CN114246883A

CN114246883A - 一种药物组合物及其治疗剂和应用

Info

Publication number: CN114246883A
Application number: CN202011005898.3A
Authority: CN
Inventors: 叶伟亮; 杨跃梅; 李立杰
Original assignee: Beijing Weige Stem Cell Technology Co ltd
Current assignee: Beijing Weige Stem Cell Technology Co ltd
Priority date: 2020-09-23
Filing date: 2020-09-23
Publication date: 2022-03-29
Also published as: WO2022063027A1

Abstract

本发明公开了一种药物组合物所述药物组合物包括组分A和组分B，所述组分A为脂肪干细胞群，所述组分B为颗粒脂肪，所述脂肪干细胞群中细胞密度为1×10⁵至1×10⁸/mL；所述组分A和组分B的体积比为1:10‑30。本发明还提供了一种治疗硬皮病的治疗剂及其应用。本发明提供的药物组合物安全有效，成本低，排异反应效果好，含有本发明药物组合物的治疗剂在改善LoS患者面部萎缩的移植物保留方面是有效、安全且优于简单脂肪移植或SVF辅助脂肪移植的。另外本发明提供的治疗剂可以在不显著改变血流灌注的情况下更有效地提高脂肪存活率。

Description

一种药物组合物及其治疗剂和应用

技术领域

本发明涉及生物制药技术领域，具体涉及一种药物组合物及其治疗剂和应用。

背景技术

硬皮病是慢性疾病，主要症状是胶原在皮肤或其它器官中的过度沉淀。硬皮病可以是局部的或全身的。硬皮病的局部形式是致残的，但不趋向致死。硬皮病的全身形式表现为弥漫性硬皮病或系统性硬化，由于心、肾、肺或肠的破坏，导致该疾病可以是致死的。硬皮病的三种类型是弥漫性硬皮病Diffuse cutaneous systemic scleroderma、局限性硬皮病limited cutaneous systemic sclerosis(通常称CREST综合征也是全身性的)，和局灶性硬皮病 Localized scleroderma，即硬斑/线形硬皮病(其局限于皮肤)。弥漫性硬皮病是最严重的形式，受害者发病迅速、皮肤广泛硬化、内脏(特别是肺和胃肠道) 损害严重。

硬皮病的局限性形式比较温和，发病和发展缓慢。局限性硬皮病的皮肤硬化通常限于手和面部，相比弥漫性硬皮病，其对内脏器官的损害较不严重。通常，雷诺现象(Reynaud′s phenomenon)可以经过数年发展成为硬皮病。雷诺现象的原因是在寒冷中，裸露体表的小动脉血管收缩，特别是在手和足，典型表现为是三相变色：首先白色，然后是蓝色和最后回暖后的红色。局限性硬皮病形式常被称为CREST综合征，其中“CREST”是五种主要特征的首字母缩写：钙化(calcinosis，软组织的钙沉淀，例如皮肤)、雷诺氏综合征(Raynaud’s syndrome)、食道运动障碍(esophageal dysmotility)、指端硬化(sclerodactyly，手指的硬皮病)，和毛细管扩张(telangiectasia，蛛网静脉)。

硬皮病的发展与存在自身抗体相关，特别是抗着丝粒和抗scl70/抗拓扑异构酶抗体。多达90％的患者都有可检测到的抗核抗体。抗着丝粒抗体在局限性硬皮病(80-90％)中比在全身性硬皮病(10％)中更常见，而抗scl70则在弥漫性硬皮病(30-40％)和非洲-美洲患者中更常见。

硬皮病的早期治疗主要针对免疫、血管及胶原的异常，以抗炎、免疫抑制、免疫调节、改善血循环和减少纤维化为基础。后期遗留皮肤硬化、皮下脂肪萎缩、局部凹陷等畸形，常常需要整形科治疗。

