12, 무기염류로는 트레이스 성분(CuSO45H2O, Fe(NO3)39H2O, ZnSO4), 포스포에놀 피루베이트(Phosphoenol pyruvate), 모노에탄올아민(Momoethanolamine), 소듐 셀레니트(Sodium selenite) 및 소듐 바이카보네이트(Sodium bicarbonate), 기타 성분으로는 D-글루코스, 리놀레익산(Linoleic acid), 리포익산(Lipoic acid), 소듐 피루베이트(Sodium pyruvate), 하이폭산틴 나트륨(Hypoxantine Na), 퓨트레신 하이드로클로라이드(Putrescine HCl) 및 폴리아민 용액(Polyamine solution)을 포함할 수 있다.
상기 배양은 성장 및 증식인 것일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "성장(growth) 및 증식(proliferation)"은, 세포 수의 증가를 의미한다. 상기 배양은 미분화 증식인 것일 수 있다. 상기 미분화 증식(undifferentiated proliferation)은 줄기세포가 특정 세포로 분화되지 않은 채 원래의 세포와 동일한 성질을 가지는 즉, 분화능(potency) 및 자기재생(self-renewal)능을 가지는 세포로 증식하는 것을 의미한다. 본 명세서에서 용어 "분화(differentiation)"는 세포가 분열 증식하여 성장하는 동안에 서로 구조나 기능이 특수화되는 현상, 즉 생물의 세포, 조직 등이 각각에게 주어진 일을 수행하기 위하 여 형태나 기능이 변해가는 것을 의미한다. 특정 세포 유형으로의 분화 정도를 측 정 또는 판단하는 것은 당해 분야에 익히 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다. 또 한, 상기 분화는, 유세포 분석 또는 면역세포화학과 같은 기법을 사용하여 세포 표 면 표지 (예를 들면, 조직-특이적 또는 세포-표지 특이적 항체로 세포를 염색함) 및 세포 형태의 변화 (예를 들면, 핵 비율/세포질 비율)를 측정하면서, 광학 현미 경 또는 공초점 현미경을 사용하여 세포 형태를 조사함으로써, 또는 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction: PCR) 및 유전자-발현 프로파일과 같은 당해 분 야에 익히 공지된 기법을 사용하여 유전자 발현상의 변화를 측정함으로써 확인될 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 조성물은 근육줄기세포를 미분화 상태로 유지시키는 것일 수 있다. 이에 따라, 상기 배지 조성물은 근육줄기세포의 미분화 상태를 유지하면서 근육줄기세포를 효율적으로 증식시킬 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 배지 조성물에는 0.01 μM 내지 100 μM의 농도의 인슐린이 포함될 수 있다. 예를 들면, 상기 배지 조성물에는 0.01 μM 내지 100 μM의 농도의 인슐린, 0.05 μM 내지 100 μM의 농도의 인슐린, 0.1 μM 내지 100 μM의 농도의 인슐린, 0.1 μM 내지 50 μM의 농도의 인슐린, 0.1 μM 내지 40 μM의 농도의 인슐린, 0.1 내지 30 μM의 농도의 인슐린, 0.1 μM 내지 20 μM의 농도의 인슐린, 0.5 μM 내지 100 μM의 농도의 인슐린, 0.5 μM 내지 50 μM의 농도의 인슐린, 0.5 μM 내지 40 μM의 농도의 인슐린, 0.5 μM 내지 30 μM의 농도의 인슐린, 0.5 μM 내지 20 μM의 농도의 인슐린, 0.5 내지 10 μM의 농도의 인슐린, 1 μM 내지 100 μM의 농도의 인슐린, 1 μM 내지 50 μM의 농도의 인슐린, 1 μM 내지 40 μM의 농도의 인슐린, 1 μM 내지 30 μM의 농도의 인슐린, 1 μM 내지 20 μM의 농도의 인슐린 또는 1 μM 내지 10 μM의 농도의 인슐린이 포함될 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 배지 조성물에는 적어도 10 μM 농도 이상의 인슐린이 포함될 수 있다.
다른 양상은 분리된 근육줄기세포를 인슐린을 포함하는 근육줄기세포 배양용 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 근육줄기세포 배양 방법을 제공한다.
상기 배양하는 방법은 계대 배양을 포함하는 것일 수 있다.
