CN114540298A - 一种干细胞无血清培养基及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种干细胞无血清培养基及其制备方法，所述干细胞无血清培养基包含基础培养基、血小板裂解物和其他生长因子，所述基础培养基和血小板裂解物体积比为(90‑99)％：(1‑10)％；所述其他生长因子占基础液与血小板裂解物混合物的体积份数为1‑11μg/ml。与现有技术相比，本发明培养基以低于10％血小板裂解物与不同生长因子相互协同作用，便可大幅度提高间充质干细胞的扩增效率，同时大幅度的节约了间充质干细胞的培养成本，增强干细胞贴壁效果，细胞不易衰老，且细胞周期长，多向分化能力更强等优点。

Description

一种干细胞无血清培养基及其制备方法
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，特别涉及一种干细胞无血清培养基及其制备方法。
背景技术
间充质干细胞是一类具有自我更新能力和多向分化潜能的组织干细胞，可以从脐带、脂肪、胎儿血液、骨髓、肝脏等组织获得，在疾病治疗领域有巨大的潜力。其中脂肪间充质干细胞存在于成熟脂肪组织中，其含量丰富，提取简便，供区易被患者接受，被认为是有极大应用前景的干细胞。多个研究证实脂肪干细胞据报道可旁分泌多种细胞因子，包括炎症因子、血管源性因子、生长因子等等，并表现出对伤口愈合，组织修复和抗衰老的积极作用。对于临床应用间充质干细胞治疗多种疾病有很大的发展潜力，但在目前临床前研究与临床实验对间充质干细胞数量的需求很大，所以如何在体外更安全合格的扩增间充质干细胞就变得尤为关键。
传统方法中，干细胞的培养体系主要应用含动物血清(如胎牛血清)的培养基，胎牛血清丰富且易于获得，是大多数人类跟动物细胞的通用生长补充剂，包含细胞生存和增殖所需的大多数因素，但是动物血清(如胎牛血清)组件定义不明确，容易携带异源性污染及病毒支原体等病原体污染，批次间差异较大，培养体系下细胞蛋白污染的风险，动物福利的伦理问题，为脂肪间充质干细胞的临床前研究与临床治疗带来了极大风险与困难。由此而言，对脂肪间充质干细胞无血清培养体系的研发与生产就变得很有意义跟价值。
目前市场上商品化的无血清培养基如Stem Cell公司的Mesent Cult-XF Medium，Gibco公司的Stem PRO MSC SFM及相关品牌无血清培养基，细胞增殖效果不理想，原代分离培养细胞生长状况较差，且成分复杂，临床科研验证困难，体外长时间培养细胞会出现衰老，增殖率下降，多向分化能力降低，此外，目前无血清培养基大部分需要国外进口，而且价格十分昂贵，
中国专利CN100494345C公开了一种细胞悬浮培养和贴壁培养的无血清培养基及其制备方法，所述无血清培养基由牛血清白蛋白、胰岛素、纯化人转铁蛋白、胆固醇、过氧化氢酶、亚硒酸钠、1％二巯基乙醇溶液、细胞纤维连结蛋白和促贴壁因子组成。该培养基加入的过氧化氢酶和亚硒酸钠有抗氧化作用，二巯基乙醇可促进淋巴细胞的生长；促贴壁因子可促进贴壁，且适用于多种类型的组织和细胞的生长。中国专利CN105420182A公开了一种无血清的脐带间充质干细胞培养基，该培养基包括碱性成纤维生长因子hFGF、表皮生长因子hEGF、胰岛素hI、白血病抑制因子hLIF、L-谷氨酰胺、2-巯基乙醇、亚硒酸钠、转铁蛋白、人白蛋白、纤连蛋白和黄芪多糖APS。该培养基克服了细胞扩增数量与降低成本之间的矛盾问题，使细胞保持良好的贴壁特性。上述培养基需要添加牛血清白蛋白、促贴壁因子、巯基乙醇、黄芪多糖等成分，成分复杂不易得，难以大规模生产应用。
已有研究表明，采用血小板裂解物作为添加成分来替换胎牛血清可以满足间充质干细胞的扩增及维持其多向分化能力，但是血小板裂解物需达到较高浓度(一般为10％以上甚至更高)才可以达到10％胎牛血清培养的间充质干细胞的扩增效率，血小板裂解物用量大导致成本较高。
发明内容
为了解决上述背景技术中存在的问题，本发明的主要目的在于提供一种干细胞无血清培养基及其制备方法。
本发明采用血小板裂解物代替胎牛血清，以血小板裂解物为主体，添加重组人源表皮生长因子(hEGF)、重组人源碱性成纤维细胞生长因子(hFGF)、重组人源血管内皮生长因子(hVEGF)、胰岛素样生长因子(IGF-1)、纤连蛋白(FN)，血小板裂解物与生长因子相互协同作用对脂肪间充质干细胞培养相比10％(v/v)胎牛血清对细胞增殖效率有很大提高。该体系不仅使间充质干细胞的扩增效率大幅度提高，而且也大大降低了间充质干细胞的培养成本。本发明间充质干细胞培养体系相对于目前市场上无血清培养基生产体系，成分清晰明确，无外源性污染风险，成分简单尤为重要，可以适合临床前科研大规模生产，从而满足临床研究跟治疗细胞的培养规模和条件。
