CN109402175B - 表达趋化因子受体ccr2b的脂肪干细胞及制备方法与应用 - Google Patents

表达趋化因子受体ccr2b的脂肪干细胞及制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了表达趋化因子受体CCR2B的脂肪干细胞及制备方法与应用，可用于治疗皮肤损伤及促进创面的愈合的新型脂肪干细胞的制备方法及用途。具体涉及脂肪间充质干细胞的提取与鉴定、外源基因CCR2B的导入及评估其对皮肤损伤的治疗作用。在众多类型干细胞中，来源于中胚层的脂肪间充质干细胞具有多方向分化潜能，因获取途径广泛，获取代价小，不涉及伦理问题等优势，成为干细胞治疗优选；同时还可以携带并有效表达外源基因CCR2B，显著增强其向皮肤损伤区域的迁移能力，使治疗效果显著提高，为修复皮肤损伤提供了一种全新的脂肪干细胞制剂。

Description

表达趋化因子受体CCR2B的脂肪干细胞及制备方法与应用
技术领域
本发明涉及对皮肤损伤修复有治疗作用的脂肪干细胞，具体是涉及一种表达趋化因子受体 CCR2B的脂肪干细胞及制备方法与应用。
背景技术
皮肤是人体最大的组织和器官，对于保护机体至关重要，各种因素造成的皮肤损伤难以愈合、愈合速度慢或创伤后疤痕，给患者带来了无尽痛苦。随着干细胞技术的发展，应用干细胞移植对于皮肤损伤进行修复受到越来越多的关注，在众多类型干细胞中，来源于中胚层的脂肪间充质干细胞(adipose-derived stem cells, ADSCs) 具有多方向分化潜能，因获取途径广泛，获取代价小，不涉及伦理问题等优势，成为干细胞治疗优选。越来越多的临床前和临床研究证明了脂肪干细胞移植对于皮肤损伤修复的治疗效果，相关研究发现，大多数情况下，移植的ADSCs在体内往往是短暂的存在的，对于损伤发生部位的靶向性较差，单纯地移植干细胞促进皮肤创伤愈合的目标已不能满足现阶段人们对高质量皮肤创伤修复的新需求，如何提高干细胞治疗的效率成为亟待解决的问题。
发明内容
为了克服上述技术问题，本发明提供了一种制备过表达CCR2B的脂肪干细胞的简捷而有效的方法，制备的脂肪干细胞为皮肤损伤患者提供了一种全新的治疗方法，也为其它多种皮肤疾病的治疗带来了新的希望。
本发明采用如下技术方案：
表达趋化因子受体CCR2B的脂肪干细胞的制备方法，将表达趋化因子受体CCR2B的基因转至脂肪干细胞，得到表达趋化因子受体CCR2B的脂肪干细胞。
上述技术方案中，所述脂肪干细胞源自新鲜的脂肪标本；先构建表达趋化因子受体CCR2B的基因的慢病毒质粒，然后包装病毒，再感染脂肪干细胞。
上述技术方案中，将表达趋化因子受体CCR2B的基因的慢病毒质粒、脂质体混和物加入293T细胞中，培养箱培养12小时后全量换液，继续培养后收集病毒上清，加入聚凝胺后感染脂肪干细胞，得到表达趋化因子受体CCR2B的脂肪干细胞。
上述技术方案中，脂质体混和物包括无血清Opti-MEM培养基稀释的Rev、VSVG、pMDL以及无血清Opti-MEM培养基稀释的脂质体2000；将表达趋化因子受体CCR2B的基因的慢病毒质粒、脂质体混和物孵育5 min后混匀继续孵育25 min，再加入293T细胞中；12小时后以含10% FBS的DMEM培养基全量换液；然后分别于36小时、72小时收集病毒上清；在终浓度为8μg/ml的聚凝胺存在下，先用于36小时收集的病毒上清感染脂肪干细胞，1～2小时后换于72小时收集的病毒上清，培养68～75小时得到表达趋化因子受体CCR2B的脂肪干细胞。其中表达趋化因子受体CCR2B的基因的慢病毒质粒、Rev、VSVG、pMDL、脂质体2000的用量比例为10μg∶2μg∶3μg∶5μg∶60μl。
本发明还公开了根据上述表达趋化因子受体CCR2B的脂肪干细胞的制备方法制备的表达趋化因子受体CCR2B的脂肪干细胞。
