CN111690595B - 一种无血清无饲养层的胚胎干细胞或多能干细胞培养基及其应用 - Google Patents

一种无血清无饲养层的胚胎干细胞或多能干细胞培养基及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种无血清无饲养层的胚胎干细胞或多能干细胞培养基及其应用，所述无血清无饲养层的胚胎干细胞或多能干细胞培养基包括基础培养基和添加剂，所述添加剂包括肝素钠、哌啶酸、γ‑氨基丁酸和锂离子盐。其是一种完全无异源(Xeno‑free)的培养体系，不会带来外源污染；培养基中的bFGF浓度可以被显著地降低，因而使培养基的制备成本显著降低，同时有效减少了bFGF的聚集现象，稳定性提高，使培养的胚胎干细胞或多能干细胞的质量维持稳定，能够长时间维持胚胎干细胞或多能干细胞的未分化状态和多能性；另外，哌啶酸、γ‑氨基丁酸和锂离子盐三种物质在促进胚胎干细胞或多能干细胞的生存、增殖、维持连续传代中具有难以预料的协同增效作用。

Description

一种无血清无饲养层的胚胎干细胞或多能干细胞培养基及其 应用
技术领域
本发明属于细胞培养技术领域，涉及一种胚胎干细胞或多能干细胞培养基及其应用，具体涉及一种无血清无饲养层的胚胎干细胞或多能干细胞培养基及其应用，尤其涉及一种稳定的、低蛋白含量的胚胎干细胞或多能干细胞培养基及其应用。
背景技术
人胚胎干细胞(Human embryonic stem cells，hESCs)是来源于体外受精的囊胚内细胞团的多能性细胞。hESCs具有向外胚层、内胚层和中胚层分化的能力，如心肌细胞、神经元、胶质细胞、肝细胞、胰岛细胞、软骨细胞、骨骼肌细胞、脂肪细胞和内皮细胞等。
传统的hESCs培养方法需要将hESCs置于丝裂霉素处理的饲养层细胞上(如胚胎成纤维细胞，MEFs)，这种方法虽然可以维持hESCs的生长和增殖，但是面临着饲养层细胞制备过程繁琐、不易分离饲养层细胞等问题。此外，饲养层细胞的质量也会对hESCs的生长造成影响，导致hESCs质量不一，批次性差异大，而且饲养层细胞也可能是动物病原体和支原体污染的来源。
为了进一步提高hESCs体外培养时的质量，需要在不影响hESCs质量和数量的前提下开发完全无异源的培养体系。目前已开发了无需饲养层细胞的培养方案，即采用来自小鼠肉瘤细胞的基底胶或者玻连蛋白包被培养板，已经证明可以用于hESCs的稳定培养和连续传代。hESCs具有广阔的工程应用前景，可以控制添加小分子、化合物和生长因子调控hESCs的生长，为下游的药物研究、疾病机理研究提供质量均一的种子细胞。
目前，现有技术已经开发了各具特色的无血清、无饲养层的hESCs培养基，虽然市面上这些无血清培养基可以在一定程度上克服血清和饲养层细胞引发的问题，但是大多存在蛋白含量高、生产成本高、细胞易出现分化等问题。尤其是细胞因子bFGF(碱性成纤维生长因子)，需要达到100ng/mL的高浓度才可以维持细胞的正常生长及多能性，bFGF正是造成无血清培养基生产成本居高不下的主要原因。
bFGF是已知的FGF家族的23个成员之一，该家族蛋白在促进细胞增殖和分化、产前发育、产后生长和各种组织再生过程中起着重要作用。bFGF信号通过FGFR 1b、FGFR 1c、FGFR 2c、FGFR 3c和FGFR4发挥作用。bFGF通过与细胞表面的特定酪氨酸激酶受体(RTK)结合，激活其靶细胞。在目前的研究中，FGFR信号可能在人胚胎干细胞的维持中发挥重要作用。然而，bFGF信号是剂量依赖性的，高水平的bFGF可能需要满足特定的信号阈值或防止蛋白降解等抑制作用。同时bFGF在37℃时会发生聚集，从而降低了维持多能性的生物利用度。因此，bFGF作为一种重要的信号因子，其高浓度增加了无血清培养基的成本，不稳定性又会影响hESCs的质量，从事hESCs研究的科研人员不得不面临着成本和质量的两难选择。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种胚胎干细胞或多能干细胞培养基及其应用，具体提供一种无血清无饲养层的胚胎干细胞或多能干细胞培养基及其应用，尤其提供一种稳定的、低蛋白含量的胚胎干细胞或多能干细胞培养基及其应用。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
