CN115624570A

CN115624570A - 人脂肪间充质干细胞在制备治疗结缔组织疾病药物中的应用

Info

Publication number: CN115624570A
Application number: CN202211645459.8A
Authority: CN
Inventors: 杨跃梅; 曹静; 程腾; 安文强; 雷蕾
Original assignee: Beijing Weige Stem Cell Technology Co ltd
Current assignee: Beijing Weige Stem Cell Technology Co ltd
Priority date: 2022-12-21
Filing date: 2022-12-21
Publication date: 2023-01-20

Abstract

本发明公开了人脂肪间充质干细胞在制备治疗结缔组织疾病药物中的应用，所述人脂肪间充质干细胞分泌以下干细胞因子HGF、VEGF，各干细胞因子的分泌量均大于975pg/1×10⁶cells。本发明制备的人脂肪间充质干细胞利用定向趋化方法能够安全稳定的扩增适合大规模临床生产需要，同时对免疫系统因素、炎症因素、创伤或退行性因素引起的纤维化或血管异常治疗效果显著，尤其是皮肤纤维化疾病表现出优异的治疗效果。

Description

人脂肪间充质干细胞在制备治疗结缔组织疾病药物中的应用

技术领域

本发明涉及细胞治疗技术领域，特别涉及人脂肪间充质干细胞在制备治疗结缔组织疾病药物中的应用。

背景技术

结缔组织是机体中分布广泛的一种组织，身体的各个部位、器官都存在结缔组织。结缔组织由细胞、大量细胞间质组成，细胞间质包括细胞基质以及纤维。结缔组织分为疏松结缔组织、致密结缔组织以及细胞，细胞包括成纤维细胞、肥大细胞等。结缔组织病是一组疾病的总称，泛指的是结缔组织受累。在临床医学中，结缔组织疾病是一种以松散结缔组织的粘液性水肿和纤维蛋白样变性为基础的疾病。其是由胶原纤维的纤维蛋白样变性引起的，故又称弥漫性胶原病或胶原血管病。人们普遍认为这种疾病与遗传因素、免疫和病毒感染有关。该病可累及多个器官，累计皮肤的多表现为细胞外基质异常。

细胞外基质（extracellular matrice，ECM）是指在所有组织中由胶原、弹性蛋白、糖蛋白和蛋白多糖特异性组织的网络，具有独特结构作用和特定功能特性。

ECM结构变化会引起一系列人类疾病，从Ehlers-Danlos综合征到大疱性表皮松解症，同时ECM的成分也是多种自身免疫疾病攻击的靶点，如大疱性系统红斑狼疮、硬化性苔藓、系统硬化症等。

纤维化通常被定义为ECM因子（主要是I型胶原蛋白）的加速积累，阻止组织的再生。由于创伤、炎症、免疫排斥反应、化学毒性或氧化应激，它几乎可以发生在任何组织中。

脂肪组织生长需要细胞外基质和脂肪细胞相互协同，ECM不仅发挥着结构作用，并且对于组织微环境也具有重要作用，指导细胞表达和功能行为。

在过去的十多年中，关于间充质干/基质细胞（MSC）治疗和修复受损细胞和组织的功能机制有了爆发性增长。MSC是一类具有自我更新能力和多向分化潜能的组织干细胞，可以从脐带、脂肪、胎儿血液、骨髓、肝脏等组织获得，在疾病治疗领域有巨大的潜力。其中脂肪间充质干细胞（又称脂肪来源干细胞）存在于成熟脂肪组织中，其含量丰富，提取简便，供区易被患者接受，被认为是有极大应用前景的干细胞。干细胞进入人体后，其独特的干性和归巢特性会由于机体微环境的变化而做出适应性的调整。自然界的有生命的生物都表现出与其生活环境相适应的特征，来源于脂肪的人脂肪间充质干细胞根据其与ECM的的微环境相似性和相互协同性等特性无疑将发挥其独特干细胞干性优势。

尽管干细胞具有多能性，但一样受到细胞因子的调控。不同类型的干细胞被许多细胞因子靶向。这些细胞因子改变干细胞的增殖、分化和其他特性。细胞因子是促进免疫细胞间有效通信的小糖蛋白信使。细胞因子调节干细胞增殖和自我更新。干细胞因子（StemCell Factor, SCF）是干细胞的主要调节因子，大多数常见的细胞因子都与它一起起到协同或拮抗作用。SCF通过与受体结合作用于上皮细胞、造血细胞、血管内皮细胞等多种细胞，是一种可调节多种细胞生长、运动和形态发生的多功能因子。

虽然MSCs的抗纤维化作用可能与它们的抗炎和血管生成特性重叠，但具体机制仍然知之甚少。如何筛选适合皮肤修复的干细胞，如何在体外更安全稳定的扩增适合临床需要的具有靶向功能的人脂肪间充质干细胞，如何获得更适合特定ECM微环境的人脂肪间充质干细胞是本发明要解决的问题。

发明内容

为了解决上述背景技术中存在的问题，本发明的主要目的在于提供人脂肪间充质干细胞在制备治疗结缔组织疾病药物中的应用。

为实现上述目的，本发明选用人脂肪间充质干细胞。

首先，人脂肪间充质干细胞伦理和法规要求相对宽泛；人脂肪间充质干细胞免疫原性低。从移植的部位、成本、干细胞数目等等因素考虑，相对于其他成体干细胞，脂肪间充质干细胞有如下优点：量大，皮下分布，采集容易，采集部位副作用小。