本发明还公开了上述表达趋化因子受体CCR2B的基因的慢病毒质粒在制备表达趋化因子受体CCR2B的脂肪干细胞中的应用。
本发明还公开了上述表达趋化因子受体CCR2B的脂肪干细胞在制备皮肤损伤修复药物中的应用。
本发明还公开了一种皮肤损伤修复药物的制备方法，将表达趋化因子受体CCR2B的基因转到脂肪干细胞，得到表达趋化因子受体CCR2B的脂肪干细胞；将表达趋化因子受体CCR2B的脂肪干细胞与药物载体混合，得到皮肤损伤修复药物。
上述技术方案中，所述脂肪干细胞源自新鲜的脂肪标本；先构建表达趋化因子受体CCR2B的基因的慢病毒质粒，然后包装病毒，再通过慢病毒感染脂肪干细胞；药物载体为常规组分，比如分散介质、生理盐水等。
上述技术方案中，将表达趋化因子受体CCR2B的基因的慢病毒质粒、脂质体混和物加入293T细胞中，培养箱培养后全量换液，继续培养后收集病毒上清，加入聚凝胺后感染脂肪干细胞，换液培养，得到表达趋化因子受体CCR2B的脂肪干细胞。
上述技术方案中，脂质体混和物包括无血清Opti-MEM培养基稀释的Rev、VSVG、pMDL以及无血清Opti-MEM培养基稀释的脂质体2000；将表达趋化因子受体CCR2B的基因的慢病毒质粒、脂质体混和物孵育5 min后混匀继续孵育25 min，再加入293T细胞中；12小时后以含10% FBS的DMEM培养基全量换液；然后分别于36小时、72小时收集病毒上清；在终浓度为8μg/ml的聚凝胺存在下，先用于36小时收集的病毒上清感染脂肪干细胞，1～2小时后换于72小时收集的病毒上清，培养68～75小时得到表达趋化因子受体CCR2B的脂肪干细胞，优选1.5小时后换于72小时收集的病毒上清，培养72小时。其中表达趋化因子受体CCR2B的基因的慢病毒质粒、Rev、VSVG、pMDL、脂质体2000的用量比例为10μg∶2μg∶3μg∶5μg∶60μl，实验证实，此比例下皮肤修复效果最好，第9天达到93%，更改比例修复率下降。
本发明还公开了根据上述皮肤损伤修复药物的制备方法制备的皮肤损伤修复药物。
本发明中，脂肪间充质干细胞从人体脂肪提取而来，转染了表达CCR2B基因的逆转录病毒质粒，用于治疗皮肤损伤；所述的脂肪干细胞来源于人体脂肪，其特异性表达ADSCs表面抗原如CD44(95%), CD73(99.5%)和CD105(98%) ，不表达CD31；所述表达CCR2B基因慢病毒质粒为携带表达CCR2B、由CMV启动的慢病毒质粒，作为基因治疗的良好载体，携带并有效表达外源基因 CCR2B。
本发明所述表达趋化因子受体 CCR2的脂肪干细胞的制备方法以及效果研究可以包括下列步骤:
步骤一、脂肪干细胞的提取与鉴定
获得新鲜的脂肪标本，用酶消化法提取原代脂肪干细胞，经流式细胞检测，免疫组化及成脂、成骨、成软骨分化实验，鉴定为脂肪干细胞且其有多向分化潜能；
步骤二、构建 CCR2B表达的质粒、转至脂肪干细胞及 CCR2B表达的检测；CCR2B基因的慢病毒质粒由 CMV启动子驱动；以 293T细胞包装病毒；用病毒上清感染ADSCs，对照组只表达 EGFP；检测CCR2B的表达，证实被转染的ADSCs可有效表达 CCR2B和EGFP。
步骤三、制作创伤模型及注射细胞后创面的观察
将30只小鼠常规饲养7d后，腹腔注射水合氯醛400mg/kg麻醉，剃去背部毛，在脊背两侧分别制备一个0.8cm×0.8cm创面，深至皮下。随机将小鼠分为对照组、EGFP组和CCR2组。造模隔天在小鼠背部伤口外取四个点，每个点皮下注射细胞106个，对照组注射等体积PBS。进行上述实验后小鼠分笼饲养，每天观察进食情况、创面变化及愈合情况，计算创面愈合率，并造模后第九天分别切取各组移植区的全层皮肤1cm×1cm制作组织石蜡切片，对创伤愈合情况进行检查。