为实现上述目的，本发明具体技术方案如下：
第一方面，本发明提供了一种干细胞无血清培养基，所述干细胞无血清培养基包含基础培养基、血小板裂解物和其他生长因子，所述基础培养基和血小板裂解物体积比为(90-99)％：(1-10)％；所述其他生长因子占基础液与血小板裂解物混合物的体积份数为1-11μg/ml。
进一步地，所述血小板裂解物体积份数3.8％。
进一步地，所述其他生长因子包括纤连蛋白、重组人表皮生长因子、重组人碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子和重组人源血管内皮生长因子。
进一步地，所述干细胞无血清培养基中包括以下浓度的组分：1-10％(v/v)血小板裂解物、10-60ng/ml重组人表皮生长因子、10-30ng/ml重组人碱性成纤维细胞生长因子、5-20ng/ml重组人源血管内皮生长因子、10-30ng/ml胰岛素样生长因子和1-10μg/ml纤连蛋白。
进一步地，所述干细胞无血清培养基中包括以下浓度的组分：3.8％(v/v)血小板裂解物、30ng/ml重组人表皮生长因子、10ng/ml重组人碱性成纤维细胞生长因子、10ng/ml重组人源血管内皮生长因子、20ng/ml胰岛素样生长因子和5μg/ml纤连蛋白。
进一步地，所述基础培养基为α-MEM基础培养基。
第二方面，本发明提供了一种上述任一项所述的干细胞无血清培养基的制备方法，包括如下步骤：
(1)血小板裂解物进行预处理：解冻后添加氯化钙，充分溶解反复冻融3次，将血小板裂解物离心，用0.22μm过滤器过滤血小板裂解物；
(2)血小板裂解物和基础培养基按比例混和，得混和物；
(3)按比例添加所述生长因子，配制完成后再次过滤除菌，即为所述干细胞无血清培养基。
进一步地，所述对血小板裂解物进行预处理具体为：解冻后加入添加0.025mol/L的氯化钙尽量去除血小板裂解物中的纤连蛋白原，充分溶解反复冻融3次，将血小板裂解物于300×g转速条件下离心5min，去除血小板裂解物中的多余氯化钙及脂肪及由纤连蛋白原析出杂质，用0.22μm过滤器过滤血小板裂解物除菌除杂质。
第三方面，本发明提供了一种干细胞的培养方法，所述培养方法包括采用上述任一项所述的干细胞培养基培养干细胞的步骤。
进一步地，所述干细胞为脂肪间充质干细胞。
进一步地，所述具体步骤包括：
(1)脂肪组织采用胶原酶Ⅰ消化，筛网过滤、加入PBS离心清洗。
(2)收集沉淀细胞，加入培养基重悬，调整细胞密度接种至培养瓶中，37℃5％CO2培养箱中正常培养，培养48小时后，换液后培养72小时。
进一步地，所述步骤(1)中采用胶原酶Ⅰ消化具体方法为采用0.1％胶原酶Ⅰ37℃，100r震荡消化40min。
基于上述技术方案，本发明具有以下有益效果：
传统模式中的胎牛血清培养基成分定义不明确，批次间差异较大，且容易对培养体系的间充质干细胞带来外源性污染及病原体污染，而本发明的培养基含有血小板裂解物和生长因子，成分清晰，容易配制生产，批次间均一性较好且无外源性污染；
本发明培养基中加入少剂量血小板裂解物，无需添加促贴壁因子，便可实现较好的贴壁生长效果；
目前市场的无血清培养基以10％-25％的血小板裂解物甚至更高代替10％胎牛血清去培养间充质干细胞，而本发明培养基以低于10％血小板裂解物与不同生长因子相互协同作用，便可大幅度提高间充质干细胞的扩增效率，同时大幅度的节约了间充质干细胞的培养成本，增强干细胞贴壁效果，细胞不易衰老，且细胞周期长，多向分化能力更强等优点。
附图说明
图1实施例1中不同培养体系的细胞数量统计结果。
图2实施例2中不同培养体系的细胞数量统计结果。
图3实施例3中不同培养体系的细胞数量统计结果。
图4实施例4中不同培养体系培养下获得的脂肪间充质干细胞集落数。
图5实施例5中不同培养体系的细胞数量统计结果。
图6实施例6中不同培养体系的细胞流式检测结果。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
下述实施例所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所有的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
