CN102058905A - 一种复合脂肪颗粒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种复合脂肪颗粒及其制备方法，该复合脂肪颗粒由富含血小板血浆、人凝血酶溶液、脂肪干细胞、脂肪颗粒按照下述比例组成：2ml富含血小板血浆∶1ml人凝血酶溶液∶(2±0.5)×107个脂肪干细胞∶4ml脂肪颗粒。该复合脂肪颗粒可提高移植后脂肪的成活率、并减少远期吸收率，且不会出现异位纤维化结节形成等情况。
Description
技术领域
本发明属于移植材料技术领域，特别涉及一种用于移植的复合脂肪颗粒及其制备方法。
背景技术
1893年Neuber完成了第一例采用多个自体游离的小脂肪块充填软组织缺损的脂肪移植手术并取得满意的疗效，此后脂肪移植手术逐渐流行。尤其是液态硅胶注射由于众多并发症被禁止后，人们在移植材料领域又进行了大量的探索，到20世纪80年代初，随着脂肪抽吸技术的成熟和发展，再次掀起了自体游离脂肪移植的热潮。因自体脂肪来源丰富、取材方便、安全可靠、无免疫排斥反应等优点，极易被患者所接受。并且对于全身脂肪堆积明显者，可在自体脂肪移植的同时达到瘦身丰胸、完美身形、形体雕塑的良好效果。
目前广泛应用于临床的脂肪移植技术，一般采用单纯的脂肪颗粒移植，即通过吸脂获取脂肪细胞，稍微处理去除水分血液油脂等成分后，直接注射到受区。然而，由于部分移植脂肪细胞在移植前已经被损坏或者发生坏死；移植后局部的无菌性炎症反应导致脂肪细胞坏死、外漏脂质纤维化引起组织收缩；继发于脂肪细胞脂质丢失或去分化的非坏死性容积缩小等等，都可引起移植脂肪细胞成活率低、吸收率较高，一年内吸收率可高达60％以上，并且如果移植的脂肪体积过大，重建的血供难以达到移植物中心，也将导致移植脂肪颗粒中心坏死液化，增加吸收率，甚至发生纤维化，导致受植区域变硬。
目前也有学者为了提高移植脂肪的成活率，而在移植的单纯脂肪颗粒中添加一定量的脂肪干细胞，来减少移植的吸收率，取得了一定的效果；但个别却出现异位纤维化结节形成的情况，导致受植区出现硬的团块。
发明内容
本发明的主要目的是针对上述现有技术单纯的脂肪颗粒移植后脂肪成活率低、远期吸收率高，以及直接在移植的单纯脂肪颗粒中添加脂肪干细胞可能出现异位纤维化结节形成等问题，提供一种新的复合脂肪颗粒，可提高移植后脂肪的成活率、并减少远期吸收率，且不会出现异位纤维化结节形成等情况。
本发明的另一个目的是提供一种上述复合脂肪颗粒的制备方法。
为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
一种复合脂肪颗粒，由富含血小板血浆、人凝血酶溶液、脂肪干细胞、脂肪颗粒按照下述比例组成：
2ml富含血小板血浆∶1ml人凝血酶溶液∶(2±0.5)×107个脂肪干细胞∶4ml脂肪颗粒。
其中：
富含血小板血浆(PRP，platelet rich plasma)是将全血经过浓集、分离得到的成分血液制品，其中血小板浓度为(1300.00±400.00)×109/L。目前富含血小板血浆的制备方法已较为成熟，已有专用仪器(如多功能医用血成分的自动分离设备)可以快速、便捷、有效的制备得到。
人凝血酶溶液是采用氯化钙溶液溶解的人凝血酶，在本发明中作为激活PRP凝结及释放多量生长因子的催化剂。其制备方法较为固定简单，其组分比例为：1ml蒸馏水∶0.1g氯化钙∶800～1200单位人凝血酶冻干粉(人凝血酶的比例参照常规配比方法，其小范围的波动对产品的质量及效果无特殊影响)。
脂肪干细胞(ASCs，adipose-derived stem cells)是脂肪组织中含有的大量具有多向分化潜能的细胞群，由国际脂肪应用技术协会(International Fat Applied Technology Society)将其统一命名为脂肪来源的干细胞(adipose-derived stem cells，ASCs)，简称脂肪干细胞。目前对于脂肪干细胞的研究已经较为普遍，对于其培养主要采用组织块培养法和消化培养法。