在皮肤损伤修复炎性反应阶段，本发明表达趋化因子受体CCR2B的脂肪干细胞能够迁移至感染和炎症部位，参与损伤修复（如调控白细胞粘附、外移、归巢），广泛参与细胞的招募和介导，解决了现有ADSCs迁移率差的问题。
因此，本发明通过慢病毒过表达技术构建能过表达CCR2的HADSCs，体外对改造细胞基本生长特征和趋向性变化进行观察研究，体内构建小鼠背部机械损伤创口，进行皮下细胞移植以观察其对提高创面愈合效率的作用，为创伤修复的基础研究和临床应用提供参考。
附图说明
图1是倒置显微镜下观察ADSCs梭形细胞样(x10)图；
图2是细胞流式技术检测ADSCs表面抗原，CD44和CD31（A） CD73和CD105（B）图；
图3是ADSCs成脂（A）、成骨（B）和成软骨（C）体外诱导分化（×100）图；
图4是ADSCs感染72小时后镜下观察荧光（×10）图；
图5是过表达CCR2后ADSCs的增殖检测；
图6是过表达CCR2后ADSCs的凋亡（A,B）和细胞周期流式检测(C,D)图，其中A&C:EGFP-hADSCs组，B&D: CCR2-EGFP-hADSCs组；
图7是细胞划痕实验结果照片（A）细胞划痕实验结果迁移率（B）；
图8是ADSCs移植对小鼠皮肤创伤愈合的作用；
图9是皮肤组织HE染色结果（200×）图。
具体实施方式
实施例一
一种表达趋化因子受体 CCR2B 的脂肪干细胞的制备方法，包括如下步骤：
步骤一：脂肪干细胞的提取与鉴定
新鲜的脂肪标本（人体脂肪）用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗三次，于无菌操作台上用无菌剪刀剪碎，加入等体积0.2%胶原酶I，置于37℃的水浴锅中消化1.5个小时。加入等体积的培养基终止消化，1500转离心5分钟。去除上清，用含10%胎牛血清(FBS)的DMEM/F12培养基将细胞重悬，按细胞密度106个/ml进行接种，记为P0代，然后培养于37℃，5 % CO2的培养箱中，隔天换液。当原代细胞生长至90%时，进行传代培养，去除培养皿中的上清液，加入PBS连续漂洗2遍；加入胰蛋白酶(0.05%胰蛋白酶/0.5 mM EDTA)，置于37℃，5 % CO2培养箱里消化5分钟。贴壁细胞悬浮后转入15毫升离心管中，1200r离心5分钟,去除上清液，完全培养基重悬沉淀，以1:3的比例接种在新的培养皿中，记为P1代。取培养到2～5代的ADSCs进行后续实验，其结果见图1。
细胞传至第三代，首先消化，将细胞吹打成单细胞。按照抗体使用说明书用PBS稀释抗体，注意避光。将稀释好的抗体加入到细胞中，轻轻吹打均匀成单细胞悬液，冰上避光孵育30分钟。孵育完成后，以1200转/分钟低温离心10分钟。去掉上清，用PBS洗3遍后重悬，过流式细胞仪检测，其结果见图2。
预先接种三组细胞（104 个/cm2）到明胶包被的6孔板中，37℃，5% CO2培养箱中培养。待细胞增殖达80%时，成脂诱导组每孔更换0.5ml成脂分化培养基；成骨诱导组每孔更换0.5ml成骨分化培养基；成软骨诱导组每孔换成0.2ml成软骨分化培养基。培养14～21天，每3天换液。诱导结束之后，吸去培养基，用PBS洗 3遍。向每孔中加入0.5 ml的4%多聚甲醛固定30分钟后用PBS洗3遍。成脂诱导组每孔中加入 0.3 ml油红O染液染色30分钟；成骨诱导组每孔中加入 0.3 ml茜素红S染色液染色10分钟；成软骨诱导组每孔中加入 0.1 ml阿利新蓝染色液染色30分钟。PBS洗2遍，然后置于倒置显微镜下观察拍照。其结果见图3。
步骤二、构建 CCR2B和 EGFP共表达的质粒、转染脂肪干细胞及 CCR2B表达的检测