由于，本发明第一目的是解决皮肤等结缔组织组织纤维化问题，人脂肪间充质干细胞来源于皮下脂肪，人脂肪间充质干细胞本身存活和生长需要特定的环境，用人脂肪间充质干细胞治疗皮肤等相关疾病，其分化为细胞外基质所需相关因子最直接、环境改变最小。由于特定微环境的作用，人脂肪间充质干细胞能发挥其最大调节和治疗潜能。

基于此，本发明具体解决技术方案如下：

首先，本发明提供了人脂肪间充质干细胞在制备治疗结缔组织疾病药物中的应用，所述人脂肪间充质干细胞分泌以下干细胞因子HGF、VEGF，各干细胞因子的分泌量均大于975pg/1×10⁶cells。

优选地，所述人脂肪间充质干细胞是通过减少α-SMA、III型胶原、TGF-β1，和/或增加HGF、VEGF的分泌量来减轻皮肤纤维化程度。

优选地，所述干细胞因子还包括MMPs，所述MMPs分泌量大于656pg/1×10⁶cells。

优选地，所述人脂肪间充质干细胞的工作细胞为P5代细胞，P2代到P5代细胞所述HGF分泌量大于2504pg/1×10⁶cells，VEGF分泌量大于975pg/1×10⁶cells，所述MMPs分泌量大于656pg/1×10⁶cells。更优选地，P5代细胞HGF分泌率大于12160.4±3568.5pg/1×10⁶cells，VEGF分泌率大于4229.4±165.3pg/1×10⁶cells。

优选地，所述人脂肪间充质干细胞细胞表面标志物CD73、CD90、CD105阳性表达，阳性率不低于95%；CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR阴性表达，阳性率应不高于2%；细胞具有成脂细胞、成骨细胞、成软骨细胞分化的能力。

进一步地，所述结缔组织疾病包括免疫系统因素、炎性因素、创伤或退行性因素引起的纤维化或血管异常。

优选地，所述结缔组织疾病包括硬皮病、皮肌炎、硬斑病、嗜酸性筋膜炎、硬肿症、硬化性黏液水肿、肾源性系统性纤维化、慢性移植性抗宿主病、皮肌炎、硬化性苔藓、创伤性瘢痕或瘢痕疙瘩造成的皮肤纤维化和/或血管损伤。

更优选地，所述结缔组织疾病还包括硬皮病造成的脏器纤维化。

其中，所述创伤选自：擦伤，撕裂，吹气创伤，切开创伤，烧伤，挫伤，穿刺创伤，外科创伤和皮下创伤等。

优选地，所述人脂肪间充质干细胞为异体脂肪间充质干细胞。

进一步地，本发明第二目的提供了制备人脂肪间充质干细胞的制备方法，所述人脂肪间充质干细胞制备采用消化法和贴壁法获得，采用的培养基为无血清完全培养基，所述人脂肪间充质干细胞由P0传代培养至P5代为工作细胞，P2代到P5代干细胞经过干细胞因子HGF和VEGF的筛选，各代干细胞因子的分泌量均大于975pg/1×10⁶cells。

优选地，所述无血清完全培养基为基础培养基是α-MEM，还添加3.8%（v/v）血小板裂解物、30ng/ml重组人表皮生长因子、10ng/ml重组人碱性成纤维细胞生长因子、10ng/ml重组人源血管内皮生长因子、20ng/ml胰岛素样生长因子和5µg/ml纤连蛋白。

优选地，所述无血清完全培养基为市售为无血清完全培养基，在一优选实施例中为友康培养基和友康添加剂按照500：1配置。

优选地，所述消化法采用的消化液为0.1%~0.5%Ⅱ型胶原酶，37℃，100~150rpm，震荡消化30~40min。

优选地，传代培养过程中，细胞接种密度为8×10³~1.2×10⁴/cm²。

优选地，所述人脂肪间充质干细胞的治疗剂量为5×10⁴~5×10⁶cells/只小鼠，每只小鼠重20±2g。优选为5×10⁴~5×10⁵cells/只小鼠

优选地，所述人脂肪间充质干细胞的注射方式为皮下注射、皮内注射、肌肉注射。更优选皮下注射。

基于上述技术方案，本发明具有以下有益效果：

本发明制备的人脂肪间充质干细胞利用定向趋化方法能够安全稳定的扩增适合大规模临床生产需要，同时对免疫系统因素、炎症因素、创伤或退行性因素引起的纤维化或血管异常，尤其是皮肤纤维化疾病表现出优异的治疗效果。

附图说明

图1 实施例2中细胞表面标志物的检测结果;

图2实施例2中本发明三系分化检测结果;

图3实施例3中ADSCs- CM对HDFs细胞活力的影响;

图4 实施例4中HGF对HDFs纤维化相关因子基因水平的表达情况;

图5 实施例5中HGF对HUVECs细胞增殖情况;

图6 实施例6中人ADSCs体外对HDFs细胞增殖的结果;

图7 实施例6中人ADSCs对HDFs体外纤维化基因表达水平的影响结果;

图8实施例6中人ADSCs对人皮肤胶原蛋白沉积的影响结果;

图9实施例7中剂量探索组1单次注射ADSCs 28d后各组皮肤Masson染色图，C表示胶原纤维厚度（单位μm），A表示真皮层脂肪组织厚度（单位μm）;

图10实施例7中剂量探索组1两次注射ADSCs 28d后各组皮肤Masson染色图，C表示真皮层纤维化厚度（单位μm），A表示真皮层脂肪组织厚度（单位μm）;

图11实施例7剂量探索组2注射ADSCs 28d后各组皮肤Masson染色图，C表示胶原纤维厚度（单位μm），A表示真皮层脂肪组织厚度（单位μm）;

