CN112608891A - 一种间充质干细胞无血清培养基及其应用 - Google Patents

一种间充质干细胞无血清培养基及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及细胞培养技术领域，具体涉及一种间充质干细胞无血清培养基及其应用。所述的间充质干细胞无血清培养基包括基础培养基和添加成分，其中，所述基础培养基为IMDM培养基；所述添加成分包括TGF‑β3和抗坏血酸，所述TGF‑β3的浓度为1‑5μg/L，所述抗坏血酸和TGF‑β3的用量比为25‑200mg：1‑5μg。本发明中的培养基具有良好的促细胞贴壁作用，培养所获得的细胞增殖能力强、形态完整、分泌能力强。相比传统血清培养体系和已有的无血清体系，本发明中无血清培养基的化学成分明确，且无人源或动物源蛋白、无血清，避免了动物源成分和批次的不稳定性。

Description

一种间充质干细胞无血清培养基及其应用
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，具体涉及一种间充质干细胞无血清培养基及其应用。
背景技术
目前国内外获得大量间充质干细胞的扩增方法依然是添加胎牛血清(fetalbovine serum，FBS)，胎牛血清中虽然包含多种细胞增殖所需的营养成分，被广泛应用于培养间充质干细胞，然而FBS培养的间充质干细胞往往存在细胞老化过快，杂细胞较多、易发生分化等问题，且FBS中含有多种未知动物来源蛋白，甚至可能携带细菌、病毒、传染性蛋白疾病等。
随着血清培养的多种不利因素逐渐出现，血清培养方案也越来越受到业内人士排斥。随着间充质干细胞研究的深入，国内外也逐渐开发出相应的无血清培养方案，这些方案含有多种生长因子、结合转运蛋白、维生素、氨基酸、微量元素、激素等，可在一定程度上去除血清的影响。
如CN 110564680 A中提到了人脐带间充质干细胞培养方法，通过浓缩无血清培养的人脐带间充质干细胞上清，获得细胞分泌蛋白，再通过添加维生素、生长因子、重组蛋白等，从而实现人脐带间充质干细胞的无血清培养，这在完全无血清无异源蛋白的人脐带间充质干细胞培养技术出现之前为人脐带间充质干细胞的无血清培养提供了一种可行性方案。
而在CN 109749992 A提到的间充质干细胞无血清培养方法中，则采用了来自PALL的无血清添加剂，这类无血清培养方案含有多种生长因子、结合转运蛋白、维生素、氨基酸、微量元素、激素等，可在一定程度上去除血清的影响。然而这类无血清添加剂的具体成分未知，往往包含动物源蛋白，无法完全排除异源病毒的危险。同样的，CN109161520A涉及的间充质干细胞无血清培养基采用了来源于UltraCULTURE的无血清添加剂，也面临同样的问题。
此外，US 2010/0015710 A1虽然不包含血清和动物源成分，也不需要对培养耗材进行包被，但在实际使用过程中细胞培养难以超过10代，且细胞形态宽扁、立体感弱、增殖能力不强等。CN 105420182公开了一种无血清的脐带间充质干细胞培养基，包括DMEM培养基、碱性成纤维生长因子、表皮生长因子、胰岛素、白血病抑制因子、L-谷氨酰胺、2-巯基乙醇、亚硒酸钠和纤连蛋白等，通过添加较高含量的纤连蛋白实现了较好的贴壁性能，但细胞增殖速率较慢，且多种细胞外基质的添加大大增加了应用成本。
国内部分无血清无异源蛋白的间充质干细胞无血清培养基专利涉及到的培养方法甚至无法重复其所宣传的效果。
发明内容
为了提供一种无血清，无动物源成分，不需要基质胶包被的间充质干细胞培养基，本发明进行了多年的研发和优化，提供了一种间充质干细胞无血清培养基及其应用。
具体而言，本发明首先提供了一种间充质干细胞无血清培养基(或称人脐带间充质干细胞无血清无动物源蛋白完全培养基)，包括基础培养基和添加成分，
其中，所述基础培养基为IMDM培养基；
所述添加成分包括TGF-β3(人转化生长因子)和抗坏血酸，所述TGF-β3的浓度为1-5μg/L，所述抗坏血酸和TGF-β3的用量比为25-200mg：1-5μg。优选为50-150mg：1-3μg；更优选为80-120mg：1-3μg。
