CN112451745A - 一种高存活率的移植颗粒脂肪及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及医疗美容技术领域，特别是涉及一种高存活率的移植颗粒脂肪，由移植用脂肪干细胞与脂肪颗粒按照体积比为1：(1.0～2.0)组成；移植用脂肪干细胞为初代脂肪干细胞培养第三代至第五代的脂肪干细胞。制备方法包括：将脂肪原样离心去除油层和组织液后，将脂肪颗粒与混合胶原酶进行恒温震荡消化后离心，将初代脂肪干细胞传代培养，将第三代至第五代的脂肪干细胞调整细胞密度，再与脂肪颗粒按照体积比为1：(1.0～2.0)混合均匀，即得。本发明解决现有技术中颗粒脂肪移植很快被吸收、存活率很低的问题，通过将脂肪干细胞联合颗粒脂肪进行移植，显著增加颗粒脂肪的存活率，方法操作简单、成本低，便于市场推广。

Description

一种高存活率的移植颗粒脂肪及其制备方法
技术领域
本发明涉及医疗美容技术领域，特别是涉及一种高存活率的移植颗粒脂肪及其制备方法。
背景技术
人体组织通常因为衰老、创伤产生缺损，如随着年龄的增加，衰老迹象逐渐明显，面部会因为脂肪的流失而出现皱纹和不同程度的凹陷，影响面部美观。目前，通常采用填充剂对缺损的组织进行修复，填充剂主要为石蜡、硅胶、动物胶原蛋白、聚丙烯酞胺凝胶、透明质酸凝胶、细胞生长因子等。但石蜡、硅胶、动物胶原蛋白、聚丙烯酞胺凝胶由于非人体自身物质，容易发生排斥反应。透明质酸凝胶因代谢被分解吸收，达不到长期填充的目的。细胞生长因子因在局部停留的时间相当短暂，达不到长久刺激细胞生长的目的。研究如何提高填充剂的填充效果以及提高移植颗粒脂肪细胞存活率的方法具有重要的作用。
自体脂肪移植技术近年来发展迅猛，由于自体脂肪无免疫排斥、取材便捷等特点，已经应用于丰胸、丰臀、面部抗衰老、瘢痕重塑等方面。自体脂肪从人体自身某些部位吸取多余的皮下脂肪细胞，然后将吸出的混合物经净化处理、注入药物得到复合颗粒脂肪，选择完整的颗粒脂肪细胞通过注射的方式再移植到自己需要进行脂肪填充的部位，例如乳房、面部等，用以治疗胸部扁平、两侧乳房不对称、浅表微细皱纹、薄嘴唇隆成厚嘴唇等等。因此，需要提高自体脂肪注射的成活率，从而设计了一种提高移植性脂肪细胞或者填充式脂肪细胞成活率的复活因子的提纯和萃取工艺。
现阶段越来越多的人排斥假体移植，从而选择自体脂肪组织移植。但目前很多脂肪填充后吸收率高，为了保证最好的效果需要进行再次手术，脂肪的用量过多或注射过于集中，大量脂肪堆积会因供血不足导致脂肪坏死、溶解、吸收，极易引发感染，出现纤维化或钙化、脂肪坏死等后遗症，很多的自体脂肪在注射之后，成活率都较低，会造成手术的负面效果，影响手术成果。部分细胞生长因子可以起到提高移植脂肪存活率的效果，但是细胞因子在局部停留的时间非常短暂，达不到长久刺激细胞生长的目的。
脂肪干细胞是从脂肪组织中分离出来的具有多向分化潜能的干细胞，干细胞是一类具有自我更新能力且在适合微环境下具有多系分化潜能的细胞。研究发现脂肪干细胞能够在体外稳定增殖且衰亡率低，同时它具有取材容易、少量组织即可获取大量干细胞，适宜大规模培养，对机体损伤小等优点，而且其来源广泛，体内储备量大，适宜自体移植。
在现有技术中，【CN106267353A】本发明提供一种脂肪干细胞填充剂，包括脂肪干细胞、成纤维干细胞、成纤维细胞、细胞生长营养素，脂肪干细胞的密度为1×107～5×107/ml、成纤维干细胞的密度为0.5×107～1×107/ml、成纤维细胞的密度为0.5×107～1×107/ml、细胞生长营养素的浓度为20～30mg/ml。【CN106701674A】本发明公开了一种提高移植性脂肪细胞或者填充式脂肪细胞成活率的复活因子的提纯和萃取工艺，该方法包括以下步骤对于全血样本的采集全血样本的分离全血样本的发酵发酵液上清冷冻处理全血样本细胞复苏复活因子的提纯与萃取静置后的液体加入离心管内，放在离心机内进行二次离心处理，离心完成后在恒温环境下静置处理，弃掉离心管上层的血浆，加入新的血浆样本，使得沉淀的血小板重新悬浮，得到复活因子，能够很好的提取出自体脂肪注射所需的，大大提高了从细胞中提取的效率，能够保证自体脂肪注射后的活力，使得自体脂肪注射手术更加安全可靠，值得推广。