图12实施例7剂量探索组2注射ADSCs 28d后各组胶原纤维厚度和脂肪层厚度变化，**p<0.01相对 Con；##p<0.01 相对 M。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。下述实施例中所有的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。当描述本发明的实施方式时，使用“优选地”、“更优选地”等指，在某些情况下可提供某些有益效果的本发明实施方案。然而，在相同的情况下或其他情况下，其他实施方案也可能是优选的。除此之外，对一个或多个优选实施方案的表述并不暗示其他实施方案不可用，也并非旨在将其他实施方案排除在本发明的范围之外。

在本发明中，脂肪组织来源于健康人捐献的脂肪组织样本提取扩增而成。人脂肪间充质干细胞既可以是源自被检体的自体细胞，也可以是源自同种的其它健康对象的异体细胞。优选为异体细胞。

细胞表面标志物是指脂肪间充质干细胞表达标记物基因、或表达标记物蛋白、或表达其两者。即，是指人脂肪间充质干细胞表达CD73、CD90、CD105组中的细胞表面标记物的基因和/或蛋白；不表达选自CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR组中的细胞表面标记物的基因和/或蛋白。此处，对于人脂肪间充质干细胞是否表达了各标记物的判断，就基因表达而言例如可以通过基因芯片阵列、聚合酶链反应(逆转录酶PCR、实时PCR、现有的PCR)等现有公知的方法来进行。另外，就蛋白表达而言，例如可以通过使用与各标记物蛋白特异性结合的抗体的FACS解析(流式细胞术)、酶联免疫吸附检测法(ELISA)等现有公知的方法来进行。在任意情况下均将未表达各标记物基因或蛋白的细胞作为阴性对照，从而判断表达的有无、表达的高低。

本发明的脂肪间充质干细胞表达CD73、CD90、CD105，阳性率不低于95%；更优选阳性率不低于98%；最优选阳性率不低于99%。本发明的脂肪间充质干细胞不表达CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR，阳性率应不高于2%；更优选阳性率不高于1%。表达了上述标记物的间充质干细胞显示出优异的抗纤维化作用、抗炎作用等。

本发明的人脂肪间充质干细胞除了表达上述特定标记物这样的特征之外，例如还可以通过以下方法来表征：生长特征(例如，传代代数、倍增时间)、核型分析(例如，正常核型、母体系统或新生儿系统)、利用流式细胞术(例如，FACS分析)的除上述以外的表面标记物表达、免疫组织化学和/或免疫细胞化学(例如，表位检测)、基因表达谱(例如，基因芯片阵列；反转录PCR、实时PCR、以往类型PCR等聚合酶链反应)、miRNA表达谱、蛋白质阵列、细胞因子等蛋白质分泌(例如，血浆凝固分析、ELISA、细胞因子阵列)、代谢产物(代谢物组学分析)、本领域中已知的其它方法等。

本发明的人脂肪间充质干细胞还可以通过有无以下特定的细胞因子分泌或蛋白来进一步表征。本发明的间充质干细胞分泌HGF、VEGF、MMPs中一种或多种细胞因子。

HGF（hepatocyte growth factor，HGF），肝细胞生长因子，该基因编码一种与肝细胞生长因子受体结合的蛋白质，以调节许多细胞和组织类型的细胞生长，细胞运动和形态发生。选择性剪接导致多个转录本变体，其中至少一个编码前蛋白，该前蛋白经过蛋白水解处理以产生α和β链，形成成熟的异源二聚体。这种蛋白质由间充质细胞分泌，在主要上皮来源的细胞上充当多功能细胞因子。这种蛋白质也在血管生成，肿瘤发生和组织再生中发挥作用。ADSCs分泌的HGF可有效抑制纤维化，加入HGF抗体，使蛋白表达和分泌恢复到基础水平。ADSCs分泌因子HGF在促进血管生成和抗纤维化中的有显著作用。

VEGF（vascular endothelial growth factor，VEGF)，血管内皮生长因子，一种高度特异性的促血管内皮细胞生长因子，具有促进血管通透性增加、细胞外基质变性、血管内皮细胞迁移、增殖和血管形成等作用。

MMPs(matrix metalloproteinases，MMPs)，基质金属蛋白酶，MMPs通常以非活性的proMMP形式分泌，它被包括其他MMP在内的各种蛋白酶裂解为活性形式。MMPs降解ECM中的各种蛋白质底物，包括胶原蛋白和弹性蛋白。是特异性切断I型、II型、III型、V型胶原蛋白的螺旋部位、参与组织破坏和组织再构建的酶。MMPs促进细胞增殖、迁移和分化，并在血管生成、细胞凋亡和组织修复中发挥作用。

本发明细胞因子分泌量可以通过本领域技术人员利用公知的方法来测定。例如可列举出ELISA法等。优选地，本发明P5代细胞HGF分泌率大于12160.4±3568.5pg/1×10⁶cells，VEGF分泌率大于4229.4±165.3pg/1×10⁶cells。

本发明的人脂肪间充质干细胞具有成骨、成脂、成软骨分化的分化能力。关于各自的分化能力，可以通过本领域技术人员利用公知的分化诱导条件培养上述间充质干细胞群体来进行判断。脂肪细胞、骨细胞及软骨细胞难以由其细胞形状来判定，但可以通过对细胞内脂质进行染色(例如可以通过油红O染色法染成红色)来确认脂肪细胞的存在。另外，通过将细胞用茜素红(Alizarin red)进行染色，能够确认骨细胞的存在。另外，通过进行番红O染色，能够确认软骨细胞的存在。利用本发明中培养基和培养方法获得的干细胞具有向着脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞分化的分化能力。

