KR20070053316A - 배아 줄기 세포용 배지 및 이의 배양물 - Google Patents

배아 줄기 세포용 배지 및 이의 배양물 Download PDF

Info

Publication number
KR20070053316A
KR20070053316A KR1020077007607A KR20077007607A KR20070053316A KR 20070053316 A KR20070053316 A KR 20070053316A KR 1020077007607 A KR1020077007607 A KR 1020077007607A KR 20077007607 A KR20077007607 A KR 20077007607A KR 20070053316 A KR20070053316 A KR 20070053316A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
medium
cells
stem cells
human
culture
Prior art date
Application number
KR1020077007607A
Other languages
English (en)
Other versions
KR101264940B1 (ko
Inventor
제임스 에이 톰슨
테네일 루드윙
Original Assignee
위스콘신 얼럼나이 리서어치 화운데이션
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 위스콘신 얼럼나이 리서어치 화운데이션 filed Critical 위스콘신 얼럼나이 리서어치 화운데이션
Publication of KR20070053316A publication Critical patent/KR20070053316A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101264940B1 publication Critical patent/KR101264940B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
    • C12N5/0606—Pluripotent embryonic cells, e.g. embryonic stem cells [ES]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0696—Artificially induced pluripotent stem cells, e.g. iPS
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C12N2500/12—Light metals, i.e. alkali, alkaline earth, Be, Al, Mg
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C12N2500/20—Transition metals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C12N2500/20—Transition metals
    • C12N2500/24—Iron; Fe chelators; Transferrin
    • C12N2500/25—Insulin-transferrin; Insulin-transferrin-selenium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/32—Amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/36—Lipids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/38—Vitamins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/50—Soluble polymers, e.g. polyethyleneglycol [PEG]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/90—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/98—Xeno-free medium and culture conditions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/15—Transforming growth factor beta (TGF-β)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/80—Neurotransmitters; Neurohormones
    • C12N2501/845—Gamma amino butyric acid [GABA]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

종래 인간 배아 줄기 세포 배양 방법은 줄기 세포를 미분화 상태로 유지시키기 위해서 영양 공급 세포인 섬유아 세포나 섬유야 영양 세포에 노출시킨 배지가 필수적이었다. 본 발명에서는 배지에 감마 아미노 부티르산, 피페콜산, 리튬 및 지질과 함께 고농도로 섬유아 세포 성장 인자를 사용하게 되면, 영양 공급세포나 순화 배지없이도, 줄기 세포가 다수의 계대 배양을 통해서 무한하게 미분화 상태로 유지될 수 있는 것을 확인하였다.
배아 줄기 세포, 배양,