【CN107638592A】本发明涉及一种一步法自体脂肪干细胞丰胸方法，包括以下步骤选取一身体部位采集自体脂肪细胞，用于分离培养脂肪干细胞分离培养脂肪干细胞一周，获得培养后的脂肪干细胞往脂肪干细胞加入脐带间充质干细胞，获得干细胞混合物再次在身体原部位采集脂肪细胞，与干细胞混合物混合，加入生长因子与转换因子，混合均匀，过滤，弃去滤渣，取清亮滤液作为注射液在乳房底部、中部和顶部分别选取注射点位在注射点位注射注射液，其具有丰胸效果自然、莹润、无毒副作用的特点。
在现有技术中，假体移植存在如下缺点：石蜡、硅胶、动物胶原蛋白、聚丙烯酞胺凝胶由于非人体自身物质，容易发生排斥反应，透明质酸凝胶因代谢被分解吸收，达不到长期填充的目的，细胞生长因子因在局部停留的时间相当短暂，达不到长久刺激细胞生长的目的。自体脂肪移植术缺点：术后脂肪颗粒具有很高的吸收率，极大的影响脂肪移植的效果，往往需要二次填充，限制了此项技术的应用和发展。在现有技术中现有提高移植性脂肪细胞或者填充式脂肪细胞成活率的方法步骤太过繁琐，实际操作复杂，成本高，不容易推进临床应用。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种高存活率的移植颗粒脂肪，用于解决现有技术中颗粒脂肪移植很快被吸收、存活率很低、存活效果不理想以及保持时间短的问题，同时，本发明还将提供一种高存活率的移植颗粒脂肪的制备方法。本发明通过将脂肪干细胞联合颗粒脂肪进行移植，显著增加颗粒脂肪的存活率，方法操作简单、成本低，便于市场推广。
为实现上述目的及其他相关目的，
本发明的第一方面，提供一种高存活率的移植颗粒脂肪，所述移植颗粒脂肪由移植用脂肪干细胞与脂肪颗粒按照体积比为1：(1.0～2.0)组成；所述移植用脂肪干细胞为初代脂肪干细胞培养第三代至第五代的脂肪干细胞。
通过将脂肪干细胞联合颗粒脂肪进行移植，显著增加颗粒脂肪的存活率。从实施例的数据中可以看出，脂肪干细胞联合颗粒脂肪移植后的1.5个和3个月后均能够显著增加移植颗粒脂肪的存活率。
于本发明的一实施例中，所述移植颗粒脂肪由移植用脂肪干细胞与脂肪颗粒按照体积比1：1组成。
于本发明的一实施例中，所述移植用脂肪干细胞的细胞密度为1×106/ml～1×108/ml。
于本发明的一实施例中，所述移植用脂肪干细胞的细胞密度为1×107/ml。
本发明的第二方面，提供一种高存活率的移植颗粒脂肪的制备方法，包括如下步骤：
步骤一、将脂肪原样离心去除油层和组织液后，得到纯化的脂肪颗粒；
步骤二、将脂肪颗粒与混合胶原酶进行恒温震荡消化后离心，得到初代脂肪干细胞，将初代脂肪干细胞传代培养，将第三代至第五代的脂肪干细胞用生理盐水调整细胞密度，得到用于移植的脂肪干细胞；
步骤三、将步骤二中用于移植的脂肪干细胞与步骤一中的脂肪颗粒按照体积比为1：(1.0～2.0)加入混合容器中混合均匀，即得。
通过将脂肪干细胞联合颗粒脂肪进行移植，显著增加颗粒脂肪的存活率，方法操作简单、成本低，便于市场推广，从而解决了现有技术中医美用颗粒脂肪进行移植容易出现颗粒脂肪移植很快被吸收、存活率很低、达不到理想的存活效果、不能长期保持移植后的填充和年轻化效果的问题。
于本发明的一实施例中，所述步骤一中脂肪原样离心温度为20～25℃，离心速率为1800～2500r/min，离心时间为3～6min；
所述步骤二中脂肪颗粒恒温震荡消化的温度为35～38℃，时间为30～50min；
所述步骤二中离心转速为1200～1800r/min，离心时间为4～6min。
于本发明的一实施例中，所述步骤一中脂肪原样离心温度为23℃，离心速率为2000r/min，离心时间为5min；
所述步骤二中脂肪颗粒恒温震荡消化的温度为37℃，时间为40min；
所述步骤二中离心转速为1500/min，离心时间为5min。