细胞的代数是影响干细胞活性及临床有效性、安全性的一个重要因素。理论上讲，细胞代数越靠前，干细胞的干性也越强。但是干细胞在体外培养的过程中，干细胞有从组织微环境到体外培养环境的一个调整和适应过程，一部分不适应的细胞会被淘汰，所以在前两三代，干细胞基因组有着不稳定的因素，可能不宜临床应用。本发明选用P5代人脂肪间充质干细胞作为工作细胞在治疗效果中表现良好。尤其对促血管和抗纤维化作用表现优异。

如，本发明人脂肪间充质干细胞通过TGF-β信号通路激活剂，激活TGF-β信号通路，导致细胞纤维化水平升高与ADSCs共培养后，从蛋白水平和基因水平检测发现细胞的纤维化水平降低，说明ADSCs具有抗纤维化的功效。

本发明的脂肪干细胞对人皮肤成纤维细胞发挥作用，显示出抑制作为纤维化相关基因的TGF-β和COL3的表达的效果。因此，本发明的脂肪干细胞可以说对人皮肤成纤维细胞的纤维化相关疾病如硬化症、动脉硬化等疾病是有效的。

本发明的人脂肪间充质干细胞还显示出抑制作为纤维化相关基因的 COL1的表达的效果。因此，本发明的人脂肪间充质干细胞可以说该基因导致的炎症、纤维化相关疾病是有效的。

能够用本发明人脂肪间充质干细胞制备的疾病包括免疫系统因素、炎性因素、创伤或退行性因素引起的纤维化或血管异常疾病，尤其皮肤纤维化疾病如硬皮病、硬斑病。脏器纤维化如肺纤维化、肝纤维症等。

具体优选实施例如下：

实验例1 脂肪间充质干细胞的体外分离、培养

1、人脂肪组织的采集

人脂肪组织采集环境：手术室洁净环境中进行的无菌操作。人脂肪组织采集操作：待患者麻醉、消毒、铺巾后，于吸脂区域做一5 mm左右切口后注射预先配置好的肿胀液（1000 mL生理盐水加2％利多卡因30 mL加1:1000肾上腺素1 mL加5％碳酸氢钠10 mL），肿胀液的注射量根据吸脂范围而定，腹部和单侧大腿吸脂需注射1000 mL。肿胀液注射后，首先按揉10 min；然后采用注射器法或吸引器法进行吸脂；吸脂完成后，将注射器直立放置10min，待脂肪与肿胀液分层后，排出下层肿胀液，仅收集上层脂肪，置于样本采集瓶中。

2、组织处理和原代细胞的制备

2.1.人脂肪组织样本分离

用移液管吸取组织样本转移至离心管中，然后向其加入氯化钠注射液反复吹打清洗，室温 600g，1min，离心。离心后吸弃组织上层淡黄色脂肪液体及组织下层液体，然后向其加入氯化钠注射液再次清洗，重复上述步骤6-9次，直至清洗人脂肪组织无血色为止。

2.2脂肪组织样本消化

清洗完，用移液管将样本转移至新的离心管中，记录。加入与样本等体积的0.1%~0.5%（体积浓度）胶原酶消化液工作液至离心管中，并吹打混匀。将该离心管横放于恒温振荡器中固定好，37℃、100~150rpm、30~40min消化，直至无肉眼可见的大颗粒组织，消化完成的脂肪成糊状，室温 600g，5min，离心。

2.3 SVFs细胞清洗、过滤及收集

用移液管吸弃上层的脂肪和上清，加入30mL细胞清洗液重悬细胞沉淀并吹打混匀后，细胞悬液用100μm筛网过滤至离心管，室温600g，5min，离心。用移液管吸弃上清，加入无血清完全培养基重悬细胞沉淀并吹打混匀后，细胞悬液用100μm筛网过滤至1个50mL离心管中，计数。

2.4 SVFs细胞接种及培养

每个T75培养瓶按30000~60000个活细胞/cm²的细胞接种密度接种，补充无血清完全培养基至每个T75培养瓶最终体积为15mL，摇匀细胞悬液均匀平铺至培养瓶底部。水平放入二氧化碳培养箱5%CO₂、37℃培养，3-4天。

2.5原代细胞（P0代）换液及培养

待原代细胞（P0代）观察完成后，首先使用移液管吸弃细胞培养上清，添加细胞清洗。用25mL移液管缓慢添加无血清完全培养基至培养瓶中，缓慢摇匀使其分布均匀至培养瓶底面。水平放入二氧化碳培养箱5%CO₂、37℃再培养3-4天。所用无血清完全培养基为基础培养基是α-MEM，还添加3.8%（v/v）血小板裂解物、30ng/ml重组人表皮生长因子、10ng/ml重组人碱性成纤维细胞生长因子、10ng/ml重组人源血管内皮生长因子、20ng/ml胰岛素样生长因子和5µg/ml纤连蛋白。

3、干细胞的传代培养和冻存

3.1细胞观察及消化

若镜下观察细胞均异常，且细胞融合度达到80%以上，则进行原代细胞（P0代）消化及接种。使用加入氯化钠注射液，用移液管吸弃氯化钠注射液，重复上述操作，清洗两次。使用移液管加入消化酶，轻摇瓶身，使消化酶（TrypLE）均匀铺满细胞表面。

3.2细胞的消化终止及收集

镜下观察，若细胞质回缩，细胞间隙增大，漂浮且不再连接成片，则消化完成。随后使用移液管加入细胞清洗液，轻摇瓶身，收集至离心管中。并室温600g，5min，离心。

3.3 细胞接种

离心完毕后，使用移液管吸弃离心上清液，轻弹离心管底部，使用移液管吸取完全培养基重悬细胞沉淀并吹打混匀。根据计数结果，按8000-12000/cm²接种密度接种。换瓶补充完全培养放入二氧化碳培养箱5%CO₂、37℃培养3天。并传代至P2，P2代细胞检测后进行细胞冻存。定向检测趋化因子中，HGF、VEGF分泌量大于975pg/1×10⁶cells。