（1）复苏293T细胞增殖达85%时，将转移质粒(过表达组LV-mCCR2-IRES-ZsGreen1，10μg；空载组LV-IRES-ZsGreen1，10μg )、Rev2μg、VSVG3μg、pMDL 5μg以1.5 ml无血清Opti-MEM培养基稀释、60μl脂质体2000以1.5 ml无血清Opti-MEM培养基稀释共孵育5 min后，然后重新混匀继续孵育25 min；将孵育后的质粒、脂质体混和物加入293T细胞，培养箱培养12小时后以含10% FBS的DMEM全量换液，继续培养24h后观察293T细胞中EGFP荧光的表达情况，然后分别于36小时、72小时收集病毒上清；在终浓度为8μg/ml的聚凝胺存在下，先用于36小时收集的病毒上清感染脂肪干细胞（第三代），1.5小时后换于72小时收集的病毒上清，培养72小时得到表达趋化因子受体CCR2B的脂肪干细胞，荧光显微镜观察，其结果如图4。Rev、VSVG、pMDL、脂质体2000都为现有产品。
（2）接种表达趋化因子受体CCR2B的脂肪干细胞悬液100微升于96孔板，预先置于37℃，5%CO2饱和湿度的培养箱内培养；取不同培养时间点，在每孔内加入10微升的CCK-8试剂，然后把培养板放到培养箱内2个小时，最后在450nm波长处测定吸光值，其结果如图5，横坐标表示培养时间。
（3）接种表达趋化因子受体CCR2B的脂肪干细胞于10cm的皿中，预先置于37℃，5%CO2饱和湿度的培养箱内培养48小时，用不含EDTA的胰酶消化细胞，胰酶消化时间不宜过长或过短，最好是在轻轻吹打可以使贴壁细胞吹打下来时，吸除胰酶消化液，加入细胞培养液，将细胞轻轻吹打下来，转移到离心管内，500g离心5min收集细胞。然后收集细胞后，加入PBS溶液轻摇或用移液器轻柔吹打洗涤，细胞计数。收集细胞5×105，500g离心5分钟，弃上清，加入195μl Binding Buffer工作液轻柔吹打重悬细胞。加入5μl Annexin V-FITC，轻轻混匀，室温避光孵育10min。最后加入10μl PI（20μg/ml，轻轻混匀，室温避光孵育5min，用流式细胞仪检测细胞周期变化，其结果如图6。
（4）在细胞长满培养板时，采用移液器枪头尖头在单层细胞上划出一道均匀的空白区域，拍照记为0 h 图像，PBS反复冲洗去除残留的培养基和漂起的细胞，加入含有炎症因子培养基后，在6、12小时定时拍照，并对图像划痕边缘标注，其结果如图7。
实施例二
制作创伤模型及注射细胞后创面的观察
（1） 将30只小鼠常规饲养7d后，腹腔注射水合氯醛400mg/kg麻醉，剃去背部毛，在脊背两侧分别制备一个0.8cmx0.8cm创面，深至皮下。随机将小鼠均分为PBS组（注射PBS）、EGFP组（注射EGFP-hADSCs）和CCR2组（注射CCR2-EGFP-hADSCs，表达趋化因子受体CCR2B的脂肪干细胞），其结果如图8。
（2）造模隔天在小鼠背部伤口外取四个点，每个点皮下注射细胞106个，对照组注射等体积PBS。进行上述实验后小鼠分笼饲养，每天观察进食情况、创面变化及愈合情况，计算创面愈合率，并造模后第九天分别切取各组移植区的全层皮肤1cm×1cm制作组织石蜡切片，对创伤愈合情况进行检查，其结果如图9。
图1可以看出健康成人腹部抽脂手术脂肪，经分离消化得到的原代细胞的接种到培养皿中，贴壁后细胞体细长，以涡旋式的方式扩增，传至3-4代时细胞形态均一，呈梭形的成纤维细胞样。
图2可以看出细胞传至第三代，流式分析结果表明细胞高表达ADSCs表面抗原如CD44(95%), CD73(99.5%)和CD105(98%)，基本不表达CD31。
图3可以看出ADSCs成脂肪诱导14天镜下细胞可见明显脂滴，经油红O染色脂滴呈红色(图3A)；成骨诱导21天发现明显的矿物质沉积，茜素红S染色液可见深红色矿化结节(图3B)；成软骨诱导14天经艾茜蓝染色可见呈蓝色的软骨细胞(图3C)。
图4可以看出慢病毒转染ADSCs后，于48h时在荧光显微镜下EGFP-hADSCs 组（LV-IRES-ZsGreen1）(图4A)和CCR2-EGFP-hADSCs组（LV-mCCR2-IRES-ZsGreen1）(图4B)均可观察到EGFP表达，至72h时，荧光表达较强，转导效率可达70%(图4A、图4B)。