一方面，本发明提供一种无血清无饲养层的胚胎干细胞或多能干细胞培养基，所述无血清无饲养层的胚胎干细胞或多能干细胞培养基包括基础培养基和添加剂，所述添加剂包括肝素钠、哌啶酸、γ-氨基丁酸和锂离子盐。
本发明所涉及的培养基创造性地以肝素钠、哌啶酸、γ-氨基丁酸和锂离子盐作为添加剂，其中，肝素钠可与bFGF中的特定氨基酸结合，有助于维持bFGF的蛋白活性，在没有外源性FGF的情况下添加肝素会使hESCs中FGF受体的磷酸化，这与内源性产生的FGF的稳定作用是一致的；在添加肝素的情况下，培养基中的bFGF浓度可以被显著地降低，因而使培养基的制备成本显著降低，同时有效减少了bFGF的聚集现象，稳定性提高，使培养的胚胎干细胞或多能干细胞的质量维持稳定，能够长时间维持胚胎干细胞或多能干细胞的未分化状态和多能性。
本发明创造性地在培养基中同时添加哌啶酸、γ-氨基丁酸和锂离子盐三种物质，其在促进胚胎干细胞或多能干细胞的生存、增殖、维持连续传代中具有难以预料的协同增效作用。其中，锂离子盐由于具有抑制糖原合成酶激酶-3(GSK-3)的能力，已被用作典型的Wnt通路激活剂；LiCl不仅增加Nanog的表达，而且还增强了Nanog的转录活动；此外锂离子通过下调LSD1(H3K4特异性组蛋白去甲基化酶)来促进表观遗传修饰，从而发挥其作用，维持hESCs的多能性；虽然短期培养并不需要L-哌啶酸，但长期连续传代培养中，L-哌啶酸的作用是至关重要的，且具有辅助GABA的作用；其中，γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)是一种天然存在的氨基酸，作为中枢神经系统中的抑制性神经递质，在外周组织中也可用作神经调节剂，其可与GABAA受体结合，抑制信号接收神经活性，GABAA受体能够在神经细胞细胞膜形成通道；一旦和GABA结合，受体被激活，允许带负电的分子，比如氯离子通过通道，进入细胞，降低细胞兴奋度；此外，GABAA受体信号通过磷脂酰肌醇-3-OH激酶相关激酶家族和组蛋白H2AX的s期检查点激酶传递，这一信号通路独立于细胞分化、凋亡和DNA损伤而对细胞增殖起关键的调控作用。
优选地，所述肝素钠在所述无血清无饲养层的胚胎干细胞或多能干细胞培养基中的浓度为10-200ng/mL，例如10ng/mL、20ng/mL、60ng/mL、80ng/mL、100ng/mL、120ng/mL、150ng/mL或200ng/mL等，优选60-100ng/mL，上述范围内的任意具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述哌啶酸在所述无血清无饲养层的胚胎干细胞或多能干细胞培养基中的浓度为0.05-5μg/mL，例如0.05μg/mL、0.1μg/mL、0.15μg/mL、0.2μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、4μg/mL或5μg/mL等，优选0.05-0.15μg/mL，上述范围内的任意具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述γ-氨基丁酸在所述无血清无饲养层的胚胎干细胞或多能干细胞培养基中的浓度为10-200μg/mL，例如10μg/mL、30μg/mL、50μg/mL、70μg/mL、100μg/mL、130μg/mL、150μg/mL或200μg/mL等，优选30-70μg/mL，上述范围内的任意具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述锂离子盐在所述无血清无饲养层的胚胎干细胞或多能干细胞培养基中的浓度为10-150μg/mL，例如10μg/mL、20μg/mL、50μg/mL、60μg/mL、100μg/mL、130μg/mL或150μg/mL等，优选20-60μg/mL，上述范围内的任意具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