本发明意外发现，在以IMDM培养基为基础培养基的情况下，相较于其他的人转化生长因子(如TGF-β1)，在使用TGF-β3并与抗坏血酸按上述方式复配后，可以促进细胞合成并分泌纤维连接蛋白、胶原蛋白等细胞外基质，并促进细胞迁移，使间充质干细胞具备良好的粘附贴壁效果，且对增殖也具有较好的改善作用。而相较于其他的基础培养基(如DMEM高糖，低糖，a-MEM，DMEM/F12，RPMI1640等)，在本发明中应用IMDM培养基时，无论细胞生长速度还是细胞均质性都具有更好的效果。
本领域人员可按照公知常识设置培养基中的其他组分，其均可以得到与本发明上述描述相当的效果。
作为优选，所述添加成分包括0.1-1v/v％化学脂质。
本发明发现，虽然化学脂质的常规指导用量多为0.1v/v％，但是在0.1-1v/v％(优选为0.3-1v/v％)的范围内，化学脂质的含量越高，细胞的生长状态越好。
本发明中的化学脂质指多种脂质混合物，包括如下组分：
花生四烯酸，含量为1.8-2.2mg/L，胆固醇，含量为200-240mg/L，维生素E(生育酚)，含量为60-80mg/L，亚油酸，含量为8-12mg/L，亚麻酸，含量为8-12mg/L，肉豆蔻酸，含量为8-12mg/L，油酸，含量为8-12mg/L，棕榈酸，含量为8-12mg/L，棕榈油酸，含量为8-12mg/L，Pluronic F-68，含量为80000-100000mg/L，硬脂酸，含量为8-12mg/L。
更优选地，由如下组分组成：
花生四烯酸，含量为2mg/L，胆固醇，含量为220mg/L，维生素E(生育酚)，含量为70mg/L，亚油酸，含量为10mg/L，亚麻酸，含量为10mg/L，肉豆蔻酸，含量为10mg/L，油酸，含量为10mg/L，棕榈酸，含量为10mg/L，棕榈油酸，含量为10mg/L，Pluronic F-68，含量为90000mg/L，硬脂酸，含量为10mg/L。
在实际应用时，可通过市售途径获得符合上述要求的化学脂质，比如Gibco，11905或Sigma，L0288。
更优选的，所述添加成分还包括20-35mg/L的复合酯类物质，所述复合酯类物质为重量比为1-5：5-30：2-20的乙醇胺、胆固醇、大豆卵磷脂的混合物。其与上述的化学脂质共同使用时，可很好地提供细胞生长代谢所需脂类，并有利于促进细胞膜的合成。
本发明进一步发现，降低氢化可的松的浓度，有利于减缓细胞的老化速度，作为优选，所述添加成分还包括0.1-2mg/L的氢化可的松，更优选其含量为0.1-1mg/L。
更优选的，所述添加成分还包括胰岛素、孕酮和地塞米松，所述胰岛素、孕酮、地塞米松和氢化可的松的用量比为8-25mg：1-10μg：4-20μg：0.1-2mg。当上述复配方式添加激素时，可促进细胞利用培养基中的糖类、氨基酸等进行物质合成和能量代谢。
作为优选，所述添加组分还包括1-5g/L白蛋白，所述白蛋白是由植物作为表达宿主得到的重组人白蛋白，所述植物优选为水稻。在实际应用时，可通过市售途径获得符合上述要求的重组人白蛋白，比如禾元生物，HYC002M01。
本发明偶然发现，相较于其他表达宿主(如微生物、动物)得到的重组人白蛋白，通过在本发明的配方中使用上述白蛋白，可以进一步改善细胞的贴壁性能和增殖效果，同时使细胞生长形态完整且具有良好的均一性。
优选地，所述添加组分还包括转铁蛋白，所述转铁蛋白与所述重组人白蛋白的用量比为10-30mg：1-5g时，可结合并将维生素、脂类、氨基酸以及无机盐离子等转运进入细胞内，为细胞代谢及分裂增殖提供必要成分。
作为优选，所述添加组分还包括40-60μg/L的复合生长因子，所述生长因子为重量比为5-40：5-50：2-10的b-FGF(人碱性成纤维生长因子)、EGF(人表皮生长因子)和HGF(人肝细胞生长因子)时，可促进间充质干细胞贴壁增殖并使其增殖过程中保持干细胞多能性而不发生分化。
