CN113832097B - 组合物及含有其的无血清、无饲养层干细胞培养基及应用 - Google Patents
组合物及含有其的无血清、无饲养层干细胞培养基及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种组合物及含有其的干细胞培养基及应用。本发明提供的将激活素A和维生素B1搭配，并进一步与适量的抗坏血酸倍半镁盐搭配，形成特定的组合物，将该组合物与碳酸氢钠、亚硒酸钠等一起添加至基础培养基，从而形成特定配方的无血清、无饲养层的干细胞培养基，采用该干细胞培养基培养胚胎干细胞，能够很好地维持胚胎干细胞的多能性。并且，采用本发明的干细胞培养基培养干细胞特别是胚胎干细胞的过程中，细胞增殖快、活率高，细胞多能性维持效果好。
Description
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，特别涉及一种组合物及含有其的干细胞培养基及应用。
背景技术
胚胎干细胞(ESCs)来源于哺乳动物胚胎发育早期内部细胞团，它具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性。经过诱导，胚胎干细胞可以分化为任何细胞，比如诱导分化成治疗帕金森病的多巴胺分泌神经元，或者是用于治疗糖尿病的胰岛β细胞，也有可能是用于治疗心肌梗死的心肌细胞。但是，胚胎干细胞在体外维持培养成具有高度分化能力的胚胎干细胞并不容易，细胞在培养过程中可能出现状态变差、分化潜力减弱、自主性分化增加等问题。因此，体外培养胚胎干细胞时不仅需要专业化的操作，而且需要高质量的、稳定的无血清、无饲养层胚胎干细胞培养基。
发明内容
基于此，针对上述背景技术中存在的问题，本发明的主要目的是提供一种包含激活素A和维生素B1并进一步包含适量的抗坏血酸倍半镁盐的组合物，将该组合物特别是将其与碳酸氢钠、亚硒酸钠等同时添加至基础培养基形成无血清、无饲养层的干细胞培养基，采用该干细胞培养基培养胚胎干细胞，能够很好地维持胚胎干细胞的干多能性。
本发明的上述目的可以通过以下技术方案实现的：
一种组合物，所述组合物包含激活素A和维生素B1。
在其中一个实施例中，所述激活素A与所述维生素B1的质量比为(0.5～15)×10-3：(2～10)。
在其中一个实施例中，所述激活素A和所述维生素B1的质量比为(4～6)×10-3：(6～8)。
在其中一个实施例中，所述组合物还包括抗坏血酸倍半镁盐。
在其中一个实施例中，所述激活素A、所述维生素B1和所述抗坏血酸倍半镁盐的质量比为(0.5～15)×10-3：(2～10)：(1～200)。
一种无血清、无饲养层的干细胞培养基，所述干细胞培养基包含如上所述的组合物，还包含碳酸氢钠、亚硒酸钠、乙二胺四乙酸铁、重组人碱性成纤维细胞生长因子、硫酸锌、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、植物源重组人血清白蛋白、CD lipids以及基础培养基。
在其中一个实施例中，所述激活素A浓度为0.5ng/mL～15ng/mL，所述维生素B1浓度为2μg/mL～10μg/mL。
在其中一个实施例中，所述抗坏血酸倍半镁盐的浓度为1mg/L～200mg/L。
在其中一个实施例中，所述干细胞培养基包含100mg/L～1000mg/L碳酸氢钠、1μg/L～50μg/L亚硒酸钠、50μM～200μM乙二胺四乙酸铁、5μg/L～100μg/L重组人碱性成纤维细胞生长因子、1μg/L～20μg/L硫酸锌、1mg/L～200mg/L抗坏血酸倍半镁盐、100μM～1000μML-谷氨酰胺、10μM～500μM非必需氨基酸、0.1mg/mL～12.96mg/mL植物源重组人血清白蛋白、0.1mL/L～10mL/L CD lipids、0.5ng/mL～15ng/mL激活素A、2μg/mL～10μg/mL维生素B1以及基础培养基。
