CN107412851B - 一种复合细胞的预血管化大块生物骨支架构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种复合细胞的预血管化大块生物骨支架构建方法，用于生物制造领域，采用复合生物3D打印、电流体动力学直写、减材制造和细胞组装技术在大块生物骨支架内部构建功能性预制血管化网络来促进大块骨缺损的修复。此方法的关键在于采用可在体内讲解的生物材料海藻酸钠作为牺牲材料，并在其中加载内皮细胞，通过内皮细胞自身的迁移粘附到预制血管网络表面，与此同时，海藻酸钠降解形成预制血管网络；此外，骨支架材料中的人骨髓间充质干细胞分化成成骨细胞，并与内皮细胞的相互促进作用下合成分泌骨基质，并矿化，提高骨组织修复的效率，解决了大块骨组织修复的功能性问题，对临床医学上解决大块骨组织修复问题具有重要意义。

Description

一种复合细胞的预血管化大块生物骨支架构建方法
技术领域
本发明涉及一种含细胞的功能性临床大块骨组织修复的构建方法，特别是涉及一种复合细胞的预血管化大块生物骨支架构建方法，应用于生物制造技术领域。
背景技术
高能创伤、骨肿瘤等疾病常导致骨缺损，自体骨移植是治疗的最好方法。但自体骨源移植极其有限并增加痛苦，而异体骨移植又存在免疫反应和诸多并发症等。虽然人体骨骼具有一定的再生和自修复能力，但较大块骨缺损修复（内径>5mm）无法单纯依靠骨的自愈能力，因此大块骨损伤作为临床常见病仍是尚未解决的世界难题，大量患有大块骨缺损的病人只能使用假体来修复，致使全球每年有数以万计的患者不能得到治愈而落下终生残疾，人们对大块骨缺损修复的需求日益迫切，渴望得到一种能取代自体同源的大块骨移植，减少患者的痛苦，真正解决大块骨源不足的问题。
随着骨组织工程技术的发展，骨组织工程的再生修复有了很大的进展，对于大块生物骨组织来讲，成骨细胞很难深入到生物骨支架的中心，而生物骨植入体内后的早期营养主要来源于组织液的渗透和血液的传输，最多只能进入支架内100-300μm，造成支架内细胞的营养和氧气供给都受到限制，导致内部细胞死亡，形成血栓，不能达到大块骨缺损修复的目的。因此，目前面临的一大难点就是如何保证生物骨支架植入体内后能快速并稳定地实现支架内部的血液运输通道的重建，解决骨组织修复和再生的营养物质和氧气，以及体内新陈代谢产物的运输和排出，即大块骨组织修复和再生的血管化问题。
目前，众多研究采用传统模具、牺牲材料等工艺来实现生物骨支架中预制血管网络的构建，但这些方法所获得的预制血管网络结构尺寸较大，并且单一，不能满足骨组织血管网络的要求，在形状上也难制出有三维结构的预制血管网络，牺牲材料的使用在一定程度上降低了骨支架的生物相容性。
在生物制造领域，出现基于传统模具和基于牺牲材料的预制血管网络成形方法，在多尺度结构或材料梯度成形，以及细胞组装等方面都存在较大的局限性。因此，单一的工艺方法制备的预制血管网络支架都无法满足组织工程对骨支架多尺度结构和血管化尺寸形状的要求，更无法进行有效的细胞组装试验，有关增材制造、减材制造、细胞组装一体化工艺制备含预制血管网络的骨支架方法还处于起步阶段。
发明内容
