CN115137527B - 一种力学仿生复合乳房支架的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种力学仿生复合乳房支架的制备方法，包括含孔阵列的螺旋二十四面体乳房支架结构的设计与优化、熔融沉积成型3D打印(FDM)、人脂肪干细胞光固化生物墨水的制备、复合支架的制备。本发明采用上述的一种力学仿生复合乳房支架的制备方法，将支架弹性模量调整到了与乳房组织相匹配的水平，实现了乳房支架的力学仿生，同时，复合支架中的光固化水凝胶网络为人脂肪干细胞和自体脂肪细胞提供了生长所需的微环境，促进细胞的增殖、迁移和分化。支架既满足了机械性能的要求，又保证了生物相容性，为乳腺癌术后乳房修复和重建提供了新思路。
Description
技术领域
本发明涉及组织工程技术领域，尤其是涉及一种力学仿生复合乳房支架的制备方法。
背景技术
目前，乳腺癌已成为世界上最常见的癌症。早期乳腺癌的治疗手段以保乳手术为主，药物治疗为辅。保乳手术相较全乳房切除术而言具有创伤小、患者顺应性高等特点。尽管保乳手术仅需切除肿瘤及其周围1-2cm组织，但术后仍会在乳房中造成较大空缺，导致乳房畸形，严重影响患者生活质量。因此，术后乳房的修复极为重要。
假体移植和自体皮瓣移植是当前乳房修复的主要技术手段。其中，假体移植易引起包膜挛缩，进而导致乳房变形、疼痛等并发症；自体皮瓣移植会导致供区损伤，术后也会出现乳房变形、皮瓣坏死等问题。组织工程为乳房修复提供了新思路，其旨在通过将提取的自体细胞和生物材料支架相结合形成生物活性支架，并将支架植入体内，从而达到修复乳房创伤和重建乳房功能的目的。
在组织工程中，常用可生物降解高分子聚合物或水凝胶材料通过3D打印技术制备高精度生物活性支架以修复乳房。可生物降解高分子聚合物支架具有弹性模量可调范围广的特点，且其抗疲劳能力强，能够提供足够的机械支撑。但目前可生物降解高分子聚合物支架的弹性模量与乳房组织不匹配，支架弹性模量远高于乳房组织，无法有效刺激乳房修复和重建，且其缺乏细胞生长所需的微环境，生物相容性较差。水凝胶具有类细胞外基质的特点，利于细胞生长，但其机械性能较差，无法保证乳房修复、重建过程的长期顺利进行。因此，支架机械性能和生物相容性之间的矛盾仍是目前乳房修复亟待解决的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种力学仿生复合乳房支架的制备方法，解决现有技术中存在的问题，实现兼具机械性能和生物相容性的力学仿生复合乳房支架的制造，为乳腺癌术后乳房修复和功能重建提供了新思路。
为实现上述目的，本发明提供了一种力学仿生复合乳房支架的制备方法，步骤如下：
S1、通过三维建模软件设计具有孔阵列的Gyroid乳房支架，得到未优化的力学仿生乳房支架原始模型；
S2、通过有限元仿真软件对步骤S1得到的乳房支架模型进行静态结构力学压缩仿真分析和流体流动分析，得到支架的弹性模量、应力分布、渗透率和流速分布的数据；
S3、优化步骤S1得到的支架模型，使其在步骤S2中得到的弹性模量、应力分布、渗透率和流速分布的数据满足支架设计要求，得到优化后的力学仿生乳房支架模型；
S4、将步骤S3得到的支架模型通过FDM技术，利用聚己内酯打印形成Gyroid支架；
S5、将目标自体脂肪干细胞培养于培养液中，待细胞增殖到一定数目时，将hADSCs消化重悬后得到细胞悬液；
S6、用灭菌后的超纯水溶解PEGDA，然后将光引发剂溶解于PEGDA溶液中，调节溶液的pH至中性，过滤得到PEGDA预聚液；
S7、将步骤S5得到的细胞悬液加入到步骤S6得到的PEGDA预聚液中，混合均匀，得到PEGDA生物墨水；
