MX2007002390A

MX2007002390A - Medio y cultivo de celulas progenitoras embrionarias.

Info

Publication number: MX2007002390A
Application number: MX2007002390A
Authority: MX
Inventors: James A Thomson; Tenneille Ludwing
Original assignee: Wisconsin Alumni Res Found
Priority date: 2004-09-08
Filing date: 2005-09-08
Publication date: 2007-04-23
Also published as: NO20071576L; AU2005282510B2; CN101044235B; NO344695B1; JP2008512122A; CA2579643A1; US8426203B2; GB0706626D0; US20120178161A1; AU2005282510A1; BRPI0514778B1; JP2014014373A; US7449334B2; IL181437A0; CN101044235A; GB2432846B; BRPI0514778A; ES2383813T3; KR20070053316A; KR101264940B1

Abstract

Los metodos previos para cultivar celulas de tallo embrionarias humanas han requerido ya sea celulas alimentadoras de fibroblasto o un medio que ha sido expuesto a celulas alimentadoras de fibroblasto con el fin de mantener.

Description

MEDIO Y CULTIVO DE CÉLULAS PROGENITURAS EMBRIONARIAS CAMPO DE LA INVENCIÓN I Esta invención se hizo con el soporte del gobierno , de los Estados Unidos otorgado por las siguientes agencias: NIH RR17721. Los Estados Unidos tienen ciertos derechos en esta invención ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las células progenitoras se definen como células I que son capaces de diferenciación en muchos otros tipos de < células diferenciadas. Las células progenitoras embrionarias I son células de tallo de embriones que son capaces de diferenciación en la mayor parte, sino todos, los tipos de células diferenciadas del cuerpo maduro. Las células progenitoras son referidas como pluripotentes, lo que describe esta capacidad de diferenciación en muchos tipos de célula. Una categoría de célula progenitora pluripotente de alto interés para la comunidad de la investigación es La célula progenitora embrionaria humana, abreviada aquí como célula ES, la cual es una célula progenitora embrionaria derivada de una fuente embrionaria humana. Las células progenitoras embrionarias humanas son de un gran interés científico porque son capaces de la proliferación indefinida en cultivo y de esta forma son capaces, por lo menos en t Ref. 179899 i principio, de suministrar células y tejidos para el reemplazo de tejido deficiente o defectuoso humano. La existencia en el cultivo de células de tallo embrionarias humanas ofrece el potencial de cantidades ilimitadas de células y tejidos humanos para uso en una variedad de protocolos terapéuticos para ayudar en la salud humana. Se contempla en el futuro que Las células progenitoras embrionarias humanas se proliferarán y se dirigirán para diferenciarse en linajes específicos para así desarrollar células o tejidos diferenciadas que se pueden transplantar en cuerpo humanos para propósitos terapéuticos. As células de tallo y las células diferenciadas que se pueden derivar de éstas también son poderosas herramientas científicas para el estudio de sistemas celulares y de desarrollo humanos. Se han descrito las técnicas básicas para crear y cultivar células de tallo embrionarias humanas. Las técnicas previamente reportadas funcionan, pero existen limitaciones e inconvenientes a muchos de los procedimientos actualmente utilizados para cultivar células de tallo embrionarias humanas. Una limitación es de preocupación particular. La mayor parte de las lineas de células de tallo embrionarias humanas han sido, en un grado u otro, expuestas directamente a células de ratón o a un medio en donde las células de ratón han sido previamente cultivadas. El hecho de que algunas células ES humanas de líneas de células existentes se encontró que exhiben el residuo siálico Neu5Gc, que no se hace normalmente a través de células humanas, recibió mucha atención en la prensa. Las técnicas originales para la generación y cultivo de células de tallo embrionarias humanas requirieron el uso de células alimentadoras de fibroblasto embrionario de ratón (MEF, por sus siglas en inglés) como una capa alimentadora en las cuales se podrían cultivar Las células progenitoras embrionarias humanas. Las células alimentadoras de fibroblasto actúan, a través de alguno, pero aún no completamente entendido mecanismo, para estimular que Las células progenitoras permanezcan en un estado no diferenciado. Más tarde se descubrió que se podría lograr el mismo