CN101850132B - 组织工程化乳房移植物及其构建方法 - Google Patents

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本发明属于生物医学工程中用组织工程方法构建人工器官技术领域，涉及一种组织工程化乳房移植物及其构建方法。本发明所述的组织工程化乳房移植物，以可注射性材料I型胶原凝胶作为载体支架，以脂肪干细胞为种子细胞，所述种子细胞附着于载体支架上，形成脂肪干细胞/I型胶原凝胶复合体，胶原终浓度为2mg/ml，细胞密度为2×107/ml。本发明所述的组织工程乳房移植物采用可注射型材料负载自体脂肪干细胞构成，制备简便，通过实验证实可产生新生脂肪组织，该组织工程乳房移植物最终转化为自体脂肪，不存在免疫排斥问题，从而为乳房填充和重建提供一种新的解决方案。

Description

组织工程化乳房移植物及其构建方法
技术领域
本发明属于生物医学工程中用组织工程方法构建人工器官技术领域，具体是涉及一种组织工程化乳房移植物及其构建方法。
背景技术
由于种族、遗传及营养等原因，相当一部分的女性乳房发育不良或松弛萎缩。隆乳术以其立竿见影的效果受到广大爱美女性的青睐。乳房填充是目前用来改善女性乳房发育不良或松弛萎缩，以及由于肿瘤切除或外伤等原因造成的乳房缺失的治疗方法。在美国每年有20万女性接受隆胸手术，中国国内每年隆胸人数尚无准确统计，而文献推测人数可能在30万至50万之间。目前，目前国内外医学隆乳的方法大致可分为注射法和手术法。注射法使用的材料有自体脂肪颗粒；而手术法则使用硅胶囊假体置入隆乳。
目前，国内外最常用的隆乳方法包括：(1)自体脂肪注射。自体脂肪注射隆胸已开展多年，但因其超过50％的吸收率及可能存在脂肪液化、感染、血肿等并发症，注射脂肪液化所引起的囊肿亦可干扰乳腺肿瘤的诊断，限制了该技术的应用。移植过程中脂肪细胞的损伤，受区早期血液循环建立的状况，移植的脂肪细胞因缺血、缺氧而液化，成熟的脂肪细胞没有增殖能力等，可能是造成脂肪注射隆胸后高吸收率的原因。(2)假体置入法隆乳。根椐硅胶弹性膜内的材料不同，可分为硅凝胶假体和盐水充注式假体。由于假体是异物，植入后导致各种并发症的发生。隆乳术后假体包膜挛缩是术后最常见的并发症，硅胶弹性膜做为一种异物置入人体后引起局部组织反应，形成纤维包膜。严重时发生乳房硬化，发生率高达4.76％-6.19％。
组织工程为乳房填充和重建提供一种新的方法。组织工程的基本原理是从机体获取少量活组织，将功能细胞从组织中分离出来并在体外进行培养、扩增，然后与可降解、吸收的支架材料按一定比例混合，植入体内病损部位，生物材料在体内逐渐被降解和吸收，植入的细胞在体内增殖和分泌细胞外基质，最后形成所需的组织或器官。乳房组织工程是利用组织工程原理对乳房进行填充或再造，其目的是改善其外观。乳房的形状和大小则主要由脂肪组织维持。目前，乳房组织工程的主要难题在于脂肪组织的形成，应用于乳房的组织工程移植物尚未见报道。
发明内容
针对上述现有技术状况，本发明提供一种组织工程乳房移植物，该组织工程乳房移植物为可注射型材料负载自体脂肪干细胞构成，制备简便，通过实验验证可产生新生脂肪组织。制备的组织工程乳房移植物，最终转化为自体脂肪，不存在免疫排斥问题。
脂肪干细胞(Adipose-Derived Stem Cells，ADSCs)具有易获取、增殖快及成脂分化能力的特点，可作为脂肪组织工程的种子细胞。I型胶原蛋白是成熟的产品，本实验使用的I型胶原蛋白(collagen type I，COL)是通过醋酸提取，氯化钠沉淀、磷酸氢二钠沉淀等步骤制备的(参考文献Birkedal-Hansen H.Catabolism and turnover of collagen：Collagenases.Methods Enzymol，1987，144：140-171)。I型胶原蛋白在酸性、低温的状态下为液态，在中性、常温的状态下会迅速凝结，本发明利用这个特点，使用其作为可注射水凝胶支架。I型胶原凝胶支架作为水凝胶类支架的一种，生物相容性好，可降解，可以实现与种子细胞的良好的复合。本发明将I型胶原凝胶与脂肪干细胞复合后直接注射于大鼠乳腺皮下，研究脂肪干细胞与I型胶原凝胶复合体在乳腺的分化情况，探讨将其应用于乳房缺损修复的可行性。