本发明实施例中培养基的制备方法，包括如下步骤：
(1)血小板裂解物进行预处理：解冻后添加氯化钙，充分溶解反复冻融3次，将血小板裂解物离心，用0.22μm过滤器过滤血小板裂解物；
(2)血小板裂解物和基础培养基按比例混和，得混和物；
(3)按比例添加所述生长因子，配制完成后再次过滤除菌，即为所述干细胞无血清培养基。
进一步地，所述对血小板裂解物进行预处理具体为：解冻后加入添加0.025mol/L的氯化钙尽量去除血小板裂解物中的纤连蛋白原，充分溶解反复冻融3次，将血小板裂解物于300×g转速条件下离心5min，去除血小板裂解物中的多余氯化钙及脂肪及由纤连蛋白原析出杂质，用0.22μm过滤器过滤血小板裂解物除菌除杂质。
实验例1不同浓度血小板裂解物对细胞扩增效率的影响
1.培养基分组
A组：α-MEM+10vol％血小板裂解物+30ng/ml重组人表皮生长因子(EGF)+20ng/ml重组人碱性成纤维细胞生长因子(FGF)+10ng/ml重组人源血管内皮生长因子(hVEGF)+20ng/ml胰岛素样生长因子(IGF-1)+5μg/ml纤连蛋白(FN)；
B组：α-MEM+1vol％血小板裂解物+30ng/ml重组人表皮生长因子(EGF)+20ng/ml重组人碱性成纤维细胞生长因子(FGF)+10ng/ml重组人源血管内皮生长因子(hVEGF)+20ng/ml胰岛素样生长因子(IGF-1)+5μg/ml纤连蛋白(FN)；
C组：α-MEM+3.8vol％血小板裂解物+30ng/ml重组人表皮生长因子(EGF)+20ng/ml重组人碱性成纤维细胞生长因子(FGF)+10ng/ml重组人源血管内皮生长因子(hVEGF)+20ng/ml胰岛素样生长因子(IGF-1)+5μg/ml纤连蛋白(FN)。
2.细胞培养方法和结果
10ml的脂肪组织采用0.1％胶原酶Ⅰ37℃，100r震荡消化40min，100μm筛网过滤、加入PBS清洗，于300×g转速条件下离心5min。收集细胞沉淀(SVF)。
将收集的细胞沉淀(SVF)分成3等份，分别用10ml培养基A、10ml培养基B、10ml培养基C重悬细胞。分别对3组细胞悬液进行计数，调整细胞密度，将3种不同培养体系下的细胞悬液分别接种至T75培养瓶，补充相应培养基至15ml混合均匀，转移至37℃5％CO2培养箱中正常培养，培养48小时后，3组培养体系分别全量换液，全量换液后培养72小时，拍照记录；
SVF在3种培养体系下培养5天后，分别吸弃3组培养体系下的细胞培养上清；用10ml PBS清洗T75培养瓶底部2遍；每个T75瓶加入2ml 0.25％胰蛋白酶进行细胞消化，轻摇瓶身，使细胞消化液铺满所有细胞表面，约2分钟后在显微镜下观察所消化细胞，若胞质回缩，细胞间隙增大，漂浮且不再连接成片，表明此时细胞消化适度，加入消化中止液中止消化，将3组细胞悬液分别转移至相应离心管中，再用清洗液清洗残余细胞后吸回相应离心管中，进行细胞计数与统计分析，每组重复3次实验。
表1 A组计数结果：
组别 A1 A2 A3
计数结果 5.67×10<sup>6</sup> 5.97×10<sup>6</sup> 5.91×10<sup>6</sup>
表2 B组计数结果：
组别 B1 B2 B3
计数结果 3.12×10<sup>6</sup> 2.41×10<sup>6</sup> 2.16×10<sup>6</sup>
表3 C组计数结果：
组别 C1 C2 C3
计数结果 5.21×10<sup>6</sup> 5.47×10<sup>6</sup> 4.97×10<sup>6</sup>
结果如图1和表1-3所示：培养基A组培养下所获得的脂肪间充质干细胞数分别为5.67×106个、5.97×106个、5.91×106个；培养基B组培养下所获得的脂肪间充质干细胞数分别为3.12×106个、2.41×106个、2.16×106个；培养基C组培养下所获得的脂肪间充质干细胞数分别为5.21×106个、5.47×106个、4.97×106个；采用K2计数仪对细胞计数，用方差分析法对3组间细胞数作统计分析，B组细胞数与A组细胞数、B组细胞数与C组细胞数比较统计，P值均小于0.05，即B组与C组、B组与A组两组间细胞数有显著性差异，A组与C组无显著性差异，说明A组与C组培养体系下的细胞相较于B组培养体系下的细胞扩增效率更高，A组与C组细胞扩增效率无显著性差异，但是结合成本综合考虑，C组要更有优势，故选择最适合血小板裂解物为3.8vol％。