fenómeno si Las células progenitoras fueran expuestas a "medios condicionados". El medio condicionado es un medio de cultivo de célula progenitoraen el cual las células alimentadores, tales como las MEF, han sido previamente cultivadas. Ya sea que las células alimentadoras impartan algún factor al medio o remuevan algún factor del medio, el resultado es que el medio condicionado se puede utilizar para cultivar células de tallo sin diferenciación. Cualquier condición de cultivo, el crecimiento directo de ES humano en células alimentadoras de murino, o el uso de medio condicionado, dan origen a una preocupación de que uno o más agentes tales como un virus se podrían transmitir de las células de ratón a las células ES humanas. Si uno de los objetivos de los cultivos de células de tallo embrionarias humanas es crear tejidos que finalmente pueden ser trasplantados al cuerpo humano, es altamente deseable que Las células progenitoras nunca sean expuestas a las células de otras especies o a un medio que ha sido utilizado para cultivar células de otras especies. Por consiguiente, la definición de una condición de cultivo, que permitirá la proliferación y el cultivo de células de tallo embrionarias humanas sin la capa alimentadora de fibroblasto, es de gran interés en el continuo desarrollo de técnicas para cultivos de larga duración de células de tallo embrionarias humanas. Un rasgo característico de la células de tallo embrionarias humanas es que si las condiciones son menos que ideales, las células tienen una tendencia a diferenciarse. Es fácil inducir células ES humanas para diferenciarse mientras a su vez, es importante mantener las células ES humanas en estado no diferenciado en el cultivo. La mayor parte de las condiciones de cultivo darán como resultado algún nivel de diferenciación indeseada, particularmente alrededor de la periferia de la colonia de células ES en crecimiento. Ya que las células ES se pueden cultivar con algún grado de diferenciación indeseada, el objetivo es definir una condición de cultivo que permite que el cultivo permanezca tan no diferenciado como sea posible, es decir, con tantas células no diferenciadas como sea posible. Se cree que se han utilizado estándares particularmente estrictos para definir las condiciones que soportarán el cultivo indefinido de cultivos de células ES no diferenciadas. Varias formulaciones de medio permitirán que las células ES humanas permanezcan sin diferenciar durante algún tiempo, pero eso estado por lo general falla en mantenerse así mismo. En particular, se define el crecimiento de células ES humanas a partir de un cultivo de semilla inicial en un recipiente de cultivo para la confluencia en el mismo recipiente de cultivo como un "paso" . Se han encontrado varias formulaciones de medio que permiten el cultivo de células ES humanas de uno o dos pasos sin una diferenciación severa, pero después las células se diferencian rápidamente sobre pasos subsiguientes. Se ha llegado a creer que con el fin de que un medio verdaderamente dé soporte a la proliferación indefinida de células ES humanas sin diferenciación, sin medio condicionado o células alimentadoras de fibroblasto, el medio debe demostrar que da soporte al cultivo de células ES humanas en un estado sustancialmente uniforme y no diferenciado durante al menos cinco pasos. También es importante que los cultivos permanezcan relativamente homogéneos y no diferenciados a lo largo del periodo de cultivo y retener todas las características importantes de las células ES humanas. El estado de la diferenciación de un cultivo de célula progenitorase puede evaluar más fácilmente juzgando -las características morfológicas de las células. Las células progenitoras no diferenciadas tienen una morfología característica, es decir, células pequeñas y compactas con bordes de células claramente definidos, una morfología que puede ser fácilmente vista a través del examen de un cultivo de célula progenitorabajo un microscopio. En contraste, las células que se han diferenciado aparecen más grandes y más difusas con bordes indistintos. Ya que algunas de las células diferenciadas pueden, y normalmente lo hacen, aparecer en el margen de las colonias de células no diferenciadas, el cultivo de célula progenitoraóptimo es uno que