相对于现有技术，本发明具有以下特点和优点：
(1)移植物最终转化为自体脂肪组织，不存在免疫排斥问题。比较假体移植，不易出现包膜挛缩等并发症；比较脂肪游离移植，不易出现感染，脂肪液化等并发症。
(2)采用ADSCs作为组织工程的种子细胞，该细胞具有以下优点：首先，取材方便是其最大的优势，脂肪组织分布广泛，而且吸脂手术属于技术成熟的常规手术，手术风险小。其次，ADSCs在脂肪组织中含量丰富，每250-500mL脂肪抽吸物中的细胞产量可达109个。最后，ADSCs增殖快，成脂分化能力强，冷冻保存后增殖分化能力无明显改变。由此可见，ADSCs适合作为脂肪组织工程的种子细胞。
(3)I型胶原凝胶作为种子细胞的支架。胶原是脊椎动物和人体的最主要结构蛋白，约占机体总蛋白的20％～30％。其中以I、II、III型最为常见，约占体内总胶原蛋白的80％～90％。胶原蛋白生物相容性好，作为支架可促进细胞粘附，降解产物对人体无害。作为美国FDA批准的注射移植材料，胶原蛋白使用的长期安全性已经在临床上得到证实。本发明经实验证明，I型胶原支架可完全降解，降解产物未引起周围乳腺组织炎症反应。
(4)可注射支架在骨、软骨及脂肪组织工程已有开展，但应用于乳房组织工程尚未见报道。本发明采用可注射支架复合细胞的方法构建组织工程乳房移植物，具有微创、美观、可重复的优点，更符合整形外科的发展趋势。
(5)通过本发明的实验发现，脂肪干细胞/I型胶原凝胶复合体(ADSCs-COL)注射后，未见大鼠乳腺皮肤有明显红肿及感染等炎症表现，病理切片显示注射处乳腺组织未见明显炎症反应。说明其组织相容性好，无排斥反应。实验组见新生脂肪组织形成，而对照组未见明显新生脂肪组织，说明ADSCs在三维胶原支架内能增殖分化为成熟脂肪组织。
综上所述，本发明所述的组织工程乳房移植物采用可注射型材料负载自体脂肪干细胞构成，制备简便，通过实验证实可产生新生脂肪组织，该组织工程乳房移植物最终转化为自体脂肪，不存在免疫排斥问题，从而为乳房填充和重建提供一种新的解决方案。
附图说明
图1为显微镜图(100倍)，显示经分离培养至第三代的大鼠脂肪干细胞。
图2为脂肪干细胞经成脂诱导2周后油红O染色的显微镜图(100倍)，图中红色为脂滴。
图3为脂肪干细胞经成骨诱导4周后von Kossa染色的显微镜图(100倍)，图中黑色为钙盐沉积。
图4为大鼠注射脂肪干细胞/I型胶原凝胶复合体(ADSCs-COL)后的外观照片。
图5为大鼠注射8周后的解剖照片。图5a为实验组，见ADSCs-COL注射处新生脂肪样组织形成；图5b为对照组，见单纯COL注射未见明显脂肪形成。
图6为解剖后取出的脂肪组织的照片。图6a为实验组，显示注射处的脂肪组织的大小；图6b为对照组，显示注射处的脂肪组织的大小。
图7为新生组织HE染色的显微镜图(100倍)，图中见支架已完全降解，脂肪组织形成，而无炎症反应表现。
图8为新生组织油红O染色的显微镜图(400倍)，红色为脂滴，证明为成熟脂肪组织。
具体实施方式
以下结合实验来说明本发明的技术方案和技术效果。
实验动物和主要材料、仪器
实验动物：成年雌性Sprague Dawley大鼠10只，清洁级，体重160～200g，9～10周龄。购自中山大学实验动物中心。