更优选的，所述添加组分还包括：2-20μg/L的PDGF-BB(人血小板源性生长因子BB)。
更优选的，所述添加组分还包括：5-20μg/L的VEGF(人血管内皮生长因子)。
作为优选，所述添加组分还包括IGF-1(人胰岛素生长因子)，所述IGF-1与胰岛素的用量比为10-40μg：8-25mg时，可以更好地辅助胰岛素发挥其功能。
作为优选，所述添加组分还包括：1-5μg/L的CTGF(人结缔组织生长因子)时，可促进细胞外基质的累积，为细胞生长提供更优的环境。
作为优选，所述添加组分还包括：1-5mg/L的还原型谷胱甘肽、0.2-2mM的N-Acetyl-L-Cysteine和50-100μM的β-巯基乙醇时，与抗坏血酸协同作用，可以很好地清除细胞内活性氧，起到抗衰老和保护作用。
本领域人员可对上述优选方案进行组合，并按照公知常识设置培养基中的其他组分，得到本发明的优选实施例。
作为优选方案，每1L培养基包含以下组分：
IMDM 17.662g、L-丙胺酰-谷氨酰胺2mM、化学脂质0.1-1v/v％、胆固醇5-30mg、胰岛素8-25mg、转铁蛋白10-30mg、重组人白蛋白1-5g、氢化可的松0.1-2mg、地塞米松4-20μg、孕酮1-10μg、腐胺5-15mg、抗坏血酸25-200mg、β-巯基乙醇50-100μM、大豆卵磷脂2-20mg、七水硫酸锌1.25-2.5mg、硫辛酸0.1-0.5mg、N-Acetyl-L-Cysteine 0.2-2mM、还原型谷胱甘肽1-5mg、牛磺酸2-10mg、Y-27632 2-10μM、乙醇胺1-5mg、b-FGF 5-40μg、EGF 5-50μg、PDGF-BB2-20μg、IGF-1 10-40μg、TGF-β3 1-5μg、HGF 2-10μg、CTGF 1-5μg和VEGF 5-20μg。
最优选的，每1L培养基包含以下组分：
IMDM 17.662g、L-丙胺酰-谷氨酰胺2mM、化学脂质0.6v/v％、胆固醇15mg、胰岛素12.5mg、转铁蛋白25mg、重组人白蛋白2g、氢化可的松500μg、地塞米松4μg、孕酮5.66μg、腐胺9mg、抗坏血酸100mg、β-巯基乙醇75μM、大豆卵磷脂10mg、七水硫酸锌2.5mg、硫辛酸0.2mg、N-Acetyl-L-Cysteine 1mM、还原型谷胱甘肽2mg、牛磺酸5mg、Y-27632 5μM、乙醇胺2mg、b-FGF 20μg、EGF 20μg、PDGF-BB 10μg、IGF-1 15μg、TGF-β3 2μg、HGF 10μg、CTGF 2μg和VEGF 15μg。
作为优选，本发明培养基中所用到的蛋白均为重组蛋白。
作为优选，本发明培养基中所用的生长因子均为重组生长因子。
本发明中的培养基可通过常规的配置手段获得。
作为优选方案，配制所述无血清培养基时，先将IMDM粉末溶解于细胞培养用水中，搅拌均匀，使用0.22um滤膜过滤后，先添加溶解于0.01M稀盐酸的胰岛素，待胰岛素与基础培养基混合均匀，再依次添加其他组分，各组分添加过程中需适当搅拌促使分布均匀。
作为优选，所述胰岛素在0.01M稀盐酸中的浓度不高于13mg/ml时，溶解效果更优，可以避免加入其他组分之后析出的情况。
在一些优选的方案中，部分试剂如胆固醇、大豆卵磷脂、氢化可的松、孕酮、地塞米松需适用DMSO或无水乙醇溶解，同时需注意调整添加方式，以边滴加边搅拌的方式以免发生局部结晶沉淀。
本发明中的间充质干细胞无血清培养基在配置结束后需密封4℃避光保存，并在一个月内尽快使用。
本发明进一步提供所述的间充质干细胞无血清培养基在培养间充质干细胞中的应用。
作为优选，优选所述间充质干细胞为人脐带间充质干细胞。本发明中的培养基在应用于人脐带间充质干细胞的培养时尤其具有很好的效果。
作为优选，所述培养包括原代培养和传代培养。
作为优选，所述培养为2D细胞培养和3D细胞培养。
尤其地，经多次试验，本发明中的间充质干细胞无血清培养基可在基于各类型微载体的3D细胞培养中应用并得到很好的效果。