prolifera en el recipiente del cultivo con solamente números mínimos de células en la periferia del cultivo que parece que están diferenciadas. Con experiencia, se puede juzgar el estado de la diferenciación y la salud de los cultivos de células ES humanas visualmente con buena exactitud. Se utiliza un marcador biológico para rastrear el estado de las células ES como no diferenciadas en la presencia del factor de transcripción Oct4, el cual ha llegado a estimarse co o el marcador más confiable del estado no diferenciado de células ES, y el cual es uno de los primeros marcadores que se pierden según las células no diferenciadas inician la diferenciación .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se resume como un método para cultivar células de tallo embrionarias humanas sin la necesidad de células alimentadoras o medio condicionado, el método incluye el paso de cultivar Las células progenitoras embrionarias humanas en un medio que incluye sales, vitaminas, aminoácidos, glucosa, un factor de crecimiento de fibroblasto, ácido gama amino butírico, ácido pipecólico, litio y el factor beta de crecimiento de transformación, todos en una cantidad suficiente para mantener Las células progenitoras en un estado no diferenciado a través de los múltiples pasos del cultivo. La presente invención también está dirigida a un cultivo células in vi tro de células de tallo embrionarias humanas cultivadas en un medio que incluye altos niveles de factor de crecimiento de fibroblasto, ácido gama amino butírico, ácido pipecólico, una sal de litio y el factor beta de crecimiento de transformación de tal forma que Las células progenitoras se pueden cultivar indefinidamente en un estado no diferenciado sin la necesidad de células alimentadoras de fibroblasto o medio condicionado. Es un objeto de la presente invención definir condiciones de cultivo de larga duración para células de tallo embrionarias humanas que evitan el uso o exposición a células de animal, y proteínas de animal, ya sea células alimentadoras o medio condicionado en el cual Las células ¡ i progenitoras se cultivan. Es otro objeto de la presente invención definir condiciones de cultivo para células de tallo embrionarias humanas que están tan definidas como es posible mientras se mantiene la proporción máxima de la célula en el cultivo tanto como sea posible en un estado no diferenciado. Otros objetos, características y ventajas de la presente invención serán evidentes a partir de la siguiente especificación.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 presenta datos del trabajo experimental descrito en la especificación siguiente mostrando que los componentes del medio reducen la proporción de células diferenciadas en el cultivo de células ES humanas que crecen ahí . La Figura 2 es una presentación gráfica de los datos que muestran que el medio con proteínas de matriz humana dan como resultado células ES humanas que no exhiben un residuo de ácido siálico de origen no humano. La Figura 3 es una presentación gráfica de datos que muestra el alto nivel de células no diferenciadas en el cultivo de células de tallo humanas. La Figura 4 es una representación gráfica de datos que muestran que el medio descrito aquí da como resultado el crecimiento robusto de cultivos de células de tallo.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Se han identificado múltiples condiciones de cultivo y medios que permiten el cultivo indefinido y la proliferación robusta de células de tallo embrionarias humanas en un estado no diferenciado y también en ausencia tanto de células alimentadoras como medio condicionado. El desarrollo de estos medios y condiciones de cultivo hace posible la derivación y mantenimiento de líneas de células ES humanas en condiciones definidas y controladas sin la exposición directa o indirecta a células de animal de cualquier clase. Este medio ha demostrado que da soporté a la proliferación de células ES no diferenciadas a través de múltiples pasos, por lo menos cinco pasos, lo cual es una evidencia firme de que este medio dará soporte a dichos cultivos indefinidamente. Un medio definido y humanizado para el cultivo y proliferación de células ES humanas típicamente incluye sales, vitaminas, una fuente de glucosa, minerales y aminoácidos. Para