Description

배아 줄기 세포용 배지 및 이의 배양물{MEDIUM AND CULTURE OF EMBRYONIC STEM CELLS}
관련 출원의 교차 참조
본 출원은 2004년 9월8일 출원된 미국 가출원 제60/608,040호를 우선권으로 주장한다.
연방정부의 지원에 의한 연구 또는 개발과 관련된 진술문
본 발명은 다음의 기관: NIH RR17721에 의해 수여되는 미합중국 정부 지원금을 통해 수행되었다. 미합중국은 본 발명에 대한 일정 권리를 갖는다.
본 발명은 배아 줄기 세포용 배지 및 이의 배양물에 관한 것이다.
줄기 세포는 다양한 유형의 분화 세포로 분화할 수 있는 세포로 정의된다. 배아 줄기 세포는 배아 유래의 줄기 세포로, 성체의 대부분(모두는 아님)의 분화된 세포 유형으로 분화할 수 있는 세포이다. 줄기 세포는 이의 다능성을 주목할 수 있는 데, 이는 다양한 유형의 세포로 분화할 수 있는 능력을 의미한다. 연구 집단에게 가장 주목받는 다능성 줄기 세포 카테고리는 인간 배아 줄기 세포(본 명세서에서는 인간 ES 세포로 축약함)이며, 이는 인간 배아에서 유래한 배아 줄기 세포이다. 인간 배아 줄기 세포는 배양 중에 무한 증식이 가능하며 또한, 적어도 이론적 으로는, 기능이 상실되거나 손상된 인간 조직을 대체할 수 있는 세포 및 조직을 제공할 수 있기 때문에 과학적으로 매우 흥미롭다. 배양 상태로 생존하는 인간 배아 줄기 세포는 인간 건강을 보조하기 위한 다양한 치료 프로토콜에서 사용가능한 인간 세포를 무한한 양으로 제공할 수 있는 잠재력을 갖는다. 미래에 치료 목적으로 인간의 몸에 이식시킬 수 있는 분화된 세포 또는 조직으로 발달하도록, 인간 배아 줄기 세포를 증식시켜서 특정 세포주로 분화시킬 수 있을 것으로 기대하고 있다. 또한 인간 배아 줄기 세포 및 이들로 부터 유도된 분화 세포는 인간 세포 및 발생계의 연구를 위해서 과학적으로 강력한 재료들이다.
인간 배아 줄기 세포를 생성시키고 배양하는 기본 기술은 공지이다. 종래 기술이 유효하긴 하나, 인간 배아 줄기 세포를 배양하는 데 현재 사용되는 많은 방법들에는 한계와 단점이 존재한다. 특히 중요한 한계가 문제가 되고 있다. 대부분의 현존하는 인간 배아 줄기 세포주는 생쥐 세포에 어느 정도 직접 노출되거나 또는 이전에 생쥐 세포를 배양했던 배지에 노출시킨 것들이다. 인간 세포에서는 정상적으로는 만들어지지 않는 시알산 잔기인 Neu5Gc가 현존하는 세포주들 중 일부 인간 ES 세포에서 나타나는 것이 발견된 사실이 언론에서 높은 주목을 받았다. 인간 배아 줄기 세포의 생성 및 배양을 위한 원천 기술은 인간 배아 줄기 세포를 배양할 수 있는 영양 공급 층의 영양 공급 세포로 생쥐의 배아 섬유아 세포(MEF)를 사용하는 것이 필수적이다. 섬유아 영양 공급 세포는 아직 완전하게 규명되지 않은 기작을 통해서 줄기 세포를 미분화 상태로 유지시키는 데 도움을 준다. 이후, "순화 배지(conditioned medium)"에 줄기 세포를 노출시킨 경우에도 동일한 현상이 일어날 수 있다는 것이 밝혀졌다. 순화 배지는 영양 공급 세포, 예컨대 MEF를 사전에 배양했던 줄기 세포 배양 배지이다. 영양 공급 세포는 배지에 특정 인자를 제공하거나 배지에서 특정 인자를 제거하지만, 결과적으로 상기 순화 배지는 분화없이 줄기 세포를 배양시키는 데 사용되어 왔다. 생쥐의 영양 공급 세포상에서 인간 ES를 직접 성장시킬 수 있는 배양 조건이나, 순화 배지를 사용하는 것은 생쥐 세포에서 인간 ES 세포로 하나 이상의 병원체 예컨대 바이러스가 전달될 수 있다는 문제가 야기된다. 인간 배아 줄기 세포의 배양 목적 중 하나가 궁극적으로 인간의 몸에 이식시킬 수 있는 조직을 생성시키고자 하는 것이라면, 다른 종의 세포 또는 다른 종의 세포를 배양한 적이 있는 배지에 줄기 세포를 노출시키지 않는 것이 매우 바람직하다. 따라서, 영양 공급 세포인 섬유아 세포층 없이 인간 배아 줄기 세포를 증식 및 배양시킬 수 있는 배양 조건을 특정화시키는 것은 인간 배아 줄기 세포의 장기 배양을 위한 기술을 지속적으로 발전시키는데 있어서 대단히 중요하다.
배양 중인 인간 배아 줄기 세포의 특징적인 형질은 만약 배양 조건이 덜 이상적인 경우, 세포가 분화되는 경향이 있다는 것이다. 인간 ES 세포의 분화를 유도하는 것은 쉬우나, 배양 중 미분화 상태로 인간 ES 세포를 유지시키는 것은 대단한 노력이 요구된다. 대부분의 배양 조건은 어느 정도 원치않는 분화가 일어나는데, 특히 성장하는 ES 세포 군집(colony)의 주변부에서 발생한다. 어느 정도 원치않는 분화가 일어난 상태로 ES 세포를 배양할 수 있지만, 본 발명의 목적은 배양물을 가능한 미분화상태로 지속시키면서, 즉, 가능한 세포 분화가 거의 일어나지 않도록 배양할 수 있는 배양 조건을 특정화하는 것이다. 본 발명자들은 우리가 미분화 ES 세포 배양물의 무한한 배양을 지원할 수 있는 조건을 특정화하는 데 매우 엄격한 기준을 적용해 왔다고 믿고 있다.
몇몇 배지 제제가 인간 ES 세포를 잠시동안 미분화 상태로 유지시킬 수 있으나, 대개는 그 상태를 유지시키는 데 실패하였다. 구체적으로, 본 발명자들은 배양 용기에서 초기 종배양부터 동일한 배양 용기에 세포가 왕성하게 자라는 시기(confluence)까지의 인간 ES 세포의 성장을 "계대(passage)"로 정의하였다. 본 발명자들은 1 또는 2 계대 동안에는 심한 분화없이 인간 ES 세포의 배양이 가능하나, 이후, 후속 계대 시에는 세포가 빠르게 분화하게 되는 몇몇 배지 제제를 발견하였었다. 그러나, 본 발명자들은 세포의 분화가 일어나지 않고, 순화 배지나 영양 공급 세포인 섬유아 세포 없이, 인간 ES 세포의 무한 증식을 확실하게 유지시킬 수 있는 배지가 되려면, 최소 5 계대 동안 인간 ES 세포 배양을 실질적으로 균일하게 미분화 상태로 유지시킬 수 있는 배지여야 한다고 믿게 되었다. 또한 중요한 것은 배양 기간 내내 배양물이 비교적 균일하게 미분화 상태를 지속시키면서, 인간 ES 세포의 중요한 모든 특성은 계속 유지해야 한다는 것이다.