本发明所涉及的培养基对添加的肝素钠、哌啶酸、γ-氨基丁酸和锂离子盐有特定的浓度要求，当其处于上述特定的数值范围浓度时，培养基在维持胚胎干细胞或多能干细胞未分化状态和多能性方面、促进胚胎干细胞或多能干细胞的生存、增殖、维持连续传代方面具有更显著的作用。
优选地，所述基础培养基包括DMEM/F12培养基。
优选地，所述锂离子盐包括氯化锂。
优选地，所述无血清无饲养层的胚胎干细胞或多能干细胞培养基的pH值为7.0-7.4，例如pH＝7.0、pH＝7.1、pH＝7.2、pH＝7.3或pH＝7.4等，上述范围内的任意具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述添加剂还包括pH调节剂、硒补充剂、铁补充剂、抗氧化剂、重组人碱性成纤维细胞生长因子、重组人转化生长因子β、谷胱甘肽、丙戊酸、D-泛酸钙和硫酸锌。
优选地，所述pH调节剂包括碳酸氢钠。
优选地，所述硒补充剂包括亚硒酸钠。
优选地，所述铁补充剂包括乙二胺四乙酸铁。
优选地，所述抗氧化剂包括L-抗坏血酸。
在本发明中，所述pH调节剂、硒补充剂、铁补充剂、抗氧化剂、重组人碱性成纤维细胞生长因子、重组人转化生长因子β、谷胱甘肽、丙戊酸、D-泛酸钙和硫酸锌在所述无血清无饲养层的胚胎干细胞或多能干细胞培养基中的浓度分别为100-1000mg/L、1-50μg/L、100-400μM、30-100mg/L、5-100μg/L、1-20μg/L、1-50mg/L、20-200mg/L、1-20mg/L和1-50μg/L。
所述pH调节剂的浓度可以为100mg/L、200mg/L、300mg/L、400mg/L、500mg/L、600mg/L、700mg/L、800mg/L、900mg/L或1000mg/L等，上述范围内的任意具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
所述硒补充剂的浓度可以为1μg/L、5μg/L、10μg/L、20μg/L、30μg/L、40μg/L或50μg/L等，上述范围内的任意具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
所述铁补充剂的浓度可以为100μM、150μM、200μM、250μM、300μM、350μM或400μM等，上述范围内的任意具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
所述抗氧化剂的浓度可以为30mg/L、40mg/L、50mg/L、60mg/L或70mg/L等，上述范围内的任意具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
所述重组人碱性成纤维细胞生长因子的浓度可以为5μg/L、10μg/L、15μg/L、20μg/L、30μg/L、40μg/L、50μg/L、60μg/L或100μg/L等，上述范围内的任意具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
所述重组人转化生长因子β的浓度可以为1μg/L、5μg/L、10μg/L、15μg/L或20μg/L等，上述范围内的任意具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
所述谷胱甘肽的浓度可以为1mg/L、5mg/L、10mg/L、20mg/L或30mg/L等，上述范围内的任意具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
所述丙戊酸的浓度可以为20mg/L、50mg/L、100mg/L、150mg/L或200mg/L等，上述范围内的任意具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
所述D-泛酸钙的浓度可以为1mg/L、5mg/L、10mg/L、15mg/L或20mg/L等，上述范围内的任意具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述pH调节剂、硒补充剂、铁补充剂、抗氧化剂、重组人碱性成纤维细胞生长因子、重组人转化生长因子β、谷胱甘肽、丙戊酸、D-泛酸钙和硫酸锌在所述无血清无饲养层的胚胎干细胞或多能干细胞培养基中的浓度分别为300-500mg/L、20-40μg/L、200-400μM、50-60mg/L、5-20μg/L、5-15μg/L、5-20mg/L、10-50mg/L、1-5mg/L和1-5μg/L。