suplementar el medio y las condiciones de suministro para dar soporte al crecimiento de células, inicialmente el medio de Las células progenitoras incluye suero de una fuente u otra. También previamente se ha reportado que la adición del factor de crecimiento de fibroblasto más un reemplazo de suero aditivo permitirá el cultivo de células ES humanas sin suero. El reemplazo del suero puede ser un producto comercialmente disponible vendido para ese propósito o puede ser una mezcla formulada de proteína, tal como albúmina de suero, vitaminas, sales, minerales, una transferrina o un sustituto de transferrina, una insulina o un sustituto de insulina. Este componente de reemplazo se suero también se puede suplementar con selenio. Se prefiere utilizar un reemplazo de suero definido en lugar de suero de cualquier fuente en el cultivo de células ES humanas, con el fin de evitar los aspectos de variación en los constituyentes del suero y utilizar medios tan definidos como sea posible. Se ha definido un medio suficiente, y todos los componentes del medio enseñados aquí se describen en la Tabla 1 establecida a continuación, que enumera todos los componentes de nuestro medio, designado TeSRl, a través de la concentración de los constituyentes. El medio TeSRl está comprendido de una base DMEM/DF12, suplementada con albúmina de suero, vitaminas, antioxidantes, minerales de rastreo, lípidos específicos, y factores de crecimiento clonados. Para evitar la necesidad de una capa alimentadora de fibroblasto, previamente se pensó que era necesario mantener células ES humanas en un estado no diferenciado, se reporta en la presente que la combinación del uso de concentraciones más altas de FGF (de 10 a 1000 ng/ml) junto con el uso de GABA (ácido gama amino butírico) , ácido • pipecólico (PA, por sus siglas en inglés) , cloruro de litio (LiCl) y el factor beta de crecimiento de transformación (TGF-beta, por sus siglas en inglés) , permitirá que un medio dé soporte al crecimiento de células de tallo no diferenciadas. La combinación de estos aditivos se ha encontrado que es suficiente para mantener el cultivo de células ES humanas en un estado no diferenciado , indefinidamente sin la exposición ya sea a células alimentadoras o medio condicionado. Estos aditivos son suficientemente demostrables. Sin embargo, todos estos pueden I no ser necesarios para cada formulación de medio. A través de la eliminación selectiva de estos aditivos, uno o más de estos componentes se pueden eliminar dando como resultado cultivos de células ES humanas que aún crecerán a una pérdida de purera del estado no diferenciado en los cultivos. Dichos cultivos pueden o no pueden permanecer estables a través de ¡ muchos pasos. Sin embargo, es claro que la combinación es ' suficiente para permitir una variedad de medios que soportarán el cultivo a de larga duración y la proliferación de células ES humanas no diferenciadas a través de un número indefinido de pasos sin células alimentadoras o medio condicionado . Nuestras clasificaciones subjetivas iniciales de estos factores de crecimiento individuales, seleccionados porque los receptores expresados a través de células ES i humanas, identificaron varios factores como sus efectos positivos en la proliferación no diferenciada. De estos, bFGF, LiCl, ácido ?-aminobutírico (GABA), ácido pipecólico, y TGFß fueron finalmente incluidos en TeSRl . Para cada una de las cuatro líneas de células probadas, la tasa de proliferación y el porcentaje de células que mantuvieron la expresión de marcadores de células ES humanas características fue mayor en TeSRl que en células de control cultivadas en j medio condicionado con fibroblasto, y la remoción de ' 1 ! cualquiera de estos cinco factores disminuyó el rendimiento i del cultivo. Algunos de estos datos se ilustran en la Figura 1, que muestra que los cultivos crecen en medio con cualquiera de estos constituyentes omitidos exhibieron un porcentaje menor de células que permanecieron no diferenciadas según comparado con cultivos con los cuatro constituyentes del medio incluidos. Observar que 0ct4, SSEA-1, SSEA-4, Tral-60 y Tral-80 todos son marcadores de superficie de célula o factores de transcripción (Oct4) que se utilizaron para rastrear el estado de diferenciación de Las células