实验例2不同浓度重组人表皮生长因子对细胞扩增效率的影响
1.培养基分组
A组：α-MEM+3.8vol％血小板裂解物+10ng/ml重组人表皮生长因子(EGF)+20ng/ml重组人碱性成纤维细胞生长因子(FGF)+10ng/ml重组人源血管内皮生长因子(hVEGF)+20ng/ml胰岛素样生长因子(IGF-1)+5μg/ml纤连蛋白(FN)；
B组：α-MEM+3.8vol％血小板裂解物+30ng/ml重组人表皮生长因子(EGF)+20ng/ml重组人碱性成纤维细胞生长因子(FGF)+10ng/ml重组人源血管内皮生长因子(hVEGF)+20ng/ml胰岛素样生长因子(IGF-1)+5μg/ml纤连蛋白(FN)；
C组：α-MEM+3.8vol％血小板裂解物+50ng/ml重组人表皮生长因子(EGF)+20ng/ml重组人碱性成纤维细胞生长因子(FGF)+10ng/ml重组人源血管内皮生长因子(hVEGF)+20ng/ml胰岛素样生长因子(IGF-1)+5μg/ml纤连蛋白(FN)。
2.细胞培养方法和结果
10ml的脂肪组织采用0.1％胶原酶Ⅰ37℃，100r震荡消化40min，100μm筛网过滤、加入PBS清洗，于300×g转速条件下离心5min。收集细胞沉淀(SVF)。
将收集的细胞沉淀(SVF)分成3等份，分别用10ml培养基A、10ml培养基B、10ml培养基C重悬细胞。分别对3组细胞悬液进行计数，调整细胞密度，将3种不同培养体系下的细胞悬液分别接种至T75培养瓶，补充相应培养基至15ml混合均匀，转移至37℃5％CO2培养箱中正常培养，培养48小时后，3组培养体系分别全量换液，全量换液后培养72小时，拍照记录；
SVF在3种培养体系下培养5天后，分别吸弃3组培养体系下的细胞培养上清；用10ml PBS清洗T75培养瓶底部2遍；每个T75瓶加入2ml 0.25％胰蛋白酶进行细胞消化，轻摇瓶身，使细胞消化液铺满所有细胞表面，约2分钟后在显微镜下观察所消化细胞，若胞质回缩，细胞间隙增大，漂浮且不再连接成片，表明此时细胞消化适度，加入消化中止液中止消化，将2组细胞悬液分别转移至相应离心管中，再用清洗液清洗残余细胞后吸回相应离心管中，进行细胞计数与统计分析，每组重复3次实验。
表4 A组计数结果：
组别 A1 A2 A3
计数结果 3.93×10<sup>6</sup> 4.61×10<sup>6</sup> 4.25×10<sup>6</sup>
表5 B组计数结果：
组别 B1 B2 B3
计数结果 5.5×10<sup>6</sup> 5.5×10<sup>6</sup> 5.6×10<sup>6</sup>
表6 C组计数结果：
组别 C1 C2 C3
计数结果 6.3×10<sup>6</sup> 5.4×10<sup>6</sup> 5.9×10<sup>6</sup>
结果如图2和表4-6所示：培养基A组培养下所获得的脂肪间充质干细胞数分别为3.93×106个、4.61×106个、4.25×106个；培养基B组培养下所获得的脂肪间充质干细胞数分别为5.5×106个、5.5×106个、5.6×106个；培养基C组培养下所获得的脂肪间充质干细胞数分别为6.3×106个、5.4×106个、5.9×106个；将3组间细胞数进行统计分析发现，A组细胞数与B组细胞数、A组细胞数与C组细胞数比较统计，P值均小于0.05，即A组与B组、A组与C组两组间细胞数有显著性差异，B组与C组无显著性差异。上述说明B组与C组培养体系下的细胞相较于A组培养体系下的细胞扩增效率更高，B组与C组细胞扩增效率无显著性差异，但是结合成本综合考虑，B组要更有优势，故选择最适合重组人表皮生长因子(EGF)浓度为30ng/ml。
实验例3不同浓度重组人碱性成纤维细胞生长因子对细胞扩增效率的影响
1.培养基分组
A组：α-MEM+3.8vol％胎牛血清+30ng/ml重组人表皮生长因子(EGF)+10ng/ml重组人碱性成纤维细胞生长因子(FGF)+10ng/ml重组人源血管内皮生长因子(hVEGF)+20ng/ml胰岛素样生长因子(IGF-1)+5μg/ml纤连蛋白(FN)；
B组：α-MEM+3.8vol％血小板裂解物+30ng/ml重组人表皮生长因子(EGF)+20ng/ml重组人碱性成纤维细胞生长因子(FGF)+10ng/ml重组人源血管内皮生长因子(hVEGF)+20ng/ml胰岛素样生长因子(IGF-1)+5μg/ml纤连蛋白(FN)；