在其中一个实施例中，所述干细胞培养基包含100mg/L～1000mg/L碳酸氢钠、1μg/L～50μg/L亚硒酸钠、50μM～200μM乙二胺四乙酸铁、5μg/L～100μg/L重组人碱性成纤维细胞生长因子、1μg/L～20μg/L硫酸锌、80mg/L～115mg/L抗坏血酸倍半镁盐、100μM～1000μML-谷氨酰胺、10μM～500μM非必需氨基酸、0.1mg/mL～12.96mg/mL植物源重组人血清白蛋白、0.1mL/L～10mL/L CD lipids、4ng/mL～6ng/mL激活素A、6μg/mL～8μg/mL维生素B1以及基础培养基。
在其中一个实施例中，所述干细胞培养基包含400mg/L～600mg/L碳酸氢钠、15μg/L～30μg/L亚硒酸钠、80μM～130μM乙二胺四乙酸铁、30μg/L～50μg/L重组人碱性成纤维细胞生长因子、2μg/L～5μg/L硫酸锌、80mg/L～115mg/L抗坏血酸倍半镁盐、350μM～450μM L-谷氨酰胺、50μM～150μM非必需氨基酸、1mg/mL～5mg/mL植物源重组人血清白蛋白、1.6mL/L～2.5mL/L CD lipids、4ng/mL～6ng/mL激活素A、6μg/mL～8μg/mL维生素B1以及基础培养基。
在其中一个实施例中，所述基础培养基为DMEM/F12基础培养基。
在其中一个实施例中，所述植物源重组人血清白蛋白为经过脱毒处理的植物源重组人血清白蛋白。
一种干细胞的培养方法，所述培养方法包括采用干细胞培养基培养干细胞的步骤；所述干细胞培养基添加有如上所述的组合物，或者所述干细胞培养基选用如上所述的干细胞培养基。
在其中一个实施例中，培养为原代培养或/和传代培养。
在其中一个实施例中，所述干细胞为胚胎干细胞或者诱导多能干细胞。
与现有技术相比，本发明具有如下技术效果：
本发明提供的将激活素A和维生素B1搭配，并进一步与适量的抗坏血酸倍半镁盐搭配，形成特定的组合物，将该组合物与碳酸氢钠、亚硒酸钠等一起添加至基础培养基，从而形成特定配方的无血清、无饲养层的干细胞培养基，采用该干细胞培养基培养胚胎干细胞，能够很好地维持胚胎干细胞的多能性。并且，采用本发明的干细胞培养基培养干细胞特别是胚胎干细胞的过程中，细胞增殖快、活率高，细胞多能性维持效果好。同时，本发明培养基成分稳定，以无机盐和维生素类为主要添加成分，细胞因子使用浓度低，且采用低浓度植物源重组白蛋白对细胞因子具有一定保护作用，避免使用过程中效价降低造成的培养基性能下降；本发明提供的培养基没有引入动物源成分、成分简单明确，易于配制，批次间的稳定性可以得到有效保证，且成本低。
附图说明
图1为分别采用实施例及对比例提供的干细胞培养基培养得到的第48代胚胎干细胞的形态图像；
图2为分别采用实施例及对比例提供的干细胞培养基培养得到的胚胎干细胞的多能性基因Oct4的相对表达量统计图；
图3为分别采用实施例及对比例提供的干细胞培养基培养得到的胚胎干细胞的多能性基因Sox2的相对表达量统计图；
图4为分别采用实施例及对比例提供的干细胞培养基培养得到的胚胎干细胞的多能性基因Nanog的相对表达量统计图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更详细的描述。但是，应当理解，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式或实施例。相反地，提供这些实施方式或实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式或实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”的可选范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。第一方面，本发明提供一种组合物，所述组合物包含激活素A和维生素B1。