줄기 세포 배양물의 분화 상태는 형태적인 특징을 통해 확인할 수 있다. 미분화 줄기 세포는 특징적인 형태, 즉 세포 경계가 확실하게 구분되는 작고 조밀한 세포 형태를 가지며, 현미경을 통해서 줄기 세포 배양물을 관찰하면 이러한 형태적 특징을 쉽게 확인할 수 있다. 이와 달리, 분화된 세포는 경계가 불분명하면서 보다 크고 보다 퍼져 보인다. 일부 분화 세포가 미분화 세포 군집의 주변에서 보일 수 있으며, 그러한 것이 정상적이지만, 최적의 줄기 세포 배양은 배양 용기에서 배양 물 주변부에 분화하는 것으로 보이는 세포가 단지 최소수로 증식하는 것이다. 경험적으로, 인간 ES 세포 배양물의 분화 상태 및 건강 상태는 육안으로 정확하게 구별이 가능하다. 미분화 상태의 ES 세포를 추적하기 위해 사용되는 생화학적 표지로는 전사 인자 Oct4의 존재인데, ES 세포의 미분화 상태를 확인할 수 있는 가장 신뢰할 만한 표지이며, 미분화 세포가 분화하기 시작하면 없어지는 1차 표지들 중 하나이다.
- 본 발명의 요약 -
본 발명은 영양 공급 세포 또는 순화 배지를 필요로 하지 않는 인간 배아 줄기 세포의 배양 방법에 관한 것으로, 다수의 계대 배양에 걸쳐서 줄기 세포를 미분화 상태로 유지시키기에 모두 충분한 양으로 염, 비타민, 아미노산, 포도당, 섬유아 세포 성장인자, 감마 아미노 부티르산, 피페콜산, 리튬 및 전환 성장 인자 베타를 포함하는 배지에서 인간 배아 줄기 세포를 배양하는 단계를 포함한다.
또한 본 발명은 영양 공급 세포인 섬유아 공급 세포 또는 순화 배지의 필요없이 미분화 상태로 줄기 세포를 무한하게 배양할 수 있도록 섬유아 성장 인자, 감마 아미노 부티르산, 피페콜산, 리튬 및 전환 성장 인자 베타를 고농도로 포함하는 배지에서 배양한 인간 배아 줄기 세포의 시험관 내 세포 배양물에 관한 것이다.
본 발명의 목적은 영양 공급 세포로부터 유래한 것이든지 또는 줄기 세포를 배양한 순화 배지를 위한 것이든지, 동물 세포 및 동물 단백질에 노출되거나, 또는 이를 사용하는 것을 피하고, 인간 배아 줄기 세포를 장기 배양할 수 있는 조건을 특정화하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 배양 중인 세포를 최대 비율로 가능한 미분화 상태로 유지시키면서 가능한 특정화된 인간 배아 줄기 세포를 위한 배양 조건을 특정화하는 데 있다.
본 발명의 기타 목적, 특징 및 장점은 이하 명세서를 통해서 분명해 질 것이다.
본 발명자들은 미분화 상태로 인간 배아 줄기 세포를 무한하게 배양하여 건강하게 증식시킬 수 있으며, 또한 영양 공급 세포 및 순화 배지가 전혀 없는 다수의 배양 조건 및 배지를 발견하였다. 본 발명의 배지 및 배양 조건의 개발을 통해서 어떠한 종류의 동물 세포에도 직적 또는 간접적으로 노출되지 않으면서 특정화되고 제어된 조건에서 인간 ES 세포주를 유도 및 유지시킬 수 있다. 본 발명의 배지는 최소한 5 계대에 걸쳐서 미분화 상태의 ES 세포 증식을 지원할 수 있는 것으로 증명되었으며, 이는 상기 배지가 이러한 배양물들을 무한하게 지원할 수 있다는 확실한 증거이다.
인간 ES 세포의 배양 및 증식을 위해 특정화되고 인간화된 배지는 통상적으로 염, 비타민, 포도당 공급원, 미네랄 및 아미노산을 포함한다. 배지를 보충하고 세포 성장을 지원하는 조건을 공급하기 위해서, 초기 줄기 세포 배지는 하나의 공급원 또는 다른 공급원에서 유래한 혈청을 포함한다. 또한 이미, 섬유아 세포 성장 인자와 혈청 대체 첨가물을 부가하여 혈청없이 인간 ES 세포를 배양할 수 있다는 것이 알려져 있었다. 혈청 대체물로는 이를 목적으로 판매중인 제품을 사용하거나 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 비타민, 미네랄, 트랜스페린 또는 트랜스페린 대체물, 및 인슐린 또는 인슐린 대체물 등의 제제화된 혼합물을 사용할 수 있다. 또한 이러한 혈청 대체 성분으로 셀레늄을 보충할 수 있다. 혈청 성분의 변형 문제를 피하고 가능한 특정화된 배지를 사용하기 위해서, 인간 ES 세포 배양 시 임의 공급원으로부터 유래한 혈청 대신 특정화된 혈청 대체 첨가물 믹스를 사용하는 것이 본 발명에서는 바람직하다. 본 발명자들은 충분한 배지를 특정화하였으며, 본 발명에서 확인된 배지의 모든 성분은 하기 표 1에 나타내었는데, 여기에 본 발명의 배지(TeSR1이라 함)의 모든 성분은 이들 성분의 농도로 기재하였다. TeSR1 배지는 인간 혈청 알부민, 비타민, 항산화제, 미량의 미네랄, 특정 지질, 및 클론된 성장인자가 보충된 DMEM/DF12 베이스로 구성된다.
이전에는 인간 ES 세포를 미분화 상태로 유지시키는 데 필수적이라고 여겨지던, 영양 공급 세포인 섬유아 세포 층의 필요성을 없애기 위해서, 본 발명에서 기술하는 고농도의 FGF(10 내지 1000 ng/㎖)를 GABA(감마-아미노부티르산), 피페콜산(PA), 염화리튬(LiCl) 및 전환 성장 인자 베타(TGF-베타)와 함께 조합한 배지를 사용하면 미분화 줄기 세포 성장 지원이 가능하게 된다. 이들 첨가물들의 조합을 통해서 영양 공급 세포나 순화 배지에 노출없이도 무한하게 인간 ES 세포 배양물을 미분화 상태로 충분히 유지시킬 수 있는 것으로 확인되었다. 이들 첨가물은 명백하게 충분하다. 그러나, 이들 모두가 모든 배지 제제에 필수적인 것은 아니다. 이들 첨가물의 선택적 제거를 통해서, 하나 이상의 성분들을 제거할 수 있지만 배양 중인 세포의 미분화 상태의 순도가 소실된 상태에서 인간 ES 세포는 여전히 성장하는 결과가 야기된다. 이러한 배양물들은 다수의 계대에 걸쳐서 안정하거나 또는 그렇지 않을 수 있다. 그러나, 이러한 조합이 영양 공급 세포나 순화 배지없이 무한한 계대 수를 통해서 미분화 인간 ES 세포의 장기 배양 및 증식을 지원할 수 있는 다양한 종류의 배지로 충분하다는 것은 분명하다.