본 명세서에서 용어, "계대 배양"은, 세포 증식 방법의 하나로, 세포를 보존하고 세포의 대를 이어 가기 위해 수일마다 주기적으로 새로운 배지에 이식시키는 것을 의미한다. "계대(passage)"는 배양 용기에서 초기 종배양부터 동일한 배양 용기에 세포가 왕성하게 자라는 시기(confluence)까지의 줄기세포의 성장 및 증식인 것일 수 있다. 세포를 배양하는 방법 및 계대 배양 방법은 통상의 배양 방법 및 공지된 방법으로 수행되는 것일 수 있다.
상기 배지 조성물을 이용하여 세포를 배양하는 방법에 따르면, 근육줄기세포 고유의 특성을 유지하는 근육줄기세포를 대량으로 증식 및 성장시켜 수득할 수 있다.
또 다른 양상은 상기 배지 조성물을 분리된 비-인간 동물 유래 근육줄기세포에 처리하여 배양육을 제조하는 단계를 포함하는 배양육을 제조하는 방법을 제공한다.
본 명세서에서 용어 "배양육"은 살아있는 동물의 세포를 채취한 뒤 세포 공학 기술로 증식하여 얻게 되는 식용 고기를 의미한다. 일 구체예에 있어서, 상기 배양육은 소 또는 닭의 세포를 채취한 뒤 세포 공학 기술로 증식하여 얻게 되는 식용 고기일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 배양육은 합성 식품(synthetic food product)으로도 제조될 수 있으며, 상기 합성 식품에는 상기 배양육 이외에 미네랄, 비타민, 보조-비타민, 필수 지방산, 필수 아미노산, 효소, 항산화제 또는 이들의 둘 이상의 조합을 더 포함할 수 있다.
또한, 상기 배양육을 포함하는 합성 식품은 향미제, 향미증진제, 감미제, 착색제, 발색제, 표백제, 보존제, 살균제, 산화방지제, 팽창제, 응고제, 또는 증점제를 더 포함할 수 있다.
상기 배양육은 구체적으로 육가공품 형태로 가공되거나 제조될 수 있으며, 상기 육가공품은 예를 들어, 멸균 식육제품, 햄류, 프레스햄, 혼합프레스햄, 소시지, 혼합소시지, 건조소시지(건조혼합소시지), 반건조소시지(반 건조혼합소시지), 가열냉동소시지, 베이컨류, 건조저장육, 양념육, 분쇄가공육품, 포장육 및 기타 육가공품 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 배양육 제조 방법은 상기 배지 조성물을 분리된 비-인간 동물 유래 근육줄기세포에 처리하여 상기 근육줄기세포의 미분화를 유지시키면서 증식을 촉진시키는 단계; 및 상기 배지 조성물을 분리된 비-인간 동물 유래 근육줄기세포에 처리하여 상기 근육줄기세포의 증식을 촉진시키면서 근육줄기세포를 근모세포로의 분화를 유도하는 단계를 포함할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 근육줄기세포의 미분화를 유지시키면서 증식을 촉진시키는 단계는 0.01 μM 내지 100 μM의 농도의 인슐린이 포함된 배지 조성물을 처리하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들면, 0.01 μM 내지 100 μM의 농도의 인슐린, 0.05 μM 내지 100 μM의 농도의 인슐린, 0.1 μM 내지 100 μM의 농도의 인슐린, 0.1 μM 내지 50 μM의 농도의 인슐린, 0.1 μM 내지 40 μM의 농도의 인슐린, 0.1 내지 30 μM의 농도의 인슐린, 0.1 μM 내지 20 μM의 농도의 인슐린, 0.5 μM 내지 100 μM의 농도의 인슐린, 0.5 μM 내지 50 μM의 농도의 인슐린, 0.5 μM 내지 40 μM의 농도의 인슐린, 0.5 μM 내지 30 μM의 농도의 인슐린, 0.5 μM 내지 20 μM의 농도의 인슐린, 0.5 내지 10 μM의 농도의 인슐린, 1 μM 내지 100 μM의 농도의 인슐린, 1 μM 내지 50 μM의 농도의 인슐린, 1 μM 내지 40 μM의 농도의 인슐린, 1 μM 내지 30 μM의 농도의 인슐린, 1 μM 내지 20 μM의 농도의 인슐린 또는 1 μM 내지 10 μM의 농도의 인슐린이 포함된 배지 조성물을 처리하는 것을 포함할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 배지 조성물을 분리된 비-인간 동물 유래 근육줄기세포에 처리하여 상기 근육줄기세포의 증식을 촉진시키면서 근육줄기세포를 근모세포로의 분화를 유도하는 단계는 적어도 10 μM 농도 이상의 인슐린이 포함된 배지 조성물을 처리하는 것을 포함할 수 있다.