本发明进一步提供所述的间充质干细胞无血清培养基在制备培养间充质干细胞的产品中的应用。
作为优选，优选所述间充质干细胞为人脐带间充质干细胞。
作为优选，所述培养包括原代培养和传代培养。
作为优选，所述培养为2D细胞培养和3D细胞培养。
基于上述技术方案，本发明的有益效果如下：
(1)相比传统血清培养体系和已有的无血清体系，本发明中无血清培养基的化学成分明确，且无人源或动物源蛋白、无血清，避免了动物源成分和批次的不稳定性。
(2)本发明中的培养基具有良好的促细胞贴壁作用，培养所获得的细胞增殖能力强、形态完整、分泌能力强，符合国际对间充质干细胞的质控标准。该培养体系下培养的细胞安全、理想，具有良好的临床及商业应用前景。
(3)在使用本发明中培养基时，无需使用外源基质对培养皿进行包被，完全杜绝了人源、动物源成分的添加，且操作简单，与血清培养无差异，可良好支持脐带来源间充质干细胞原代及传代培养，而且可很好地支持人脐带间充质干细胞的微载体三维培养。
(4)由于本发明中无血清培养基的成分完全已知，更利于研究人员对间充质干细胞(尤其是人脐带间充质干细胞)的特性研究，对该培养体系稍加修改，增加或减去所需研究的组分，就可以更直观的探究间充质干细胞在不同试剂影响下的基因、蛋白表达水平和增殖、分化、治疗效果等，可作为间充质干细胞基础研究的有利工具。
附图说明
图1为本发明实施例1的无血清培养基培养的不同代数的人脐带间充质干细胞。
图2为本发明实施例1的无血清培养基培养的人脐带间充质干细胞流式表型检测结果。
图3为本发明实施例1的无血清培养基与传统血清培养体系下人脐带间充质干细胞倍增曲线对比。
图4为本发明实施例1的无血清培养基培养的人脐带间充质干细胞成脂、成骨、软骨分化能力检测。
图5为本发明实施例1的无血清培养基、FBS培养基、商业化无血清培养基培养的人脐带间充质干细胞增殖能力对比。
图6为使用实施例2、4、5中的培养基培养得到的细胞。
图7为使用实施例1、6中的培养基培养得到的细胞。
图8为使用实施例3、对比例1中的培养基培养得到的细胞。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
为了便于比对效果，以下实施例中所用到的蛋白均为重组蛋白，所用的生长因子均为重组生长因子，其中，重组人白蛋白由水稻作为表达宿主得到，具体产品为禾元生物，HYC002M01；化学脂质均为Gibco，11905。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。
实施例1
本实施例提供一种间充质干细胞无血清培养基，每1L培养基由以下组分组成：
IMDM 17.662g、L-丙胺酰-谷氨酰胺2mM、化学脂质0.6v/v％、胆固醇15mg、胰岛素12.5mg、转铁蛋白25mg、重组人白蛋白2g、氢化可的松500μg、地塞米松4μg、孕酮5.66μg、腐胺9mg、抗坏血酸100mg、β-巯基乙醇75μM、大豆卵磷脂10mg、七水硫酸锌2.5mg、硫辛酸0.2mg、N-Acetyl-L-Cysteine 1mM、还原型谷胱甘肽2mg、牛磺酸5mg、Y-27632 5μM、乙醇胺2mg、b-FGF 20μg、EGF 20μg、PDGF-BB 10μg、IGF-1 15μg、TGF-β3 2μg、HGF 10μg、CTGF 2μg和VEGF 15μg；余量为细胞培养用水。
本实施例进一步提供上述间充质干细胞无血清培养基的配置方法：
先将IMDM粉末溶解于细胞培养用水中，搅拌均匀，使用0.22um滤膜过滤后，先添加溶解于0.01M稀盐酸的重组人胰岛素，待胰岛素与基础培养基混合均匀，再依次添加其他组分，在各组分添加过程中，适当搅拌促使分布均匀。在其他组分中，胆固醇、大豆卵磷脂、氢化可的松、孕酮、地塞米松用DMSO溶解，同时以边滴加边搅拌的方式添加。
实施例2
本实施例提供一种间充质干细胞无血清培养基，每1L培养基由以下组分组成：