본 발명자들의 초기 선별과정시 인간 ES 세포에 의해 발현되는 수용체들 중에서 개별 성장 인자들을 선택하였으며, 이들 중 몇몇 인자들은 미분화 증식에 긍정적인 효과를 나타내는 것으로 확인되었다. 이들 중, bFGF, LiCl, γ-아미노부티르산(GABA), 피페콜산, 및 TGFβ를 최종적으로 TeSR1에 포함시켰다. 각각 4 종의 세포주에 대해서 실험하였는데, 섬유아세포-순화 배지에서 배양한 대조구 세포에 비해서, 특징적인 인간 ES 세포 표지의 발현이 유지되는 세포의 비율 및 증식 속도가 TeSR1에서 배양시킨 경우에 보다 높았으며, 이들 5 종의 인자들 중 임의의 하나를 제거하면 배양 효율이 감소하였다. 이들 데이타 중 일부를 도 1에 나타내었는데, 여기서 상기 성분들 중 어느 하나가 생략된 배지에서 성장한 배양물은 상기 4 종의 모든 성분들을 포함하는 배지의 배양물에 비해 미분화 상태로 남아있는 세포의 비율이 보다 낮은 것으로 나타났다. 주목할 것은 Oct4, SSEA-1, SSEA-4, Tra-60 및 Tra1-80은 모두 줄기 세포의 분화 상태를 추적하는 데 사용되는 세포 표면 표지이거나 전사 인자(Oct4)라는 것이다. 도 4는 이와 유사한 실험 결과를 나타내는데, 다수의 계대에 걸쳐서 배양물의 성장 속도는 배양 배지에 상기 성분들이 모두 존재할 때 가장 높다는 것을 증명하고 있다.
또한 인간 ES 세포를 위한 배양 조건으로 배양 용기에 생물학적 메트릭스를 포함시키는 것도 유용하다. 종래 사용되었던 이러한 물질로는 Matrigel™이 있는데, 이는 생쥐 세포 유래의 인공 기저막(basement membrane)으로, 생쥐 세포 무함유 제품으로 공급된다. 또한 유사한 목적으로 제공되는 공지의 다른 인간 유래의 물질로는 피브로넥틴이 있는데, ES 세포 배양을 위한 기저막으로 제공하기 위한 섬유 메트릭스를 생성하기 위해서 이의 불용성 형태로 사용되는 인간 당단백질이다. 우리의 경우 피브로넥틴 단독 메트릭스만으로는 충분치 않았다. 그러나, 본 발명자들은 메트릭스 단백질 콜라겐 IV, 피브로넥틴, 라미닌, 및 비트로넥틴을 조합하여 인간 메트릭스 물질을 제조할 수 있었으며 이러한 메트릭스는 인간 ES를 TeSR1 배지에서 미분화 상태로 무한하게 지원하기에 충분한 것으로 현재 확인되었다.
상기 언급한 배지 첨가물을 얻기 위해서 80 종 이상의 개별 성장 인자에 대한 방법론적 실험을 수행하였다. 일부 첨가물은 최소 몇 계대(a few passages) 동안 인간 ES 세포 배양물의 성장을 지원하는 듯하였으나, 대부분 이후의 후속 계대 배양에서 ES 세포를 미분화 상태로 유지시키는 데 실패하였다. 본 발명자들은 하기 실시예에 기술한 결과를 나타내는 배지 첨가물을 제공하는 이들 인자의 다른 조합을 확인하지 않았다. 이는 상기 성분들에 일부 변화를 주지 않았다는 것을 의미하는 것은 아니다. 예를 들어, LiCl은 wnt 경로를 자극하기 때문에 배지에 사용하게 된다. LiCl이 상기 목적으로 가장 경제적인 작용제이긴 하지만, LiCl 동등물로서 Wnt 자체 또는 기타 이의 경로 자극인자 예컨대 액티빈을 대신 사용할 수 있다. 이와 유사하게, GABA는 GABA 수용체와 상호작용하는 것으로 알려져 있으며, 과학 문헌등에 동일 수용체의 길항제로 동정된 몇몇 분자들이 기재되어 있으며, 이들을 GABA 동등물로 배지에 대신 사용할 수 있다. 한편, PA도 GABA 수용체와 상호작용하는 것으로 알려져 있다. PA 및 GABA는 모두 본 발명에서 사용하는 농도로 배지에 존재하는 경우 유용한 것으로 확인되었으며, 이들 성분들 중 하나 또는 나머지의 농도를 상당히 증가시켜서, 다른 것들에 대한 필요성을 없애는 것을 또한 고려할 수 있다.
고농도(40 내지 100 ng/㎖)로 섬유아 세포 성장 인자를 사용하게 되면 영양 공급 세포의 필요성이 제거되는 듯하다. 바람직한 FGF는 염기성 FGF(bFGF 및 FGF2라고도 함)이나, 적어도 FGF4, FGF9, FGF17 및 FGF18을 포함하는 다른 FGF도 이러한 목적을 만족시킨다. 다른 FGF도 높은 농도에서이긴 하지만, 효과가 있다.
단지 영양 공급 세포인 섬유아 세포가 존재하거나 또는 순화 배지에서 배양시킬 경우에만 인간 배아 줄기(ES) 세포 배양물이 미분화 상태를 유지한다는 이전의 관찰 결과는 섬유아 세포가 ES 세포의 분화를 억제하는 작용을 하는 인자를 배지로 방출한다는 고찰로 이어졌다. 그러나, 배지에 미치는 영양 공급 세포인 섬유아 세포에 의해 매개되는 효과가 어떠한 것이든지, 하기에 기술한 배지가 그 효과를 대체한다는 것은 이제 분명하다. 하기에 정의한 3 종의 배지는 특정화된 것으로, 동물 세포를 함유하지 않으며, 미분화 상태로 미분화 인간 ES 세포를 장기 배양하는 것이 가능하다. 또한 하기 실시예에 기술한 배지에서 배지내 단백질은 모두 인간 유래이며, 이러한 "인간화" 배지 및 메트릭스는 동물 유래의 세포내(subcellular) 생성물에 대해 야기될 수 있는 어떠한 문제도 피할 수 있다.
도 1은 본 명세서에 기재된 실시예의 결과를 나타내는 그래프로서, 배지 내에서 성장하고 있는 인간 ES 세포 배양물 중의 분화 세포 비율을 감소시키는 배지 성분을 나타낸다.
도 2는 인간 메트릭스 단백질을 사용한 배지를 통해서 배양한 인간 ES 세포가 비-인간 유래의 시알산 잔기를 나타내지 않음을 보여주는 그래프이다.
도 3은 본 발명에 따른 인간 줄기 세포 배양물 내에 높은 농도의 미분화 세포가 존재함을 보여주는 그래프이다.
도 4는 본 발명의 배지를 통해 줄기 세포 배양물이 건강하게 성장함을 보여주는 그래프이다.
본 발명에서 기술한 모든 배양물에 사용되는 TeSR1 배지의 성분은 달리 언급하지 않으면, 하기 표 1에 나타낸 바와 같다. 본 발명자들의 사전 실험을 통해서 미분화 인간 ES 세포 증식은 pH는 7.2, 삼투몰 농도는 350 mOsMol, 그리고 대기 조건은 10%CO2/5%O2인 경우가 최적인 것으로 확인되었다. 상기 조건을 이하 기술할 모든 후속 배양 조건으로 사용하였다.
인간 ES 세포주인 H1, H7, H9, 및 H14 세포들은 각각 11, 7, 2, 및 17 계대(2 내지 6 개월) 동안 TeSR1에서 모두 건강하게 증식하였다. 이들의 핵형은 H14는 7 계대 후에, 그리고 H9는 8 및 21 계대 후에 정상인 것으로 확인되었다. 기형종(teratoma) 형성은 H1 및 H9는 11 및 20 계대 후에 확인되었다.