S8、将步骤S7得到的PEGDA生物墨水灌注到步骤S4得到的Gyroid支架中，通过光固化使其成形，得到力学仿生复合乳房支架。
优选的，步骤S1中，Gyroid支架的相对密度为15％，Gyroid单元大小为10mm×10mm×10mm，Gyroid支架整体尺寸为20mm×20mm×20mm，Gyroid支架中的孔阵列为3×4孔阵列，且孔阵列在三个坐标轴方向贯穿支架，孔间距为5mm，孔径为2-3mm。
优选的，步骤S3中，优化后的乳房支架弹性模量为0-1MPa，与乳房组织相匹配，且应力分布均匀，无明显应力集中出现；同时，支架的渗透率和流速分布满足支架设计要求。
优选的，步骤S4中，FDM打印过程中喷头直径为0.4mm，打印层厚为0.2mm，打印温度为110℃，打印平台温度为65℃，打印速度为30mm/s。
优选的，步骤S5中，培养液包括人脂肪干细胞培养基、胎牛血清、青霉素和链霉素，其体积比为100:10:1:1；细胞在温度为37℃、CO 2 浓度为5％的环境下培养，使用蛋白消化酶对hADSCs进行消化处理。
优选的，步骤S6中，PEGDA预聚液中PEGDA的分子量为700，其质量浓度为7％；光引发剂为LAP，其质量浓度为0.5％；PEGDA预聚液的pH为7.4。
优选的，步骤S7中，PEGDA生物墨水中人脂肪细胞浓度为4×10 5 Cells/mL。
优选的，步骤S8中，光固化时间为5-15s。
优选的，步骤S1中，三维建模软件为UG；步骤S2中，有限元仿真软件为ANSYS，Static Structure模块用于静态结构力学压缩仿真分析，Fluent模块用于流体流动仿真分析。
优选的，步骤S3中，对支架模型进行优化包括对孔阵列位置、孔间距、孔径大小的参数进行优化。
因此，本发明采用上述一种力学仿生复合乳房支架的制备方法，具体技术效果如下：
(1)本发明利用Gyroid结构构建乳房支架，既能保证支架具有高稳定性和承载能力，又为支架内细胞的黏附生长提供了高比表面积，同时，Gyroid具有高渗透率，利于支架内氧气的扩散、营养物质的运输和废物的排泄。
(2)本发明通过在Gyroid结构中设计孔阵列，调节乳房支架的弹性模量，使其与乳房组织弹性模量相匹配，以刺激细胞生长分化，实现乳房修复和功能重建。
(3)本发明利用有限元仿真分析软件对支架的弹性模量、稳定性、渗透性等性能进行建模分析，进而优化支架结构，以满足支架性能要求，这缩短了乳房支架的设计制造周期，降低了时间成本和制造成本。
(4)本发明将可生物降解支架、水凝胶以及细胞集成为复合乳房支架，不仅满足了支架对机械性能的要求，还提供了良好的细胞生长微环境，为细胞黏附、增殖、迁移和分化提供了有利条件，并为最终乳房的成功修复和功能重建提供了重要基础。
下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
附图说明
图1是本发明通过UG软件设计的一种Gyroid孔阵列力学仿生支架模型；
图2是Gyroid支架力学压缩仿真和流体流动仿真模型图；
图3是支架的应力应变实验结果图；
图4是本发明中的力学仿生复合乳房支架的结构示意图。
具体实施方式
以下通过附图和实施例对本发明的技术方案作进一步说明。
除非另外定义，本发明使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的主旨或基本特征的情况下，能够以其它的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内，不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其它实施方式。这些其它实施方式也涵盖在本发明的保护范围内。