C组：α-MEM+3.8vol％血小板裂解物+30ng/ml重组人表皮生长因子(EGF)+30ng/ml重组人碱性成纤维细胞生长因子(FGF)+10ng/ml重组人源血管内皮生长因子(hVEGF)+20ng/ml胰岛素样生长因子(IGF-1)+5μg/ml纤连蛋白(FN)。
2.细胞培养方法和结果
10ml的脂肪组织采用0.1％胶原酶Ⅰ37℃，100r震荡消化40min，100μm筛网过滤、加入PBS清洗，于300×g转速条件下离心5min。收集细胞沉淀(SVF)。
将收集的细胞沉淀(SVF)分成2等份，分别用10ml培养基A、10ml培养基B、10ml培养基C重悬。分别对3组细胞悬液进行计数，调整细胞密度，将3种不同培养体系下的细胞悬液分别接种至T75培养瓶，补充相应培养基至15ml混合均匀，转移至37℃5％CO2培养箱中正常培养，培养48小时后，三组培养体系分别全量换液，全量换液后培养72小时，拍照记录；
SVF在3种培养体系下培养5天后，分别吸弃3组培养体系下的细胞培养上清；用10ml PBS清洗T75培养瓶底部2遍；每个T75瓶加入2ml 0.25％胰蛋白酶进行细胞消化，轻摇瓶身，使细胞消化液铺满所有细胞表面，约2分钟后在显微镜下观察所消化细胞，若胞质回缩，细胞间隙增大，漂浮且不再连接成片，表明此时细胞消化适度，加入消化中止液中止消化，将3组细胞悬液分别转移至相应离心管中，再用清洗液清洗残余细胞后吸回相应离心管中，进行细胞计数与统计分析，每组重复3次实验。
表7 A组计数结果：
组别 A1 A2 A3
计数结果 5.97×10<sup>6</sup> 5.28×10<sup>6</sup> 4.75×10<sup>6</sup>
表8 B组计数结果：
组别 B1 B2 B3
计数结果 5.06×10<sup>6</sup> 4.73×10<sup>6</sup> 6.98×10<sup>6</sup>
表9 C组计数结果：
组别 C1 C2 C3
计数结果 5.96×10<sup>6</sup> 5.4×10<sup>6</sup> 5.73×10<sup>6</sup>
结果如图3和表7-9所示：培养基A组培养下所获得的脂肪间充质干细胞数分别为5.97×106个、5.28×106个、4.76×106个；培养基B组培养下所获得的脂肪间充质干细胞数分别为5.06×106个、4.73×106个、6.98×106个；培养基C组培养下所获得的脂肪间充质干细胞数分别为5.96×106个、5.4×106个、5.73×106个；将3组间细胞数进行统计分析发现，P值均大于0.05，3组间无显著性差异。上述说明3组体系下细胞增殖均无差异，但是结合成本综合考虑，A组要更有优势，故选择最适合重组人碱性成纤维细胞生长因子(FGF)浓度为10ng/ml。
实验例4脂肪干细胞增殖效率比较
1.培养基分组
A组：α-MEM+10vol％胎牛血清；
B组：α-MEM+20vol％血小板裂解物；
C组：α-MEM+3.8vol％血小板裂解物+30ng/ml重组人表皮生长因子(EGF)+10ng/ml重组人碱性成纤维细胞生长因子(FGF)+10ng/ml重组人源血管内皮生长因子(hVEGF)+20ng/ml胰岛素样生长因子(IGF-1)+5μg/ml纤连蛋白(FN)。
2.细胞培养方法与结果
10ml的脂肪组织采用0.1％胶原酶Ⅰ37℃，100r震荡消化40min，100μm筛网过滤、加入PBS清洗，于300×g转速条件下离心5min。收集细胞沉淀(SVF)。
将收集的细胞沉淀(SVF)分成3等份，分别用30ml培养基A、30ml培养基B、30ml培养基C重悬，细胞计数。分别从3组不同培养体系中取5×106的细胞悬液转移至100mm无菌培养皿中，补充相应培养基至10ml混合均匀，转移至37℃5％CO2培养箱中正常培养，培养48小时后，3组培养体系分别全量换液，全量换液后培养72小时；
SVF在3种培养体系下培养5天后，分别吸弃3种培养体系下的细胞培养上清；用5mlPBS清洗培养皿底部2遍；清洗完成后向培养皿中加入1ml 0.25％的胰蛋白酶进行消化，室温静置3min，加入中止液中止消化；用PBS轻柔清洗培养皿底部(防止细胞丢失)，转移至50ml离心管，进行细胞计数。