于本发明的一实施例中，所述步骤二中混合胶原酶为I型胶原酶和胰蛋白酶按照体积比为1：(0.8～1.2)混合得到；所述步骤二中颗粒脂肪组织与混合胶原酶的体积比为4：(0.9～1.1)。
于本发明的一实施例中，所述步骤二中混合胶原酶为I型胶原酶和胰蛋白酶按照体积比为1：1混合得到；所述步骤二中颗粒脂肪组织与混合胶原酶的体积比为4：1.0。
如上所述，本发明的一种高存活率的移植颗粒脂肪及其制备方法，具有以下有益效果：通过将脂肪干细胞联合颗粒脂肪进行移植，显著增加颗粒脂肪的存活率。从实施例的数据中可以看出，脂肪干细胞联合颗粒脂肪移植后的1.5个和3个月后均能够显著增加移植颗粒脂肪的存活率。从附图中可以看出，将脂肪干细胞联合颗粒脂肪进行移植其粒脂肪表面积和粒脂肪体积保有率均显著增加。
附图说明
图1显示为本发明实施例1中裸鼠注射移植颗粒脂肪后颗粒脂肪表面积差异显著性分析。
图2显示为本发明实施例1中裸鼠注射移植颗粒脂肪后颗粒脂肪体积保有率差异显著性分析。
图3显示为本发明实施例1中裸鼠注射移植颗粒脂肪1.5个月后解剖前的照片。
图4显示为本发明实施例1中裸鼠注射移植颗粒脂肪3个月后解剖前的照片。
图5显示为本发明实施例1中裸鼠注射移植颗粒脂肪1.5个月解剖后移植脂肪的照片。
图6显示为本发明实施例1中裸鼠注射移植颗粒脂肪3个月解剖后移植脂肪的照片。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。
实施例1
一种高存活率的移植颗粒脂肪的制备方法如下：
步骤一、新鲜脂肪原样在23℃、2000r/min的条件下离心5min后去除油层和组织液，得到纯化的颗粒脂肪；
步骤二、将I型胶原酶和胰蛋白酶按照体积比为1：1混合后得到混合胶原酶，再将颗粒脂肪组织与混合胶原酶按体积为4：1混合，在37℃下恒温震荡消化40min，继续在1500r/min下离心5min，得到初代脂肪干细胞；将初代脂肪干细胞培养到第三代至第五代，用生理盐水调整细胞密度为1×107/ml，得到用于移植的脂肪干细胞；
步骤三、将0.2ml的用于移植的脂肪干细胞添加到0.3ml的颗粒脂肪(步骤一中制备)，用1ml注射器吹打混匀，即得高存活率的移植颗粒脂肪。
上述方法制备得到的高存活率的移植颗粒脂肪注射至裸鼠背部右侧皮下作为实验组。
将0.2ml NaCl添加到0.3ml的颗粒脂肪(步骤一中制备)，用1ml注射器吹打混匀，即得移植颗粒脂肪。此方法制备得到的移植颗粒脂肪注射至裸鼠背部左侧皮下作为对照组。
在注射后1.5个月、3个月，测量移植的颗粒脂肪表面积和体积保有率。
注射后1.5个月剩余颗粒脂肪表面积对比如表格1所示。注射后3个月剩余颗粒脂肪表面积对比如表格2所示。注射后1.5个月剩余颗粒脂肪体积保有率对比如表格3所示。注射后3个月剩余颗粒脂肪体积保有率对比如表格4所示。
表格1注射后1.5个月剩余颗粒脂肪表面积对比
Figure BDA0002196435570000051
表格2注射后3个月剩余颗粒脂肪表面积对比
Figure BDA0002196435570000052
Figure BDA0002196435570000061
表格3注射后1.5个月剩余颗粒脂肪体积保有率对比
Figure BDA0002196435570000062
表格4注射后3个月剩余颗粒脂肪体积保有率对比
Figure BDA0002196435570000063
Figure BDA0002196435570000071
图1为裸鼠注射移植颗粒脂肪后颗粒脂肪表面积差异显著性分析。图2为裸鼠注射移植颗粒脂肪后颗粒脂肪体积保有率差异显著性分析。图3为裸鼠注射移植颗粒脂肪1.5个月后解剖前的照片(左边为对照组，右边为实验组)。图4为裸鼠注射移植颗粒脂肪3个月后解剖前的照片(左边为对照组，右边为实验组)。图5为裸鼠注射移植颗粒脂肪1.5个月解剖后移植脂肪的照片(左边为对照组，右边为实验组)。图6为裸鼠注射移植颗粒脂肪3个月解剖后移植脂肪的照片(左边为对照组，右边为实验组).