还应当理解，以上所述的具体实施例仅用于解释本发明，本发明的保护范围并不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明/发明的保护范围之内。
本发明中使用的“包括”或者“包含”等类似的词语意指在该词前的要素涵盖在该词后列举的要素，并不排除也涵盖其它要素的可能。术语“内”、“外”、“上”、“下”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制，当被描述对象的绝对位置改变后，则该相对位置关系也可能相应地改变。在本发明中，除非另有明确的规定和限定，术语“附着”等术语应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或成一体；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通或两个元件的相互作用关系。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。本发明中使用的术语“约”具有本领域技术人员公知的含义，优选指该术语所修饰的数值在其±50％，±40％，±30％，±20％，±10％，±5％或±1％范围内。
本公开使用的所有术语(包括技术术语或者科学术语)与本公开所属领域的普通技术人员理解的含义相同，除非另外特别定义。还应当理解，在诸如通用词典中定义的术语应当被理解为具有与它们在相关技术的上下文中的含义相一致的含义，而不应用理想化或极度形式化的意义来解释，除非本文有明确地这样定义。
对于相关领域普通技术人员已知的技术、方法和设备可能不作为详细讨论，但在适当情况下，所述技术、方法和设备应当被视为说明书的一部分。
本发明说明书中引用的现有技术文献所公开的内容整体均通过引用并入本发明中，并且因此是本发明公开内容的一部分。
实施例一
本发明提供了一种力学仿生复合乳房支架的制备方法，具体步骤如下：
1)设计Gyroid孔阵列支架结构：
通过三维建模软件(如UG软件)，以参数化方式建立Gyroid模型，并在模型中设计贯穿的孔阵列。如图1所示，Gyroid孔阵列支架结构模型。
在本实施例中，Gyroid支架的相对密度为15％，Gyroid单元大小为10mm×10mm×10mm，Gyroid支架整体尺寸为20mm×20mm×20mm；Gyroid支架中的孔阵列为3×4孔阵列，且孔阵列在三个坐标轴方向贯穿支架，孔间距为5mm，孔径为2-3mm。
Gyroid结构受力均匀，稳定性良好，作为乳房支架能够提供可靠的机械支撑；Gyroid结构比表面积高，孔隙率高，为细胞黏附和生长发育提供了有利条件；支架中的孔阵列可以调节支架的弹性模量与乳房组织相匹配，以此刺激细胞生长分化成乳房组织，完成乳房修复和功能重建。
2)Gyroid孔阵列支架的仿真分析：
通过ANSYS有限元仿真分析软件的Static Structure模块和Fluent模块分别建立力学压缩仿真模型和流体流动模型，对步骤1)中的Gyroid孔阵列支架进行机械性能和渗透性能的分析。
在本实施例中，力学压缩仿真模型中Gyroid孔阵列支架被放置于两个刚体平台之间，上平台以1MPa的载荷作用于支架，而下平台固定不动；在流体流动模型中，Gyroid孔阵列支架被设置为流体边界，空隙处为流体流动区域，入口处以1mm/s的流速通入水，出口处设置压力值为零。
如图2所示，为本发明提供的Gyroid孔阵列支架的力学压缩仿真(A)和流体流动仿真(B)结果图。从仿真结果可以得到支架的弹性模量和应力分布情况，以及支架渗透性的大小和流速分布情况，用于后续优化支架结构。
3)Gyroid孔阵列支架的优化：