상기 배지 조성물을 이용하여 배양육을 제조하는 방법에 따르면, 근육줄기세포의 미분화를 유지시키면서 증식을 촉진시킬 수 있으며, 근육줄기세포의 분화시기를 적절히 선택할 수 있어, 필요한 때 근육줄기세포를 분화시킴으로써 배양육의 품질을 향상시킬 수 있는 효과가 있다.
또 다른 양상은 상기 배양육 제조 방법에 의해 제조된 배양육을 제공한다.
상기 배양육은 상기한 바와 같다.
일 양상에 따른 인슐린을 포함하는 근육줄기세포 배양용 배지 조성물에 의하면, 근육줄기세포를 체외에서 배양하는 경우에도 세포의 증식능 및 분화능이 저하되지 않아 근육줄기세포를 대량 배양할 수 있는 효과가 있다. 이를 통해, 고가의 bFGF를 포함하는 배양 배지를 효과적으로 대체하여 경제적이면서도, 근육줄기세포를 배양하는 경우 적절한 분화시기를 선택할 수 있어, 필요한 때 근육줄기세포를 분화시킴으로써 배양육의 품질을 향상시킬 수 있는 효과가 있다.
도 1은 인슐린 및 bFGF 포함 배지의 근육줄기세포 증식 효과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 bFGF를 불포함하는 인슐린 배지의 근육줄기세포 증식 효과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 인슐린 및 bFGF 포함 배지에서 인슐린의 농도에 따른 근육줄기세포 마커인 Oct4의 발현 정도를 나타낸 그래프이다.
도 4는 인슐린 및 bFGF 포함 배지에서 인슐린의 농도에 따른 근육줄기세포 마커인 Nanog의 발현 정도를 나타낸 그래프이다.
도 5는 인슐린 및 bFGF 포함 배지에서 인슐린의 농도에 따른 근모세포 마커인 Pax7의 발현 정도를 나타낸 그래프이다.
도 6은 bFGF를 불포함하는 인슐린 배지에서 인슐린의 농도에 따른 근육줄기세포 마커인 Oct4의 발현 정도를 나타낸 그래프이다.
도 7은 bFGF를 불포함하는 인슐린 배지에서 인슐린의 농도에 따른 근육줄기세포 마커인 Nanog의 발현 정도를 나타낸 그래프이다.
도 8은 bFGF를 불포함하는 인슐린 배지에서 인슐린의 농도에 따른 근모세포 마커인 Pax7의 발현 정도를 나타낸 그래프이다.
이하 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 인슐린 포함 배지의 제조
500 ml의 DMEM(Gibco #10313039)에 5 ml의 Penicillin-Streptomycin(10,000 U/mL)을 첨가하여 DMEM 기본 배지를 제조하였다. 상기 DMEM 기본 배지에 인슐린을 첨가하여 인슐린 포함 배지를 제조하였다. 인슐린의 농도에 따른 분화능 유지 효과를 확인하기 위해 상기 인슐린의 농도를 달리하여(각 0.1 μM, 1 μM, 5 μM, 8 μM, 10 μM) 배지를 제조하였다.
실험예 1. 인슐린 포함 배지의 근육줄기세포 증식 효과 확인
실험예 1.1 인슐린 및 bFGF 포함 배지의 근육줄기세포 증식 효과 확인
상기 실시예 1.에서 제조한 DMEM 기본배지에 5 %의 FBS, 8 ng/ml의 bFGF 및 10 μM의 인슐린을 첨가하고 근육줄기세포의 증식 효과를 확인하였다.
보다 구체적으로, 먼저 소의 우둔살에 트립신을 처리한 후 초대배양하여 소의 근육줄기세포를 수득하였다. 그 후, 5% FBS, 10 μM의 인슐린 및 8 ng/ml의 bFGF가 포함된 DMEM 기본배지에서 상기 근육줄기세포를 배양하고 근육줄기세포의 증식을 측정하였다. 그리고, 그 결과를 도 1에 나타내었다. 대조군으로는 5 % FBS + 8 ng/ml의 bFGF가 첨가된 DMEM 기본배지를 사용하였다.
도 1은 인슐린 및 bFGF 포함 배지의 근육줄기세포 증식 효과를 나타낸 그래프이다.
도 1에 나타낸 바와 같이 29 일 동안 근육세포를 배양한 경우, 10 μM의 인슐린을 포함하는 배지의 세포 증식률이 기본 배지의 세포 증식률 대비 약 6 배 이상 증가함을 확인하였다.