종래 ES 세포 배양물들은 인간에 의해 만들어 지지 않는 시알산인 Neu5Gc의 존재로 인해 최적이라고 하기에는 미흡한 것으로 지적되어 왔다. 인간 메트릭스 성분인 콜라켄, 피브로넥틴, 라미닌 및 비트로넥틴의 사용으로 인간 ES 세포를 위한 TeSR1 배양 조건에서 이러한 최종 동물 생성물들이 제거되기 때문에, 본 발명자들은 상기 배지에서 배양 중인 현행 인간 ES 세포주에서 Neu5Gc가 제거되었는지 시험하였다. 본 발명자들에 따르면 섬유아 세포 순화 배지에서 배양한 인간 ES 세포상에는 Neu5Gc가 존재하였고, Matrigel 상의 TeSR1에서 배양한 세포 상에서는 Neu5Gc가 감소되긴하였으나 탐지될만한 정도의 양으로 관찰된 반면, 상기 4 종의 인간 메트릭스 성분을 사용하여 TeSR1에서 배양한 ES 세포 상에서는 어떠한 Neu5Gc도 탐지되지 않았다. 이 결과는 도 2에 나타내었다. 따라서 TeSR1 및 인간 단백질 메트릭스에서 배양한 인간 ES 세포는 생쥐의 영양 공급 세포 상에서 배양한 세포에서 발견되는 비-인간 시알산 잔기를 나타내지 않았다.
인간 ES 세포 배양물들을 장기간 유지시킨 경우 ES 세포 군집들의 상태 및 배양 안정성을 시험하기 위해서, TeSR1 배지를 종래 최고의 배지 조건(여기서는 순화 배지를 사용함)과 비교하였다. 그 결과 TeSR1 배지를 사용하면 장기 배양후에도 90% 이상의 세포가 Oct4 시험에서 계속적으로 양성으로 나타나면서 미분화 상태로 인간 ES 세포를 유지시킬 수 있는 것으로 확인되었다. 결과는 도 3의 그래프로 나타내었다. 이러한 결과는 어떠한 영양 공급 세포 및 순화 배지도 함유하지 않는 배지가, 배양 중인 세포의 90% 이상이 모든 시기에서 미분화 상태로 남아있는 정도로 인간 ES 세포의 미분화 성장 수준을 유지시킨다는 것을 보여주는 첫 일례이다.
TeSR1 배지 및 다음의 각 성분들: TGFβ, PA, LiCl, GABA 및 bFGF가 생략된 TeSR1 배지에서 3 계대 동안 배양한 H1 세포의 성장 곡선 및 FACS 분석을 수행하였다. 배양을 시작하기 위해서, 각 세포주의 3×105 세포를 계대 1의 0 일에 플레이트에 도포하였다. 세포수는 3개 웰에서 계산하여서 계대 시 부착(2-3 일) 및 최종 세포 수(6-7일)를 측정하였다. 초기 도포한 밀도와 샘플링 기간을 가능할 때, 5 계대 동안 반복하였다. 3 계대의 6일에 세포 표면 표지인 SSEA1, SSEA4, Tra 1-60 및 Tra 1-81과 전사 인자 Oct4에 대해서 FACS로 분석하였다. 그 결과는 도 1에 그래프로 나타내었다. 이에 따르면 성분들 중 각각이 결핍된 배지에서는 어느 정도 배양물에 원치않는 분화 세포가 존재하는 손해를 감수하면서 인간 ES 세포를 배양할 수 있지만, 상기 성분들을 모두 사용하게 되면 최고 수준으로 미분화 상태의 배양물을 얻을 수 있음을 보여주고 있다. 유사한 결과를 역시 다른 세포주에서도 얻었다.
TeSR1 배지에서 유지시킨 인간 ES 세포주의 다능성을 측정하였다. Matrigel 메트릭스 상의 TeSR1 배지에서 각각 11 및 20 계대 동안 배양된, 새롭게 개시된 세포주 WA01 및 WA09의 세포들을 각각 SCID-베이쥐 생쥐에 주입하였다. 복합적인 분화가 나타나는 기형종은 접종 후 6-8주령된 생쥐에서 발생하였다.
TeSR1 배지용 완전 제제
무기 염 염화칼슘(무수물) HEPES 염화마그네슘(무수물) 황산마그네슘(MgSO4) 염화칼륨(KCl) 중탄산나트륨(NaHCO3) 염화나트륨(NaCl) 인산나트륨,이염기성(무수물) 인산나트륨, 모노 (NaH2PO4-H2O) 미량의 미네랄 질산철(Fe(NO3)3-9H2O) 황산철(FeSO4-7H2O) 황산구리(CuSO4-5H2O) 황산아연(ZnSO4-7H2O) 암모늄 메타바나데이트 (NH4VO3) 황산망간(MnSO4H2O) 암모늄 몰리브데이트 NiSO4 6H2O 메타규산 나트륨 (Na2SiO3 9H2O) SnCl2 CdCl2 CrCl3 AgNo3 AlCl3 6H2O Ba(C2H3O2)2 CoCl2 6H2O GeO2 KBr KI NaF RbCl ZrOCl2 8H2O mM 0.8232 11.76 0.2352 0.319088 3.26144 11.2112 94.55824 0.392 0.355152 0.00009408 0.001176 4.0768E-0.6 0.001176 0.000056 1.00592E-05 1.00404E-05 4.94861E-06 0.004926108 5.32544E-06 6.21931E-05 9.41176E-06 5.00293E-06 2.4855E-05 4.99217E-05 5.0021E-05 2.5337E-05 5.04202E-06 5.12048E-06 0.000500119 5.00414E-05 9.03834E-05 아미노산 L-알라닌 L-아르기닌 염산염 L-아스파라긴-H2O L-아스파르트산 L-시스테인-HCl-H2O L-시스틴 2HCl L-글루탐산 L-글루타민 글리신 L-히스티딘-HCl-H2O L-이소류신 L-류신 L-라이신 염산염 L-메티오닌 L-페닐알라닌 L-프롤린 L-세린 L-트레오닌 L-트립토판 L-타이로신 2Na 2H2O L-발린 비타민 아스코르브산 바이오틴 염화콜린 D-판토텐산칼슘 폴산 i-이노시톨 니아신아미드 피리독신 염산염 리보플라빈 티아민 염산염 비타민 B12 mM 0.1392 0.5488 0.1392 0.1392 0.0784 0.0784 0.1392 2.96 0.296 0.1176 0.326144 0.353584 0.391216 0.090944 0.16856 0.2176 0.296 0.352016 0.0346528 0.167776 0.354368 0.375 1.12112E-05 0.0502544 0.0036064 0.004704 0.05488 0.012936 0.0076048 0.0004704 0.02460217 0.000392
성장인자 GABA 피페콜산 bFGF LiCl TGF 베타 1 지질 리놀레산 리포산 아라키돈산 콜레스테롤 DL-알파 토코페롤-아세트산염 리놀렌산 미리스트산 올레산 팔미톨레인산 스테아르산 mM 0.979 0.000984 5.80E-06 0.979 2.35E-08 0.0070976 0.00039984 0.001312 0.0113798 0.02962 0.007184 0.008758 0.00708 0.007862 0.00703 에너지 기질 D-포도당 피루브산나트륨 단백질 인간 인슐린 인간 홀로-트랜스페린 인간 혈청 알부민 기타 성분 글루타티온(환원) 하이포잔틴 Na 페놀 레드 퓨트레신-2HCl 티미딘 2-머캅토에탄올 셀레늄 플루로닉 F-68 트윈 80 mM 13.72784 0.392 0.0034438 0.14 199.7 0.00592996 0.01176 0.0159936 0.000394352 0.001176 0.1 0.000177304 0.238 0.3358

