CN104984399A - 一种生物支架材料、svf辅助的脂肪组织制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种生物支架材料、SVF辅助脂肪组织制备方法及其应用。本发明是在无菌条件下，将生物支架材料、纯化脂肪颗粒用医用级胶原酶消化后制备的血管基质成分（stromal vascular fraction,SVF）与纯化脂肪颗粒按照一定比例混合均匀后，制备成填充用脂肪移植物。SVF是脂肪间充质干细胞等多种细胞的混合物，与自体脂肪颗粒混合后进行移植，在体内可以继续发育为成熟的脂肪组织，生物支架材料能为移植脂肪提供支撑，易于移植组织再血管化，提高移植组织的成活率；移植组织适于16G或18G针头注射，便于临床应用，可用于凹陷畸形的修复(如颞部、颊部凹陷)，面部、胸部美容充填，软组织功能重建等；尤其在美容充填中，本发明制备的移植脂肪组织可促进外形恢复、防止液化坏死。

Description

一种生物支架材料、SVF辅助的脂肪组织制备方法

技术领域

本发明属于医用脂肪移植技术领域，具体涉及一种生物支架材料和SVF辅助的脂肪移植材料的制备方法及其应用。

背景技术

数据显示，目前到各整形医院接受隆胸术的女性中年龄集中在25～45岁之间，其中，超过67.58%的人选择自体脂肪隆胸；实施面部除皱抗衰美容的人群集中在35～55岁之间，约45%以上的人选择自体脂肪除皱抗衰美容。

注射型自体脂肪颗粒移植是目前临床经常使用的一种脂肪移植方案，移植物多来源于自体脂肪的抽提。这种方法的优点是生物相容性好，组织来源丰富，易于塑形，不会产生免疫排斥等不良反应；缺点是注射入面部或乳房部位的脂肪颗粒不能很好的建立起血液供应系统，当大量脂肪堆积到一起时，会因供血不足导致脂肪细胞坏死、溶解、吸收，极易引发感染、血肿、变形、疼痛、硬结、囊肿、坏死等后遗症。研究发现约有50%-60%的脂肪颗粒被吸收，存活下来的组织也逐渐被纤维化或钙化，效果不持久，常需要间隔3个月后再次注射来维持形状。

针对以上问题，中国专利201310508120.8公开了脂肪颗粒填充物的制备方法，其制备的脂肪颗粒填充物由脂肪前细胞和脂肪颗粒组成。脂肪前体细胞的添加能提高移植物的成活率，但如果前体细胞的数量不足以发挥功能或细胞活性较低，还是达不到改善移植效果的目的。中国专利201110203210.7公开了一种富集自体干细胞的脂肪组织隆胸材料的制备方法，该专利分别通过首次少量抽脂分离并扩大培养脂肪间充质干细胞、移植前抽脂分别制备SVF和脂肪颗粒，再将所有细胞与脂肪颗粒混合，制备隆胸材料。但隆胸术需要填充大量的移植材料，如果新生细胞没有很好的胞外支架，也较难成活。

发明内容

为克服现有脂肪移植材料制备方法的不足，本发明的目的是提供一种生物支架材料、血管基质成分（stromal vascular fraction, SVF）辅助的脂肪移植材料的制备方法，使所获得的移植材料具有注射后易于再血管化、成活率提高的优点，安全可靠，一劳永逸。适用于软组织填充、修复软组织缺损造成的凹陷畸形、面部及身体美容塑形。

本发明所述的脂肪移植材料制备方法，包括有生物支架材料的选择、脂肪组织的纯化、脂肪SVF的制备、以及三者混合制备最终移植材料，具体步骤包括：

步骤一、脂肪组织的纯化

将抽脂获得的脂肪组织1000-2000r/min，21℃离心2-10min，去除液体部分，得到固态的脂肪颗粒。再将得到的脂肪颗粒去除结缔组织，用组织剪将大块组织剪碎，以1ml注射器去除针头后能正常抽取为宜；