실험예 1.2 bFGF를 불포함하는 인슐린 배지의 근육줄기세포 증식 효과 확인
상기 실시예 1.에서 제조한 DMEM 기본 배지에 5 %의 FBS 및 10 μM의 인슐린을 첨가하고 근육줄기세포의 증식 효과를 확인하였다.
보다 구체적으로, 먼저 소의 우둔살에 트립신을 처리한 후 초대배양하여 소의 근육줄기세포를 수득하였다. 그 후, 5% FBS 및 10 μM의 인슐린이 포함된 DMEM 기본배지에서 상기 근육줄기세포를 배양하고 근육줄기세포의 증식을 측정하였다. 그리고, 그 결과를 도 2에 나타내었다. 대조군으로는 5 % FBS가 첨가된 DMEM 기본배지를 사용하였다.
도 2는 bFGF를 불포함하는 인슐린 배지의 근육줄기세포 증식 효과를 나타낸 그래프이다.
도 2에 나타낸 바와 같이 41 일 동안 근육세포를 배양한 경우, 10 μM의 인슐린을 포함하는 배지의 세포 증식률이 기본 배지의 세포 증식률 대비 약 13 배 이상 증가함을 확인하였다.
이상의 결과는, bFGF의 유무와 상관없이, 인슐린이 근육줄기세포의 증식 촉진제로 작용할 수 있음을 의미한다.
실험예 2. 인슐린 포함 배지의 근육줄기세포 분화능 유지 효과 확인
실험예 2.1 인슐린 및 bFGF 포함 배지의 근육줄기세포 분화능 유지 효과 확인
상기 실시예 1.에서 제조한 DMEM 기본배지에 5 %의 FBS, 8 ng/ml의 bFGF 및 인슐린을 첨가하고 근육줄기세포의 분화능 유지 효과를 확인하였다.
보다 구체적으로, 먼저 소의 우둔살에 트립신을 처리한 후 초대배양하여 소의 근육줄기세포를 수득하였다. 그 후, 5 % FBS 및 8 ng/ml의 bFGF가 포함된 DMEM 기본배지에 인슐린의 농도를 달리하여(각 0.1 μM, 1 μM, 5 μM, 8 μM, 10 μM 농도의 인슐린) 인슐린 및 bFGF 포함 배지를 제조한 뒤, 근육줄기세포를 2번의 계대배양을 통해 배양하였다. 그리고 상기 배지에서 근육줄기세포 마커인 Oct4 및 Nanog, 및 근모세포 마커인 Pax7의 발현 정도를 qPCR을 통해 확인하고, 그 결과를 각 도 3 내지 5에 나타내었다.
도 3은 인슐린 및 bFGF 포함 배지에서 인슐린의 농도에 따른 근육줄기세포 마커인 Oct4의 발현 정도를 나타낸 그래프이다.
도 4는 인슐린 및 bFGF 포함 배지에서 인슐린의 농도에 따른 근육줄기세포 마커인 Nanog의 발현 정도를 나타낸 그래프이다.
도 5는 인슐린 및 bFGF 포함 배지에서 인슐린의 농도에 따른 근모세포 마커인 Pax7의 발현 정도를 나타낸 그래프이다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 인슐린 및 bFGF 포함 배지에서 Oct4의 발현이 유지되어 분화능이 유지됨을 확인하였다. 그리고 인슐린의 농도가 10 μM 이상이 되자, Oct4의 발현이 유의적으로 감소함을 확인하였다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 인슐린 및 bFGF 포함 배지에서 Nanog의 발현이 유지되어 분화능이 유지됨을 확인하였다. 그리고 인슐린의 농도가 10 μM 이상이 되자, Nanog의 발현이 감소함을 확인하였다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 인슐린 및 bFGF 포함 배지에서 Pax7의 발현이 인슐린의 농도에 비례하여 증가함을 확인하였다.
이상의 결과는 인슐린 포함 배지에서 근육줄기세포를 배양하는 경우 근육줄기세포의 분화능을 유지시킬 수 있음을 의미한다. 또한, 적어도 10 μM 농도 이상의 인슐린을 포함하는 배지에서는 Oct4 및 Nanog의 발현이 줄어들고, Pax7의 발현이 증가함을 확인하였다. 이에 10 μM 농도 이상의 인슐린을 포함하는 배지에서 근육줄기세포의 근모세포로의 분화를 유도할 수 있음을 확인하였다.
실험예 2.2 bFGF를 불포함하는 인슐린 배지의 근육줄기세포 분화능 유지 효과 확인
상기 실시예 1.에서 제조한 DMEM 기본배지에 5 %의 FBS 및 인슐린을 첨가하고 근육줄기세포의 분화능 유지 효과를 확인하였다.