局灶性硬皮病(LoS)主要表现为皮肤和皮下组织的面部萎缩和色素沉着过度，这是一种罕见的自身免疫性结缔组织疾病，其主要症状是皮肤和皮下脂肪的炎症和纤维化，有时具有较深的组织(筋膜，肌肉，有时甚至骨头) 在患处，严重影响患者的生活质量和心理健康。有文献报道凭借轻度侵袭，快速恢复和自然外观的优势，脂肪移植已取代微血管游离皮瓣转移方法，成为改善LoS面部萎缩的主要手术治疗方法。由于局部炎症微环境，以及皮质类固醇激素诱导的脂肪组织中脂肪来源的干细胞减少，LoS患者的脂肪移植物保留量很小，使患者经历了多轮脂肪移植以维持相对令人满意的外观效果并负担财务和精神压力。一些研究表明，在健康人群中，血管基质成分 (SVF)辅助脂肪移植可以使脂肪移植的存活率提高约35％，但尚未有报道证明LoS患者的脂肪移植存活率有类似的增长。

发明内容

为了有效解决硬皮病带给患者的心理和生理上的痛苦，本发明的一方面提供一种药物组合物。

本发明的还一方面提供了一种治疗硬皮病的治疗剂。

本发明另一方面提供了所述治疗剂的应用。

为实现上述目的，本发明首先提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括组分A和组分B，所述组分A为脂肪来源干细胞组成的脂肪干细胞群，所述组分B为颗粒脂肪，所述脂肪干细胞群中细胞密度为1×10⁵至1×10⁸/ mL；所述组分A和组分B的体积比为1:10-30。

所述脂肪干细胞是指从脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的间充质干细胞，也属于成体干细胞中的一种。相比于胎盘干细胞或脐带血干细胞，脂肪干细胞存在以下优点：

(1)伦理和法规要求相对宽泛；

(2)成体干细胞基本上是自体应用(骨髓造血干细胞例外)，费用和免疫原性可以降至最低。

(3)从移植的部位、成本、干细胞数目等等因素考虑，相对于其他成体干细胞，脂肪间充质干细胞有如下优点：量大，皮下分布，采集容易，采集部位副作用小。

(4)硬皮病本身是皮肤病，皮肤主要表现是皮下脂肪萎缩、局部凹陷，脂肪干细胞本就在皮下脂肪中，脂肪干细胞本身的存活和生长需要特定的环境，用脂肪干细胞治疗硬皮病是分化为脂肪最直接的途径，回输皮下脂肪中对脂肪干细胞本身也应该是最有利的，能发挥其最大作。

(5)从干细胞自身功能上讲，脂肪干细胞(Adipose derived stem cells ADSCs)能够明显提高脂肪存活率，改善局部组织的血供，具有免疫调节作用，同时脂肪干细胞能显著降低TGF-β的表达、CollagenⅠ表达，抑制成纤维细胞增生，干细胞的这些特点刚好能弥补自体脂肪移植治疗局限性硬皮病患者面部凹陷畸形的不足。

在一优选实施例中，所述的脂肪干细胞免疫表型为CD29、CD44、CD105 及FIK-1呈阳性，CD34、HLA-DR呈阴性。

在一优选实施例中，所述脂肪干细胞群为来自单个个体或者多个个体的脂肪干细胞，所述颗粒脂肪为自体脂肪颗粒。

本发明所述脂肪干细胞和干细胞群包括从皮下任意部位，如腹部、四肢等，直接获得的干细胞和含有干细胞的细胞群，还包括培养中的干细胞群。

优选的，所述脂肪干细胞群为来自单个个体的脂肪干细胞，尤其考虑自体脂肪干细胞。

进一步地，本发明还提供了一种治疗硬皮病的治疗剂，所述治疗剂包括上述药物组合物。

在一优选实施例中，所述治疗剂还包括一种或多种有利于植入的化合物。如抗T细胞抗体、免疫抑制剂、葡萄糖等稳定剂。

优选的，所述治疗剂的剂型为注射剂。

在应用中，本发明的治疗剂优先使用所述硬皮病为晚期局限性硬皮病的皮肤萎缩或凹陷，或局灶性硬皮病患者的皮肤萎缩或凹陷。

其中，所述局限性硬皮病的症状为以下症状中的一种或几种：肢体远端，即肘和膝，和面部皮肤对称性增厚；血管部分伴有雷诺现象，雷诺现象出现在皮肤改变前数年；内脏受累，主要包括胃肠受累，肺动脉高压；抗着丝点抗体、抗Th/To抗体。