参考步骤2)中得到的仿真结果数据，对支架孔阵列的孔径大小、孔间距、孔数量和位置等参数进行优化。在本实施例中，优选调整孔径大小为2.6mm，仿真得到的弹性模量为0.725MPa，应力分布均匀，无明显的应力集中现象，且渗透性良好，流速分布均匀，符合支架的设计要求。
4)FDM打印支架：
使用聚己内酯线材，通过FDM打印机打印步骤3)中得到的优化后的Gyroid孔阵列模型，在本实施例中，打印参数设置如下：喷头直径为0.4mm，打印层厚为0.2mm，打印温度为110℃，打印平台温度为65℃，打印速度为30mm/s。
对得到的Gyroid孔阵列支架进行力学压缩实验，支架的应力应变曲线如图3所示，支架在压缩过程中表现出三个阶段，第一个阶段是应力随应变线性变化的过程，支架的弹性模量从这一阶段应力应变曲线的斜率计算得到。第二个阶段应力稳定在一个固定水平，且稳定窗口较大，这表明支架具有良好的吸能效果，能有效地缓冲外部载荷；第三个阶段应力随应变急剧增长，这是压缩后期支架致密化所导致。
5)hADSCs细胞悬液的制备：
将hADSCs培养在含有培养液的培养皿中，培养液包括人脂肪干细胞培养基、胎牛血清、青霉素和链霉素，其体积比为100：10：1：1；细胞在温度为37℃、CO 2 浓度为5％的环境下培养；待细胞增殖至细胞面积占培养皿底部面积的80％时，将培养液移除，加入2mL磷酸缓冲溶液润洗清理死细胞，之后加入1mL蛋白消化酶消化细胞15s，将蛋白消化酶移除后，加入细胞培养液吹打培养皿底部的细胞，使其脱离培养皿底部，将细胞混合均匀，得到细胞悬液。
6)PEGDA预聚液的制备：
首先用灭菌锅对超纯水进行灭菌，用灭菌后的超纯水溶解PEGDA，随后将光引发剂均匀溶解于PEGDA溶液中，再加入适量的氢氧化钠调节PEGDA溶液的pH至中性，过滤得到PEGDA预聚液。
在本实施例中，PEGDA预聚液中PEGDA的分子量为700，质量浓度为7％；所述光引发剂为LAP，质量浓度为0.5％；溶液的PH调节到7.4。PEGDA的分子量和质量浓度可根据不同需求进行选择，本实施例中PEGDA的分子量和质量浓度能满足细胞对生长微环境的需求，在有需要的情况下可进行调整。
7)PEGDA生物墨水的制备：
将步骤5)得到的细胞悬液加入到步骤6)得到的PEGDA预聚液中，调整细胞浓度至4×10 5 Cells/mL，混合均匀，得到PEGDA生物墨水。本实施例中细胞浓度有利于细胞生长形成乳房组织，细胞浓度在有需要的情况下可进行调整。
8)复合乳房支架的制备：
使用75％的酒精对步骤4)得到的Gyroid孔阵列支架进行消毒，之后用紫外光照射灭菌2小时。将步骤7)制备的PEGDA生物墨水灌注到Gyroid孔阵列支架中，使用紫外光照射，使PEGDA生物墨水固化成形，与Gyroid孔阵列支架形成复合乳房支架。
如图4所示，复合乳房支架由Gyroid孔阵列支架、PEGDA水凝胶以及人脂肪干细胞组成。Gyroid孔阵列支架能提供足够的机械支撑以保护细胞和组织，其与乳房组织相匹配的弹性模量能促进细胞生长分化成乳房组织；PEGDA水凝胶网络为细胞提供了良好的生长微环境，保证了支架的生物相容性；脂肪干细胞能分化成脂肪细胞，完成乳房组织的修复和功能重建。
本发明结合了FDM打印技术和光固化成形技术，提出了力学仿生复合乳房支架的制备方法，支架由可生物降解聚己内酯Gyroid孔阵列支架、PEGDA水凝胶和人脂肪干细胞组成。Gyroid孔阵列支架不仅具有良好的支撑作用和吸能性，其弹性模量能与乳房组织匹配，相比现有乳房支架能够更好地刺激细胞生长分化成乳房组织。另外，PEGDA水凝胶则提供了良好的脂肪细胞生长微环境。