4、工作细胞的制备

4.1细胞复苏

复苏细胞，核对标识，确定无误后迅速放入37℃水浴锅中。当冻存管内容物融解到黄豆粒大小时，从水浴锅中取出冻存管，并移至生物安全柜打开。

4.2 P3细胞接种

用移液管吸取细胞悬液，缓慢加入至装有完全培养基的离心管中；用移液管吸取细胞悬液冲洗冻存管内壁，收集残留细胞，转移至离心管中，充分混匀后，室温600g，5min，离心；离心结束后吸弃上清液，并加入完全培养基，轻轻吹打混匀，计数。根据计数结果，按8000-12000/cm²接种密度接种，吹打混匀，用10mL移液管吸取1mL细胞悬液依次转移至每个T75培养瓶中，补充完全培养基。将T75培养瓶水平放入二氧化碳培养箱5%CO₂、37℃中培养3天。重复传代至P5为工作细胞。

P5代细胞定向检测趋化因子中，P5代细胞HGF分泌率大于12160.4±3568.5pg/1×10⁶cells，VEGF分泌率大于4229.4±165.3pg/1×10⁶cells。

实施例2、人脂肪间充质干细胞的鉴定和功能评价

1、细胞数及活率

将冻存细胞置于37℃恒温水浴锅中快速融化，然后把冻存管内悬液转移至含9mL完全培养基的15mL离心管中并混匀，置于离心机中500g、5min离心，离心完毕后弃上清，轻弹离心管底部并加入10mL完全培养基，轻轻吹打混匀，从悬液中部取样至EP管中，每个样本不少于200μL，重复此步骤三次，取三个样本，分别对3份细胞悬液进行AOPI染色后置于细胞计数仪中计数，细胞数应在0.8×10⁷~1.5×10⁷，活率都不低于80%。

2、细胞表面标志物

利用流式细胞技术检测每代细胞表面标志物，CD105、CD73和CD90不低于95%的细胞表达，且表达CD45、CD34、CD11b、CD19、HLA-DR类分子的细胞不应超过总数的2%，例如取P2和P5细胞通过流式细胞仪检测标记对应抗体的间充质干细胞，以确定间充质干细胞符合标准。检测结果如图1所示。

3、三系分化

本发明P5细胞成脂分化后的细胞经油红O染色应成红色脂滴，成骨分化后的细胞经茜素红染色应成红色钙结节，成软骨分化后的细胞经切片后番红O染色呈红色，如图2所示。实验结果表明，本发明P5细胞向着脂肪细胞、骨细胞分化的分化能力与其他间充质干细胞群体相比显著提高。

4、用ELISA法检测HGF分泌率

供试品制备：待测样本为供试品，对待检测样本稀释4倍。取适量酶标板孔，将Assay Diluent RD1-38以100μL/孔加入到酶标板中，每个浓度标准品2个孔，供试品2个孔。将稀释后的标准品、供试品分别以50μL/孔加入到酶标板中，盖好封板膜，室温下500±50rpm水平震荡孵育2h。取出酶标板，重复洗板4次。将Human HGF Conjugate抗体320以200μL/孔加入到酶标板中，盖好封板摸，室温下500±50rpm水平震荡孵育1h。取出酶标板，重复洗板4次。将Streptavidin-HRP 1以200μL/孔加入到酶标板中，盖好封板摸，室温下避光500±50rpm水平震荡孵育0.5h。取出酶标板，重复洗板4次。将显色液A与显色液B等体积混合制成显色液。以200μL/孔加入到酶标板中；盖好封板膜，室温避光孵育0.5h。取出酶标板，以50μL/孔加入终止液，充分混匀。将酶标板放入酶标仪，盖上盖子；在Gen5软件上选择450nm/570nm波长，四参数拟合曲线测定各孔OD值；以标准品浓度为横坐标，所测OD值为纵坐标制作标准曲线，进行回归分析并计算R²。P5代细胞HGF分泌率为12160.4±3568.5pg/1×10⁶cells。

5、用ELISA法检测VEGF分泌率

待检测样本稀释25倍。将稀释后的标准品、供试品分别以100μL/孔加入到酶标板中，盖好封板膜，室温孵育2h，每个浓度标准品2个孔，供试品2个孔。取出酶标板，重复洗板4次。将Human VEGF Conjugate抗体以200μL/孔加入到酶标板中，盖好封板膜，室温下孵育2h。取出酶标板，重复洗板4次。将显色液A与显色液B等体积混合制成显色液。以200μL/孔加入到酶标板中；盖好封板膜，室温避光孵育0.5h。取出酶标板，以50μL/孔加入终止液，充分混匀。将酶标板放入酶标仪，盖上盖子；在Gen5软件上选择450nm/570nm波长，四参数拟合曲线测定各孔OD值；以标准品浓度为横坐标，所测OD值为纵坐标制作标准曲线，进行回归分析并计算R²。P5代细胞VEGF分泌率为4229.4±165.3pg/1×10⁶cells。