实施例2
一种高存活率的移植颗粒脂肪的制备方法如下：
步骤一、新鲜脂肪原样在20℃、2500r/min的条件下离心6min后去除油层和组织液，得到纯化的颗粒脂肪；
步骤二、将I型胶原酶和胰蛋白酶按照体积比为1：1.2混合后得到混合胶原酶，再将颗粒脂肪组织与混合胶原酶按体积为4：1.1混合，在38℃下恒温震荡消化30min，继续在1800r/min下离心6min，得到初代脂肪干细胞；将初代脂肪干细胞培养到第三代至第五代，用生理盐水调整细胞密度为5.0×107/ml，得到用于移植的脂肪干细胞；
步骤三、将0.2ml的用于移植的脂肪干细胞添加到0.3ml的颗粒脂肪(步骤一中制备)，用1ml注射器吹打混匀，即得高存活率的移植颗粒脂肪。
实施例3
一种高存活率的移植颗粒脂肪的制备方法如下：
步骤一、新鲜脂肪原样在22℃、1900r/min的条件下离心5min后去除油层和组织液，得到纯化的颗粒脂肪；
步骤二、将I型胶原酶和胰蛋白酶按照体积比为1：0.9混合后得到混合胶原酶，再将颗粒脂肪组织与混合胶原酶按体积为4：0.9混合，在36℃下恒温震荡消化45min，继续在1400r/min下离心5min，得到初代脂肪干细胞；将初代脂肪干细胞培养到第三代至第五代，用生理盐水调整细胞密度为0.5×107/ml，得到用于移植的脂肪干细胞；
步骤三、将0.2ml的用于移植的脂肪干细胞添加到0.3ml的颗粒脂肪(步骤一中制备)，用1ml注射器吹打混匀，即得高存活率的移植颗粒脂肪。
综上所述，本发明通过将脂肪干细胞联合颗粒脂肪进行移植，显著增加颗粒脂肪的存活率，方法操作简单、成本低，便于市场推广。所以，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (9)

1.一种高存活率的移植颗粒脂肪，其特征在于，所述移植颗粒脂肪由移植用脂肪干细胞与脂肪颗粒按照体积比为1：(1.0～2.0)组成；所述移植用脂肪干细胞为初代脂肪干细胞培养第三代至第五代的脂肪干细胞。
2.根据权利要求1所述的一种高存活率的移植颗粒脂肪，其特征在于：所述移植颗粒脂肪由移植用脂肪干细胞与脂肪颗粒按照体积比1：1组成。
3.根据权利要求1或2所述的一种高存活率的移植颗粒脂肪，其特征在于：所述移植用脂肪干细胞的细胞密度为1×106/ml～1×108/ml。
4.根据权利要求3所述的一种高存活率的移植颗粒脂肪，其特征在于：所述移植用脂肪干细胞的细胞密度为1×107/ml。
5.一种如权利要求1～4任一项所述高存活率的移植颗粒脂肪的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一、将脂肪原样离心去除油层和组织液后，得到纯化的脂肪颗粒；
步骤二、将脂肪颗粒与混合胶原酶进行恒温震荡消化后离心，得到初代脂肪干细胞，将初代脂肪干细胞传代培养，将第三代至第五代的脂肪干细胞用生理盐水调整细胞密度，得到用于移植的脂肪干细胞；
步骤三、将步骤二中用于移植的脂肪干细胞与步骤一中的脂肪颗粒按照体积比为1：
(1.0～2.0)加入混合容器中混合均匀，即得。
6.根据权利要求5所述的一种高存活率的移植颗粒脂肪的制备方法，其特征在于：所述步骤一中脂肪原样离心温度为20～25℃，离心速率为1800～2500r/min，离心时间为3～6min；
所述步骤二中脂肪颗粒恒温震荡消化的温度为35～38℃，时间为30～50min；
所述步骤二中离心转速为1200～1800r/min，离心时间为4～6min。
7.根据权利要求5所述的一种高存活率的移植颗粒脂肪的制备方法，其特征在于：所述步骤一中脂肪原样离心温度为23℃，离心速率为2000r/min，离心时间为5min；
所述步骤二中脂肪颗粒恒温震荡消化的温度为37℃，时间为40min；
所述步骤二中离心转速为1500/min，离心时间为5min。
8.根据权利要求5～7任一项所述的一种高存活率的移植颗粒脂肪的制备方法，其特征在于：所述步骤二中混合胶原酶为I型胶原酶和胰蛋白酶按照体积比为1：(0.8～1.2)混合得到；所述步骤二中颗粒脂肪组织与混合胶原酶的体积比为4：(0.9～1.1)。
9.根据权利要求8所述的一种高存活率的移植颗粒脂肪的制备方法，其特征在于：所述步骤二中混合胶原酶为I型胶原酶和胰蛋白酶按照体积比为1：1混合得到；所述步骤二中颗粒脂肪组织与混合胶原酶的体积比为4：1。
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