其中，所述局灶性硬皮病仅局限于皮肤及皮下组织，活检显示真皮纤维化类似于系统性硬化症增厚皮肤的组织病理学改变；不会出现雷诺氏现象、手指缺血性及累及脏器受累情况。

本发明所述治疗剂可以在不显着改变血流灌注的情况下更有效地提高脂肪存活率。

进一步地，本发明还提供了所述药物组合物的制备方法，包括如下步骤：

(1)组分A的制备，包括收集脂肪，然后用胶原酶I消化、离心，收集底部细胞并用无菌盐水配制基质血管成分SVF溶液，对SVF细胞培养两周，并贴壁培养分离间充质干细胞，进一步传代培养富集即得脂肪干细胞群；

(2)组分B的制备；

(3)组分A和组分B冻存保存，使用时按照比例混合。

有益效果

本发明提供的药物组合物安全有效，成本低，排异反应效果好，含有本发明药物组合物的治疗剂在改善LoS患者面部萎缩的移植物保留方面是有效、安全且优于简单脂肪移植或SVF辅助脂肪移植的。另外本发明提供的治疗剂可以在不显著改变血流灌注的情况下更有效地提高脂肪存活率。

附图说明

图1比色分析结果示意图，显示了与三组术前图像相比，从术后到随访的相对距离下降的趋势。

图2脂肪移植物体积变化显示在冠状平面TI序列上显示图。(a，术前； b，术后；c，三个月后；d，六个月后)

图3 MRI体积分析的结果示意图，显示了三组之间的脂肪存活率差异。(a，三个月后；b，六个月后；c，平均脂肪存活率的变化趋势)

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

本发明所用到的试剂如下：

脂肪保存液：为含有肝素的无菌TC199，每100ml保存液含肝素4000 单位、庆大霉素2000单位，1ml保存液可抗凝3至10ml脂肪组织。

细胞完全培养液：DMEM/F12培养基购于GIBICO公司， MCDB(MCDB201mediumcomplete with trace element)购于Sigma公司，含2％胎牛血清、1xA液及1xB液。

胶原酶消化液：0.2％胶原酶，经0.22μm滤器过滤除菌后分装，置-20℃保存。

细胞冻存液：含20％DMSO、20％胎牛血清、60％DF12培养液。

干细胞保存液：TC199，为含2％人血白蛋白及复方氨基酸的生理盐水。

实施例1样本的采集

本研究选取硬皮病引起的面部凹陷畸形患者22例(女性：15人；男性： 7人)，8例患者接受ADSCs辅助脂肪移植(实验组)、7例血管基质成分 (SVF)辅助脂肪移植(标准对照组)和7例单纯脂肪移植组(空白对照组)。该研究遵循赫尔辛基指南的声明，该声明已获得机构伦理委员会 (JMLL20180902)的批准，并在中国临床试验注册中心 (ChiCTR1900025717)注册。

样本的纳入标准：

(1)皮肤科确诊的局限性硬皮病患者；

(2)局限性硬皮病处于稳定期；

(3)局限性硬皮病导致面部凹陷畸形；

(4)年纪18-50岁；

(5)受试者或法定代表知情同意，志愿受试，签署知情同意书。

样本的排除标准：

(1)正在接受激素、抗纤维化及抗瘢痕药物治疗的患者；

(2)不稳定期或进展期的局限性硬皮病患者；

(3)妊娠、准备妊娠或哺乳期受试者；

(4)正在参加其他临床试验或者3个月内参加过其他临床试验；

(5)患有心脑血管等其他基础疾病；

(6)患者或法定代表拒绝参与此项研究，或患者因精神、认知、语言等各种原因不能配合完成试验相关内容。

在研究前已从每个受试者获得知情同意。本实施例所指局限性硬皮病优指局灶性硬皮病。

实施例2颗粒脂肪的采集

脂肪组织来源于健康志愿者，在采集前详细记录供体的年龄、性别，常规体检了解其健康状况，要求其HBV，HCV，HIV及梅毒血清学检测应均为阴性。采集当日清晨禁食、水，进手术室前检查生化全项及血常规。

吸脂区一般位于腹部，肿胀液麻醉，肿胀液配方：1000mL生理盐水+2％利多卡因30mL+1：1000肾上腺素1mL+5％碳酸氢钠10mL。采用20mL 注射器连接小口径锐性抽吸针(直径mm)，进入皮下后回抽，形成负压，车辐状或扇形往复抽吸。抽吸完毕后，将注射器静止倒置30min。排出下层的肿胀液，将脂肪颗粒移至T75培养瓶。