图5可以看出过表达CCR2B后对ADSCs的增殖存在影响，采用CCK8法评价HADSCs增殖。结果显示，过表达CCR2B后，ADSCs增殖较对照组有所增加，但两者无统计学差异(P>0.05，图5)。
图6可以看出过表达CCR2B后对ADSCs的凋亡和细胞周期存在影响，采用流式检测细胞凋亡和细胞周期。与增殖实验结果相似，感染后CCR2-EGFP-hADSCs组(图6B)凋亡较EGFP-hADSCs对照组(图6A)有所减少，但两者无统计学差异(P> 0.05)。细胞周期检测结果显示过表达CCR2的hADSCs组的“S+G2期”为23.2% (图6D)， EGFP-hADSCs对照组为24.5%(图6C)，两者无统计学差异(P>0.05)。
图7通过划痕实验验证CCR2-EGFP-ADSCs迁移能力。在细胞长满培养板时，采用移液器枪头尖头在单层细胞上划出一道均匀的空白区域，拍照记为0 h 图像，PBS反复冲洗去除残留的培养基和漂起的细胞，加入含有炎症因子培养基后，在6、12小时定时拍照，并对图像划痕边缘标注，观察到CCR2-EGFP-ADSCs组向损伤区域迁移的细胞明显多于EGFP-ADSCs组（图7A），对细胞迁移率的统计也印证了这一结果（图7B）。
图8可以看出皮肤创伤造模及细胞移植后各组小鼠均存活、体征均正常。造模后每天丈量并记录创面愈合情况，可见CCR2-EGFP-ADSCs组伤口愈合相较于另外两明显变快（图8A），其创面愈合率为第5天 69% 和第9天 93%；EGFP-ADSCs治疗组为第5天 60% 和第9天84% ；注射PBS的对照组为第5天 56% 和第9天 76% （图8B）。结果显示注射了ADSC的两组愈合速度显著好于PBS对照组(P<0.05)。CCR2-EGFP-ADSCs组愈合速度显著好于EGFP-ADSCs治疗组(P<0.05)（图8B）。现有技术中，用于皮肤损伤修复的细胞制剂在第9天创面愈合为83%；如果采用表皮干细胞或者骨髓干细胞，第9天创面愈合分别86%、81%，转染48小时、80小时，第9天创面愈合分别88%、91%。
图9可以看出术后第九天，愈合创面皮肤组织切片可见 EGFP-CCR2-ADSCs 组（图9D），EGFP-ADSCs 组（图9C）和 PBS 组（图9B）相对于正常皮肤组织（图9A），新增上皮生长活跃，有增生的血管腔，大小不一，真皮层厚度均有增加，但在3组之间厚度无显著性差异 (P＞0.05)。EGFP-CCR2-ADSCs 组和 EGFP-ADSCs 组相较于 PBS 组，皮肤真皮层中存在较明显的类似于正常皮肤的毛囊结构，且EGFP-CCR2-ADSCs组较EGFP-ADSCs组更密集，可见多个椭圆形尚未成熟的毛囊结构（图9D）。

Claims (5)

1.表达趋化因子受体CCR2B的脂肪干细胞的制备方法，其特征在于：将表达趋化因子受体CCR2B的基因转至脂肪干细胞，得到表达趋化因子受体CCR2B的脂肪干细胞；将表达趋化因子受体CCR2B的基因的慢病毒质粒、脂质体混和物加入293T细胞中，培养箱培养后全量换液，继续培养后收集病毒上清，加入聚凝胺后感染脂肪干细胞，培养得到表达趋化因子受体CCR2B的脂肪干细胞；脂质体混和物包括无血清Opti-MEM培养基稀释的Rev、VSVG、pMDL以及无血清Opti-MEM培养基稀释的脂质体2000；将表达趋化因子受体CCR2B的基因的慢病毒质粒、脂质体混和物孵育5 min后混匀继续孵育25 min，再加入293T细胞中；12小时后以含10%FBS的DMEM培养基全量换液；然后分别于36小时、72小时收集病毒上清；在终浓度为8μg/ml的聚凝胺存在下，先用于36小时收集的病毒上清感染脂肪干细胞，1～2小时后换于72小时收集的病毒上清，培养68～75小时得到表达趋化因子受体CCR2B的脂肪干细胞。