将上述3组培养体系下的细胞以10000/cm2的接种密度接种至100mm培养皿中，转移至37℃5％CO2培养箱中正常培养72小时，0.25％胰蛋白酶正常消化，3组培养体系分别细胞计数，梯度稀释并计数；100个细胞接种至100mm无菌培养皿，转移至37℃5％CO2培养箱中正常培养14天，每3天一换液并观察细胞状态；14天后，加入结晶紫染液进行染色，在显微镜下对细胞进行拍照，统计各组别细胞集落数；
结果如图4所示，培养基A组、培养基B组、培养基C组培养下所获得的脂肪间充质干细胞集落数分别为8±1个、11±2个、32±2个。根据平板克隆结果说明，在3组脂肪间充质干细胞培养基中，C组细胞增殖效率远远大于A组与B组。
实施例5脂肪干细胞扩增效率比较
1.培养基分组
A组：α-MEM+10vol％胎牛血清；
B组：α-MEM+20vol％血小板裂解物；
C组：α-MEM+3.8vol％血小板裂解物+30ng/ml重组人表皮生长因子(EGF)+10ng/ml重组人碱性成纤维细胞生长因子(FGF)+10ng/ml重组人源血管内皮生长因子(hVEGF)+20ng/ml胰岛素样生长因子(IGF-1)+5μg/ml纤连蛋白(FN)；
2.细胞培养方法和结果
10ml的脂肪组织采用0.1％胶原酶Ⅰ37℃，100r震荡消化40min，100um筛网过滤、加入PBS离心清洗，于300×g转速条件下离心5min。收集细胞沉淀(SVF)。
将收集的细胞沉淀(SVF)分成3等份，分别用10ml培养基A、10ml培养基B重悬、10ml培养基C重悬。分别对3组细胞悬液进行计数，调整细胞密度，将3种不同培养体系下的细胞悬液分别接种至T75培养瓶，补充相应培养基至15ml混合均匀，转移至37℃5％CO2培养箱中正常培养，培养48小时后，3组培养体系分别全量换液，全量换液后培养72小时，拍照记录；
SVF在3种培养体系下培养5天后，分别吸弃3组培养体系下的细胞培养上清；用10ml PBS清洗T75培养瓶底部2遍；每个T75瓶加入2ml 0.25％胰蛋白酶进行细胞消化，轻摇瓶身，使细胞消化液铺满所有细胞表面，约2分钟后在显微镜下观察所消化细胞，若胞质回缩，细胞间隙增大，漂浮且不再连接成片，表明此时细胞消化适度，加入消化中止液中止消化，将3组细胞悬液分别转移至相应离心管中，再用清洗液清洗残余细胞后吸回相应离心管中，进行细胞计数与统计分析，每组重复3次实验。
表10 A组计数结果：
组别 A1 A2 A3
计数结果 3.5×10<sup>6</sup> 3.1×10<sup>6</sup> 2.6×10<sup>6</sup>
表11 B组计数结果：
组别 A1 A2 A3
计数结果 3.4×10<sup>6</sup> 3.8×10<sup>6</sup> 4.05×10<sup>6</sup>
表12 C组计数结果：
组别 B1 B2 B3
计数结果 5.3×10<sup>6</sup> 6.1×10<sup>6</sup> 5.8×10<sup>6</sup>
结果如图5和表10-12所示：培养基A组培养下所获得的脂肪间充质干细胞数分别为3.5×106个、2.6×106个、3.1×106个；培养基B组培养下所获得的脂肪间充质干细胞数分别为3.4×106个、3.8×106个、4.05×106个；培养基C组培养下所获得的脂肪间充质干细胞数分别为5.3×106个、6.1×106个、5.8×106个；将3组间细胞数进行统计分析发现，C组细胞数与B组细胞数、C组细胞数与A组细胞数比较统计，P值均小于0.05，即B组与C组、A组与C组两组间细胞数有显著性差异，说明C组培养体系下的细胞扩增效率更高。
实施例6脂肪干细胞免疫表型比较
1.培养基分组
A组：α-MEM+10vol％胎牛血清；
B组：α-MEM+20vol％血小板裂解物；
C组：α-MEM+3.8vol％血小板裂解物+30ng/ml重组人表皮生长因子(EGF)+10ng/ml重组人碱性成纤维细胞生长因子(FGF)+10ng/ml重组人源血管内皮生长因子(hVEGF)+20ng/ml胰岛素样生长因子(IGF-1)+5μg/ml纤连蛋白(FN)；
2.细胞培养方法与结果
10ml的脂肪组织采用0.2％胶原酶Ⅰ37℃，100r震荡消化40min，100μm筛网过滤、加入PBS离心清洗，于300×g转速条件下离心5min。收集细胞沉淀(SVF)。