实验例3 CCK8检测HGF对人皮肤真皮成纤维细胞细胞增殖的影响

因为成纤维细胞的增殖和活性是皮肤纤维化的重要影响因素之一，我们对ADSCs条件培养基（ADSCs-CM）中的HGF对人皮肤真皮成纤维细胞（Human Dermal Fibroblasts，HDFs）增殖和活性的影响进行检测。用ADSCs-CM或HGF（1 ng/mL）重组蛋白对HDFs进行处理。用山羊抗人HGF中和抗体（Neutralizing antibody，Ab）中和ADSCs-CM中的HGF活性，研究HGF的对HDFs增殖的调控作用。

按照4000个/孔的接种密度将HDFs接种于96孔板中，分别于DMEM，DMEM+Ab，DMEM+ADSCs-CM（50%），DMEM+ADSCs-CM（50%）+Ab，DMEM+HGF (1ng /mL)， DMEM+HGF +Ab培养基中进行培养。于接种后第0 h、24 h、48 h采用CCK8测定HGF对HDFs增殖和活性的影响。

实验结果，如图3所示，24 h时各组之间没有显著差异；48 h时，与DMEM相比，50%ADSCs-CM显著抑制了HDFs细胞的增殖（p＜0.0001）；300 ng/mL和900 ng/mL HGF中和抗体均能显著逆转50% ADSCs-CM对HDFs细胞的增殖抑制作用，且两个浓度之间无明显差异。结果显示，ADSCs-CM对HDFs有明显增殖抑制作用(p＜0.05)，提示可能是由于ADSCs分泌因子HGF发挥了作用。

实验例4检测HGF对HDFs纤维化相关因子的调控

用ADSCs-CM（50%）或HGF（1 ng/mL or 230*50% pg/mL）重组蛋白对HDFs进行处理。用山羊抗人HGF抗体（Ab）(300 ng/mL)中和ADSCs-CM中的HGF活性，研究HGF的抗纤维化作用。

实验共分为6组，具体分组如下：将HDFs按照4 ×10⁵个/孔的接种密度接种于6孔板中，分别于DMEM，DMEM+Ab， DMEM+ADSCs-CM（50%），DMEM+ADSCs-CM（50%）+Ab， DMEM+HGF(1ng /mL)，DMEM+HGF +Ab培养基中进行培养。分别于6 h和24 h后，提取HDFs总RNA。RT-PCR检测纤维化相关基因I型胶原蛋白（Collagen 1，COL1）、III型胶原蛋白（Collagen 3，COL3）、α平滑肌肌动蛋白（Alpha-smooth muscle actin，α-SMA）和转化生长因子-β1（Transforming Growth Factor -β1，TGF-β1）的表达。

如图4所示：TGF-β1刺激剂能够使COL1、COL3、α-SMA和TGF-β1的基因表达水平显著升高（p＜0.0001）；加入ADSCs-CM或HGF蛋白6 h后，COL1、COL3、α-SMA、TGF-β1的基因表达水平均显著降低（p＜0.05）；HGF中和抗体，能够显著逆转ADSCs-CM对TGF-β1基因表达的抑制作用，使其表达明显升高（p＜0.01），COL3、α-SMA、基因表达也有逆转趋势；HGF中和抗体组COL1、α-SMA、TGF-β1的基因表达也有逆转趋势。结果显示了ADSCs分泌因子HGF可显著降低纤维化指标COL1、COL3、α-SMA、TGF-β1基因表达水平（p＜0.05），提示人ADSCs分泌因子HGF可有效抑制体外皮肤纤维化。

实验例5 CCK8检测HGF对HUVECs细胞增殖的影响

按照3000个/孔的接种密度将HUVECs接种于96孔板中，分别于HUVECs，HUVECs+Ab,HUVECs+ADSCs-CM（50%），HUVECs+ADSCs-CM（50%）+Ab, HUVECs+HGF (1ng /mL), HUVECs+HGF +Ab培养基中进行培养。于接种后第0h，24h，48h采用CCK8测定HGF对HDFs增殖和活性的影响。

如图5所示，ADSCs-CM显著促进了HUVECs细胞的增殖（p＜0.0001），加入HGF中和Ab后，显著逆转了HUVECs细胞的增殖趋势（p＜0.0001），且ADSCs-CM作用明显强于单独HGF（p＜0.0001），说明ADSCs上清中可能含有其他能够促进HUVECs增殖的因子，可能跟HGF发挥了协同作用。

本发明的结果结合VEGF的作用，说明HGF与VEGF等因子结合协同发挥了对HDFs具有明显增殖抑制作用，并能够显著降低TGF-β1诱导的HDFs体外纤维化模型中相关指标COL1、COL3、α-SMA、TGF-β1基因（p＜0.01）水平表达。

实验例6 人ADSCs体外对HDFs细胞增殖的影响

1、实验材料和方法

健康人成纤维细胞P4（P5）商业购买或者按照已公知方法制备、健康人脂肪间充质干细胞P5，无血清培养基（友康生物科技(北京)股份有限公司，间充质干细胞无血清培养基基础，货号：NC0103，间充质干细胞无血清培养基添加剂3，货号：NC0104.S， PBS（索莱宝）、0.05%含EDTA的胰蛋白酶（trypsin-EDTA，BI）、TGF-β信号通路激活剂TGF-β1（SRI-011381，品牌：MCE，货号： HY-100347 ）、成纤维细胞培养基（品牌：大连美伦生物，货号：PWL116）、DMEM高糖培养基（品牌：Gibco，货号：C11995）、培养瓶/离心管/培养板/冻存管（Corning）。

消化P4（P5）成纤维细胞，将P4（P5）代成纤维细胞根据不同处理方式分为三组（①成纤维细胞；②成纤维细胞+信号通路(TGF-β）激活剂；③成纤维细胞+信号通路(TGF-β）激活剂+脂肪间充质干细胞（上述实施1、2制备得到的P5代干细胞；每组设置3个重复。用CCK8检测成纤维细胞增殖率的检测，分别在0 h、24 h、48 h、72 h四个时间点检测细胞增殖情况，使用酶标仪读取450 nm处吸光度值。用RT-PCR法检测纤维化指标的基因水平。