脂肪颗粒是通过吸脂获取的脂肪细胞。目前对于脂肪细胞获取公认的方法是采用手动针吸法获取，并采用低于50g的离心力离心2分钟，去尽上层的油脂和水分，制备好后可以置于4℃下保存3天。
本发明复合脂肪颗粒可通过包括下述主要步骤的方法制得：
(1)、制备富含血小板血浆(PRP)：
抽取抗凝全血，通过两次离心法得到富含血小板血浆(PRP)，方法可如下：
用预先装有0.5ml 3.8％枸橼酸三钠抗凝剂的5ml注射器，抽取4.5ml全血，摇匀，移入离心管中，进行两次离心。第一次离心速度为1000r/min，时间为15分钟。离心后血液分为三层：最上层为血浆层、中间层包括血小板和白细胞(棕黄层)、最下层为红细胞层。弃去最下层的红细胞，吸取上层和中间层至另一离心管，进行二次离心，速度为2000r/min，时间为15分钟，弃去最上层的大部分血浆，剩余约0.5ml液体，将其摇匀，即得到PRP。
PRP制备全过程应严格无菌。
(2)、制备人凝血酶溶液：
按照1ml蒸馏水∶0.1g氯化钙∶800～1200单位人凝血酶冻干粉的组分比，将人凝血酶冻干粉置于无菌的10％氯化钙溶液中配制成人凝血酶溶液，用于激活血浆中血小板及促进血浆凝结；
(3)、分离培养脂肪干细胞(ASCs)：
由于人脂肪中成熟脂肪细胞和油脂较多，不利于组织块培养，油脂和多余的脂肪细胞容易损耗大量培养基，本发明中优选采用消化培养法，通过此法可以尽量去除脂肪细胞和油脂对于干细胞的生长和贴壁的影响。
在无菌条件下抽取脂肪，浸于生理盐水中，于抽取后2h内在超净工作台中，用2倍体积的PBS缓冲液(PBS-T)冲洗至少3次，以除去血液、油脂，然后将组织剪碎，加入等体积的1％I型胶原酶，混匀后于37℃恒温摇床振荡消化60分钟，1000r/min离心8分钟，吸除表面漂浮油脂、脂肪组织及液体，将沉积于管底的物质接种于25cm2培养瓶中，加入α-MEM培养基(含10％胎牛血清，1％双抗)，置入37℃、饱和湿度、5％CO2的孵箱中培养，3天后加2ml液(即培养基，下同)，7天后换液，清除未贴壁的细胞及组织块。原代细胞培养15～20d即可融合。细胞长满80％(指培养瓶底面积的80％，下同)时，以0.25％胰酶消化、传代。传代细胞继续加入α-MEM培养基，置入37℃、饱和湿度、5％CO2的孵箱中培养，倒置相差显微镜下观察细胞生长情况，每3天换一次液。待细胞生长至60％时，以0.25％胰酶消化、离心、收集底部沉积的脂肪干细胞待用。
(4)、制备脂肪颗粒：
在无菌条件下抽取脂肪，采用2倍体积的生理盐水冲洗至少3次，以去除血液、水分、油脂等，通过1000转/分钟低速离心2分钟，进一步去除血液、水分、油脂等成分，得到纯净的脂肪颗粒；
(5)、混合、制得复合脂肪颗粒：
将上述各步骤制得的富含血小板血浆(PRP)、人凝血酶溶液、脂肪干细胞(ASCs)、脂肪颗粒按照2ml∶1ml∶(2±0.5)×107个∶4ml的比例充分混合均匀，即得到本发明所述的复合脂肪颗粒。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明通过在纯净脂肪颗粒中添加适当比例的富含血小板血浆、人凝血酶溶液和脂肪干细胞，通过人凝血酶溶液对PRP中血小板的激活，释放大量生长因子，可以促进细胞增殖及移植物周边毛细血管的增殖，从而保证移植脂肪早期血供，防止脂肪细胞坏死液化。同时PRP凝结后形成丰富的纤维网络对促进细胞粘附和防止细胞流式均具有一定的作用。而脂肪干细胞其不仅自身能分化为脂肪细胞促进脂肪组织再生，而且可以分化为血管内皮细胞促进血管生成，并且在移植后的缺氧的急性状态下可以改善局部组织缺血的情况。这些作用都可以促进移植物早期迅速建立血供，为移植细胞的成活提供必要的条件，从而提高脂肪细胞成活率，减少远期吸收率；并且不会出现异位纤维化结节形成等情况。
附图说明
图1是在裸鼠的左右肩部和臀部皮下分的ABCD四组。