progenitoras. La Figura 4 ilustra ensayos similares en donde se demostró que a través de múltiples pasos la tasa de crecimiento de los cultivos fue más alta cuando estuvieron todos estos constituyentes juntos en el medio de cultivo. También es útil incluir en las condiciones de cultivo para las células ES humanas una matriz biológica en el recipiente de cultivo. Uno de dichos materiales que ha sido utilizado es Matrigel™, el cual es una membrana de basamento artificial de origen celular de ratón, que es suministrada como un producto comercial libre de células de ratón. Otro material de origen humano también conocido ahora que sirve para un propósito similar es fibronectina, una glicoproteína humana que se produce en su forma insoluble para crear una matriz de fibra que también sirve como una membrana de basamento para el cultivo de células ES. En nuestras manos una matriz de fibronectina sola no fue suficiente. Sin embargo también se ha encontrado que un material de matriz humana también se puede hacer de una combinación de colágeno IV de proteínas de matriz humana, fibronectina, laminina, y vitronectina y esta matriz es suficiente para soportar células ES humanas indefinidamente en un estado no diferenciado en el medio TeSRl . Para llegar a los aditivos de medio enumerados anteriormente, se siguió la prueba metódica de más de 80 factores de crecimiento individuales. Ya que algunos de los aditivos parecen, al menos por unos pasos, que soportan el crecimiento de células ES humanas en cultivo, muchos fallan en los subsiguientes pasos para mantener las células ES en un estado no diferenciado. No se identificaron otras ¡ combinaciones de estos otros factores que dan los resultados de los aditivos de medio descritos en los ejemplos siguientes. Esto no es para decir que los constituyentes no son sujetos a alguna variación. Por ejemplo, el LiCl se utilizó en el medio porque estimula la trayectoria wnt. Los wnt por sí mismos u otros estimuladores de esta trayectoria tal como activina podrían sustituirse como equivalentes para LiCl, aún cuando LiCl es probablemente el agente más económico para este propósito. Similarmente, el GABA se cree que interactúa con el receptor GABA, y la literatura científica incluye la identificación de varias moléculas que son agonistas del mismo receptor y podrían sustituirse por GABA en el medio como un equivalente. También se cree que PA también interactúa con el receptor GABA. Ya que tanto GABA como PA se encontró son útiles en el medio a las concentraciones utilizadas aquí, también se contempla que uno u el otro de estos constituyentes podría dramáticamente aumentar en concentración para obviar la necesidad del otro. El factor de crecimiento de fibroblasto en concentraciones más altas (40 a 100 ng/ml) parece que obvia la necesidad de células alimentadoras. El FGF preferido es FGF básico, también referido como bFGF y FGF2 , pero otros FGF que incluyen al menos FGF4 , FGF9, FGF17 y FGF18 serán suficientes para este propósito también. Otros FGF también pueden funcionar, aún a concentraciones más altas. La observación de que los cultivos de células de tallo embrionarias humanas (ES) han sido previamente mantenidos en un estado no diferenciado solamente cuando se cultivan en la presencia de células alimentadoras de fibroblasto o en medio condicionado ha conducido a la especulación de que los fibroblastos liberan en el medio un factor que actúa para inhibir la diferenciación de las células ES. Sin embargo, cualquiera que sea el efecto que se media por las células alimentadoras de fibroblasto al medio, ahora es claro que el medio descrito más adelante sustituirá ese efecto. Los tres medios definidos a continuación están definidos, no contienen células de animal, y permiten el cultivo de larga duración de células ES humanas no diferenciadas en un estado no diferenciado. También se presenta un ejemplo de un medio en donde las proteínas en el medio todas son humanas, para tener un medio "humanizado" y condiciones de cultivo que evitan cualquier posible preocupación acerca de los productos sub-celulares de origen animal.

EJEMPLOS Los constituyentes del medio TeSRl, que se utilizaron para todos los cultivos descritos aquí a menos que se indique otra cosa, se establece en la Tabla 1 siguiente.