在其中一个示例中，所述激活素A与所述维生素B1的质量比为(0.5～15)×10-3：(2～10)。
在其中一个示例中，所述激活素A和所述维生素B1的质量比为(4～6)×10-3：(6～8)。
在其中一个示例中，所述组合物还包括抗坏血酸倍半镁盐。优选地，所述激活素A、所述维生素B1和所述抗坏血酸倍半镁盐的质量比为(0.5～15)×10-3：(2～10)：(1～200)。更优选地，所述激活素A、所述维生素B1和所述抗坏血酸倍半镁盐的质量比为(4～6)×10-3：(6～8)：(80～115)。
第二方面，本发明提供一种无血清、无饲养层的干细胞培养基，所述干细胞培养基包含如上所述的组合物，还包含碳酸氢钠、亚硒酸钠、乙二胺四乙酸铁、重组人碱性成纤维细胞生长因子、硫酸锌、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、植物源重组人血清白蛋白、CD lipids以及基础培养基。
本发明提供的干细胞培养基可以是一种稳定的无血清、无饲养层含低浓度脱毒植物源重组白蛋白的人胚胎干细胞培养基，添加了激活素A(activin A)以及适量的硫胺素(维生素B1)。硫胺素是一种酶的辅助因子，参与细胞基本的能量代谢，同时硫胺素在降低氧化应激、蛋白质加工、过氧化物酶体功能、钙储存控制和基因表达等方面发挥相关作用。Activin A作为TGF-β超家族的重要成员，可以有效诱导OCT4、Nanog、Nodal、Wnt3和FGF2的表达，抑制BMP信号，进而维持胚胎干细胞的多能性。avtivin A和硫胺素组合应用于多能干无血清培养基中，可以更好的稳定维持胚胎干细胞的多能性。
本发明可以解决胚胎干细胞/诱导多能干细胞培养基的高成本、产品不稳定、容易引入动物源成分等问题，本发明提供一种无血清、无饲养层的含低浓度脱毒植物源重组白蛋白的人胚胎干细胞培养基，添加的activin A和硫胺素可以更好的维持胚胎干细胞的多能性。该培养基成分明确、无动物源，引入的植物源重组白蛋白经过脱毒处理，能够实现ESCs快速增殖，同时维持细胞的未分化状态。
本发明中的CD lipids为全称为Chemically Defined Lipid Concentrate，中文名称为化学成分确定的脂质浓缩物。
优选地，所述无血清、无饲养层的干细胞培养基中，所述激活素A浓度为0.5ng/mL～15ng/mL，所述维生素B1浓度为2μg/mL～10μg/mL；更优选地，所述抗坏血酸倍半镁盐的浓度为1mg/L～200mg/L。
在其中一个示例中，所述干细胞培养基包含100mg/L～1000mg/L碳酸氢钠、1μg/L～50μg/L亚硒酸钠、50μM～200μM乙二胺四乙酸铁、5μg/L～100μg/L重组人碱性成纤维细胞生长因子、1μg/L～20μg/L硫酸锌、1mg/L～200mg/L抗坏血酸倍半镁盐、100μM～1000μM L-谷氨酰胺、10μM～500μM非必需氨基酸、0.1mg/mL～12.96mg/mL植物源重组人血清白蛋白、0.1mL/L～10mL/L CD lipids、0.5ng/mL～15ng/mL激活素A、2μg/mL～10μg/mL维生素B1以及基础培养基。
优选地，所述干细胞培养基包含100mg/L～1000mg/L碳酸氢钠、1μg/L～50μg/L亚硒酸钠、50μM～200μM乙二胺四乙酸铁、5μg/L～100μg/L重组人碱性成纤维细胞生长因子、1μg/L～20μg/L硫酸锌、80mg/L～115mg/L抗坏血酸倍半镁盐、100μM～1000μM L-谷氨酰胺、10μM～500μM非必需氨基酸、0.1mg/mL～12.96mg/mL植物源重组人血清白蛋白、0.1mL/L～10mL/L CD lipids、4ng/mL～6ng/mL激活素A、6μg/mL～8μg/mL维生素B1以及基础培养基。