本发明的目的在于克服已有技术存在的不足，提供一种复合细胞的预血管化大块生物骨支架构建方法，将增材制造、减材制造与细胞组装三种制造工艺相结合，所采用的方法为复合生物3D打印含细胞的骨支架材料、含细胞的牺牲材料，电流体动力学直写含细胞的牺牲材料，细胞可在材料内迁移并到达指定位置，牺牲材料无需在支架制备初期去除，而是随着细胞的迁移，牺牲材料可在骨支架内部降解形成含细胞的预血管化大块生物骨支架，具有生物活性，从而更好的模拟人体大块骨组织中的结构，并进行快速修复。
为达到上述发明创造目的，本发明的构思如下：
本发明采用载有人骨髓间充质干细胞的水凝胶Ⅰ作为打印骨支架的原料（以下简称：含细胞的骨支架材料），以载有人脐静脉内皮细胞的水凝胶Ⅱ作为牺牲材料（以下简称：含细胞的牺牲材料），宏观挤出打印含细胞的骨支架材料作为骨支架主体结构，宏观挤出打印含细胞的牺牲材料作为宏观尺度牺牲结构，电流体动力学直写含细胞的牺牲材料作为微观尺度牺牲结构，复合打印完毕后将支架置于37℃、5% CO2的细胞培养液环境下进行培养，牺牲材料内的内皮细胞迁移到牺牲材料表面，随着牺牲材料的降解形成宏微观尺度的预制血管网络（即多尺度预制血管网络），内皮细胞粘附到多尺度预制血管网络表面，从而完成复合细胞的预血管化大块生物骨支架的构建。含细胞的骨支架材料和含细胞的牺牲材料均装入容量为10mL的医用注射器中，采用两个相同的医用针头分别进行含细胞的骨支架材料和宏观尺度牺牲材料的打印，采用尺寸较小的医用针头进行电流体动力学直写形成微观尺度牺牲结构。
根据上述发明构思，本发明采用如下技术方案：
一种复合细胞的预血管化大块生物骨支架构建方法，包括如下步骤：
a.配制载有人骨髓间充质干细胞的水凝胶Ⅰ作为打印骨支架的原料和载有人脐静脉内皮细胞的水凝胶Ⅱ作为牺牲材料：将经高温烘烤并经紫外灯消毒的水凝胶Ⅰ和水凝胶Ⅱ粉末分别倒入细胞培养液，分别配制好浓度符合宏观打印和电流体动力学直写条件的水凝胶Ⅰ溶液和水凝胶Ⅱ溶液；分别将培育中的第三代人骨髓间充质干细胞和第三代人脐静脉内皮细胞从培养箱中取出，经胰蛋白酶消化，离心步骤后，倒掉上清液，分别获得人骨髓间充质干细胞和人脐静脉内皮细胞，各细胞分别倒入1mL新鲜配制的细胞培养液并吹打均匀，并分别倒入水凝胶Ⅰ溶液和水凝胶Ⅱ溶液，搅拌均匀，分别获得含有人骨髓间充质干细胞的水凝胶Ⅰ溶液和含有人脐静脉内皮细胞的水凝胶Ⅱ溶液；
b.将步骤a获得的含有人骨髓间充质干细胞的水凝胶Ⅰ溶液倒入一支10mL医用注射器中，供宏观挤出打印骨支架使用，将含有人脐静脉内皮细胞的水凝胶Ⅱ溶液倒入两支10mL医用注射器中，分别供挤出打印宏观尺度牺牲模块和电流体动力学直写微观尺度牺牲模块使用；
c.将步骤b获得的三只装有打印材料的医用针管分别装载在打印平台上，开始打印：首先接收平台移动到宏观挤出工位打印骨支架材料，形成骨支架基底；而后接收平台移动到另一宏观挤出工位打印宏观尺度牺牲材料，形成宏观尺度牺牲结构；最后接收平台移动到电流体动力学直写工位打印微观尺度牺牲材料，形成微观尺度牺牲结构，至此，经过三个工位的转换完成一层同时含有骨支架材料和宏微观尺度牺牲材料的打印；最终，三个工位在运动程序的控制下不断转换并复合打印成形含有宏微观尺度牺牲结构的骨支架；