所述脂肪组织离心，目的为去除麻醉过程中注射的肿胀液，使脂肪组织纯度更高；去除结缔组织是使后续移植材料混合均匀和易于注射。

步骤二、脂肪SVF的制备

将上述纯化的脂肪颗粒取出一半，加等体积生理盐水进行清洗，1000-1500r/min，21℃离心3-10min，去除液体部分，得到固态的脂肪颗粒。再加入等体积生理盐水配置的胶原酶溶液，200U/ml，37℃，恒温震荡消化30-60min，收集消化液，500-1200r/min，21℃离心5-10min，去除上清，取细胞沉淀，再加入5-10ml生理盐水，500-1500r/min，21℃离心5-10min，再次取细胞沉淀，用1-10ml生理盐水重悬，获得脂肪SVF。

在倒置相差显微镜下观察细胞形态，用细胞计数仪进行计数，并进行台盼蓝染色，计算出细胞成活率，并进行总成活细胞数的计算：

总成活细胞数=成活率×细胞总数；

所述SVF是多种细胞的混合物，除含有脂肪间充质干细胞外，还含有基质细胞、血管内皮细胞、成纤维细胞、巨噬细胞、血液成分细胞、平滑肌细胞等十余种细胞。可提高移植材料的成活率，无需体外扩大培养，分离后可直接应用。SVF中各种细胞能够促进周围环境中多种生长因子的分泌，如VEGF、PDGF、EGF、FGF、IGF等，从而进一步促进血管新生，在短时间内为移植的脂肪提供血液和养分，提高了祖细胞和脂肪组织的存活率；另一方面，SVF具有免疫调节作用，能够降低炎症反应，为移植的脂肪存活提供一个适宜的环境。

所述生理盐水均为医用0.9%的NaCl注射液；所述胶原酶为医用级。

步骤三、生物支架材料的选择

微粒化生物支架材料可以选择已商品化的产品或自行制备，其材质为机体可接受的生物可降解材料或来源于自体成分的纤维支架成分，包括胶原、透明质酸、聚乳酸、羟基磷灰石、富血小板纤维蛋白（PRF）的任一种或是几种的组合，微粒化生物支架材料的粒径为20-1000um；

所述生物支架材料均为临床注射填充材料，安全可靠。支架材料的使用，能为新生细胞提供支撑和空间，便于细胞生长及新生血管的长入；移植初期，支架材料能起到很好的辅助付型作用，随着支架材料的代谢吸收，新生组织将填充其原有的空间，提高整体的填充效果和组织成活率。

步骤四、移植材料混合

将步骤二中SVF与步骤三选择的生物支架材料用1-5ml注射器反复吹吸混合均匀，再将上述混合物与步骤一制备的脂肪颗粒混合均匀，保证混合物中脂肪SVF含量为10⁶-10⁷/ml。

所述SVF和生物支架材料选用1ml注射器混合是便于后续注射；所述SVF的数量控制是保证移植脂肪材料中鲜活干细胞和其他促进血管生成细胞的数量，使移植组织不易缺乏营养而坏死或被吸收。

本发明所提供的脂肪移植材料制备方法的优势在于：

1、此方法制备的移植材料易于成活：生物支架材料、SVF与脂肪颗粒均匀混合移植后，能为移植细胞和新生细胞提供营养和支架，利于移植脂肪材料成活和再血管化；

2、此方法制备的移植材料使用方便：移植材料适于16G或18G针头注射，对受区创伤小，且移植后不会留下疤痕，便于临床应用，适用于大面积软组织缺损的手术修复；主要功能有：用于凹陷畸形的修复(如颞部、颊部凹陷)，面部、胸部美容充填，软组织功能重建等；尤其在美容充填中，本发明制备的移植脂肪组织可促进外形恢复、防止液化坏死；

3、此方法制备的移植材料使用安全：移植材料中的所含成分均来源于自体，生物相容性好，外源添加物在临床使用广泛，不会产生免疫排斥反应，使用更安全。

本发明所制备的移植脂肪材料中SVF及生物支架材料的添加能很好的解决移植过程中大量脂肪的堆积问题，从而避免了脂肪细胞坏死、溶解、吸收、变形等并发症的产生。SVF细胞数量和活性的控制，也有利于新生血管的快速形成，建立完整的血供系统，提高成活率。因此，本发明所制备的移植脂肪材料便于临床推广。

图1A为所制备单纯脂肪颗粒移植裸鼠两个月后的解剖图片，可以看出移植脂肪大部分被吸收；图1B为本发明实例1所制备含PRF、SVF的脂肪移植物移植裸鼠后两个月的解剖图片，可以看出大部分移植脂肪仍然存在，并可看见大量血管生成；图1C单纯脂肪移植后切片CD31染色未见清晰的血管，图1D含PRF、SVF的移植物切片可见一个大血管（箭头指示部位），血管周围也有许多再生组织。