进一步优选地，所述干细胞培养基包含400mg/L～600mg/L碳酸氢钠、15μg/L～30μg/L亚硒酸钠、80μM～130μM乙二胺四乙酸铁、30μg/L～50μg/L重组人碱性成纤维细胞生长因子、2μg/L～5μg/L硫酸锌、80mg/L～115mg/L抗坏血酸倍半镁盐、350μM～450μM L-谷氨酰胺、50μM～150μM非必需氨基酸、1mg/mL～5mg/mL植物源重组人血清白蛋白、1.6mL/L～2.5mL/L CD lipids、4ng/mL～6ng/mL激活素A、6μg/mL～8μg/mL维生素B1以及基础培养基。
本发明对基础培养的具体种类不做特别限定，适用于干细胞特别是胚胎干细胞的培养即可，例如可以是DMEM/F12基础培养基。
可以理解的是，为适用干细胞培养的需求，可以将培养基调至合适的渗透压，包括但不限于280mOSM/kg～320mOSM/kg，例如280mOSM/kg、290mOSM/kg、300mOSM/kg、310mOSM/kg、320mOSM/kg。
在其中一个示例中，所述植物源重组人血清白蛋白为经过脱毒处理的植物源重组人血清白蛋白。本发明对脱毒处理的步骤不做特别限定，包括但不限于采用如下步骤：将混合树脂球(mixed resin beads)加入到配置好的白蛋白溶液中，使用量为3g混合树脂球/每100mL白蛋白溶液，4℃静置脱毒处理4h，0.22μm过滤，备用。本发明对植物源重组人血清白蛋白的脱毒处理，避免了其中的杂质对干细胞的潜在威胁。
本发明干细胞培养基，可以是用于培养胚胎干细胞的培养基。
第三方面，本发明提供一种干细胞的培养方法，所述培养方法包括采用干细胞培养基培养干细胞的步骤；所述干细胞培养基添加有所述的组合物，或者所述干细胞培养基选用所述的干细胞培养基。
其中一个示例中，培养为原代培养或/和传代培养。
本发明对培养的干细胞的种类不做特别限定，包括但不限于胚胎干细胞、诱导多能干细胞。
如上所述的组合物或者如上所述的干细胞培养基在稳定维持胚胎干细胞或者诱导多能干细胞的多能性的应用。
本发明以下实施例中，所涉及的组分、试剂均为常规市售产品。DMEM/F12基础培养基，购自Gibco公司。其他组分均可从sigma、Peprotech、Gibco等公司购得。
实施例1
本实施例提供一种无血清、无饲养层的含低浓度脱毒植物源重组白蛋白的人胚胎干细胞培养基。
本实施例培养基的配方请参见表1。
本实施例培养基的制备方法包括如下步骤：
(1)参照表1所示培养基配方，按照各添加成分的溶解特性溶解，0.22μm滤膜过滤除菌。
(2)在20℃、无菌条件下，将各成分逐一加入到DMEM/F12基础培养基中，吹打混匀，氯化钠调节渗透压为320mOSM/kg，配好的培养基4℃保存。
本实施例中，植物源重组白蛋白经脱毒处理后再用于制备培养基，脱毒处理的步骤可以包括：
将混合树脂球(mixed resin beads)加入到配置好的白蛋白溶液中，使用量为3g混合树脂球/每100mL白蛋白溶液，4℃静置脱毒处理4h，0.22μm过滤，备用。
实施例2
本实施例是实施例1的变化例，相对于实施例1的变化之处主要在于VB1的使用浓度不同，具体地，本实施例培养基配方中含有7.16μg/mL的VB1，具体请参见表1。
实施例3
本实施例是实施例1的变化例，相对于实施例1的变化之处主要在于VB1的使用浓度不同，具体地，本实施例培养基配方中含有9.55μg/mL的VB1，具体请参见表1。
实施例4
本实施例是实施例1的变化例，相对于实施例1的变化之处主要在于Activin A和VB1的使用浓度不同，具体地，本实施例培养基配方中含有1ng/mL的Activin A和9.55μg/mL的VB1，具体请参见表1。
实施例5
本实施例是实施例1的变化例，相对于实施例1的变化之处主要在于Activin A和VB1的使用浓度不同，具体地，本实施例培养基配方中含有10ng/mL的Activin A和7.16μg/mL的VB1，具体请参见表1。
表1、实施例1至实施例5中培养基的配方汇总
实施例6至实施例11