보다 구체적으로, 먼저 소의 우둔살에 트립신을 처리한 후 초대배양하여 소의 근육줄기세포를 수득하였다. 그 후, 5 % FBS가 포함된 DMEM 기본배지에 인슐린의 농도를 달리하여(각 0.1 μM, 1 μM, 5 μM, 8 μM, 10 μM 농도의 인슐린) 인슐린 포함 배지를 제조한 뒤, 근육줄기세포를 2번의 계대배양을 통해 배양하였다. 그리고 상기 배지에서 근육줄기세포 마커인 Oct4 및 Nanog, 및 근모세포 마커인 Pax7의 발현 정도를 qPCR을 통해 확인하고, 그 결과를 각 도 6 내지 8에 나타내었다.
도 6은 bFGF를 불포함하는 인슐린 배지에서 인슐린의 농도에 따른 근육줄기세포 마커인 Oct4의 발현 정도를 나타낸 그래프이다.
도 7은 bFGF를 불포함하는 인슐린 배지에서 인슐린의 농도에 따른 근육줄기세포 마커인 Nanog의 발현 정도를 나타낸 그래프이다.
도 8은 bFGF를 불포함하는 인슐린 배지에서 인슐린의 농도에 따른 근모세포 마커인 Pax7의 발현 정도를 나타낸 그래프이다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 인슐린 포함 배지에서 Oct4의 발현이 유지되어 분화능이 유지됨을 확인하였다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 인슐린 포함 배지에서 Nanog의 발현이 유지되어 분화능이 효과적으로 유지됨을 확인하였다. 그리고, 10 μM의 인슐린을 첨가한 경우 Nanog의 발현이 유의하게 감소함을 확인하였다.
도 8에 나타낸 바와 같이, 인슐린 포함 배지에서 Pax7의 발현이 인슐린의 농도에 비례하여 증가함을 확인하였다. 특히, 10 μM의 인슐린을 포함하는 배지에서 Pax7의 발현이 인슐린 미첨가 배지 대조군(DMSO control) 대비 약 6배 이상 증가함을 확인하였다.
즉, bFGF를 불포함하는 인슐린 배지에서도 근육줄기세포 마커인 Oct4 및 Nanog의 발현이 효과적으로 유지됨을 확인하였다. 또한, 10 μM 농도의 인슐린을 포함하는 인슐린 배지에서는 근육줄기세포의 마커인 Nanog의 발현이 유의하게 감소하면서, 근모세포의 마커인 Pax7의 발현은 유의적으로 증가함을 확인하였다. 이는, 인슐린의 농도를 조절함에 따라 적절한 분화시기를 선택할 수 있고, 필요한 때 근육줄기세포를 분화시킴으로써 배양육의 품질을 향상시킬 수 있음을 의미한다.

Claims (10)

  1. 인슐린을 포함하는 근육줄기세포 배양용 배지 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 줄기세포는 포유동물의 줄기세포인 것인, 근육줄기세포 배양용 배지 조성물.
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 조성물은 근육줄기세포를 미분화 상태로 유지시키는 것인, 근육줄기세포 배양용 배지 조성물.
  4. 청구항 1에 있어서,
    상기 조성물은 bFGF를 포함하지 않는 것인, 근육줄기세포 배양용 배지 조성물.
  5. 청구항 1에 있어서,
    상기 인슐린을 0.01 μM 내지 100 μM의 농도로 포함하는 것인, 근육줄기세포 배양용 배지 조성물.
  6. 청구항 1에 있어서,
    상기 인슐린을 적어도 10 μM의 농도로 포함하는 것인, 근육줄기세포 배양용 배지 조성물.
  7. 포유동물로부터 분리된 근육줄기세포를 인슐린을 포함하는 근육줄기세포 배양용 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 근육줄기세포 배양 방법.
  8. 청구항 7에 있어서,
    상기 배양은 계대 배양인 것인, 배양 방법.
  9. 인슐린을 포함하는 근육줄기세포 배양용 배지 조성물을 분리된 비-인간 동물 유래 근육줄기세포에 처리하여 배양육을 제조하는 단계를 포함하는 배양육 제조 방법.
  10. 청구항 9의 방법으로 제조된 배양육.
KR1020220039098A 2021-03-29 2022-03-29 근육줄기세포 증식을 위한 인슐린을 포함하는 근육줄기세포 배양용 배지 조성물 KR20220135213A (ko)

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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