图2是采用精确到0.1ml的2.5ml空针对移植物体积进行测量的操作图。采用此法可以将移植物体积的测量精确到0.1ml，估计到0.01ml。
图3是移植7天后见到A组移植物表面有大量血管生成，B组移植物吸收较多，CD组移植物表面有部分血管生成。
图4是移植7天时本发明的复合脂肪颗粒组移植物表面有大量血管(小箭头所示)生成，细胞形态较好，细胞间质正常(×100)。
图5是移植7天时纯净脂肪颗粒组移植物内毛细血管较少，脂肪细胞变形，细胞间未见明显纤维增生。
图6是移植90天时本发明的复合脂肪颗粒组中脂肪细胞大部分形态可，少数细胞变大出现了空泡，大部分区域细胞间隙保持较好，少数区域出现细胞间隙变大，纤维增生。
图7是移植90天时纯净脂肪颗粒组移植物内大部分脂肪细胞已经完全失去细胞形态，细胞间隙增大，纤维增生。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明的上述发明内容作进一步的详细描述。
但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于下述实施例。在不脱离本发明上述技术思想情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段，做出各种替换和变更，均应包括在本发明的范围内。
实施例1
本实施例复合脂肪颗粒(简称PA脂肪)由富含血小板血浆、人凝血酶溶液、脂肪干细胞、脂肪颗粒按照下述比例组成：
2ml富含血小板血浆∶1ml人凝血酶溶液∶(2±0.5)×107个脂肪干细胞∶4ml脂肪颗粒；
其中：
富含血小板血浆中的血小板浓度为(1300.00±400.00)×109/L；
人凝血酶溶液的组分比例为：1ml蒸馏水∶0.1g氯化钙∶1000单位人凝血酶冻干粉。
本实施例PA脂肪通过包括下述步骤的方法制得：
(1)、制备富含血小板血浆(PRP)：
抽取抗凝全血，通过两次离心法得到富含血小板血浆(PRP)，方法如下：
用预先装有0.5ml 3.8％枸橼酸三钠抗凝剂的5ml注射器，抽取4.5ml全血，摇匀，移入离心管中，进行两次离心。第一次离心速度为1000r/min，时间为15分钟。离心后血液分为三层：最上层为血浆层、中间层包括血小板和白细胞(棕黄层)、最下层为红细胞层。弃去最下层的红细胞，吸取上层和中间层至另一离心管，进行二次离心，速度为2000r/min，时间为15分钟，弃去最上层的大部分血浆，剩余约0.5ml液体，将其摇匀，即得到PRP。
PRP制备全过程严格无菌。
(2)、制备人凝血酶溶液：
按照1ml蒸馏水∶0.1g氯化钙∶1000单位人凝血酶冻干粉的组分比，将人凝血酶冻干粉置于无菌的10％氯化钙溶液中配制成人凝血酶溶液；
(3)、分离培养脂肪干细胞(ASCs)：
在无菌条件下抽取脂肪，浸于生理盐水中，于抽取后2h内在超净工作台中，用2倍体积的PBS缓冲液(PBS-T)冲洗3次，以除去血液、油脂，然后将组织剪碎，加入等体积的1％I型胶原酶，混匀后于37℃恒温摇床振荡消化60分钟，1000r/min离心8分钟，吸除表面漂浮油脂、脂肪组织及液体，将沉积于管底的物质接种于25cm2培养瓶中，加入α-MEM培养基(含10％胎牛血清，1％双抗)，置入37℃、饱和湿度、5％CO2的孵箱中培养，3天后加2ml液，7天后换液，清除未贴壁的细胞及组织块。原代细胞培养15～20d即可融合。细胞长满80％时，0.25％胰酶消化、传代。传代细胞继续加入α-MEM培养基，置入37℃、饱和湿度、5％CO2的孵箱中培养，倒置相差显微镜下观察细胞生长情况，每3天换一次液。待细胞生长至60％时，可以0.25％胰酶消化、离心、收集底部沉积的脂肪干细胞待用。
(4)、制备脂肪颗粒：
在无菌条件下抽取脂肪，采用2倍体积的生理盐水冲洗3次，以去除血液、水分、油脂等，通过1000转/分钟低速离心2分钟，进一步去除血液、油脂等成分，得到纯净的脂肪颗粒；