d.将步骤c中制备的含有宏微观尺度牺牲结构的骨支架放置在含有细胞培养液、环境条件为37℃、5% CO2的细胞培养箱中进行培养，宏微观尺度牺牲结构随着培养周期逐渐降解，在骨支架内部形成多尺度三维预制血管网络；同时，宏微观尺度牺牲结构中的内皮细胞逐渐迁移到牺牲结构表面并粘附到多尺度三维预制血管网络形成内皮细胞层；
e．步骤d中获得的含有多尺度三维预制血管网络表面粘附有内皮细胞层，随着培养周期的增加，内皮细胞相互作用，逐渐形成血管网络；由于内皮细胞的存在，骨支架材料中的骨髓间充质干细胞逐渐分化为成骨细胞，在与内皮细胞的相互促进作用过程中，成骨细胞加速合成分泌骨基质并矿化，内皮细胞则加速血管网络的形成，从而实现功能性大块生物骨支架的制备，加速大块骨缺损的修复。
进一步地，在步骤a、b中，水凝胶Ⅰ和水凝胶Ⅱ可以分别为明胶和海藻酸钠。
进一步地，在步骤a、b中，水凝胶Ⅰ和水凝胶Ⅱ可以分别为壳聚糖和海藻酸钠。
进一步地，在步骤a、b中，水凝胶Ⅰ和水凝胶Ⅱ分别为明胶和海藻酸钠，在步骤a配制明胶溶液时，加入羟基磷灰石粉末以提高支架力学性能，且明胶粉末与羟基磷灰石粉末质量比为5：1；将经高温烘烤并经紫外灯消毒的明胶和羟基磷灰石粉末一并倒入细胞培养液，配制好浓度适合宏观挤出打印的明胶溶液。
进一步地，在步骤a、b中，水凝胶Ⅰ和水凝胶Ⅱ分别为壳聚糖和海藻酸钠，在步骤a配制壳聚糖溶液时，加入羟基磷灰石粉末以提高支架力学性能，且壳聚糖粉末与羟基磷灰石粉末质量比为3：1；将经高温烘烤并经紫外灯消毒的壳聚糖和羟基磷灰石粉末一并倒入细胞培养液，配制好浓度适合宏观挤出打印的壳聚糖溶液。
本发明与现有技术相比较，具有如下显而易见的突出实质性特点和显著优点：
1.与现有的单一制备含预制血管网络的生物骨支架工艺过程相比，本发明在针对复合了生物3D打印、电流体动力学直写、减材成形、细胞组装等技术，将各技术间的优势相融合，从而实现了多尺度三维预制血管网络的构建。
2.本发明在制备过程中直接加载细胞，减少了单独加载细胞过程对细胞产生的伤害。
3.本发明制备预制血管网络可根据需求来设定，改变打印路径，灵活性较高。
4.本发明同时采用内皮细胞和成骨细胞，利用其相互间的促进作用来实现骨组织的快速修复，提高修复效率。
附图说明
图1是本发明实施例一制备含有多尺度牺牲结构的生物骨支架的流程图。
图2是本发明实施例一制备含多尺度预制血管网络的生物骨支架的示意图。
具体实施方式
本发明的优选实施例详述如下：
实施例一：
在本实施例中，参见图1~图2，一种复合细胞的预血管化大块生物骨支架构建方法，包括如下步骤：
a.配制载有人骨髓间充质干细胞的明胶作为打印骨支架的原料和载有人脐静脉内皮细胞的海藻酸钠作为牺牲材料，将经高温烘烤并经紫外灯消毒的明胶和海藻酸钠粉末倒入细胞培养液，分别配制好浓度符合宏观打印和电流体动力学直写条件的明胶溶液和海藻酸钠溶液；分别将培育中的第三代人骨髓间充质干细胞和第三代人脐静脉内皮细胞从培养箱中取出，经胰蛋白酶消化，离心等步骤后，倒掉上清液分别获得人骨髓间充质干细胞和人脐静脉内皮细胞，各细胞分别倒入1mL新鲜配制的细胞培养液并吹打均匀，并分别倒入明胶溶液和海藻酸钠溶液，搅拌均匀，分别获得含有人骨髓间充质干细胞的明胶溶液和含有人脐静脉内皮细胞的海藻酸钠溶液；