Los experimentos preliminares sugirieron que la proliferación de célula ES humana no diferenciada fue óptima a un pH de 7.2, osmolaridad de 350 mOsMoles, y una atmósfera de 10% de C0 /5% de 02. Estas condiciones se utilizaron para todos los cultivos subsiguientes descritos aquí. Las células de líneas ES humanas Hl, H7 , H9 y H14 todas han proliferado robustamente en TeSRl para 11, 7, 25, y 17 pasos respectivamente (2-6 meses) . Los cariotipos se confirmaron para la línea de células H14 después de 7 pasos, i i y H9 después de 8 y 21 pasos. La formación de teratbma se i confirmó para Hl y H9 después de 11 y 20 pasos. Se ha sugerido que los cultivos de células ES | i anteriores son menos que óptimos por la presencia de Neu5Gc, ] ácido siálico no hecho por humanos. Debido a que los componentes de la matriz humana, colágeno, fibronectina, laminina y vitronectina eliminaron el producto final de animal de las condiciones de cultivo TeSRl para células ES humanas, se probó si Neu5Gc se eliminó de las líneas de células ES humanas existentes durante el cultivo en este medio. Se confirmó la presencia de New5Gc en células ES humanas cultivadas en medio condicionado con fibroblasto, se detectó una cantidad reducida pero detectable de células cultivadas en TeSRl en Matrigel, y no se pudo detectar ningún Neu5Gc en células ES cultivadas en TeSRl utilizando los cuatro componentes de matriz humana. Estos datos se ilustran en la Figura 2. De esta forma las células ES cultivadas en TeSRl y en una matriz de proteínas humanas no exhiben los residuos de ácido siálico no humano encontrados en células cultivadas sobre células alimentadoras de murino. Para probar las condiciones de las colonias de células ES y la idoneidad del cultivo para el mantenimiento a largo plazo de cultivos de células ES humanas, el medio TeSRl se comparó con la mejor condición de medio anterior, la cual es nuestras manos es el uso de medio condicionado. Se encontró que el medio TeSRl fue capaz de mantener las células ES humanas en dicho estado no diferenciado que más del 90% de las células continuaron probando positivo para Oct 4 aún después del cultivo a largo plazo. Los resultados de esta prueba se presentan en la gráfica de la Figura 3. Esto representa la primera instancia en donde cualquier medio libre de alimentador y libre de medio condicionado ha mantenido un nivel de crecimiento no diferenciado de células ES humanas que abarca más del 90% de las células en el cultivo permanecen no diferenciadas en todas las etapas. La curva de crecimiento y el análisis FACS de las células Hl cultivadas en tres pasos se midió en medio TeSRl y en medio TeSR a partir de lo cual cada uno de los siguientes componentes ha sido omitido: TGFß, PA, LiCl, GABA y bFGF. Para iniciar los cultivos, se colocaron en placas 3 x 105 células de cada línea de células en el Día 0 del paso 1. Se contador los números de células de cavidades por triplicado para evaluar la unión (día 2-3) y el número de célula final en el paso (día 6-7) . La densidad de la colocación en placas inicial y los tiempos de muestreo se repitieron, cuando fue posible, para 5 pasos. Las células se analizaron en el día 6 del paso 3 a través de FACS para marcadores de superficie de célula SSEA1, SSEA4, Tra 1-6' y Tra 1-80 y para el factor de transcripción Oct4. Estos datos se presentan gráficamente en la Figura 1. Estos datos muestran que las células ES humanas se pueden cultivar en medio carente de cada uno de íestos componentes al costo de alguna diferenciación indeseada de células en el cultivo, y que el nivel más alto de cultivo no diferenciado solo se podría lograr utilizando todos estos componentes. Se obtuvieron resultados similares con otras líneas de células también. La pluripotencia de las líneas de células ES humanas mantenida en medio TeSRl se probó. Las células de líneas de células recientemente iniciadas WA01, y WA09, cultivadas en medio TeSRl en matriz de Matrigel para 11 y 20 pasos, se inyectaron respectivamente en ratones color marrón SCID. Se desarrollaron teratomas exhibiendo diferenciación compleja en los ratones a las 6-8 semanas después de la inoculación.