(5)、混合、制得复合脂肪颗粒：
将上述各步骤制得的富含血小板血浆(PRP)、人凝血酶溶液、脂肪干细胞(ASCs)、脂肪颗粒按照2ml∶1ml∶(2±0.5)×107个∶4ml的比例充分混合均匀，即得所述的复合脂肪颗粒。
实施例2
本实施例复合脂肪颗粒(简称PA脂肪)由富含血小板血浆、人凝血酶溶液、脂肪干细胞、脂肪颗粒按照下述比例组成：
2ml富含血小板血浆∶1ml人凝血酶溶液∶(2±0.5)×107个脂肪干细胞∶4ml脂肪颗粒；
其中：
富含血小板血浆中的血小板浓度为(1300.00±400.00)×109/L；
人凝血酶溶液的组分比例为：1ml蒸馏水∶0.1g氯化钙∶800单位人凝血酶冻干粉。
本实施例PA脂肪通过包括下述步骤的方法制得：
(1)、制备富含血小板血浆(PRP)：
抽取抗凝全血，通过两次离心法得到富含血小板血浆(PRP)，方法如下：
用预先装有0.5ml 3.8％枸橼酸三钠抗凝剂的5ml注射器，抽取4.5ml全血，摇匀，移入离心管中，进行两次离心。第一次离心速度为1000r/min，时间为15分钟。离心后血液分为三层：最上层为血浆层、中间层包括血小板和白细胞(棕黄层)、最下层为红细胞层。弃去最下层的红细胞，吸取上层和中间层至另一离心管，进行二次离心，速度为2000r/min，时间为15分钟，弃去最上层的大部分血浆，剩余约0.5ml液体，将其摇匀，即得到PRP。
PRP制备全过程严格无菌。
(2)、制备人凝血酶溶液：
按照1ml蒸馏水∶0.1g氯化钙∶800单位人凝血酶冻干粉的组分比，将人凝血酶冻干粉置于无菌的10％氯化钙溶液中配制成人凝血酶溶液；
(3)、分离培养脂肪干细胞(ASCs)：
在无菌条件下抽取脂肪，浸于生理盐水中，于抽取后2h内在超净工作台中，用2倍体积的PBS缓冲液(PBS-T)冲洗3次，以除去血液、油脂，然后将组织剪碎，加入等体积的1％I型胶原酶，混匀后于37℃恒温摇床振荡消化60分钟，1000r/min离心8分钟，吸除表面漂浮油脂、脂肪组织及液体，将沉积于管底的物质接种于25cm2培养瓶中，加入α-MEM培养基(含10％胎牛血清，1％双抗)，置入37℃、饱和湿度、5％CO2的孵箱中培养，3天后加2ml液，7天后换液，清除未贴壁的细胞及组织块。原代细胞培养15～20d即可融合。细胞长满80％时，以0.25％胰酶消化、传代。传代细胞继续加入α-MEM培养基，置入37℃、饱和湿度、5％CO2的孵箱中培养，倒置相差显微镜下观察细胞生长情况，每3天换一次液。待细胞生长至60％时，可以0.25％胰酶消化、离心、收集底部沉积的脂肪干细胞待用。
(4)、制备脂肪颗粒：
在无菌条件下抽取脂肪，采用2倍体积的生理盐水冲洗3次，以去除血液、水分、油脂等，通过1000转/分钟低速离心2分钟，进一步去除血液、油脂等成分，得到纯净的脂肪颗粒；
(5)、混合、制得复合脂肪颗粒：
将上述各步骤制得的富含血小板血浆(PRP)、人凝血酶溶液、脂肪干细胞(ASCs)、脂肪颗粒按照2ml∶1ml∶(2±0.5)×107个∶4ml的比例充分混合均匀，即得所述的复合脂肪颗粒。
实施例3
本实施例复合脂肪颗粒(简称PA脂肪)由富含血小板血浆、人凝血酶溶液、脂肪干细胞、脂肪颗粒按照下述比例组成：
2ml富含血小板血浆∶1ml人凝血酶溶液∶(2±0.5)×107个脂肪干细胞∶4ml脂肪颗粒；
其中：
富含血小板血浆中的血小板浓度为(1300.00±400.00)×109/L；
人凝血酶溶液的组分比例为：1ml蒸馏水∶0.1g氯化钙∶1200单位人凝血酶冻干粉。
本实施例PA脂肪通过包括下述步骤的方法制得：
(1)、制备富含血小板血浆(PRP)：
抽取抗凝全血，通过两次离心法得到富含血小板血浆(PRP)，方法如下：