Claims (16)

  1. 다수의 연속 계대 배양을 통해서 인간 줄기 세포를 미분화 상태로 유지시키기에 충분한 양으로, 염, 비타민, 아미노산, 포도당, 섬유아 세포 성장 인자, 감마 아미노 부티르산, 피페콜산, 리튬 및 전환 성장 인자 베타를 포함하는 배지에서 인간 줄기 세포를 배양하는 단계를 포함하고,
    영양 공급 세포 또는 순화 배지없이 메트릭스 상에서 미분화 상태로 인간 줄기 세포를 배양하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 배지는 40 ng/㎖ 이상의 농도로 섬유아 세포 성장인자를 포함하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 배지는 트랜스페린 및 인슐린을 더 포함하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 인간 줄기 세포는 배아 줄기 세포인 방법.
  5. 염, 비타민, 아미노산, 및 섬유아 세포 성장인자를 포함하는 배지 및 메트릭스 상에서 인간 배아 줄기 세포를 배양하는 방법에 있어서,
    다수의 연속적인 계대 배양을 통해서 세포를 미분화 상태로 유지시키기에 충분한 양으로 감마 아미노 부티르산, 피페콜산, 리튬 및 전환 성장인자 베타를 배지 에 첨가하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 인간 줄기 세포;
    상기 줄기 세포가 성장할 수 있는 메트릭스; 및
    상기 인간 줄기 세포가 다수의 연속적인 계대 배양을 통해서 미분화 상태로 유지되기에 충분한 양으로 염, 비타민, 아미노산, 포도당, 섬유아 세포 성장인자, 감마 아미노 부티르산, 피페콜산, 리튬 및 전환 성장 인자 베타를 포함하는 배양 배지를 배양 용기에 포함하며,
    상기 배지는 영양 공급 세포를 함유하지 않고 영양 공급 세포에 노출된 적이 없는 시험관 내 세포 배양물.
  7. 제6항에 있어서, 배지는 40 ng/㎖ 이상의 농도로 섬유아 세포 성장인자를 포함하는 세포 배양물.
  8. 제6항에 있어서, 배지는 100 ng/㎖ 이상의 농도로 섬유아 세포 성장인자를 포함하는 세포 배양물.
  9. 제6항에 있어서, 배지는 알부민, 인슐린 및 트랜스페린으로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질을 더 포함하는 세포 배양물.
  10. 제6항에 있어서, 단백질은 인간 유래인 세포 배양물.
  11. 제10항에 있어서, 인슐린 및 트랜스페린은 재조합 단백질인 세포 배양물.
  12. 제6항에 있어서, 줄기 세포는 인간 배아 줄기 세포인 세포 배양물.
  13. 미분화 상태의 인간 줄기 세포, 메트릭스 및 배양 배지를 포함하는 인간 배아 줄기 세포의 배양물로서,
    상기 배양물은 영양 공급 세포 또는 영양 공급 세포에 노출된 배지를 함유하지 않고, 상기 배지는 또한 인간 이외 동물에서 유래한 생성물을 함유하지 않으며, 상기 인간 배아 줄기 세포는 미분화 상태로 증식하고 장기 배양을 통해서 전사 인자 Oct4에 대해 90% 이상이 양성인 배양물.
  14. 제13항에 있어서, 세포는 시알산 잔기 Neu5Gc를 나타내지 않는 인간 배아 줄기 세포 배양물.
  15. 다수의 계대 배양을 통해서 줄기 세포를 배지에서 미분화 상태로 유지시키기에 충분한 양으로 염, 비타민, 아미노산, 포도당, 섬유아 세포 성장인자, 감마 아미노 부티르산, 피페콜산, 리튬 및 전환 성장 인자 베타를 포함하는 줄기 세포 배양용 배지.
  16. 제15항에 있어서, 알부민, 인슐린 및 트랜스페린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질을 더 포함하는 배지.
KR1020077007607A 2004-09-08 2005-09-08 배아 줄기 세포용 배지 및 이의 배양물 KR101264940B1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US60804004P 2004-09-08 2004-09-08
US60/608,040 2004-09-08