附图2A、2B为本发明实例2PRF、SVF复合自体脂肪颗粒面部除皱前后的对比照片。从图2A可看出，填充前法令纹较深，而图2B填充三个月后，鼻唇沟饱满，面部肤色及瘢痕也有明显改善。

附图说明：

图1A为所制备单纯脂肪颗粒移植裸鼠两个月后的解剖图片，可以看出移植脂肪大部分被吸收；图1B为本发明实例1所制备含PRF、SVF的脂肪移植物移植裸鼠后两个月的解剖图片，可以看出大部分移植脂肪仍然存在，并可看见大量血管生成；图1C单纯脂肪移植后切片CD31染色未见清晰的血管；图1D含PRF、SVF的移植物切片可见一个大血管（箭头指示部位），血管周围也有许多再生组织。

附图2A、2B为本发明实例2PRF、SVF复合自体脂肪颗粒面部除皱前后的对比照片。从图2A可看出，填充前法令纹较深，而图2B填充三个月后，鼻唇沟饱满，面部肤色及瘢痕也有明显改善。

具体实施方式

以下结合实例对本发明技术方案作进一步的详细说明。

实例1：

步骤一、脂肪组织的纯化

将抽脂获得的40ml脂肪组织1200r/min，21℃离心3min，去除液体部分，得到20ml固态的脂肪颗粒。再将得到的脂肪颗粒去除结缔组织，用组织剪将大块组织剪碎，以1ml注射器去除针头后能正常抽取为宜；

步骤二、脂肪SVF的制备

将上述纯化的脂肪颗粒取出10ml，加10ml生理盐水进行清洗，1200r/min，21℃离心3min，去除液体部分，得到固态的脂肪颗粒。再加入10ml生理盐水配置的胶原酶溶液（上海乔源生物制药有限公司），200U/ml，37℃，恒温震荡消化30min，收集消化液，800r/min，21℃离心5min，去除上清，取细胞沉淀，再加入10ml无菌生理盐水，800r/min，21℃离心5min，再次取细胞沉淀，用1ml生理盐水重悬，在倒置相差显微镜下观察细胞形态，用细胞计数仪进行计数，细胞总数为2.8×10⁷个。并进行台盼蓝染色，计算出细胞成活率为93%，总成活细胞数为2.6×10⁷个；

步骤三、生物支架的选择

本实例选取的支架材料为瑞蓝2号透明质酸。

步骤四、移植材料的混合

将步骤三中的透明质酸与步骤二中SVF用两个5ml注射器去针头连通后的装置混合均匀，再将上述混合物与部分步骤一制备的脂肪颗粒混合均匀，保证混合物中活性脂肪SVF含量为10⁶/ml。

将上述未混合透明质酸和SVF的脂肪颗粒、混合透明质酸和SVF的移植脂肪进行裸鼠皮下移植，每只裸鼠在背部脊椎两侧各注射500ul上述两种移植物，两个月后托颈椎处死裸鼠，剪开背部皮肤，可见单纯脂肪颗粒大部分被吸收（参见附图1A），含PRF和SVF的移植脂肪形态良好，并有大量新生血管长出（参见附图1B）。将两组脂肪组织取出，制备石蜡切片并进行血管内皮细胞标记物CD31的免疫组织化学染色，单纯脂肪颗粒移植后的切片没有再生血管（参见附图1C），含PRF和SVF的移植脂肪切片有大量血管生成（参见附图1D，箭头指示部位）。

实例2：

步骤一、脂肪组织的纯化

将从面部法令纹填充者腹部注射肿胀液后获得的50ml脂肪组织1200r/min，21℃离心3min，去除液体部分，得到25ml固态脂肪颗粒。再将得到的脂肪颗粒去除结缔组织，用组织剪将大块组织剪碎，以1ml注射器去除针头后能正常抽取为宜；