暂时不用的脂肪颗粒可以放在脂肪保存液中保存。

实施例3脂肪来源干细胞的分离和培养

1、体细胞的分离

(1)加等体积的生理盐水洗脂肪三次：上层脂肪转移到50ml无菌离心管内，每管约20ml，用盐水补充到40ml每管，水平离心机室温下离心，500 转/分钟，5分钟。

(2)每管加入胶原酶消化液10ml，用盐水补充到35ml每管，37℃振荡消化15～35分钟，直到脂肪消化为均匀浑浊液，不可见明显块状物体存在。

(3)用100μm的滤网过滤至50ml无菌离心管内，生理盐水冲洗原离心管及滤网。用DPBS或生理盐水补足过滤后液体至40ml每管，水平离心机室温下离心，1500转/分钟，10分钟。

(4)用培养基将细胞悬浮，用台盼蓝染色方法计数活细胞，具体步骤如下：①吸取20微升细胞悬液，再吸取20微升的白细胞稀释液与之混合；②将细胞计数板与盖片放到显微镜下，用移液器吸取上面的细胞悬液从盖片与细胞计数板之间加入细胞计数板。计数四个大格中的细胞数量n；③按下面的公式计算细胞总数：Total cell number＝(n/4)×2×10000×细胞总体积，所得数值即为细胞总数，根据其用细胞完全培养液调整细胞浓度至约1x10⁶个/毫升。

2、原始间充质干细胞的分离培养

(1)将细胞以约1x10⁶个/ml的密度接种于一次性细胞培养瓶中，置于37℃，5％CO₂孵箱中培养。

(2)培养24小时后，有少量细胞贴壁，原代间充质干细胞呈克隆样生长，细胞呈梭形。弃掉悬浮细胞，加入新鲜配制的细胞完全培养液，继续培养贴壁细胞。

(3)每天观察细胞生长状态，每隔3～4天全量换液。

(4)细胞消化传代：①当细胞长至70％－80％融合时，吸去培养基，加入10ml生理盐水洗涤细胞一次；②吸去洗液，加入5～10毫升0.125％的胰酶和0.01％的EDTA，在显微镜下观察，待细胞边缘回缩，细胞变圆时，加入0.5毫升的血清终止消化反应；③用移液管轻轻吹打细胞，将细胞吹打下来，移至新的15毫升离心管中；④将离心管在天平上配平，放入水平离心机中，1200转/分钟，离心10分钟；⑤离心结束后，取出离心管，用移液管小心地将上清吸出弃掉，拍打离心管，使细胞沉淀分散；⑥加入培养液重新悬浮细胞，计数，1×10⁴细胞/cm²的密度接种细胞到一次性细胞培养瓶中。

3、原始间充质干细胞成品制备

(1)待细胞扩增总数达所需细胞数量后，按前述细胞消化的方法消化离心，收集细胞。

(2)细胞沉淀用10ml生理盐水重复洗涤3次，1000转/分，室温离心 5分钟。

(3)细胞用细胞储存液重悬，装入20ml无菌西林瓶中，并调整细胞数量为2-4x10⁷个细胞/20毫升。封好盖子，贴上标签，置于4摄氏度中保存。

实施例4干细胞药物组合物的制备

将实施例3制备的脂肪来源干细胞成品与实施例2制备的颗粒脂肪按照体积比1:20混合待用。

本发明中，在第14天，将测量的面部萎缩量过度矫正的脂肪移植物注入患者体内。对照组直接接受脂肪移植。按照20ml脂肪与1ml SVF溶液的比例将目标体积的脂肪与SVF混合，然后移植到标准对照组中。按照20ml 脂肪与1ml ADSCs溶液的比例将目标体积的脂肪与ADSCs混合，然后移植到实验组中。

实施例5细胞的检定

1、细胞形态检查

①接种1×10⁵细胞于放有无菌盖玻片的6孔板中，培养基同前。

②待细胞达到60％融合，PBS冲洗2～3遍，洗净培养基。

③加入瑞氏染液，能覆盖住玻片为止。

④30秒之后加入等体积PBS(PH值6.4)，混匀。

⑤30分钟后流水冲洗，取出玻片，甘油明胶封片。

⑥光镜下观察，判定结果：常规体系中间充质干细胞在24小时内贴壁，贴壁细胞大多呈成纤维细样，以棱形细胞为主，平行排列或漩涡样生长，瑞士染色光镜下观察细胞胞浆呈天蓝色，核呈紫红色，核染色质较粗，有明显核仁。