b.将步骤a获得的含有人骨髓间充质干细胞的明胶溶液倒入一支10mL医用注射器中，供宏观挤出打印骨支架使用，将含有人脐静脉内皮细胞的海藻酸钠溶液倒入两支10mL医用注射器中，分别供挤出打印宏观尺度牺牲模块和电流体动力学直写微观尺度牺牲模块使用；
c.将步骤b获得的三只装有打印材料的医用针管分别装载在打印平台上，开始打印。首先接收平台移动到宏观挤出工位打印骨支架材料，形成骨支架基底；而后接收平台移动到另一宏观挤出工位打印宏观尺度牺牲材料，形成宏观尺度牺牲结构；最后接收平台移动到电流体动力学直写工位打印微观尺度牺牲材料，形成微观尺度牺牲结构，至此，经过三个工位的转换可完成一层同时含有骨支架材料和宏微观尺度牺牲材料的打印。最终，三个工位在运动程序的控制下不断转换并复合打印成形含有宏微观尺度牺牲结构的骨支架；
d. 将步骤c中制备的含有宏微观尺度牺牲结构的骨支架放置在含有细胞培养液、环境条件为37℃、5% CO2的细胞培养箱中进行培养，宏微观尺度牺牲结构随着培养周期逐渐降解，可在骨支架内部形成多尺度三维预制血管网络；同时，宏微观尺度牺牲结构中的内皮细胞逐渐迁移到牺牲结构表面并粘附到多尺度三维预制血管网络形成内皮细胞层；
e.步骤d中获得的含有多尺度三维预制血管网络表面粘附有内皮细胞层，随着培养周期的增加，内皮细胞相互作用，逐渐形成血管网络；由于内皮细胞的存在，骨支架材料中的骨髓间充质干细胞逐渐分化为成骨细胞，在与内皮细胞的相互促进作用过程中，成骨细胞加速合成分泌骨基质并矿化，内皮细胞则加速血管网络的形成。从而实现功能性大块生物骨支架的制备，加速大块骨缺损的修复。
实施例二：
本实施例与实施例一基本相同，特别之处在于：
在本实施例中，一种复合细胞的预血管化大块生物骨支架构建方法，骨支架材料采用壳聚糖，包括如下步骤：
a.配制载有人骨髓间充质干细胞的壳聚糖作为打印骨支架的原料和载有人脐静脉内皮细胞的海藻酸钠作为牺牲材料：将经高温烘烤并经紫外灯消毒的壳聚糖和海藻酸钠粉末倒入细胞培养液，分别配制好浓度符合宏观打印和电流体动力学直写条件的壳聚糖溶液和海藻酸钠溶液；分别将培育中的第三代人骨髓间充质干细胞和第三代人脐静脉内皮细胞从培养箱中取出，经胰蛋白酶消化，离心等步骤后，倒掉上清液分别获得人骨髓间充质干细胞和人脐静脉内皮细胞，各细胞分别倒入1mL新鲜配制的细胞培养液并吹打均匀，并分别倒入壳聚糖溶液和海藻酸钠溶液，搅拌均匀，分别获得含有人骨髓间充质干细胞的壳聚糖溶液和含有人脐静脉内皮细胞的海藻酸钠溶液；
b.将步骤a获得的含有人骨髓间充质干细胞的壳聚糖溶液倒入一支10mL医用注射器中，供宏观挤出打印骨支架使用，将含有人脐静脉内皮细胞的海藻酸钠溶液倒入两支10mL医用注射器中，分别供挤出打印宏观尺度牺牲模块和电流体动力学直写微观尺度牺牲模块使用；
c.本步骤与实施例一相同；
d.本步骤与实施例一相同；
e.本步骤与实施例一相同。
实施例三：
本实施例与前述实施例基本相同，特别之处在于：
在本实施例中，一种复合细胞的预血管化大块生物骨支架构建方法，骨支架材料采用明胶和羟基磷灰石的混合物，包括如下步骤：