用预先装有0.5ml 3.8％枸橼酸三钠抗凝剂的5ml注射器，抽取4.5ml全血，摇匀，移入离心管中，进行两次离心。第一次离心速度为1000r/min，时间为15分钟。离心后血液分为三层：最上层为血浆层、中间层包括血小板和白细胞(棕黄层)、最下层为红细胞层。弃去最下层的红细胞，吸取上层和中间层至另一离心管，进行二次离心，速度为2000r/min，时间为15分钟，弃去最上层的大部分血浆，剩余约0.5ml液体，将其摇匀，即得到PRP。
PRP制备全过程严格无菌。
(2)、制备人凝血酶溶液：
按照1ml蒸馏水∶0.1g氯化钙∶1200单位人凝血酶冻干粉的组分比，将人凝血酶冻干粉置于无菌的10％氯化钙溶液中配制成人凝血酶溶液；
(3)、分离培养脂肪干细胞(ASCs)：
在无菌条件下抽取脂肪，浸于生理盐水中，于抽取后2h内在超净工作台中，用2倍体积的PBS缓冲液(PBS)冲洗3次，以除去血液、油脂，然后将组织剪碎，加入等体积的1％I型胶原酶，混匀后于37℃恒温摇床振荡消化60分钟，1000r/min离心8分钟，吸除表面漂浮油脂、脂肪组织及液体，将沉积于管底的物质接种于25cm2培养瓶中，加入α-MEM培养基(含10％胎牛血清，1％双抗)，置入37℃、饱和湿度、5％CO2的孵箱中培养，3天后加2ml液，7天后换液，清除未贴壁的细胞及组织块。原代细胞培养15～20d即可融合。细胞长满80％时，0.25％胰酶消化、传代。传代细胞继续加入α-MEM培养基，置入37℃、饱和湿度、5％CO2的孵箱中培养，倒置相差显微镜下观察细胞生长情况，每3天换一次液。待细胞生长至60％时，可以0.25％胰酶消化、离心、收集底部沉积的脂肪干细胞待用。
(4)、制备脂肪颗粒：
在无菌条件下抽取脂肪，采用2倍体积的生理盐水冲洗3次，以去除血液、水分、油脂等，通过1000转/分钟低速离心2分钟，进一步去除血液、油脂等成分，得到纯净的脂肪颗粒；
(5)、混合、制得复合脂肪颗粒：
将上述各步骤制得的富含血小板血浆(PRP)、人凝血酶溶液、脂肪干细胞(ASCs)、脂肪颗粒按照2ml∶1ml∶(2±0.5)×107个∶4ml的比例充分混合均匀，即得所述的复合脂肪颗粒。
实施例4
将实施例1制得的复合脂肪颗粒用于动物脂肪移植试验，同时设置对照组，以考察本发明复合脂肪颗粒用于移植后的成活率、吸收率等情况。
1.试验方法：
设计1个试验组(A组-实施例1复合脂肪颗粒组)、3个对照组(B组-脂肪干细胞复合富含血小板血浆组、C组-脂肪颗粒复合脂肪干细胞组、D组-纯净脂肪颗粒组)，按照下述方法分别将相应的移植物移植于动物体内，进行效果的对比分析：
动物实验中，采用10只裸鼠，在其背部划分出A、B、C、D四个区域(图1)，分别植入本发明复合脂肪颗粒(A组)、PRP+ASCs(B组)、脂肪颗粒+ASCs(C组)、纯净脂肪颗粒(D组)。每只裸鼠每个部位的移植量为0.4ml。将10只裸鼠随机分为5组，分别于移植后7、15、30、60、90天时分别各处死2只，进行移植物成活及血管生成的大体观察(图3)，并游离后测量体积(图2)，最后固定常规HE切片观察，对记录的移植物体积行统计学分析。
2.试验结果：
结果显示复合脂肪颗粒移植后可以在早期迅速建立血供，并在移植后期保持移植物的一定体积和移植脂肪细胞及细胞间质的形态正常。
结果显示，移植7天时可以在发明的复合脂肪颗粒组见到明显的血管生成(图4)。在对照纯净脂肪颗粒组仅能见到较少且纤细的血管(图5)。对移植物体积(ml)的记录显示没有脂肪细胞的B组吸收接近100％，而发明的复合脂肪颗粒组在90天时吸收率为21.3％，在四组中吸收最少(见下表)。
移植物体积的变化表
将本发明的复合脂肪颗粒组(A组)分别与其余三个对照组(B、C、D组)进行两两比较的双样本异方差假设的t检验，其结果显示：A组与B组：t＝13.873，p＜0.001＜0.05；A组与C组：t＝2.454，p＝0.014＜0.05；A组与D组：t＝3.252，p＝0.004＜0.05。A组分别与B、C、D三组间的差异均有统计学意义。HE切片显示在移植7天时，A、C、D三组脂肪细胞形态均正常，细胞间没有明显纤维增生，其中A组可见移植物表面血管生成明显，并有大量血管长入移植物内(图4)。移植90天时，A组脂肪细胞大部分形态可，少数细胞变大出现了空泡，大部分区域细胞间隙保持较好，少数区域出现细胞间隙变大，纤维增生(图6)；CD组大部分脂肪细胞已经完全失去细胞形态，细胞间隙增大，纤维增生(图7)。