2、表型分析

运用流式细胞术定性测定原始间充质干细胞的表型，操作如下：

①取9支流式细胞管，每管取2x10⁵细胞，1000转/分离心5分钟。

②用0.5ml含0.5％BSA的PBS洗涤1次。Flk-1为胞内标记，取2 管需进行下列操作，其中1管为同型对照管，其它表型则直接进行。

a弃去上清，将细胞摇散，加入1毫升1％多聚甲醛，4℃固定15分钟。离心，弃上清，用0.5ml PBS洗涤一次。

b弃去上清，加入1ml含0.1％皂素的PBS破膜，室温孵育1小时。

c同b洗涤一次。进行③的操作。

③弃去上清，将细胞悬浮于0.5ml含0.5％BSA的PBS中。

④将细胞管标记，分别加入2μl抗CD29、CD34、CD44、HLA-DR、 CD105和Flk-1单抗，4℃孵育30分钟，其中1管为同型对照。

⑤同②洗涤一次。

⑥各管中分别加入抗鼠荧光二抗工作液50μl，4℃孵育30分钟。

⑦同②洗涤二次。

⑧加入0.5ml PBS,上流式细胞仪检测。

⑨结果判定

a流式细胞仪采样10,000个细胞，Cellquest软件分析，在点图上可得阳性和阴性细胞群体。

b Cellquest软件统计分析各荧光抗体标记阳性细胞的百分率。

c CD29、CD44、CD105及FIK-1呈阳性，阳性率应不低于85％，CD34、 HLA-DR呈阴性，阴性率应不高于5％。

3、细胞生物学效力检测

运用T淋巴细胞增殖抑制试验测定原始间充质干细胞的生物学效力。操作程序如下：

(1)制备原始间充质干细胞培养板

①收集原始间充质干细胞，1000转/分，离心5分钟。

②弃上清，细胞沉淀用D-Hanks洗涤一次，同上离心。

③将细胞悬浮于适量培养液中，计数。

④将细胞浓度调整为2×10⁵/ml和5×10⁵/ml，100ul/孔分别加入96孔U 型底培养板中，使每孔细胞数分别为2×10⁴和5×10⁴个，每个浓度分别设置 4个重复孔，同时设置原始间充质干细胞对照孔。

⑤37℃培养约1-2小时。

⑥待贴壁后，用铯源照射30Gy，吸去培养上清，备用。

(2)制备外周血淋巴细胞

①取20～30ml肝素抗凝全血，加入等量D-Hanks液，混匀。

②取2支50ml尖底无菌离心管，每管中加入20ml淋巴细胞分离液，然后在淋巴细胞分离液界面上层缓慢加入20ml上述全血。

③室温1800转/分离心20分钟。

④小心吸出液面交界处白膜层置于另一无菌离心管中，并合并收集细胞。

⑤加入20mlD-Hanks洗涤一次。

⑥加入适量培养液，进行细胞计数，并将细胞浓度调整为1×10⁶/ml，4℃放置备用。

(3)淋巴细胞和MSC共培养

①用间充质干细胞培养板，100ul/孔加入淋巴细胞，使每孔淋巴细胞数为1×10⁵个。同时设置两组淋巴细胞对照孔。PMSC对照孔不加入淋巴细胞。

②试验组每孔加入PHA(终浓度30ug/ml)。PMSC对照孔加入PHA，一组淋巴细胞对照孔加入PHA作为阳性对照组，另一组淋巴细胞对照孔加入100ul细胞培养液作为阴性对照组。

③将培养板置于37℃5％CO₂孵箱中培养72小时。在培养结束前18小时，加入H³-TdR，1μCi/孔，至培养结束。

④1000转/分离心10分钟收集细胞，液闪计数，检测cpm值。

(4)计算结果

①培养24小时后，与阴性对照组T细胞相比，加PHA刺激的阳性对照组T细胞在光镜下可见明显的淋巴细胞母细胞化，并呈团簇状生长。

②培养结束后检测CPM值，计算各组的CPM均值。

③计算T细胞增殖抑制率。

T细胞增殖抑制率＝{1-[(试验组cpm均值-PMSC对照组cpm均值-阴性对照组cpm均值)/(阳性对照组cpm均值－阴性对照组cpm均值)]}×100％。当抑制率大于50％时，认为试验组T细胞的增殖较阳性对照组T细胞受到明显抑制，即反映PMSC具有抑制T细胞增殖的免疫调节作用。