IMDM 17.662g、L-丙胺酰-谷氨酰胺2mM、化学脂质0.1v/v％、胆固醇5mg、胰岛素8mg、转铁蛋白10mg、重组人白蛋白1g、氢化可的松0.1mg、地塞米松4μg、孕酮1μg、腐胺5mg、抗坏血酸25mg、β-巯基乙醇50μM、大豆卵磷脂2mg、七水硫酸锌1.25mg、硫辛酸0.1mg、N-Acetyl-L-Cysteine 0.2mM、还原型谷胱甘肽1mg、牛磺酸2mg、Y-27632 2μM、乙醇胺1mg、b-FGF 5μg、EGF 5μg、PDGF-BB 2μg、IGF-1 10μg、TGF-β3 1μg、HGF 2μg、CTGF 1μg和VEGF 5μg；余量为细胞培养用水。
其配置方法同实施例1。
实施例3
本实施例提供一种间充质干细胞无血清培养基，每1L培养基由以下组分组成：
IMDM 17.662g、L-丙胺酰-谷氨酰胺2mM、化学脂质1v/v％、胆固醇30mg、胰岛素25mg、转铁蛋白30mg、重组人白蛋白5g、氢化可的松2mg、地塞米松20μg、孕酮10μg、腐胺15mg、抗坏血酸200mg、β-巯基乙醇100μM、大豆卵磷脂20mg、七水硫酸锌2.5mg、硫辛酸0.5mg、N-Acetyl-L-Cysteine 2mM、还原型谷胱甘肽5mg、牛磺酸10mg、Y-27632 10μM、乙醇胺5mg、b-FGF 40μg、EGF 50μg、PDGF-BB 20μg、IGF-1 40μg、TGF-β3 5μg、HGF 10μg、CTGF 5μg和VEGF 20μg；余量为细胞培养用水。
其配置方法同实施例1。
取同一株P1代人脐带间充质干细胞进行测试，实施例1-3各进行3组重复实验，接种密度为10000cells/cm2，48小时后收获细胞并进行计数，并记录扩增倍数。然后再次以相同的密度进行接种，直至P5时收获细胞，并根据各代次细胞扩增倍数计算不同实施例培养条件下细胞收获总量，同时使用贝克曼库尔特Vi-CELL XR计数仪检测P5代细胞直径分布情况，根据统计结果得到不同实施例中人脐带间充质干细胞的增殖和直径数据，其统计结果如表1所示，由结果可知，实施例1的培养条件下人脐带间充质干细胞增殖速度更快，且细胞直径均一性更好，而实施例2和实施例3培养的间充质干细胞增殖速度略显较慢，尤其是培养过程中容易出现较多直径较大的细胞，这预示实施例2、实施例3培养的间充质干细胞均一性较差，长期培养过程中更容易发生老化和分化。
表1
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Figure BDA0002845374450000111
实施例4
本实施例提供一种间充质干细胞无血清培养基，与实施例2的区别仅在于，氢化可的松的用量为1mg/L。
其配置方法同实施例1。
实施例5
本实施例提供一种间充质干细胞无血清培养基，与实施例2的区别仅在于，氢化可的松的用量为10mg/L。
其配置方法同实施例1。
使用实施例2、4、5中的培养基培养得到的细胞如图6所示，由该结果可知，低浓度的氢化可的松(实施例2)可显著促进间充质干细胞的增殖，并维持细胞呈细长梭形生长。而高浓度的氢化可的松(实施例4、5)反而让间充质干细胞增殖速度变慢，细胞变大，呈扁平状，且细胞表面黑点显著增多，显示出衰老的状态，且长期传代效果不好。
实施例6
本实施例提供一种间充质干细胞无血清培养基，与实施例1的区别仅在于，将重组人白蛋白替换为人血清来源的白蛋白(四川蜀阳)。
其配置方法同实施例1。
使用实施例1、6中的培养基培养得到的细胞如图7所示，由该结果可知，在使用浓度同相同时，人血来源的白蛋白细胞增殖速度相比水稻重组表达的白蛋白细胞增殖速度明显较慢，而且出现了更多体积较大的细胞，均一性变差，提高人血清白蛋白的使用浓度至5g/L和10g/L时，可加快细胞的增殖速度，但最终的收获细胞量和均一性仍不及水稻重组表达的白蛋白，且长期传代效果不好。
对比例1
本对比例提供一种间充质干细胞无血清培养基，与实施例3的区别仅在于，将其中的TGF-β3等量替换为TGF-β1。
其配置方法同实施例1。