步骤二、脂肪SVF的制备

将上述纯化的脂肪颗粒取出12ml，加12ml生理盐水进行清洗，1200r/min，21℃离心3min，去除液体部分，得到固态的脂肪颗粒。再加入12ml生理盐水配置的胶原酶溶液（上海乔源生物制药有限公司），200U/ml，37℃，恒温震荡消化30min，收集消化液，800r/min，21℃离心5min，去除上清，取细胞沉淀，再加入10ml无菌生理盐水，800r/min，21℃离心5min，再次取细胞沉淀，用1ml生理盐水重悬，在倒置相差显微镜下观察细胞形态，用细胞计数仪进行计数，细胞总数为3.27×10⁷个。并进行台盼蓝染色，计算出细胞成活率为89%，总成活细胞数为2.91×10⁷个；

步骤三、生物支架材料的选择

本实例支架材料为PRF，其制备过程为：抽取面部法令纹填充者血液20ml于普通无菌采血管中，离心机3000r/min，4℃离心15min，置于4℃冰箱冷藏30min，备用；

步骤四、移植材料的混合

将步骤三4℃冷藏的血液取出，去除上层红细胞层和中层血清层，将下层9ml淡黄色PRF凝胶取出，用眼科剪剪成1mm³大小的颗粒，与步骤二中脂肪SVF混合均匀，再将上述混合物与部分步骤一制备的13ml脂肪颗粒混合均匀，保证混合物中活性脂肪SVF含量为2×10⁶/ml。

将上述混合PRF、SVF的移植脂肪进行求美者法令纹填充，填充前可见明显的法令纹（参见附图2A），单侧进行7ml含PRF、SVF的移植脂肪填充，3个月后，脂肪吸收稳定，法令纹改善效果明显（参见附图2B）。

Claims (8)

1.一种生物支架材料、SVF辅助的脂肪组织制备方法及其应用，其特征在于：脂肪移植材料是在无菌条件下，由生物支架、SVF、脂肪颗粒三者均匀混合而成。

2.其中，生物支架选自临床用于注射填充的生物材料、脂肪颗粒由抽脂术后脂肪组织纯化而来、SVF是由部分纯化后的脂肪颗粒制备的。

3.根据权利要求1所述的一种生物支架材料、SVF辅助的脂肪组织制备方法及其应用，其特征在于，包括以下操作步骤：

步骤一、脂肪组织的纯化

将抽脂获得的脂肪组织1000-2000r/min，21℃离心2-10min，去除液体部分，得到固态的脂肪颗粒。

4.再将得到的脂肪颗粒去除结缔组织，用组织剪将大块组织剪碎，以1ml注射器去除针头后能正常抽取为宜；

步骤二、脂肪SVF的制备

将上述纯化的脂肪颗粒取出一半，加等体积生理盐水进行清洗，1000-1500r/min，21℃离心3-10min，去除液体部分，得到固态的脂肪颗粒。

5.再加入等体积生理盐水配置的胶原酶溶液，200U/ml，37℃，恒温震荡消化30-60min，收集消化液，500-1200r/min，21℃离心5-10min，去除上清，取细胞沉淀，再加入5-10ml生理盐水，500-1500r/min，21℃离心5-10min，再次取细胞沉淀，用1-10ml生理盐水重悬，获得脂肪SVF。

6.在倒置相差显微镜下观察细胞形态，用细胞计数仪进行计数，并进行台盼蓝染色，计算出细胞成活率，并进行总成活细胞数的计算：

总成活细胞数=成活率×细胞总数；

步骤三、生物支架材料的选择

微粒化生物支架材料可以选择已商品化的产品或自行制备，其材质为机体可接受的生物可降解材料或来源于自体成分的纤维支架成分，包括胶原、透明质酸、聚乳酸、羟基磷灰石、富血小板纤维蛋白（PRF）的任一种或是几种的组合，微粒化生物支架材料的粒径为20-1000um；

步骤四、移植材料混合

将步骤二中SVF与步骤三选择的生物支架材料用1-5ml注射器反复吹吸混合均匀，再将上述混合物与步骤一制备的脂肪颗粒混合均匀，保证混合物中脂肪SVF含量为10⁶-10⁷/ml。

7.根据权利要求1所述的一种生物支架材料、SVF辅助的脂肪组织制备方法及其应用，其特征在于，所述移植脂肪材料可用16G或18G针头注射，对受区创伤小，易于愈合，不会留下疤痕。

8.根据权利要求1所述的一种生物支架材料、SVF辅助的脂肪组织制备方法及其应用，其特征在于，可用于凹陷畸形的修复(如颞部、颊部凹陷)，面部、胸部美容充填，软组织功能重建等。