(5)结果判定：

当MSC∶T细胞＝1∶2时，上述计算的T细胞增殖抑制率大于50％即为合格。

4、致瘤性检测

(1)消化细胞，用120目尼龙网过滤后计数细胞密度，将细胞稀释成 2×10⁵个/ml。

(2)将预先用蒸馏水配制的1.25％的琼脂置沸水浴煮溶，放在42℃水浴环境备用。

(3)将30ml胎牛血清加入90ml二倍浓度的RPMI1640培养液中，混匀，置42℃水浴中。

(4)将80ml1.25％琼脂加入配好的含血清的培养液中。置42℃水浴中。

(5)吸取7ml在配好的琼脂营养液放入直径为5cm的培养皿中。注意避免气泡。在室温静置约10分钟，即凝固为底层琼脂。

(6)将1ml在配好的琼脂营养液放入一离心管底部，再将0.5ml细胞悬液(含10⁵个原始间充质干细胞或基底细胞癌BCC细胞)加入离心管中混匀。用吸管吸出均匀地滴在铺有底层琼脂的平皿。静置片刻。在显微镜下观察细胞分布是否均匀。

(7)将平皿置饱和湿度的CO₂培养箱中培养。每隔1周取出，用显微镜观察有否克隆形成。检查后加入0.3ml培养液以避免琼脂干燥。

(8)如需进行亚克隆分离，可用吸管将克隆小心吸出，在少量培养液吹打后继续培养。

(9)实验结果：培养2周后应无克隆形成，而阳性对照组则可见明显的克隆形成。

实施例6临床评估

术前评估的指标包括年龄，性别和BMI。术后，患者在三个月和六个月进行随访。在每次随访中，均记录了手术并发症并为患者照相。在最后一次随访中，也通过Face-Q问卷(FACE-Q|

)来测量对面部外观的满意度。

1、三维(3D)立体摄影测量分析

由两名接受人体测量技术培训的分析人员为患者成像，这些分析人员使用Vectra(H1-270)3D人脸系统进行图像捕获，并使用Geomagic Wrap 3D 成像软件(2017，3D系统)进行分析。首先，通过使用选择工具删除颈部底部以下的任何图像来准备3D图像。相对于术前图像，手动对齐术后或后续图像以获得“最佳拟合”。在每个图像上选择未经手术更改的界标，以初始化叠加图像的方向，通过该界标，软件会自动将图像彼此对齐，并尽可能对齐多个相似区域。然后使用选择工具在手术前和手术后或随访的图像上精确分离面部脂肪移植区域，以检查局部硬皮病病变区域可能随治疗而变化。进行比色分析，描绘从术后或随访到术前图像的相对距离。在变色区域进行了相对定量的测量。

2、磁共振成像分析(MRI分析)

MRI在术前，术后和每次随访中均使用3.0特斯拉MR扫描仪(Discovery MR750 3T，GE Healthcare，密尔沃基，美国威斯康星州)，使用32个通道的头颈线圈。MRI检查是从额骨到颈部进行的，包括所有六个颈淋巴结水平，仅排除锁骨上区域。以4mm的切片厚度执行轴向TSE T1-FLAIR加权(获取参数：TR＝1725ms，TE＝24ms，翻转角111°，TA 3min6s；50切片；FOV 22×20mm)。使用Horos V3.3.1(Horos Project，美国)进行三维体积重格式化成像。术前和术后以及每次随访影像检查均包括局部硬皮病病变的脂肪组织的位置，外观和体积。测量局部硬皮病病变的脂肪组织体积百分比变化 (存活率＝随访时残余脂肪量/手术中脂肪移植量)。另外，注意并发症的存在。所有成像都是由具有6年经验的放射科医生进行的。

3、面部血流灌注的测量

在手术前后，对局部硬皮病病变进行血流灌注测量，并通过激光散斑对比成像(Pericam PSI System，Perimed，瑞典)进行每次随访。激光波长为 785nm，采集检测率为3张/S，从激光头到皮肤的距离固定为20cm。