本发明所涉及的培养基对添加的pH调节剂、硒补充剂、铁补充剂、抗氧化剂、重组人碱性成纤维细胞生长因子、重组人转化生长因子β、谷胱甘肽、丙戊酸、D-泛酸钙和硫酸锌也有特定的浓度要求，其对培养基在维持胚胎干细胞或多能干细胞未分化状态和多能性方面、促进胚胎干细胞或多能干细胞的生存、增殖、维持连续传代方面也具有显著的影响。
本发明所涉及的无血清无饲养层的胚胎干细胞或多能干细胞培养基的制备方法如下：
将培养基中的各添加剂成分按照各自的溶解特性溶解，滤膜过滤除菌后加入基础培养基中在常温下(15-25℃)混匀即可。
另一方面，本发明提供一种如上所述的无血清无饲养层的胚胎干细胞或多能干细胞培养基在培养胚胎干细胞或多能干细胞中的应用。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明所涉及的无血清无饲养层的胚胎干细胞或多能干细胞培养基是一种完全无异源的培养体系，因此不会带来外源污染；其次，本发明所涉及的培养基中的肝素钠可与bFGF中的特定氨基酸结合，有助于维持bFGF的蛋白活性，在没有外源性FGF的情况下添加肝素会使hESCs中FGF受体的磷酸化，培养基中的bFGF浓度可以被显著地降低，因而使培养基的制备成本显著降低，同时有效减少了bFGF的聚集现象，稳定性提高，使培养的胚胎干细胞或多能干细胞的质量维持稳定，能够长时间维持胚胎干细胞或多能干细胞的未分化状态和多能性。另外，本发明创造性地在培养基中同时添加哌啶酸、γ-氨基丁酸和锂离子盐三种物质，其在促进胚胎干细胞或多能干细胞的生存、增殖、维持连续传代中具有难以预料的协同增效作用。
附图说明
图1是各组人胚胎干细胞hES(H9)的细胞形态显微镜观察图；
图2是各组多能性基因Oct4的相对表达量统计结果图；
图3是各组多能性基因Sox2的相对表达量统计结果图；
图4是各组多能性基因Nanog的相对表达量统计结果图；
图5是人胚胎干细胞hES(H1)的细胞形态显微镜观察图；
图6是人诱导多能干细胞hips的细胞形态显微镜观察图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
以下实施例所涉及的组分、试剂均为常规市售产品，其中DMEM/F12购自Gibco公司，其他组分均从sigma、Peprotech、Gibco公司购得，将Stem Cell公司的TeSRTM-E8培养基设为对照组，进行以下实验：
实施例1
本实施例提供一种无血清无饲养层的胚胎干细胞或多能干细胞培养基，其配方如下表所示：
Figure BDA0002595334300000081
Figure BDA0002595334300000091
其制备方法为：将上表培养基中的各添加剂成分按照各自的溶解特性溶解，滤膜过滤除菌后。在20℃、无菌条件下，将各成分逐一加入到DMEM/F12基础培养基中，吹打混匀，氯化钠调节渗透压为340mOSM/kg，配好的培养基4℃保存，两周内有效。
实施例2
本实施例提供一种无血清无饲养层的胚胎干细胞或多能干细胞培养基，其配方如下表所示：
Figure BDA0002595334300000092
Figure BDA0002595334300000101
其制备方法参照实施例1。
实施例3
本实施例提供一种无血清无饲养层的胚胎干细胞或多能干细胞培养基，其配方如下表所示：
Figure BDA0002595334300000102
其制备方法参照实施例1。
实施例4
本实施例提供一种无血清无饲养层的胚胎干细胞或多能干细胞培养基，其配方与实施例1的区别仅在于肝素钠的浓度为250ng/mL，其他均保持一致。
其制备方法参照实施例1。
实施例5
本实施例提供一种无血清无饲养层的胚胎干细胞或多能干细胞培养基，其配方与实施例1的区别仅在于哌啶酸的浓度为8μg/mL，其他均保持一致。
其制备方法参照实施例1。
实施例6