TABLA 1 Formulación Completa del Medio TeSRl SALES INORGÁNICAS mM AMINOÁCIDOS mM Cloruro de calcio 0.8232 L-Alanina 0.1392 (anhidro) HEPES 11.76 Clorhidrato de L- 0.5488 Arginina Cloruro de magnesio 0.2352 L-Asparagina-H20 0.1392 (anhidro) Sulfato de magnesio 0.319088 Acido L-Aspártico 0.1392 (MgS04) Cloruro de potasio 3.26144 L-Cisteína-HCl-H20 0.0784 (KCl) Bicarbonato de sodio 11.2112 2HC1 de L-Cisteína 0.0784 (NaHC03) Cloruro de sodio 94.55824 Acido L-Glutámico 0.1392 (NaCl) Fosfato sódico- 0.392 L-Glutamina 2.96 dibásico (anhidro) Monofosfato sódico 0.355152 Glicina 0.296 (NaH2PO4-H20) L-Histidina-HCl-H20 0.1176 MINERALES DE RESIDUO L-Isoleucina 0.326144 Nitrato férrico 0.00009408 L-Leucina 0.3535l84 (Fe(NO3)3-9H20) Sulfato férrico 0.001176 Clorhidrato de L- 0.391216 (FeS04-7H20) Lisina Sulfato cúprico 4.07668E-06 L-Metionina 0.090944 (CuS04-5H20) Sulfato de Zinc 0.001176 L-Fenilalanina 0.16856 (ZnS04-7H20) Sulfato Manganoso Mn 1 .00592E-05 L-Serina 0.296 S04 H20) Molibdato de Amonio 1 .00404E-05 L-Treonina 0.35016 NÍS04 6H20 4.94861E-06 L-Triptófano 0.0346528 Metasilicato de 0.004926108 2 Na 2H20 L-Tirosina 0.167776 sodio Na2Si03 9H20 SnC12 5 .32544E-06 L-Valina 0.354368 CdC12 6.21931E-05 CrC13 9.41176E-06 VITAMINAS Ag No3 5.00293E-06 Acido ascórbico 0.375 A1C13 6H20 2.4855E-05 Biotina 1.12112E-05 Ba (C2H302)2 4.99217E-05 Cloruro de colina 0.0502544 CoC12 6H20 5.00221E-05 Pantotenato de D- 0.0036064 calcio Ge02 2.5337E-05 Acido fólico 0.004704 KBr 5.04202E-06 i-Inositol 0.05488 Kl 5.12048E-06 Niacinamida 0.012936 NaF 0.000500119 Clorhidrato de 0.Ó076048 piridoxina KbCl 5.00414E-05 Riboflavina 0.0004704 Zr012 8H20 9.03834E Clorhidrato de 0.02460217 iamina Vitamina B12 0.000392 FACTORES DE CRECIMIENTO GABA 0.979 SUSTRATOS DE ENERGÍA Acido pipecólico 0.000984 D-Glucosa 13.72784 bFGF 5.80E-06 Piruvato sódico 0.392 LiCl 0.979 TGF beta 1 2.35E-08 PROTEÍNAS Insulina Humana 0.0034438 LIPIDOS Holo transferrina 0.14 humana Acido linoleico 0.0070976 Albúmina de suero 199.7 humana Acido lipoico 0.00039984 Acido araquidónico 0.001312 OTROS COMPONENTES Colesterol 0.0113798 Glutationa 0.00592996 (reducida) DL-alfa tocoferol- 0.02962 Hipoxantina de NA 0.01176 acetato • Acido linoleico 0.007184 Rojo fenol 0.0159936 Acido mirístico 0.008758 2HC1 de Putrescina 0.000394352 Acido oleico 0.00708 Timidita 0.001176 Acido palmitoleico 0.007862 2-mercaptoetanol 0.1 Acido esteárico 0.00703 Selenio 0.000177304 Plurónico F-68 0.238 Tween 80 0.3358 Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se1 reclama como propiedad lo contenido en las siguientes ' reivindicaciones : 1.- Un método para cultivar células de tallo humanas en un estado no diferenciado sobre una matriz sin la necesidad de células alimentadoras o medio condicionado, caracterizado porgue comprende el paso de: cultivar Las células progenitoras humanas en un i medio que incluye sales, vitaminas, aminoácidos, glucosa, un factor de crecimiento de fibroblasto, ácido gama amino butírico, ácido pipecólico, litio y el factor beta de crecimiento de transformación, en cantidades suficientes para mantener Las células progenitoras humanas en un estado no diferenciado a través de múltiples pasos de cultivo sucesivos . 2.- El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el medio incluye el factor de crecimiento de fibroblasto en una concentración de al menos 40 ng/ml. 3. - El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el medio también comprende transferrina e insulina. 