将收集的细胞沉淀(SVF)分成3等份，分别用30ml培养基A、30ml培养基B、30ml培养基C重悬，细胞计数。分别从3组不同培养体系中取5×106的细胞悬液转移至100mm无菌培养皿中，补充相应培养基至10ml混合均匀，转移至37℃5％CO2培养箱中正常培养，培养48小时后，3组培养体系分别全量换液，全量换液后培养72小时；SVF在3种培养体系下培养5天后，分别吸弃3种培养体系下的细胞培养上清；用5ml PBS清洗培养皿底部2遍；清洗完成后向培养皿中加入1ml 0.25％的胰蛋白酶进行消化，室温静置3min，加入中止液中止消化；用PBS轻柔清洗培养皿底部(防止细胞丢失)，转移至50ml离心管，进行细胞计数。将上述3组培养体系下的细胞以10000/cm2的接种密度接种至100mm培养皿中，转移至37℃5％CO2培养箱中正常培养72小时，0.25％胰蛋白酶正常消化，连续传代至P4，3组培养体系P4代细胞分别细胞计数，取5×106进行流式上机检测，统计数据。
表13脂肪干细胞表型鉴定
CD11b CD19 HLA-DR CD105 CD90 CD34 CD45 CD73
A组 0.07 0.96 0.05 99.98 99.95 4.61 0.08 100
B组 0.08 0.09 0.06 99.99 100 0.13 0.75 99.78
C组 0.07 0.04 0.05 99.96 100 0.45 0.93 99.98
结果如图6和表13所示：3组培养体系下细胞进行流式表面标志物检测，各组件无明显差异。证明本发明培养体系可以代替传统胎牛血清培养体系。
此外，按照药典要求：细胞表面标志物的检测包括对MSCs阳性表面标志物群，如D73,CD90,CD105,CD44,CD166，其阳性率应不低于95％，和阴性表面标志物群如CD11b或CD14、CD19或CD79a、CD34、CD45和HLA-DR，其阳性率应不高于2％进行检测。本发明提供的培养基对于阴性表面标志物的检测如CD34更加精确，更能够满足制药需要，降低假阳性的发生率。
综上所述，在本发明中的脂肪间充质干细胞培养基相较于传统胎牛血清培养体系可以有效提高脂肪间充质干细胞的扩增效率、同时无外源物质介入，大幅度减少了给培养体系的间充质干细胞带来外源性污染及病原体污染的风险，成分清晰明确，易大规模生产，批次间差异性较少，血小板裂解物的前处理使之充分裂解，最大程度的保证了营养成分的不流失，以及3.8vol％的血小板裂解物极大程度的减少了培养体系的成本，与后续间充质干细胞的大幅度增长的扩增效率，二者结合，同时满足了未来临床科研跟治疗的细胞需求量的要求。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种干细胞无血清培养基，所述干细胞无血清培养基包含基础培养基、血小板裂解物和其他生长因子，其特征在于，所述基础培养基和血小板裂解物体积比为(90-99)％：(1-10)％；所述其他生长因子占基础液与血小板裂解物混合物的体积份数为1-11μg/ml。
2.根据权利要求1所述的干细胞无血清培养基，其特征在于，所述血小板裂解物体积份数3.8％。
3.根据权利要求1所述的干细胞无血清培养基，其特征在于，所述其他生长因子包括纤连蛋白、重组人表皮生长因子、重组人碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子和重组人源血管内皮生长因子。
4.根据权利要求3所述的干细胞无血清培养基，其特征在于，所述干细胞无血清培养基中包括以下浓度的组分：1-10％(v/v)血小板裂解物、10-60ng/ml重组人表皮生长因子、10-30ng/ml重组人碱性成纤维细胞生长因子、5-20ng/ml重组人源血管内皮生长因子、10-30ng/ml胰岛素样生长因子和1-10μg/ml纤连蛋白。
5.根据权利要求4所述的干细胞无血清培养基，其特征在于，所述干细胞无血清培养基中包括以下浓度的组分：3.8％(v/v)血小板裂解物、30ng/ml重组人表皮生长因子、10ng/ml重组人碱性成纤维细胞生长因子、10ng/ml重组人源血管内皮生长因子、20ng/ml胰岛素样生长因子和5μg/ml纤连蛋白。
6.根据权利要求1-5任一项所述的干细胞无血清培养基，其特征在于，所述基础培养基为α-MEM基础培养基。
7.一种权利要求1-5任一项所述的干细胞无血清培养基的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)血小板裂解物进行预处理：解冻后添加氯化钙，充分溶解反复冻融3次，将血小板裂解物离心，用0.22μm过滤器过滤血小板裂解物；
(2)血小板裂解物和基础培养基按比例混和，得混和物；