本实施例提供一种无血清无饲养层的胚胎干细胞或多能干细胞培养基，其配方与实施例1的区别仅在于γ-氨基丁酸的浓度为250μg/mL，其他均保持一致。
其制备方法参照实施例1。
实施例7
本实施例提供一种无血清无饲养层的胚胎干细胞或多能干细胞培养基，其配方与实施例1的区别仅在于氯化锂的浓度为200μg/mL，其他均保持一致。
其制备方法参照实施例1。
对比例1
本对比例提供一种无血清无饲养层的胚胎干细胞或多能干细胞培养基，其配方与实施例1的区别仅在于不含有肝素钠这一成分，其他成分及浓度均保持不变。
其制备方法参照实施例1。
对比例2
本对比例提供一种无血清无饲养层的胚胎干细胞或多能干细胞培养基，其配方与实施例1的区别仅在于不含有哌啶酸和γ-氨基丁酸两种成分，其他成分及浓度均保持不变。
其制备方法参照实施例1。
对比例3
本对比例提供一种无血清无饲养层的胚胎干细胞或多能干细胞培养基，其配方与实施例1的区别仅在于不含有氯化锂和γ-氨基丁酸两种成分，其他成分及浓度均保持不变。
其制备方法参照实施例1。
对比例4
本对比例提供一种无血清无饲养层的胚胎干细胞或多能干细胞培养基，其配方与实施例1的区别仅在于不含有氯化锂和哌啶酸两种成分，其他成分及浓度均保持不变。
其制备方法参照实施例1。
对比例5
本对比例提供一种无血清无饲养层的胚胎干细胞或多能干细胞培养基，其配方与实施例1的区别仅在于不含有γ-氨基丁酸这一成分，其他成分及浓度均保持不变。
其制备方法参照实施例1。
对比例6
本对比例提供一种无血清无饲养层的胚胎干细胞或多能干细胞培养基，其配方与实施例1的区别仅在于不含有氯化锂这一成分，其他成分及浓度均保持不变。
其制备方法参照实施例1。
对比例7
本对比例提供一种无血清无饲养层的胚胎干细胞或多能干细胞培养基，其配方与实施例1的区别仅在于不含有哌啶酸这一成分，其他成分及浓度均保持不变。
其制备方法参照实施例1。
对比例8
本对比例提供一种无血清无饲养层的胚胎干细胞或多能干细胞培养基，其配方与实施例1的区别仅在于不含有γ-氨基丁酸这一成分，且氯化锂的浓度为90μg/mL，其他成分及浓度均保持不变。
其制备方法参照实施例1。
对比例9
本对比例提供一种无血清无饲养层的胚胎干细胞或多能干细胞培养基，其配方与实施例1的区别仅在于不含有氯化锂这一成分，且γ-氨基丁酸的浓度为90μg/mL，其他成分及浓度均保持不变。
其制备方法参照实施例1。
应用例1
细胞形态观察：
将第9代人胚胎干细胞按照5×104个细胞/cm2的密度接种于玻连蛋白包被好的6孔板中，每组3个复孔。分别加入2mL实施例1-7和对比例1-9中的培养基在37℃、5％CO2下进行培养，第2天开始每天换液，培养至第5天，倒置显微镜下观察各组细胞形态和采集图像。
结果如图1所示(40倍放大和100倍放大)，可知实施例1-3中细胞形态与对照组均呈典型的胚胎干细胞形态，细胞排列致密、核仁明显、核质比高，日常换液培养时培养基中漂浮的死细胞较少；实施例4-7则出现一定程度的细胞分化现象。而对比例1-9则出现较多的细胞分化现象，多数细胞呈纤维状或者堆层生长，核质比下降，且克隆形状不规则。表明本发明所涉及的无血清培养基能很好地维持胚胎干细胞的形态，保持未分化状态。
应用例2
细胞增殖活性检测：
将第9代人胚胎干细胞按照2×104个细胞/cm2的密度接种于玻连蛋白包被好的24孔板中，每组3个复孔。分别加入500uL实施例1-7和对比例1-9中的培养基在37℃、5％CO2下进行培养，第2天开始每天换液，培养至第7天，收集计数计算各组细胞扩增倍数(计算公式为：第7天收集细胞数/初始种板数)及细胞活率(计算公式为：(活细胞数/总细胞数)×100％)。
表1
组别 扩增倍数 细胞活率(％)
对照组 88.96±1.69 98.26±1.52
实施例1 89.10±2.92 97.84±1.91
实施例2 79.50±2.69 97.11±2.82
实施例3 71.70±2.76 98.58±1.01
实施例4 51.00±3.31 93.83±1.96
实施例5 40.40±8.71 90.73±2.75
实施例6 44.00±6.54 92.56±0.50
实施例7 38.16±5.26 91.68±1.99
对比例1 42.49±1.95 91.71±2.30
对比例2 50.76±7.80 94.77±2.34