2、实验结果

（1）人ADSCs体外对HDFs细胞增殖的影响

人ADSCs和HDFs共培养72 h后，在不同时间（4 h、24 h、48 h、72 h）点检测细胞增殖率，TGF-β1刺激剂可以明显促进HDFs的增殖（p＜0.05）；加入ADSCs后，显著逆转了HDFs的增殖（p＜0.01），表明ADSCs可在体外有效抑制纤维化HDFs的增殖。具体结果如图6所示（*p＜0.05，****p＜0.0001 vs HDFs；##p＜0.01，####p＜0.0001 vs HDFs+TGF-β1）。

（2）人ADSCs对HDFs体外纤维化基因表达水平的影响

人ADSCs和HDFs共培养6 h后，TGF-β1刺激剂增加了HDFs细胞中COL3、α-SMA、TGF-β1的基因表达水平，其中COL3和TGF-β1有显著性差异（p＜0.01）；加入ADSCs共培养后，HDFs细胞中COL3、α-SMA、TGF-β1表达均降低，其中COL3和TGF-β1的表达有统计学差异（p＜0.05，p＜0.0001），表明人ADSCs能够抑制TGF-β1刺激剂诱导的HDFs体外纤维化模型中相关基因的表达。具体结果如图7所示（****p＜0.0001 vs HDFs；#p＜0.05，####p＜0.0001 vs HDFs+TGF-β1）。

（3）人ADSCs对人皮肤胶原蛋白沉积的影响

对不同批次的HDFs（20220530、20220602）共培养细胞上清进行人羟脯氨酸（Hyp）含量检测，结果见图8所示，加入TGF-β1刺激剂组的HDFs细胞上清中Hyp含量有升高的趋势，说明细胞中胶原蛋白沉积增加，纤维化水平升高；加入人ADSCs共培养后，Hyp含量降低，表明人ADSCs能够抑制HDFs细胞中胶原蛋白沉积，改善其纤维化。

综上研究结果表明，人ADSCs体外对HDFs具有增殖抑制作用，并能够显著降低TGF-β1诱导的HDFs体外纤维化模型中相关指标COL1、COL3、Smad2、Smad3、α-SMA基因（p＜0.01），影响胶原蛋白的沉积，从而在体外发挥抗纤维化作用。

实施例7 有效性动物实验

1、材料

（1）实验动物

C57BL/6J小鼠，雌性，6-8周龄，18-20g，购于斯贝福（北京）生物技术有限公司。

（2）材料与仪器

分析天平（Sartorius），人脂肪间充质干细胞 (ADSCs，P5)，间充质干细胞无血清基础培养基（友康生物科技北京股份有限公司）；间充质干细胞无血清培养基添加剂3（友康生物科技北京股份有限公司），Masson 三色染色液（北京索莱宝科技有限公司）；博来霉素（MCE）。CD31(abcam); TGF-β1(abcam); Collagen III (abcam); α-SMA(abcam); HGF(abcam)，显微镜玻片扫描仪（型号：APERIO CS2，徕卡公司）。

（3）造模方法

博来霉素腰背部皮下注射诱导小鼠皮肤纤维化模型，每天给药（100μL/只，50μg/只），持续28天。

2、实验分组

（1）剂量探索组1

已通过博来霉素诱导造模的小鼠根据体重随机分成9组（组2-9），另设生理盐水模拟造模组作为空白对照（组1），每组18只小鼠。分组及具体给药方式如表1所示:

表1.剂量探索组1分组和实验方案情况

a.第1组前9只动物与后9只动物分别于给药后7/14/28天取皮肤，进行病理检查，3只/时间点； 2-10组动物于给药后7/14/28天取皮肤，进行病理检查，6只/时间点。b.第1-3组给予同等体积溶媒（100μL/只），其中第1组前9只动物单次给药，后9只动物两次给药。qw："quaque week"，每周一次。

（2）剂量探索组2

完成博来霉素诱导造模的小鼠根据体重随机分成4组（组2-5），另设生理盐水模拟造模组作为空白对照（组1），每组16只小鼠（空白对照组10只）。分组及具体给药方式如表2所示：

表2.剂量探索组2分组和实验方案情况

c.第1组动物分别于给药后14/28天取皮肤，进行病理检查，5只/时间点； 2-5组动物于给药后14/28天取皮肤，进行病理检查，8只/时间点。d.第1-2组给予同等体积溶媒（100μL/只）。

3、实验方案1-测量动物体重

每天称量小鼠体重并记录。根据小鼠体重采用随机数字分组法对造模后的小鼠进行分组，之后记录小鼠体重。皮下注射ADSCs后，每天监测各组小鼠体重，结果证实，与注射同等体积溶媒的模型小鼠相比，接受ADSCs中高剂量治疗的小鼠体重在给药14天时明显高于模型小鼠，在28天时与模型组相比未观察显著性差异。具体结果见表3:

表3.注射ADSCs前后不同组别小鼠体重变化

（注：*p<0.05 相对 Con；p<0.01 相对M）。

4、实验方案-病理切片检测

取小鼠注射局部病灶组织制作病理组织切片并进行Masson 染色，采用AperioImageScope v12.3.3.7014分析Masson染色切片，用SPSS16.0、Graphpad 8.0.1统计分析软件进行统计分析和绘图。