主要材料：胎牛血清FBS、DMEM/F12培养基(Gibco公司，美国)；吲哚美辛、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、地塞米松、牛胰岛素、抗坏血酸、II型胶原酶(Sigma公司，美国)；β-甘油磷酸钠(Fluka公司，美国)；油红O(Amresco公司，美国)；I型胶原蛋白(生友生物技术有限公司)。
主要仪器：倒置相差显微镜(Nikon公司，日本)；CO2培养箱(Heraeus公司，德国)。
实施例一：大鼠脂肪干细胞(ADSCs)的制备
大鼠ADSCs的分离培养
以10％水合氯醛(3ml/kg)腹腔注射麻醉大鼠，无菌条件下取双侧腹股沟脂肪垫于PBS液中。用PBS液将脂肪垫洗3次，去除可见血管及纤维，将其剪碎。0.075％II型胶原酶37℃消化3Omin(每10min吹打1次)。等体积含10％FBS的DMEM/F12培养液中和胶原酶，1100r/min离心5min，去除上清和脂肪组织。DMEM/F12完全培养液重悬，400目细胞筛(孔径6Oμm)过滤。以1×105/ml接种，37℃、5％CO2和95％湿度的条件下培养，24小时后换液，去除未贴壁细胞、脂滴及残渣。之后每72小时换液一次。贴壁细胞融合达80％～90％后，用0.25％胰蛋白酶消化传代，按1∶3传代接种。
大鼠ADSCs的形态观察
倒置相差显微镜下观察，刚接种的原代细胞呈圆形，与脂滴一起悬浮于培养液中，24h换液后贴壁细胞呈圆形、多角形或梭形。此后细胞不断增殖，以梭形细胞为主。6～7天细胞融合成单层，排列有一定的方向性，可消化后传代。传代后的ADSCs增殖生长迅速，3～4天后细胞完全融合。连续传10代，细胞的形态无明显变化。图1显示大鼠第三代脂肪干细胞的形态。
大鼠ADSCs的成脂、成骨诱导分化
成脂诱导剂：10-6moL/L地塞米松，10mg/L胰岛素，0.5mmol/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)和0.2mmol/L吲哚美辛。
成骨诱导剂：10-7moL/L地塞米松，50mg/L抗坏血酸，10mmol/Lβ-甘油磷酸钠。
采用第3代ADSCs细胞，以105/孔接种于6孔板，待其生长融合后，于普通培养液中分别加入上述成脂诱导剂和成骨诱导剂进行培养。实验组、对照组均含有4例样本。
成脂诱导：2周后进行油红O染色检测(油红O，Amresco公司，美国)。PBS洗涤三次，10％甲醛钙液固定10分钟，油红O工作液密闭染15分钟，蒸馏水冲洗，苏木精复染，立即在显微镜下观察。
成骨诱导：4周后进行von Kossa染色检测(硝酸银，上海精细化工材料研究所；硫代硫酸钠，广州化学试剂厂)。von Kossa染色法：PBS洗涤三次，10％甲醛室温固定30分钟。蒸馏水冲洗，加入5％(wt/vol)硝酸银溶液，避光30分钟，然后置紫外线下照射60分钟，加入5％(wt/vol)硫代硫酸钠30分钟，蒸馏水冲洗，立即在显微镜下观察。
大鼠ADSCs的成脂、成骨诱导分化的鉴定
经成脂诱导2周后，如图2所示，油红O染色显示细胞胞浆内布满大小不一的红色脂滴颗；而非诱导组未见明显脂滴形成。说明该细胞具备向脂肪细胞方向分化的能力。
经成骨诱导4周后，如图3所示，Von Kossa染色可见由于细胞及其周围附着的钙盐与硝酸银发生置换反应而被染成黑色，证明此时细胞已发生矿化；而非诱导组未见明显钙盐沉积。Von Kossa染色说明该细胞具备向成骨细胞方向分化的能力。
实施例二：组织工程化乳房移植物的构建
脂肪干细胞/I型胶原凝胶复合体(ADSCs-COL)的构建
在构建组织工程化乳房移植物之前24小时使用上述成脂诱导剂培养细胞。注射前将10瓶(25cm2培养瓶)生长融合的第3代ADSCs细胞消化离心后，加入培养液至540μl中，含细胞数量约2×107个。