因此，本发明采用上述一种力学仿生复合乳房支架的制备方法，通过乳房支架结构的优化设计和3D打印制造，解决现有乳房支架中普遍存在的机械性能与生物相容性之间的矛盾，为组织支架在临床应用上提供新的思路，以更好地实现乳腺癌术后乳房修复和功能重建。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其进行限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而这些修改或者等同替换亦不能使修改后的技术方案脱离本发明技术方案的精神和范围。
Claims (6)
1.一种力学仿生复合乳房支架的制备方法，其特征在于，步骤如下：
S1、通过三维建模软件设计具有孔阵列的Gyroid乳房支架，得到未优化的力学仿生乳房支架原始模型；
S2、通过有限元仿真软件对步骤S1得到的乳房支架模型进行静态结构力学压缩仿真分析和流体流动分析，得到支架的弹性模量、应力分布、渗透率和流速分布的数据；
S3、优化步骤S1得到的支架模型，使其在步骤S2中得到的弹性模量、应力分布、渗透率和流速分布的数据满足支架设计要求，得到优化后的力学仿生乳房支架模型；
S4、将步骤S3得到的支架模型通过FDM技术，利用聚己内酯打印形成Gyroid支架；
S5、将目标自体脂肪干细胞培养于培养液中，待细胞增殖到一定数目时，将hADSCs消化重悬后得到细胞悬液；
S6、用灭菌后的超纯水溶解PEGDA，然后将光引发剂溶解于PEGDA溶液中，调节溶液的pH至中性，过滤得到PEGDA预聚液；
S7、将步骤S5得到的细胞悬液加入到步骤S6得到的PEGDA预聚液中，混合均匀，得到PEGDA生物墨水；
S8、将步骤S7得到的PEGDA生物墨水灌注到步骤S4得到的Gyroid支架中，通过光固化使其成形，得到力学仿生复合乳房支架；
步骤S1中，Gyroid支架的相对密度为15％，Gyroid单元大小为10mm×10mm×10mm，Gyroid支架整体尺寸为20mm×20mm×20mm，Gyroid支架中的孔阵列为3×4孔阵列，且孔阵列在三个坐标轴方向贯穿支架，孔间距为5mm，孔径为2-3mm；
步骤S6中，PEGDA预聚液中PEGDA的分子量为700，其质量浓度为7％；光引发剂为LAP，其质量浓度为0.5％；PEGDA预聚液的pH为7.4；
步骤S7中，PEGDA生物墨水中人脂肪细胞浓度为4×105 Cells/mL；
步骤S3中，对支架模型进行优化包括对孔阵列位置、孔间距、孔径大小的参数进行优化。
2.根据权利要求1所述的一种力学仿生复合乳房支架的制备方法，其特征在于：步骤S3中，优化后的乳房支架弹性模量为0-1MPa，与乳房组织相匹配，且应力分布均匀，无明显应力集中出现；同时，支架的渗透率和流速分布满足支架设计要求。
3.根据权利要求1所述的一种力学仿生复合乳房支架的制备方法，其特征在于：步骤S4中，FDM打印过程中喷头直径为0.4mm，打印层厚为0.2mm，打印温度为110℃，打印平台温度为65℃，打印速度为30mm/s。
4.根据权利要求1所述的一种力学仿生复合乳房支架的制备方法，其特征在于：步骤S5中，培养液包括人脂肪干细胞培养基、胎牛血清、青霉素和链霉素，其体积比为100:10:1:1；细胞在温度为37℃、CO2 浓度为5％的环境下培养，使用蛋白消化酶对hADSCs进行消化处理。
5.根据权利要求1所述的一种力学仿生复合乳房支架的制备方法，其特征在于：步骤S8中，光固化时间为5-15s。
6.根据权利要求1所述的一种力学仿生复合乳房支架的制备方法，其特征在于：步骤S1中，三维建模软件为UG；步骤S2中，有限元仿真软件为ANSYS，Static Structure模块用于静态结构力学压缩仿真分析，Fluent模块用于流体流动仿真分析。
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