对比例3 59.28±6.07 94.51±1.84
对比例4 47.63±4.26 95.91±1.27
对比例5 39.46±3.15 96.46±2.07
对比例6 36.93±1.49 92.47±1.66
对比例7 56.32±4.18 92.98±1.02
对比例8 50.23±6.18 92.77±0.48
对比例9 51.69±4.67 92.47±1.54
结果如表1所示，可知：实施例1-3的培养基具有较好的促进细胞增殖的效果，连续换液培养7天，细胞扩增倍数在70-90倍之间，而其他组中的细胞扩增倍数明显下降。实施例1-3的细胞活率均在95％以上，其他各组的细胞活率在90％-95％之间，上述结果表明本发明所涉及的培养基具有很好地维持胚胎干细胞的存活，并显著促进胚胎干细胞的增殖的能力。
应用例3
细胞多能性基因检测：
将第9代人胚胎干细胞按照1×105个细胞/cm2的密度接种于玻连蛋白包被好的6孔板中，每组3个复孔。分别加入2mL实施例1-7和对比例1-9中的培养基在37℃、5％CO2下进行培养，第2天开始每天换液，培养至第5天。0.25％胰酶溶液消化后分别提取各组总RNA，并反转录为cDNA，以cDNA为模板，采用荧光定量PCR检测ESCs多能性基因Oct4、Sox2和Nanog的表达水平，qPCR引物序列见下表所示：
Figure BDA0002595334300000161
结果如图2-图4所示(图2、3、4分别对应于Oct4、Sox2、Nanog)：实施例1-3种的多能性基因Oct4、Sox2、Nanog均保持高表达，各组差异不显著，表明本发明所涉及的培养基能很好地维持胚胎干细胞的多能性和自我更新能力。与实施例1-3相比，其他组的多能性相关基因Oct4、Sox2、Nanog出现不同程度的下降，其中Oct4下降最为明显。可能是因为在细胞开始分化的过程中，Oct4的基因表达是最先下降的。
应用例4
将第38代人胚胎干细胞hES(H1)按照2×104个细胞/cm2的密度接种于玻连蛋白包被好的6孔板中，每组3个复孔。加入2mL实施例1中的培养基在37℃、5％CO2下进行培养，以Stem cell公司的TeSRTM-E8作为对照组，第2天开始每天换液，培养至第5天，倒置显微镜下观察各组细胞形态和采集图像。
结果如图5所示(40倍放大和100倍放大)，可知本发明所涉及的无血清培养基能很好地维持胚胎干细胞的形态，保持未分化状态。
并将上述细胞按照2×104个细胞/cm2的密度接种于玻连蛋白包被好的24孔板中，每组3个复孔。加入500μL/孔实施例1的培养基在37℃、5％CO2下进行培养，以Stem cell公司的TeSRTM-E8作为对照组。第2天开始每天换液，培养至第7天，收集计数计算细胞扩增倍数，TeSRTM-E8为78.00±2.60，细胞活率为95.70±1.50％，实施例1为74.00±1.40，细胞活率为96.40±1.20％。
上述结果表明本发明所涉及的培养基具有很好地维持人胚胎干细胞hES(H1)的存活，并显著促进胚胎干细胞的增殖的能力。
应用例5
细胞形态观察：
将第15代人诱导多能干细胞hips按照2×104个细胞/cm2的密度接种于玻连蛋白包被好的6孔板中，每组3个复孔。加入2mL实施例1中的培养基在37℃、5％CO2下进行培养，以Stem cell公司的TeSRTM-E8作为对照组，第2天开始每天换液，培养至第5天，倒置显微镜下观察各组细胞形态和采集图像。
结果如图6所示(40倍放大和100倍放大)，可知本发明所涉及的无血清培养基能很好地维持多能干细胞的形态，保持未分化状态。
并将上述细胞按照2×104个细胞/cm2的密度接种于玻连蛋白包被好的24孔板中，每组3个复孔。加入500μL/孔实施例1的培养基在37℃、5％CO2下进行培养，以Stem cell公司的TeSRTM-E8作为对照组。第2天开始每天换液，培养至第7天，收集计数计算细胞扩增倍数，TeSRTM-E8为83.00±4.20，细胞活率为96.49±3.21％，实施例1为84.26±3.16，细胞活率为97.53±2.42％。