使用实施例3、对比例1中的培养基及不含人转化生长因子的对照组培养得到的细胞如图8所示，由该结果可知，TGF-β1与抗坏血酸共同作用下可促进间充质干细胞分泌细胞外基质，已有许多文献报道这个组合可刺激间充质干细胞产生胶原蛋白和纤维连接蛋白，在本实验中也看到了这个组合确实可以促进间充质干细胞在无血清条件下的贴壁。而TGF-β3与抗坏血酸的共同作用不仅可以促进间充质干细胞分泌细胞外基质，还能减少细胞外基质的降解，形成细胞外基质累积，对于细胞的贴壁和增殖更有利。此外，使用TGF-β1的长期传代效果远不如TGF-β3。
试验例
采用实施例1中的间充质干细胞无血清培养基对人脐带间充质干细胞进行培养。具体过程如下：
一、脐带来源间充质干细胞的原代分离培养
使用含2.2％青/链霉素的无菌PBS浸泡脐带组织2min，洗去残留血渍，尽量去除残留血液，使用75％的医用酒精浸泡组织1min，使用高温灭菌并冷却的眼科剪立即将组织剪去两个末端，使用无菌PBS洗两次。使用眼科剪将较长的脐带组织剪成长约2cm的小块，小心去除两条动脉和一条静脉，然后将目标组织剪碎至1mm3大小的组织块，将组织块转移到10cm培养皿中，每个皿0.5-1克组织，每皿添加12ml新鲜无血清培养基，轻晃培养皿使细胞及组织块分布均匀，37℃、5％CO2培养箱进行培养，记为P0。
72小时后，每皿补加3ml新鲜无血清培养基，之后每72小时进行换液，第6天，去除旧培养基，保留组织块，添加10ml新鲜培养基，晃动使组织块均匀分布于皿内，此后每天晃动一次培养基和组织块，使爬出的细胞均匀分布皿内，每3-4天更换一次培养基，约第12-14天，弃去旧培养基和组织块，旧皿中添加10ml新鲜培养基继续培养，之后约3-4天培养皿内大部分区域已长满细胞，可酌情进行传代或换液继续培养。
二、脐带来源间充质干细胞的传代培养
生长状态良好的处于对数期的人脐带来源间充质干细胞，去除旧培养基。使用适量(10cm皿4ml)室温的PBS洗去皿内残留的培养基，以便于细胞消化，弃去PBS。加入适量(10cm皿约2ml)1:2稀释的TrypLETMExpress Enzyme消化酶，轻轻晃动培养皿使消化酶均匀覆盖皿底，培养箱内消化约1min，待细胞触脚收缩变圆后轻拍培养皿使细胞脱落，将培养皿转移到操作台内，并将使用培养基终止消化，使用移液管轻轻吹打使细胞完全脱落，并将细胞团块吹散，悬液转移到离心管内，配平后室温离心，1200rpm/min，约300g离心5min，弃离心上清，轻弹底部使细胞团块分散，加入适量培养基重悬细胞，5/10ml吸管混匀，进行细胞计数，根据细胞计数进行接种，推荐细胞接种密度为4000～12000cells/cm2，其中P0-P4推荐接种密度为4000-8000cells/cm2，P5-P10推荐接种密度为10000cells/cm2。标记细胞类型、代数、传代日期，以十字方向轻柔滑动培养皿，重复4-6次，以使细胞分布均匀，将培养皿小心转移到37℃，5％CO2的培养皿内培养，根据细胞传代次数高低，每48小时细胞增殖约3.5-9倍。
拍照记录不同代数的细胞状态，见图1，由该图可知，该培养基可通过组织块悬浮培养法获得原代的人脐带间充质干细胞，并可长期传代超过十代以上人能保持细胞的均一性和增殖能力。
三、P3代脐带间充质干细胞的流式检测
取处于对数生长期的P3代人脐带间充质干细胞，使用1:2稀释的TrypLETMExpressEnzyme消化酶，见细胞消化并吹散成单细胞，悬液转移到离心管内，配平后室温离心，1200rpm/min，约300g离心5min，PBS重悬细胞后进行计数，然后以50万细胞每份分成数管，再次离心后100ul PBS重悬细胞，使用Human MSC Analysis Kit(BD,562245)进行细胞的流式抗体染色，每管安装厂商说明书添加对应的抗体或是同型对照抗体，Vortex混匀后4℃冰箱避光孵育30分钟，然后1200rpm/min，约300g离心5min，300ul PBS重悬细胞后上机检测。由图2可见，本发明的无血清培养基培养的人脐带间充质干细胞不表达CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR等标志物，同时高表达CD44、CD73、CD90、CD105等表面标志物，符合国际上的间充质干细胞定义标准。