Claims (7)
1.一种复合脂肪颗粒，由富含血小板血浆、人凝血酶溶液、脂肪干细胞、脂肪颗粒按照下述比例组成：
2ml富含血小板血浆∶1ml人凝血酶溶液∶(2±0.5)×107个脂肪干细胞∶4ml脂肪颗粒。
2.根据权利要求1所述的复合脂肪颗粒，其特征在于：所述的富含血小板血中，血小板浓度为(1300.00±400.00)×109/L。
3.根据权利要求1所述的复合脂肪颗粒，其特征在于：所述的人凝血酶溶液的组分比例为：
1ml蒸馏水∶0.1g氯化钙∶800～1200单位人凝血酶冻干粉。
4.权利要求1-3中任一项所述的复合脂肪颗粒的制备方法，包括下述主要步骤：
(1)、制备富含血小板血浆：
抽取抗凝全血，通过两次离心法得到富含血小板血浆；
(2)、制备人凝血酶溶液：
按照1ml蒸馏水∶0.1g氯化钙∶800～1200单位人凝血酶冻干粉的组分比，将人凝血酶冻干粉置于无菌的10％氯化钙溶液中配制成人凝血酶溶液；
(3)、分离培养脂肪干细胞：
在无菌条件下抽取脂肪，采用组织块培养法或消化培养法分离培养脂肪干细胞；
(4)、制备脂肪颗粒：
在无菌条件下抽取脂肪，去除血液、水分、油脂，得到纯净的脂肪颗粒；
(5)、混合、制得复合脂肪颗粒：
将上述各步骤制得的富含血小板血浆、人凝血酶溶液、脂肪干细胞、脂肪颗粒按照2ml∶1ml∶(2±0.5)×107个∶4ml的比例充分混合均匀，即得到本发明所述的复合脂肪颗粒。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述的步骤(1)制备富含血小板血浆的方法如下：
用预先装有0.5ml 3.8％枸橼酸三钠抗凝剂的5ml注射器，抽取4.5ml全血，摇匀，移入离心管中，进行两次离心：第一次离心速度为1000r/min，时间为15分钟，离心后血液分为三层：最上层为血浆层、中间层包括血小板和白细胞、最下层为红细胞层；弃去最下层的红细胞，吸取上层和中间层至另一离心管，进行二次离心，速度为2000r/min，时间为15分钟，弃去最上层的大部分血浆，将剩余液体摇匀，即得。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述的步骤(3)分离培养脂肪干细胞的方法如下：
在无菌条件下抽取脂肪，浸于生理盐水中，于抽取后2h内在超净工作台中，用2倍体积的PBS缓冲液冲洗至少3次，以除去血液、油脂，然后将组织剪碎，加入等体积的1％I型胶原酶，混匀后于37℃恒温摇床振荡消化60分钟，1000r/min离心8分钟，吸除表面漂浮油脂、脂肪组织及液体，将沉积于管底的物质接种于25cm2培养瓶中，加入α-MEM培养基，置入37oC、饱和湿度、5％CO2的孵箱中培养，3天后加2ml培养基，7天后换培养基，清除未贴壁的细胞及组织块，原代细胞培养15～20d即可融合；细胞长满80％时，用0.25％胰酶消化、传代；传代细胞继续加入α-MEM培养基，置入37oC、饱和湿度、5％CO2的孵箱中培养，倒置相差显微镜下观察细胞生长情况，每3天换一次培养基。待细胞生长至60％时，以0.25％胰酶消化、离心、收集底部沉积的脂肪干细胞，即得。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述的步骤(4)制备脂肪颗粒的方法如下：
在无菌条件下抽取脂肪，采用2倍体积的生理盐水冲洗至少3次，去除血液、水分、油脂，通过1000转/分钟低速离心2分钟，进一步去除血液、水分、油脂，即得。
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