上述结果表明本发明所涉及的培养基具有很好地维持多能干细胞的存活，并显著促进多能干细胞的增殖的能力。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的一种无血清无饲养层的胚胎干细胞或多能干细胞培养基及其应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

Claims (15)

1.一种无血清无饲养层的胚胎干细胞或多能干细胞培养基，其特征在于，所述无血清无饲养层的胚胎干细胞或多能干细胞培养基包括基础培养基和添加剂，所述添加剂包括肝素钠、哌啶酸、γ-氨基丁酸、锂离子盐、pH调节剂、硒补充剂、铁补充剂、抗氧化剂、重组人碱性成纤维细胞生长因子、重组人转化生长因子β、谷胱甘肽、丙戊酸、D-泛酸钙和硫酸锌；且肝素钠、哌啶酸、γ-氨基丁酸、锂离子盐在所述无血清无饲养层的胚胎干细胞或多能干细胞培养基中的浓度分别为10-200 ng/mL、0.05-5 μg/mL、10-200 μg/mL、10-150 μg/mL。
2.如权利要求1所述的无血清无饲养层的胚胎干细胞或多能干细胞培养基，其特征在于，所述肝素钠在所述无血清无饲养层的胚胎干细胞或多能干细胞培养基中的浓度为60-100 ng/mL。
3.如权利要求1所述的无血清无饲养层的胚胎干细胞或多能干细胞培养基，其特征在于，所述哌啶酸在所述无血清无饲养层的胚胎干细胞或多能干细胞培养基中的浓度为0.05-0.15 μg/mL。
4.如权利要求1所述的无血清无饲养层的胚胎干细胞或多能干细胞培养基，其特征在于，所述γ-氨基丁酸在所述无血清无饲养层的胚胎干细胞或多能干细胞培养基中的浓度为30-70 μg/mL。
5.如权利要求1所述的无血清无饲养层的胚胎干细胞或多能干细胞培养基，其特征在于，所述锂离子盐在所述无血清无饲养层的胚胎干细胞或多能干细胞培养基中的浓度为20-60 μg/mL。
6.如权利要求1所述的无血清无饲养层的胚胎干细胞或多能干细胞培养基，其特征在于，所述基础培养基包括DMEM/F12培养基。
7.如权利要求1所述的无血清无饲养层的胚胎干细胞或多能干细胞培养基，其特征在于，所述锂离子盐包括氯化锂。
8.如权利要求1所述的无血清无饲养层的胚胎干细胞或多能干细胞培养基，其特征在于，所述无血清无饲养层的胚胎干细胞或多能干细胞培养基的pH值为7.0-7.4。
9.如权利要求1所述的无血清无饲养层的胚胎干细胞或多能干细胞培养基，其特征在于，所述pH调节剂包括碳酸氢钠。
10.如权利要求1所述的无血清无饲养层的胚胎干细胞或多能干细胞培养基，其特征在于，所述硒补充剂包括亚硒酸钠。
11.如权利要求1所述的无血清无饲养层的胚胎干细胞或多能干细胞培养基，其特征在于，所述铁补充剂包括乙二胺四乙酸铁。
12.如权利要求1所述的无血清无饲养层的胚胎干细胞或多能干细胞培养基，其特征在于，所述抗氧化剂包括L-抗坏血酸。
13. 如权利要求1所述的无血清无饲养层的胚胎干细胞或多能干细胞培养基，其特征在于，所述pH调节剂、硒补充剂、铁补充剂、抗氧化剂、重组人碱性成纤维细胞生长因子、重组人转化生长因子β、谷胱甘肽、丙戊酸、D-泛酸钙和硫酸锌在所述无血清无饲养层的胚胎干细胞或多能干细胞培养基中的浓度分别为100-1000 mg/L、1-50 μg/L、100-400 μM、30-100 mg/L、5-100 μg/L、1-20 μg/L、1-50 mg/L、20-200 mg/L、1-20 mg/L和1-50 μg/L。
14.如权利要求1所述的无血清无饲养层的胚胎干细胞或多能干细胞培养基，其特征在于，所述pH调节剂、硒补充剂、铁补充剂、抗氧化剂、重组人碱性成纤维细胞生长因子、重组人转化生长因子β、谷胱甘肽、丙戊酸、D-泛酸钙和硫酸锌在所述无血清无饲养层的胚胎干细胞或多能干细胞培养基中的浓度分别为300-500 mg/L、20-40 μg/L、200-400 μM、50-60mg/L、5-20 μg/L、5-15 μg/L、5-25 mg/L、20-50 mg/L、1-5 mg/L和1-5 μg/L。
15.如权利要求1-14中任一项所述的无血清无饲养层的胚胎干细胞或多能干细胞培养基在培养胚胎干细胞或多能干细胞中的应用。
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