四、本发明培养基与血清培养的人脐带间充质干细胞生长曲线对比
使用本发明的培养基和含血清的培养基同时分离脐带来源的间充质干细胞，收获原代细胞时进行细胞计数，并使用不同的培养基以1万个细胞每平方厘米的密度接种到6cm皿中，各三个重复，平均每48小时进行传代，收获的细胞进行计数，计算增殖倍数，并再次以1万个细胞每平方厘米的密度接种到6cm皿中，直至第十代。根据各代次细胞的增殖倍数以及初始细胞接种量，计算细胞增殖曲线。由图3可见，相比含血清培养基，本发明的无血清培养基培养的人脐带间充质干细胞具备更好的增殖能力。
五、本发明培养基培养的人脐带间充质干细胞分化能力检测
为验证本发明的无血清培养基培养的人脐带间充质干细胞的分化能力，分别采购塞业公司的脐带间充质干细胞成脂诱导分化培养基HUXUC-90031、成骨诱导分化培养基HUXUC-90021以及成软骨诱导分化培养基HUXUC-9004，取第三代本发明无血清培养基培养的人脐带间充质干细胞，收获计数后按照各产品所提供的的操作流程进行间充质干细胞的分化，待分化时间达到操作说明书建议时长后，去除培养基，PBS洗涤2次，然后使用分化试剂盒提供的染色液进行染色，其中成软骨分化的细胞球使用OCT包埋后进行冰冻切片，然后使用切片进行染色，待染色完成后，在倒置显微镜下观察细胞染色情况，从而检测分化效率，并拍照记录，由图4可见，本发明的无血清培养基培养的人脐带间充质干细胞具备成脂、成骨、成软骨细胞，具备三系分化能力，符合间充质干细胞鉴定标准。
六、本发明培养基与血清培养的人脐带间充质干细胞增殖相关基因富集
为了更进一步探究不同培养条件下培养的间充质干细胞增殖能力的差异性，选取本发明的无血清培养基、含血清培养基以及商业化的无血清培养基培养的第三代的人脐带间充质干细胞，不同培养基培养的第三代人脐带间充质干细胞消化计数后，各取100万细胞，加入Trizol充分裂解细胞后，送至第三方进行表达谱检测，对检测的表达谱进行数据分析分析，整理增殖相关基因表达情况。由图5可见，三种不同的培养基所培养的人脐带间充质干细胞中，本发明的无血清培养基说收获的间充质干细胞具备更好的增殖能力。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种间充质干细胞无血清培养基，包括基础培养基和添加成分，其特征在于，
所述基础培养基为IMDM培养基；
所述添加成分包括TGF-β3和抗坏血酸，所述TGF-β3的浓度为1-5μg/L，所述抗坏血酸和TGF-β3的用量比为25-200mg：1-5μg。
2.根据权利要求1所述的间充质干细胞无血清培养基，其特征在于，所述添加成分包括0.1-1v/v％化学脂质；
所述化学脂质包括如下组分：
花生四烯酸，含量为1.8-2.2mg/L，胆固醇，含量为200-240mg/L，维生素E(生育酚)，含量为60-80mg/L，亚油酸，含量为8-12mg/L，亚麻酸，含量为8-12mg/L，肉豆蔻酸，含量为8-12mg/L，油酸，含量为8-12mg/L，棕榈酸，含量为8-12mg/L，棕榈油酸，含量为8-12mg/L，Pluronic F-68，含量为80000-100000mg/L，硬脂酸，含量为8-12mg/L；
优选的，所述添加成分还包括20-35mg/L的复合酯类物质，所述复合酯类物质为重量比为1-5：5-30：2-20的乙醇胺、胆固醇、大豆卵磷脂的混合物。
3.根据权利要求1或2所述的间充质干细胞无血清培养基，其特征在于，所述添加成分还包括0.1-2mg/L的氢化可的松；