4. - El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque Las células progenitoras humanas son células de tallo embrionarias. 5. Un método para cultivar células de tallo embrionarias humanas en una matriz y en una medio que incluye sales, vitaminas, aminoácidos, y un factor de crecimiento de fibroblasto, caracterizado porque comprende agregar al medio una cantidad de ácido gama amino butírico, ácido pipecólico, litio y un factor beta de crecimiento de transformación en una cantidad suficiente para mantener las células en un estado no diferenciado a través de múltiples pasos de cultivo sucesivos. 6. Un cultivo de células in vi tro, caracterizado porque comprende en un recipiente de cultivo: células de tallo humanas; una matriz en donde pueden crecer Las células progenitoras; y un medio de cultivo, el medio de cultivo comprende sales, vitaminas, aminoácidos, glucosa, factor de crecimiento de fibroblasto, ácido gama amino butírico, ácido pipecólico, litio y el factor beta de crecimiento de transformación en cantidades suficientes para mantener a Las células progenitoras humanas en un estado no diferenciado a través de múltiples pasos de cultivo, el medio estando libre de células alimentadoras y nunca habiendo sido expuesto a células alimentadoras 7. - El cultivo de célula de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el medio incluye el factor de crecimiento de fibroblasto en una concentración de al menos 40 ng/ml. 8. El cultivo de célula de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el medio incluye el factor de crecimiento de fibroblasto en una concentración de al menos 100 ng/ml. 9. El cultivo de célula de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el medio además comprende proteínas seleccionadas del grupo que consiste de albúmina, insulina y transferrina. 10. El cultivo de célula de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque las proteínas son humanas . 11. El cultivo de célula de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque la insulina y transferrina son proteínas recombinantes. 12. El cultivo de célula de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado Las células progenitoras son células de tallo embrionarias humanas. 13. Un cultivo de células de tallo embrionarias humanas caracterizado porque comprende células de tallo humanas no diferenciadas, una matriz y un medio de cultivo, el cultivo libre de células alimentadoras o medio expuesto a células alimentadoras, el medio también libre de productos de animales no humanos, Las células progenitoras embrionarias humanas proliferan en un estado no diferenciado y son al menos 90% positivas para el factor de transcripción 0et4 a través de cultivo prolongado. 14. El cultivo de células de tallo embrionarias humanas de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque las células no exhiben el residuo de ácido siálico Neu5Gc . 15. Un medio para cultivar células de tallo, caracterizado porque comprende sales, vitaminas, aminoácidos, glucosa, factor de crecimiento de fibroblasto, ácido amino gama butírico, ácido pipecólico, litio y factor beta de crecimiento de transformación en cantidades suficientes ' para mantener a Las células progenitoras en crecimiento en el medio en un estado no diferenciado a través de múltiples pasos de cultivo. 16. El medio de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque además comprende proteínas seleccionadas del grupo que consiste de albúmina, insulina y transferrina.