（1）剂量探索组1单次注射ADSCs 28天后真皮层厚度变化

如图9所示，与模型组相比，单次给药28d后，ADSCs低、中、高剂量组和静脉组胶原纤维厚度均有下降趋势，且低剂量效果最好，中剂量次之；脂肪层厚度中剂量、高剂量和尾静脉有一定程度增厚，但整体与模型组相比没有显著性差异。各剂量组均未见明显炎症细胞浸润。

（2）剂量探索组1两次注射ADSCs 28d后真皮层厚度变化

如图10所示，至ADSCs两次给药后28天，模型组的皮肤损伤出现较为明显的自愈现象，其脂肪层厚度与真皮层的纤维化程度，与对照组相比，差异不明显。与模型组相比，ADSCs低、中、高三个剂量组胶原纤维厚度均有下降趋势，脂肪层厚度均有增加，各剂量组炎症细胞浸润均不明显。

（3）剂量探索组1不同给药方案下，ADSCs对模型动物皮肤损伤的疗效分析

ADSCs经不同方案给药后，均能够降低模型小鼠真皮层胶原纤维厚度，减轻纤维化程度。其中在单次给药后，ADSCs对皮肤胶原纤维厚度改善情况最佳，而重复给药或经尾静脉给药未见疗效优势。给药剂量方面，低、中剂量的治疗效果较好，低剂量5×10⁵~1×10⁶/只最好。

（4）剂量探索组2注射ADSCs 28天后真皮层厚度变化

如图11、12所示，与模型组相比， ADSCs低、中、高剂量组胶原纤维厚度均显著性下降（p<0.01），三个剂量组之间无显著差异。注射ADSCs后，各治疗组脂肪层厚度均明显增加（p<0.05），且三个剂量组之间无显著差异。各剂量组均可见炎症细胞浸润。

（5）整体结论：

博来霉素连续28天皮下注射，成功诱导了小鼠系统性皮肤纤维化的发生，以皮肤胶原纤维增厚、脂肪层变薄且被细胞外纤维化基质取代为主要特征。剂量探索组2皮下单次注射三个不同剂量(5×10⁴, 1×10⁵, 5×10⁵/只)的ADSCs，对皮肤纤维化均有较为明显的改善作用，均可以较为显著的降低皮肤胶原纤维厚度，增加脂肪层厚度。相比于剂量探索组1，降低ADSCs注射剂量后有效减轻了系统性硬化症模型小鼠的免疫排斥反应，取得了更加明确的治疗效果。

本发明验证了皮下单次注射ADSCs，注射剂量5×10⁴~5×10⁶cells/只，每只小鼠重约20±2g，可以较为显著的改善博来霉素诱导的小鼠皮肤纤维化中皮肤损伤，减轻真皮层纤维化程度，增加脂肪层厚度。

本发明通过对制备方法进行优化，得到的人脂肪间充质干细胞对结缔组织疾病，特别是皮肤结缔组织疾病，尤其表现为对皮肤纤维化疾病有突出的疗效，如肥厚性瘢痕、瘢痕疙瘩、皮肤及肌腱的纤维和纤维组织增生相关疾病等。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.人脂肪间充质干细胞在制备治疗结缔组织疾病药物中的应用，所述人脂肪间充质干细胞分泌以下干细胞因子HGF、VEGF，各干细胞因子的分泌量均大于975pg/1×10⁶cells。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述人脂肪间充质干细胞是通过减少α-SMA、III型胶原、TGF-β1，和/或增加HGF、VEGF的分泌量来减轻皮肤纤维化程度。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述人脂肪间充质干细胞的工作细胞为P5代人脂肪间充质干细胞，P2代到P5代各代人脂肪间充质干细胞HGF分泌量大于12160.4±3568.5pg/1×10⁶cells。

4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述人脂肪间充质干细胞的工作细胞为P5代人脂肪间充质干细胞，P2代到P5代各代细胞VEGF分泌量大于4229.4±165.3pg/1×10⁶cells。

5.根据权利要求1~4任意一项所述的应用，其特征在于，所述人脂肪间充质干细胞细胞表面标志物CD73、CD90、CD105阳性表达，阳性率不低于95%；CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR阴性表达，阳性率应不高于2%；所述人脂肪间充质干细胞具有成脂细胞、成骨细胞、成软骨细胞分化的能力。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述结缔组织疾病包括免疫系统因素、炎性因素、创伤或退行性因素引起的纤维化和/或血管异常。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述结缔组织疾病包括硬皮病、硬斑病、嗜酸性筋膜炎、硬肿症、硬化性黏液水肿、肾源性系统性纤维化、慢性移植性抗宿主病、皮肌炎、硬化性苔藓、创伤性瘢痕或瘢痕疙瘩造成的皮肤纤维化和/或血管损伤。

8.一种制备人脂肪间充质干细胞的方法，其特征在于，该方法采用消化法和贴壁法制备人脂肪间充质干细胞，采用的培养基为无血清完全培养基，所述人脂肪间充质干细胞由P0传代培养至P5代为工作细胞，P2代到P5代干细胞经过干细胞因子HGF和VEGF的筛选，各代干细胞因子的分泌量均大于975pg/1×10⁶cells。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述无血清完全培养基为基础培养基是α-MEM，还添加3.8%（v/v）血小板裂解物、30ng/ml重组人表皮生长因子、10ng/ml重组人碱性成纤维细胞生长因子、10ng/ml重组人源血管内皮生长因子、20ng/ml胰岛素样生长因子和5µg/ml纤连蛋白。

10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述消化法采用的消化液为0.1%~0.5%Ⅱ型胶原酶，37℃，100~150rpm，震荡消化30~40min；传代培养过程中，细胞接种密度为8×10³~1.2×10⁴/cm²。