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20070053316A true KR20070053316A (ko) 2007-05-23
KR101264940B1 KR101264940B1 (ko) 2013-05-15

Family

ID=35351611

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020077007607A KR101264940B1 (ko) 2004-09-08 2005-09-08 배아 줄기 세포용 배지 및 이의 배양물

Country Status (18)

Country Link
US (5) US7449334B2 (ko)
EP (1) EP1791948B1 (ko)
JP (3) JP5420837B2 (ko)
KR (1) KR101264940B1 (ko)
CN (2) CN101052712A (ko)
AT (1) ATE549395T1 (ko)
AU (1) AU2005282510B2 (ko)
BR (1) BRPI0514778B1 (ko)
CA (1) CA2579643C (ko)
ES (1) ES2383813T3 (ko)
GB (1) GB2432846B (ko)
HK (1) HK1113171A1 (ko)
IL (1) IL181437A (ko)
IS (1) IS8618A (ko)
MX (1) MX2007002390A (ko)
NO (1) NO344695B1 (ko)
NZ (1) NZ553241A (ko)
WO (1) WO2006029197A1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020060238A1 (ko) * 2018-09-21 2020-03-26 메디포스트(주) 피부 세포 활성화용 조성물 및 이의 용도

Families Citing this family (86)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101264940B1 (ko) * 2004-09-08 2013-05-15 위스콘신 얼럼나이 리서어치 화운데이션 배아 줄기 세포용 배지 및 이의 배양물
DK3196296T3 (en) * 2004-09-08 2019-02-04 Wisconsin Alumini Res Foundation Cultivation of human embryonic stem cells
US8017395B2 (en) 2004-12-17 2011-09-13 Lifescan, Inc. Seeding cells on porous supports
CN101484575B (zh) 2005-06-08 2013-10-02 森托科尔公司 用于眼变性的细胞疗法
US20070025973A1 (en) * 2005-07-29 2007-02-01 Fitzsimmons Frederick J Reprogramming of adult or neonic stem cells and methods of use
CA2624728A1 (en) * 2005-10-07 2007-04-19 Cellartis Ab A method for obtaining a xeno-free hbs cell line
US8741643B2 (en) 2006-04-28 2014-06-03 Lifescan, Inc. Differentiation of pluripotent stem cells to definitive endoderm lineage
GB0613756D0 (en) * 2006-07-12 2006-08-23 Univ Sheffield Cell culture medium
JP5419279B2 (ja) * 2007-01-17 2014-02-19 ウィスコンシン アラムニ リサーチ ファンデーション 改良された幹細胞の培養
US8153427B2 (en) * 2007-03-15 2012-04-10 California Stem Cell, Inc. Cardiomyocytes and methods of producing and purifying cardiomyocytes
FI20075417A0 (fi) * 2007-06-05 2007-06-05 Marjo-Riitta Suuronen Koostumuksia ja menetelmiä alkion kantasolujen kasvatukseen
CA2691793A1 (en) * 2007-06-29 2009-01-08 Cellular Dynamics International, Inc. Automated method and apparatus for embryonic stem cell culture
US9080145B2 (en) 2007-07-01 2015-07-14 Lifescan Corporation Single pluripotent stem cell culture
RU2473685C2 (ru) 2007-07-31 2013-01-27 Лайфскен, Инк. Дифференцировка человеческих эмбриональных стволовых клеток
ATE523585T1 (de) 2007-11-27 2011-09-15 Lifescan Inc Differenzierung menschlicher embryonaler stammzellen
CN101918542B (zh) * 2007-12-28 2013-06-12 富士瑞必欧株式会社 哺乳动物体细胞用培养基以及该培养基的添加剂
KR20190057164A (ko) 2008-02-21 2019-05-27 얀센 바이오테크 인코포레이티드 세포 부착, 배양 및 탈리를 위한 방법, 표면 개질 플레이트 및 조성물
US8623648B2 (en) 2008-04-24 2014-01-07 Janssen Biotech, Inc. Treatment of pluripotent cells
EP2291511B1 (en) * 2008-05-02 2017-06-21 Cellular Dynamics International, Inc. Method for production of mast cells from stem cells
JP5734183B2 (ja) 2008-06-30 2015-06-17 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド 多能性幹細胞の分化
AU2009267167A1 (en) * 2008-06-30 2010-01-07 Centocor Ortho Biotech Inc. Differentiation of pluripotent stem cells
WO2010017562A2 (en) 2008-08-08 2010-02-11 Mayo Foundation For Medical Education And Research Induced pluripotent stem cells
RU2528861C2 (ru) 2008-10-31 2014-09-20 Сентокор Орто Байотек Инк. Дифференцирование человеческих эмбриональных стволовых клеток в линию панкреатических эндокринных клеток
CN102272291B (zh) 2008-10-31 2018-01-16 詹森生物科技公司 人胚胎干细胞向胰腺内分泌谱系的分化
BRPI0920956A2 (pt) 2008-11-20 2015-08-18 Centocor Ortho Biotech Inc Cultura de células-tronco pluripotentes em microveículos
RU2547925C2 (ru) 2008-11-20 2015-04-10 Сентокор Орто Байотек Инк. Способы и композиции для закрепления и культивирования клеток на плоских носителях
WO2010096746A1 (en) 2009-02-20 2010-08-26 Cellular Dynamics International, Inc. Methods and compositions for the differentiation of stem cells
CN102388130B (zh) * 2009-02-27 2014-08-27 细胞动力国际有限公司 多能细胞的分化
WO2011011300A2 (en) 2009-07-20 2011-01-27 Centocor Ortho Biotech Inc. Differentiation of human embryonic stem cells
GB2485112B (en) 2009-07-20 2014-02-26 Janssen Biotech Inc Differentiation of human embryonic stem cells
SG177416A1 (en) 2009-07-20 2012-02-28 Janssen Biotech Inc Differentiation of human embryonic stem cells
AR078805A1 (es) * 2009-10-29 2011-12-07 Centocor Ortho Biotech Inc Celulas madre pluripotentes
KR20120102709A (ko) 2009-11-17 2012-09-18 어드밴스드 셀 테크놀로지, 인코포레이티드 인간 ｒｐｅ 세포의 생산 방법 및 인간 ｒｐｅ 세포의 제약 제제
FI20096288A0 (fi) 2009-12-04 2009-12-04 Kristiina Rajala Formulations and methods for culturing stem cells
ES2633648T3 (es) 2009-12-23 2017-09-22 Janssen Biotech, Inc. Diferenciación de células madre embrionarias humanas
RU2701335C2 (ru) 2009-12-23 2019-09-25 Янссен Байотек, Инк. Способ получения популяции панкреатических эндокринных клеток, соэкспрессирующих nkx6.1 и инсулин, и способ лечения диабета
CA2791476C (en) 2010-03-01 2020-06-30 Janssen Biotech, Inc. Methods for purifying cells derived from pluripotent stem cells
RU2663339C1 (ru) 2010-05-12 2018-08-03 Янссен Байотек, Инк. Дифференцирование эмбриональных стволовых клеток человека
CN104762255B (zh) 2010-06-13 2019-05-31 中国科学院生物物理研究所 由干细胞制备心肌细胞的方法和组合物及其用途
AU2011280878B2 (en) 2010-07-23 2016-06-16 Astellas Institute For Regenerative Medicine Methods for detection of rare subpopulations of cells and highly purified compositions of cells
US9279107B2 (en) 2010-08-05 2016-03-08 Wisconsin Alumni Research Foundation Simplified basic media for human pluripotent cell culture
CN103180434A (zh) 2010-08-05 2013-06-26 威斯康星校友研究基金会 用于人多能细胞培养的简化基础培养基
CN103221536B (zh) 2010-08-31 2016-08-31 詹森生物科技公司 人胚胎干细胞的分化
PL2611910T3 (pl) 2010-08-31 2018-06-29 Janssen Biotech, Inc Różnicowanie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych
EP2611907B1 (en) 2010-08-31 2016-05-04 Janssen Biotech, Inc. Differentiation of pluripotent stem cells
CN102559587A (zh) * 2010-12-16 2012-07-11 中国科学院上海药物研究所 诱导性多能干细胞的制备方法以及用于制备诱导性多能干细胞的培养基
WO2012080842A1 (en) * 2010-12-17 2012-06-21 Biolamina Ab Recombinant laminin-521
US9133266B2 (en) * 2011-05-06 2015-09-15 Wisconsin Alumni Research Foundation Vitronectin-derived cell culture substrate and uses thereof
US20130029416A1 (en) 2011-07-22 2013-01-31 Tayaramma Thatava Differentiating induced pluripotent stem cells into glucose-responsive, insulin-secreting progeny
WO2013022584A1 (en) 2011-08-05 2013-02-14 Corning Incorporated Modulation of the mammalian receptor mtor to inhibit stem cell differentiation into neurons
CN102399742B (zh) * 2011-09-30 2014-07-30 东莞中山大学研究院 用于哺乳动物唾液腺上皮细胞和唾液腺干细胞培养的无血清培养液
WO2013082268A1 (en) 2011-11-30 2013-06-06 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Methods and compositions for regulation of cell aging, carcinogenesis, and reprogramming
EP2788033B1 (en) 2011-12-05 2017-05-31 Factor Bioscience Inc. Methods and products for transfecting cells
US8497124B2 (en) 2011-12-05 2013-07-30 Factor Bioscience Inc. Methods and products for reprogramming cells to a less differentiated state
WO2013090919A1 (en) 2011-12-16 2013-06-20 Wisconsin Alumni Research Foundation Fgf-2 having enhanced stability
EP2794857A4 (en) 2011-12-22 2015-07-08 Janssen Biotech Inc DIFFERENTIATION OF HUMAN EMBRYONIC STEM CELLS IN SINGLE INSULIN POSITIVE CELLS
CA2866590A1 (en) * 2012-03-07 2013-09-12 Janssen Biotech, Inc. Defined media for expansion and maintenance of pluripotent stem cells
AU2013251785B2 (en) 2012-04-24 2018-05-10 Dan S. Kaufman Method for developing natural killer cells from stem cells
EP3450542B1 (en) 2012-06-08 2021-09-01 Janssen Biotech, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells into pancreatic endocrine cells
GB201211873D0 (en) * 2012-07-04 2012-08-15 Univ Edinburgh Cell culture
CN104508121B (zh) 2012-07-23 2018-01-19 中国科学院生物物理研究所 体外诱导多能干细胞分化为心室肌细胞的方法
RU2019143431A (ru) 2012-11-01 2020-04-28 Фэктор Байосайенс Инк. Способы и продукты для экспрессии белков в клетках
US10370644B2 (en) 2012-12-31 2019-08-06 Janssen Biotech, Inc. Method for making human pluripotent suspension cultures and cells derived therefrom
WO2014106141A1 (en) 2012-12-31 2014-07-03 Janssen Biotech, Inc. Suspension and clustering of human pluripotent cells for differentiation into pancreatic endocrine cells
RU2658488C2 (ru) 2012-12-31 2018-06-21 Янссен Байотек, Инк. Способ получения клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток
CA2896658C (en) 2012-12-31 2021-06-22 Janssen Biotech, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells into pancreatic endocrine cells using hb9 regulators
WO2014165131A1 (en) 2013-03-13 2014-10-09 Wisconsin Alumni Research Foundation Methods and materials for hematoendothelial differentiation of human pluripotent stem cells under defined conditions
NL2011170C2 (en) * 2013-07-15 2015-01-21 Univ Erasmus Medical Ct Method and culture medium for in vitro culturing of stem cells.
WO2015042356A1 (en) 2013-09-19 2015-03-26 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Chemically defined culture medium for stem cell maintenance and differentiation
MX2016009771A (es) 2014-01-31 2016-11-14 Factor Bioscience Inc Metodos y productos para la produccion y administracion de acido nucleico.
JP6933898B2 (ja) 2014-04-24 2021-09-08 ボード オブ リージェンツ, ザ ユニバーシティ オブ テキサス システムBoard Of Regents, The University Of Texas System 養子細胞治療製品を製造するための誘導多能性幹細胞の適用
US10280400B2 (en) 2014-05-05 2019-05-07 Indiana University Research And Technology Corporation Method for producing retinal ganglion cells from pluripotent cells
KR102162138B1 (ko) 2014-05-16 2020-10-06 얀센 바이오테크 인코포레이티드 췌장 내분비 세포에서 mafa 발현을 향상시키기 위한 소분자의 용도
EP3543339A1 (en) 2015-02-13 2019-09-25 Factor Bioscience Inc. Nucleic acid products and methods of administration thereof
CN104830772A (zh) * 2015-05-28 2015-08-12 深圳富利鑫健康产业发展有限公司 一种造血干细胞培养基及其应用和干细胞培养方法
DK3365435T3 (da) * 2015-10-20 2021-04-06 Fujifilm Cellular Dynamics Inc Produktion af hæmatopoietiske prækursorceller med multi-afstamning med genetisk programmering
MA45479A (fr) 2016-04-14 2019-02-20 Janssen Biotech Inc Différenciation de cellules souches pluripotentes en cellules de l'endoderme de l'intestin moyen
CN116115629A (zh) 2016-08-17 2023-05-16 菲克特生物科学股份有限公司 核酸产品及其施用方法
SG11201906731XA (en) 2017-01-23 2019-08-27 Stemcell Tech Canada Inc Media and methods for enhancing the survival and proliferation of stem cells
KR102630672B1 (ko) 2017-05-25 2024-01-30 뉴욕 스템 셀 파운데이션, 인코포레이티드 기저 전뇌 콜린성 뉴런(bfcn)을 생성하기 위한 방법 및 조성물
EP3647411A4 (en) * 2017-06-27 2021-05-12 Ajinomoto Co., Inc. MEDIUM WITH RIBOFLAVIN DERIVATIVE
KR102121042B1 (ko) * 2017-12-06 2020-06-09 이정복 조류의 에그로부터 분리한 세포인 배반엽 전분화능세포, 신경줄기세포, 배아섬유아세포 컨디션드 배지를 유효성분으로 하는 세포 증식, 피부재생 및 주름 개선용 배지 조성물
KR102147780B1 (ko) * 2018-03-16 2020-08-25 사회복지법인 삼성생명공익재단 Fgf-17을 유효 성분으로 포함하는 줄기세포 증식 촉진용 배지 조성물 및 이를 이용한 줄기세포 증식 촉진 방법
US10501404B1 (en) 2019-07-30 2019-12-10 Factor Bioscience Inc. Cationic lipids and transfection methods
CN111690595B (zh) * 2020-07-21 2021-07-16 生物岛实验室 一种无血清无饲养层的胚胎干细胞或多能干细胞培养基及其应用
CN112029708A (zh) * 2020-09-09 2020-12-04 江苏育瑞康生物科技有限公司 一种干细胞培养系统