2.根据权利要求1所述表达趋化因子受体CCR2B的脂肪干细胞的制备方法制备的表达趋化因子受体CCR2B的脂肪干细胞。
3.权利要求2所述表达趋化因子受体CCR2B的脂肪干细胞在制备皮肤损伤修复药物中的应用。
4.一种皮肤损伤修复药物的制备方法，其特征在于：将表达趋化因子受体CCR2B的基因的慢病毒质粒、脂质体混和物加入293T细胞中，培养箱培养后全量换液，继续培养后收集病毒上清，加入聚凝胺后感染脂肪干细胞，培养得到表达趋化因子受体CCR2B的脂肪干细胞；脂质体混和物包括无血清Opti-MEM培养基稀释的Rev、VSVG、pMDL以及无血清Opti-MEM培养基稀释的脂质体2000；将表达趋化因子受体CCR2B的基因的慢病毒质粒、脂质体混和物孵育5 min后混匀继续孵育25 min，再加入293T细胞中；12小时后以含10% FBS的DMEM培养基全量换液；然后分别于36小时、72小时收集病毒上清；在终浓度为8μg/ml的聚凝胺存在下，先用于36小时收集的病毒上清感染脂肪干细胞，1～2小时后换于72小时收集的病毒上清，培养68～75小时得到表达趋化因子受体CCR2B的脂肪干细胞；将表达趋化因子受体CCR2B的脂肪干细胞与药物载体混合，得到皮肤损伤修复药物。
5.根据权利要求4所述皮肤损伤修复药物的制备方法制备的皮肤损伤修复药物。
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Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Absence of CC chemokine receptors 2a and 2b from human adipose lineage cells;Koenig,C等;《MOLECULAR AND CELLULAR ENDOCRINOLOGY》;20130430;第369卷(第1-2期);第72-85页 *
Homo sapiens C-C motif chemokine receptor 2 (CCR2), transcript variant B, mRNA;Zhuang H等;《NCBI GenBank》;20180812;第3-5页 *
Mesenchymal Stem Cells (MSCs) Attenuate Cutaneous Sclerodermatous Graft-Versus-Host Disease (Scl-GVHD) through Inhibition of Immune Cell Infiltration in a Mouse Model;Lim, JY等;《JOURNAL OF INVESTIGATIVE DERMATOLOGY》;20170930;第137卷(第9期);第1895-1904页 *
趋化因子与受体在血管形成中的作用;刘旸暘等;《标记免疫分析与临床》;20060630;第13卷(第2期);第104-105页 *
过表达CCR7的脂肪间充质干细胞对大鼠异体复合组织移植早期免疫调节作用的研究;马恬;《中国博士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》;20180215;第14-20页和第75-76页 *
过表达CC趋化因子受体7的C3H10 T1/2细胞具有更强的免疫抑制效应;张颖杰等;《细胞与分子免疫学杂志》;20150718;第31卷(第7期);第873-878页 *
过表达趋化因子受体2促进脂肪间充质干细胞对皮肤损伤的修复;祁旻龙等;《同济大学学报(医学版)》;20181015;第39卷(第5期);第23-27页 *

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