实施例6至实施例11是实施例2的变化例，相对于实施例2的变化之处主要在于每种成分的浓度有所调整，具体请参见表2。
表2、实施例6至实施例11中培养基的配方汇总
对比例1至对比例5
对比例1是实施例2的对比例，相对于实施例2的主要差别在于配方基配方不同，具体地，对比例1的培养基配方中不含Activin A，具体请参见表3。
对比例2是实施例3的对比例，相对于实施例3的主要差别在于配方基配方不同，具体地，对比例2的培养基配方中不含Activin A，具体请参见表3。
对比例3是实施例2的对比例，相对于实施例2的主要差别在于配方基配方不同，具体地，对比例3的培养基配方中不含VB1，具体请参见表3。
对比例4是实施例3的对比例，相对于实施例3的主要差别在于配方基配方不同，具体地，对比例4的培养基配方中不含VB1，具体请参见表3。
对比例5是实施例2的对比例，相对于实施例2的主要差别在于配方基配方不同，具体地，对比例3的培养基配方中采用VB5代替VB1，具体请参见表3。
表3、对比例1至对比例5中培养基的配方汇总
在应用上述各实施例和对比例提供的培养基配方的过程中，以Stem Cell公司的mTeSRTM1培养基设为对照组，进行以下实验：
应用例1、ESCs形态观察
将第38代huES(H9)细胞按照1×105cell/cm2的密度接种于vitronectin(玻璃粘连蛋白)包被好的6孔板中，分别加入上述各组培养基进行培养，第2开始每天换液，每隔4天～6天采用ReleSR进行传代，连续传代培养至第48代，倒置显微镜下观察各组第48代时的ESCs形态并采集图像。
如图1所示：实施例1至实施例11、对照组mTeSR1细胞状态较好，无分化细胞，克隆边缘光滑，克隆中间细胞排列致密；但是，对比例1至对比例5组中均出现分化的细胞，核质比变小，细胞呈纤维状，且细胞排列松散。说明本发明所述的无血清培养基中activin A和硫胺素组合有助于维持胚胎干细胞的多能性，减少细胞的自发性分化。
应用例2、ESCs增殖活性检测
将在各自培养基中连续传代培养十代后的第48代huES(H9)按照2×104cell/cm2的密度接种于vitronectin包被好的24孔板中，每组3个复孔。分别加入上述各组培养基进行培养，第2开始每天换液，培养至第7天，每天收集细胞计算各组扩增倍数及细胞活率。
结果如表4所示：从表4结果中可以看出，实施例1至实施例11组的扩增倍数均高于对照组mTeSR1组，且实施例2中的细胞扩增倍数最高，是对照组mTeSR1的1.13倍；对比例1至对比例5组细胞扩增倍数有明显下降，可能是细胞自发性分化导致细胞周期变长，扩增倍数下降；细胞活率结果中，实施例1至实施例11、对照组的细胞活率均大于90％，且实施例2中的细胞活率可以达到96.49％，对比例1至对比例5组的细胞活率均低于90％。说明本发明所述的无血清培养基更容易促进胚胎干细胞的增殖，并维持细胞的高活率。
表4、第48代huES(H9)细胞扩增倍数和细胞活率
应用例3、ESCs多能性基因检测
将各自培养基中连续传代培养十代后的第48代huES(H9)细胞按照1×105cell/cm2的密度接种于vitronectin包被好的6孔板中，分别加入上述各组培养基进行培养，第2开始每天换液，培养至第5天。0.25％胰酶溶液消化后分别提取各组huES(H9)细胞总RNA，并反转录为cDNA，以cDNA为模板，采用荧光定量PCR检测ESCs多能性基因Oct4、Sox2和Nanog的表达水平，qPCR引物序列见表5。
结果如图2、图3和图4所示：与对照组相比，实施例1至实施例11的多能性基因Oct4、Sox2和Nanog均有明显提高，且实施例2的ESCs多能性基因表达水平升高最为明显，而其余各对比例组由于细胞出现分化或状态变差等原因，导致多能性基因表达出现不同程度的下降。表明本发明所述的无血清培养基能更好的维持ESCs的多能性。
表5、ESCs多能性基因qPCR引物序列