I型胶原蛋白溶液：I型胶原蛋白浓度5mg/ml，融解于0.006mol/L乙酸。于冰浴条件下，将400μl I型胶原蛋白溶液加入到24μl 0.1mmol/L NaOH中，立刻混匀，再加入46μl10×PBS，混匀后测定pH值为7。再加入上述540μl的细胞悬液，形成脂肪干细胞/I型胶原凝胶复合体(胶原终浓度为2mg/ml，细胞密度为2×107/ml)。室温(20-25℃)下放置30分钟溶液可凝固。
大鼠自体注射
用10％水合氯醛(3ml/kg)腹腔注射麻醉大鼠，术区消毒。注射器抽取1mlADSCs-COL凝胶，距乳头1cm处皮下进针，潜行至乳头下方，注射平面位于乳腺与胸肌之间，将ADSCs-COL凝胶注射入右上侧乳腺(实验组)，拔针，进针点压迫10秒。同法在左上侧乳腺注射COL凝胶1ml(对照组)。共注射10例。
注射后定期观测大鼠乳腺皮肤情况。8周后，麻醉并解剖大鼠，观测有无新生组织形成，测量新生组织湿重，新生组织分别切片，进行油红O染色及HE染色。
统计学方法
采用SPSS 16.0统计软件包进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用t检验，P值＜0.05为有统计学意义。
结果
胶原凝胶注射后，可见乳腺区域局部隆起，如图4所示。定期观察，未见大鼠乳腺皮肤有明显红肿及感染等炎症表现。
8周后解剖大鼠，实验组可见乳腺与胸肌之间有脂肪样新生组织形成，如图5a所示，注射处脂肪组织大小如图6a所示，平均湿重为(123+/-18)mg；对照组未见明显新生组织形成，如图5b所示，注射处脂肪组织大小如图6b所示，平均湿重为(19+/-7)mg。两组间存在统计学差异，P＜0.01。
新生组织HE染色结果表明，支架已完全降解，有脂肪组织形成，而无炎症反应表现。如图7所示。
新生组织油红O染色结果表明，新生组织为成熟脂肪组织。如图8所示。

Claims (1)

1.一种组织工程化乳房移植物，其特征在于：以可注射性材料I型胶原凝胶作为载体支架，以脂肪干细胞为种子细胞，所述种子细胞附着于载体支架上，形成脂肪干细胞／I型胶原凝胶复合体，胶原终浓度为2mg/ml，细胞密度为2×107/ml；所述脂肪干细胞是采用培养至第3代，构建组织工程化乳房移植物之前24小时加入成脂诱导剂进行诱导后的脂肪干细胞。
2．根据权利要求1所述的组织工程化乳房移植物，其特征在于：所述的成脂诱导剂包括以下成分：10-6 moL／L地塞米松，10 mg／L胰岛素，0.5 mmol／L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤和0.2 mmol／L吲哚美辛。
3．如权利要求1所述的组织工程化乳房移植物的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
A．常规方法分离和培养脂肪干细胞，培养至第3代；
B．在构建组织工程化乳房移植物之前24小时使用成脂诱导剂培养上述脂肪干细胞；
C．将步骤B所得的脂肪干细胞消化、离心后，加入培养液，调整为含细胞数量约2×107个；
D．配制I型胶原蛋白溶液：于冰浴条件下，通过加入氢氧化钠溶液及磷酸盐缓冲液，将酸性的I型胶原蛋白溶液pH值调为7；
E．在上述I型胶原蛋白溶液中加入步骤C所得的脂肪干细胞悬液，20-25oC放置30分钟，凝固形成脂肪干细胞／I型胶原凝胶复合体，胶原终浓度为2mg/ml，细胞密度为2×107/ml。
4．根据权利要求3所述的组织工程化乳房移植物的构建方法，其特征在于：所述步骤B中的成脂诱导剂包括以下成分：10-6 moL／L地塞米松，10 mg／L胰岛素，0.5 mmol／L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤和0.2 mmol／L吲哚美辛。
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