(3)按比例添加所述生长因子，配制完成后再次过滤除菌，即为所述干细胞无血清培养基。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述对血小板裂解物进行预处理具体为：解冻后加入添加0.025mol/L的氯化钙，充分溶解反复冻融3次，将血小板裂解物于300×g转速条件下离心5min，去除血小板裂解物中的多余氯化钙及脂肪及由纤连蛋白原析出杂质，用0.22μm过滤器过滤血小板裂解物除菌除杂质。
9.一种干细胞的培养方法，其特征在于，所述培养方法包括采用权利要求1-6任一项所述的干细胞培养基培养干细胞的步骤。
10.根据权利要求9所述的干细胞的培养方法，其特征在于，所述干细胞为脂肪间充质干细胞。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115624570A (zh) * 2022-12-21 2023-01-20 北京瑷格干细胞科技有限公司 人脂肪间充质干细胞在制备治疗结缔组织疾病药物中的应用
CN115624571A (zh) * 2022-12-21 2023-01-20 北京瑷格干细胞科技有限公司 人脂肪间充质干细胞在制备治疗硬皮病药物中的应用
CN116396930A (zh) * 2023-06-08 2023-07-07 北京华龛生物科技有限公司 间充质干细胞无血清培养基及其应用
CN116426470A (zh) * 2023-06-08 2023-07-14 北京华龛生物科技有限公司 间充质干细胞无血清培养基及其应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110234329A (zh) * 2017-01-27 2019-09-13 辛特拉股份公司 骨骼和软骨损害或疾病的预防和治疗
CN112680414A (zh) * 2021-01-29 2021-04-20 宏之俊生物科技(上海)有限公司 一种逆转衰老的间充质干细胞的制备方法
CN113728094A (zh) * 2019-05-02 2021-11-30 Scm生命科学有限公司 包含在含有人血小板裂解物的培养基中培养的间充质干细胞培养液的化妆品组合物

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110234329A (zh) * 2017-01-27 2019-09-13 辛特拉股份公司 骨骼和软骨损害或疾病的预防和治疗
CN113728094A (zh) * 2019-05-02 2021-11-30 Scm生命科学有限公司 包含在含有人血小板裂解物的培养基中培养的间充质干细胞培养液的化妆品组合物
CN112680414A (zh) * 2021-01-29 2021-04-20 宏之俊生物科技(上海)有限公司 一种逆转衰老的间充质干细胞的制备方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
韩颢: "脐带间充质干细胞无血清培养方案的优化", 硕士电子期刊库, no. 02, pages 1 - 67 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115624570A (zh) * 2022-12-21 2023-01-20 北京瑷格干细胞科技有限公司 人脂肪间充质干细胞在制备治疗结缔组织疾病药物中的应用
CN115624571A (zh) * 2022-12-21 2023-01-20 北京瑷格干细胞科技有限公司 人脂肪间充质干细胞在制备治疗硬皮病药物中的应用
CN116396930A (zh) * 2023-06-08 2023-07-07 北京华龛生物科技有限公司 间充质干细胞无血清培养基及其应用
CN116426470A (zh) * 2023-06-08 2023-07-14 北京华龛生物科技有限公司 间充质干细胞无血清培养基及其应用
CN116426470B (zh) * 2023-06-08 2023-09-22 北京华龛生物科技有限公司 间充质干细胞无血清培养基及其应用
CN116396930B (zh) * 2023-06-08 2023-09-22 北京华龛生物科技有限公司 间充质干细胞无血清培养基及其应用

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