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。应当理解，本领域技术人员在本发明提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或者有限的试验得到的技术方案，均在本发明所附权利要求的保护范围内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。
序列表
<110> 生物岛实验室
广东国科细胞科技有限公司
<120> 组合物及含有其的无血清、无饲养层干细胞培养基及应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cacgagtgga aagcaactca 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agatggtggt ctggctgaac 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gttacctctt cctcccactc 20
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctcccaattc ccttgtatct c 21
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aagtacctca gcctccagca 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gtgctgagcc cttctgaatc 20
Claims (6)
1.一种无血清、无饲养层的干细胞培养基，其特征在于，所述干细胞培养基由0.5ng/mL～15ng/mL激活素A、2μg/mL～10μg/mL维生素B1、1mg/L～200mg/L抗坏血酸倍半镁盐、100mg/L～1000mg/L碳酸氢钠、1μg/L～50μg/L亚硒酸钠、50μM～200μM乙二胺四乙酸铁、5μg/L～100μg/L重组人碱性成纤维细胞生长因子、1μg/L～20μg/L硫酸锌、100μM～1000μM L-谷氨酰胺、10μM～500μM非必需氨基酸、0.1mg/mL～12.96mg/mL植物源重组人血清白蛋白、0.1mL/L～10mL/LCD lipids以及基础培养基组成；所述基础培养基为DMEM/F12基础培养基；所述植物源重组人血清白蛋白为经过脱毒处理的植物源重组人血清白蛋白。
2.根据权利要求1所述的无血清、无饲养层的干细胞培养基，其特征在于， 所述抗坏血酸倍半镁盐的浓度为80mg/L～115mg/L；所述激活素A的浓度为4ng/mL～6ng/mL；所述维生素B1的浓度为6μg/mL～8μg/mL。
3.根据权利要求2所述的无血清、无饲养层的干细胞培养基，其特征在于，所述碳酸氢钠的浓度为400mg/L～600mg/L；所述亚硒酸钠的浓度为15μg/L～30μg/L；所述乙二胺四乙酸铁的浓度为80μM～130μM；所述重组人碱性成纤维细胞生长因子的浓度为30μg/L～50μg/L；所述硫酸锌的浓度为2μg/L～5μg/L；所述L-谷氨酰胺的浓度为350μM～450μM；所述非必需氨基酸的浓度为50μM～150μM；所述植物源重组人血清白蛋白的浓度为1mg/mL～5mg/mL；所述CD lipids的浓度为1.6mL/L～2.5mL/L。
4.一种干细胞的培养方法，其特征在于，所述培养方法包括采用干细胞培养基培养干细胞的步骤；所述干细胞培养基选用权利要求1至3任一项所述的干细胞培养基。
5.根据权利要求4所述的干细胞的培养方法，其特征在于，培养为原代培养或传代培养。
6.根据权利要求4所述的干细胞的培养方法，其特征在于，所述干细胞为胚胎干细胞或者诱导多能干细胞。
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