4、统计分析

使用GraphPad Prism 8.0.2(GraphPad Software，美国)进行统计分析。 P值是通过单向方差分析与Tukey的多重比较测试获得的。显着性设定为p <0.05。所有数据均以平均值±SEM表示

5、结果

22名患者在整个六个月内研究结果显示，他们的平均年龄为26.68±1.28 岁，平均BMI为21.22±0.34kg/m2，如表1所示，三组之间的年龄，BMI 或脂肪移植物的体积均无显着差异。没有患者出现感染，血肿，血清肿或油囊肿。没有围手术期使用抗生素。没有发生严重的不良事件或意外事件。 Face-Q得分仅在实验组和空白对照组之间有显着差异(p＝0.0163)，但空白对照组和标准对照组之间(p＝0.2330)或标准对照组和空白对照组之间没有显着差异。实验组(p＝0.3976)。

表1参与者特征统计和Face-Q得分

区域0到相对体积增加的程度12，增加的越多，颜色越深，从0至-2表示从无变化0到相对体积损失的程度，颜色越灰代表缺失的越多。

脂肪移植物体积变化显示在冠状平面TI序列上显示图，如图2所示a，术前；b，术后；c，三个月后；d，六个月后。

MRI体积分析的结果如图3所示，图3a为术后第三个月的第一次随访，实验组和空白对照组之间的脂肪存活率只有显着差异(p＝0.0046)，而空白对照组和标准组之间没有显着差异。对照组(p＝0.3673)，或在标准对照组和实验组之间(p＝0.0932)。在随访的第六个月如图3b所示，实验组和空白对照组之间的脂肪存活率存在显着差异(p<0.0001)，实验组和标准对照组之间的脂肪存活率存在显着差异(p＝0.0223)，并且在标准对照组和空白对照组之间(p＝0.0124)。图3c为平均脂肪存活率的变化趋势。

实验组与空白对照组之间的血流灌注(p＝0.2198)，实验组与标准对照组之间(p＝0.6863)或标准对照组与空白对照组之间的血流灌注无显着差异(p＝0.6864)在最后一次随访中。

本发明结果显示，六个月后，ADSCs辅助组的脂肪移植存活率明显优于SVF辅助和简单脂肪移植组。

另外结果也表明，本发明的治疗剂在改善LoS患者面部萎缩的移植物保留方面是有效、安全且优于简单脂肪移植或SVF辅助脂肪移植的。

通过本发明研究分析表明，本发明治疗剂可以在不显著改变血流灌注的情况下更有效地提高脂肪存活率，促进血管生成应该不是ADSCs提高脂肪存活率的主要机制。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括组分A和组分B，所述组分A为脂肪干细胞群，所述组分B为颗粒脂肪，所述脂肪干细胞群中细胞密度为1×10⁵至1×10⁸/mL；所述组分A和组分B的体积比为1:10-30。

2.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述的脂肪干细胞免疫表型为CD29、CD44、CD105及FIK-1呈阳性，CD34、HLA-DR呈阴性。

3.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述脂肪干细胞群为来自单个个体或者多个个体的脂肪干细胞，所述颗粒脂肪为自体脂肪颗粒。

4.一种治疗硬皮病的治疗剂，所述治疗剂包括权利要求1～3任意一项所述药物组合物。

5.如权利要求4所述的治疗剂，其特征在于，所述治疗剂还包括一种或多种有利于植入的化合物。

6.如权利要求4或5所述的治疗剂，其特征在于，所述治疗剂的剂型为注射剂。

7.权利要求4～6任意一项所述治疗剂在硬皮病中的应用，其特征在于，所述硬皮病为晚期局限性硬皮病，或局灶性硬皮病。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述局限性硬皮病的症状为以下症状中的一种或几种：肢体远端，即肘和膝，和面部皮肤对称性增厚；血管部分伴有雷诺现象，雷诺现象出现在皮肤改变前数年；内脏受累，主要包括胃肠受累，肺动脉高压；抗着丝点抗体、抗Th/To抗体。

9.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述局灶性硬皮病仅局限于皮肤及皮下组织，活检显示真皮纤维化类似于系统性硬化症增厚皮肤的组织病理学改变；不会出现雷诺氏现象、手指缺血性及累及脏器受累情况。

10.权利要求1～3任意一项所述药物组合物的制备方法，包括如下步骤：

(2)组分B的制备；

(3)组分A和组分B冻存保存，使用时按照比例混合。