优选的，所述添加成分还包括胰岛素、孕酮和地塞米松，所述胰岛素、孕酮、地塞米松和氢化可的松的用量比为8-25mg：1-10μg：4-20μg：0.1-2mg。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的间充质干细胞无血清培养基，其特征在于，所述添加组分还包括1-5g/L白蛋白，所述白蛋白是由植物作为表达宿主得到的重组人白蛋白，所述植物优选为水稻；
优选地，所述添加组分还包括转铁蛋白，所述转铁蛋白与所述重组人白蛋白的用量比为10-30mg：1-5g。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的间充质干细胞无血清培养基，其特征在于，所述添加组分还包括40-60μg/L的复合生长因子，所述复合生长因子包括重量比为5-40：5-50：2-10的b-FGF、EGF和HGF；
优选所述添加组分还包括：2-20μg/L的PDGF-BB；和/或，5-20μg/L的VEGF。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的间充质干细胞无血清培养基，其特征在于，所述添加组分还包括IGF-1，所述IGF-1与胰岛素的用量比为10-40μg：8-25mg。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的间充质干细胞无血清培养基，其特征在于，所述添加组分还包括：1-5μg/L的CTGF；
和/或，所述添加组分还包括：1-5mg/L的还原型谷胱甘肽、0.2-2mM的N-Acetyl-L-Cysteine和50-100μM的β-巯基乙醇。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的间充质干细胞无血清培养基，其特征在于，每1L培养基包含以下组分：
IMDM 17.662g、L-丙胺酰-谷氨酰胺2mM、化学脂质0.1-1v/v％、胆固醇5-30mg、胰岛素8-25mg、转铁蛋白10-30mg、重组人白蛋白1-5g、氢化可的松0.1-2mg、地塞米松4-20μg、孕酮1-10μg、腐胺5-15mg、抗坏血酸25-200mg、β-巯基乙醇50-100μM、大豆卵磷脂2-20mg、七水硫酸锌1.25-2.5mg、硫辛酸0.1-0.5mg、N-Acetyl-L-Cysteine 0.2-2mM、还原型谷胱甘肽1-5mg、牛磺酸2-10mg、Y-27632 2-10μM、乙醇胺1-5mg、b-FGF 5-40μg、EGF 5-50μg、PDGF-BB2-20μg、IGF-1 10-40μg、TGF-β3 1-5μg、HGF 2-10μg、CTGF 1-5μg和VEGF 5-20μg；
优选地，每1L培养基包含以下组分：
IMDM 17.662g、L-丙胺酰-谷氨酰胺2mM、化学脂质0.6v/v％、胆固醇15mg、胰岛素12.5mg、转铁蛋白25mg、重组人白蛋白2g、氢化可的松500μg、地塞米松4μg、孕酮5.66μg、腐胺9mg、抗坏血酸100mg、β-巯基乙醇75μM、大豆卵磷脂10mg、七水硫酸锌2.5mg、硫辛酸0.2mg、N-Acetyl-L-Cysteine 1mM、还原型谷胱甘肽2mg、牛磺酸5mg、Y-27632 5μM、乙醇胺2mg、b-FGF 20μg、EGF 20μg、PDGF-BB 10μg、IGF-1 15μg、TGF-β3 2μg、HGF 10μg、CTGF 2μg和VEGF 15μg。
9.权利要求1-8中任一项所述的间充质干细胞无血清培养基在培养间充质干细胞中的应用；
优选所述间充质干细胞为人脐带间充质干细胞；
优选所述培养包括原代培养和传代培养；
优选所述培养为2D细胞培养和3D细胞培养。
10.权利要求1-8中任一项所述的间充质干细胞无血清培养基在制备培养间充质干细胞的产品中的应用；
优选所述间充质干细胞为人脐带间充质干细胞；
优选所述培养包括原代培养和传代培养；
优选所述培养为2D细胞培养和3D细胞培养。
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