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU729377B2 (en) 1997-10-23 2001-02-01 Asterias Biotherapeutics, Inc. Methods and materials for the growth of primate-derived primordial stem cells in feeder-free culture
US7410798B2 (en) * 2001-01-10 2008-08-12 Geron Corporation Culture system for rapid expansion of human embryonic stem cells
US7455983B2 (en) 2000-01-11 2008-11-25 Geron Corporation Medium for growing human embryonic stem cells
US7005252B1 (en) 2000-03-09 2006-02-28 Wisconsin Alumni Research Foundation Serum free cultivation of primate embryonic stem cells
US7514260B2 (en) * 2004-05-21 2009-04-07 Wicell Research Institute, Inc. Feeder independent extended culture of embryonic stem cells
DK1572984T3 (en) * 2002-12-16 2016-06-13 Technion Res & Dev Foundation FEEDER CELL-FREE, XENOPHRIC CULTIVATION SYSTEM FOR HUMAN EMBRYONAL STEM CELLS
KR100632851B1 (ko) 2004-01-20 2006-10-13 한국원자력연구소 전분화능 줄기세포의 분화를 억제하는 방법
KR101264940B1 (ko) * 2004-09-08 2013-05-15 위스콘신 얼럼나이 리서어치 화운데이션 배아 줄기 세포용 배지 및 이의 배양물
DK3196296T3 (en) * 2004-09-08 2019-02-04 Wisconsin Alumini Res Foundation Cultivation of human embryonic stem cells

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020060238A1 (ko) * 2018-09-21 2020-03-26 메디포스트(주) 피부 세포 활성화용 조성물 및 이의 용도

Also Published As

Publication number Publication date
GB0706626D0 (en) 2007-05-16
IL181437A (en) 2011-11-30
JP2008512122A (ja) 2008-04-24
JP2011206064A (ja) 2011-10-20
US20130236962A1 (en) 2013-09-12
MX2007002390A (es) 2007-04-23
US20120178161A1 (en) 2012-07-12
US20090275128A1 (en) 2009-11-05
BRPI0514778B1 (pt) 2018-07-10
NO20071576L (no) 2007-03-26
US20100304481A1 (en) 2010-12-02
IS8618A (is) 2007-03-06
JP2014014373A (ja) 2014-01-30
GB2432846A (en) 2007-06-06
CA2579643A1 (en) 2006-03-16
KR101264940B1 (ko) 2013-05-15
US8158424B2 (en) 2012-04-17
ATE549395T1 (de) 2012-03-15
US7449334B2 (en) 2008-11-11
EP1791948A1 (en) 2007-06-06
GB2432846B (en) 2009-12-30
US8426203B2 (en) 2013-04-23
NZ553241A (en) 2009-11-27
US20060084168A1 (en) 2006-04-20
JP5420837B2 (ja) 2014-02-19
HK1113171A1 (en) 2008-09-26
AU2005282510B2 (en) 2010-12-02
CN101044235A (zh) 2007-09-26
BRPI0514778A (pt) 2008-06-24
AU2005282510A1 (en) 2006-03-16
IL181437A0 (en) 2007-07-04
CA2579643C (en) 2011-12-06
EP1791948B1 (en) 2012-03-14
WO2006029197A1 (en) 2006-03-16
CN101052712A (zh) 2007-10-10
ES2383813T3 (es) 2012-06-26
CN101044235B (zh) 2013-01-02
NO344695B1 (no) 2020-03-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101264940B1 (ko) 배아 줄기 세포용 배지 및 이의 배양물
KR20070058584A (ko) 인간 배아 줄기 세포의 배양
US20080124801A1 (en) Pluripotent cell growth media
JP6913694B2 (ja) 多能性幹細胞のための培養培地
IL292933A (en) Serum-free human pluripotent stem cell culture medium
IL182143A (en) Cultivation of cultured primate embryonic stem cells expressing oct4, ssea4 or tra1-60

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
AMND Amendment
AMND Amendment
AMND Amendment
E601 Decision to refuse application
AMND Amendment
J201 Request for trial against refusal decision
B701 Decision to grant
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20160419

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20170420

Year of fee payment: 5

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20180417

Year of fee payment: 6

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20190417

Year of fee payment: 7