a.配制用载有人骨髓间充质干细胞的明胶作为打印骨支架的原料和载有人脐静脉内皮细胞的海藻酸钠作为牺牲材料，称取羟基磷灰石，且明胶与羟基磷灰石的质量比为5:1，将经高温烘烤并经紫外灯消毒的明胶和羟基磷灰石粉末混合并与海藻酸钠粉末分别倒入细胞培养液，分别配制好浓度符合宏观打印和电流体动力学直写条件的明胶溶液和海藻酸钠溶液；分别将培育中的第三代人骨髓间充质干细胞和第三代人脐静脉内皮细胞从培养箱中取出，经胰蛋白酶消化，离心等步骤后，倒掉上清液分别获得人骨髓间充质干细胞和人脐静脉内皮细胞，各细胞分别倒入1mL新鲜配制的细胞培养液并吹打均匀，并分别倒入明胶溶液和海藻酸钠溶液，搅拌均匀，分别获得含有人骨髓间充质干细胞的明胶溶液和含有人脐静脉内皮细胞的海藻酸钠溶液；
b.本步骤与实施例一相同；
c.本步骤与实施例一相同；
d.本步骤与实施例一相同；
e.本步骤与实施例一相同。
实施例四：
本实施例与前述实施例基本相同，特别之处在于：
在本实施例中，一种复合细胞的预血管化大块生物骨支架构建方法，骨支架材料采用壳聚糖和羟基磷灰石的混合物，包括如下步骤：
a.配制载有人骨髓间充质干细胞的壳聚糖作为打印骨支架的原料和载有人脐静脉内皮细胞的海藻酸钠作为牺牲材料，称取羟基磷灰石，且壳聚糖与羟基磷灰石的质量比为3:1，将经高温烘烤并经紫外灯消毒的壳聚糖和羟基磷灰石粉末混合并与海藻酸钠粉末分别倒入细胞培养液，分别配制好浓度符合宏观打印和电流体动力学直写条件的壳聚糖溶液和海藻酸钠溶液；分别将培育中的第三代人骨髓间充质干细胞和第三代人脐静脉内皮细胞从培养箱中取出，经胰蛋白酶消化，离心等步骤后，倒掉上清液分别获得人骨髓间充质干细胞和人脐静脉内皮细胞，各细胞分别倒入1mL新鲜配制的细胞培养液并吹打均匀，并分别倒入壳聚糖溶液和海藻酸钠溶液，搅拌均匀，分别获得含有人骨髓间充质干细胞的壳聚糖溶液和含有人脐静脉内皮细胞的海藻酸钠溶液；
b.本步骤与实施例二相同；
c.本步骤与实施例二相同；
d.本步骤与实施例二相同；
e.本步骤与实施例二相同。

Claims (5)

1.一种复合细胞的预血管化大块生物骨支架构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
a.配制载有人骨髓间充质干细胞的水凝胶Ⅰ作为打印骨支架的原料和载有人脐静脉内皮细胞的水凝胶Ⅱ作为牺牲材料：将经高温烘烤并经紫外灯消毒的水凝胶Ⅰ和水凝胶Ⅱ粉末分别倒入细胞培养液，分别配制好浓度符合宏观打印和电流体动力学直写条件的水凝胶Ⅰ溶液和水凝胶Ⅱ溶液；分别将培育中的第三代人骨髓间充质干细胞和第三代人脐静脉内皮细胞从培养箱中取出，经胰蛋白酶消化，离心步骤后，倒掉上清液，分别获得人骨髓间充质干细胞和人脐静脉内皮细胞，各细胞分别倒入1mL新鲜配制的细胞培养液并吹打均匀，并分别倒入水凝胶Ⅰ溶液和水凝胶Ⅱ溶液，搅拌均匀，分别获得含有人骨髓间充质干细胞的水凝胶Ⅰ溶液和含有人脐静脉内皮细胞的水凝胶Ⅱ溶液；
b.将步骤a获得的含有人骨髓间充质干细胞的水凝胶Ⅰ溶液倒入一支10mL医用注射器中，供宏观挤出打印骨支架使用，将含有人脐静脉内皮细胞的水凝胶Ⅱ溶液倒入两支10mL医用注射器中，分别供挤出打印宏观尺度牺牲模块和电流体动力学直写微观尺度牺牲模块使用；
c.将步骤b获得的三只装有打印材料的医用针管分别装载在打印平台上，开始打印：首先接收平台移动到宏观挤出工位打印骨支架材料，形成骨支架基底；而后接收平台移动到另一宏观挤出工位打印宏观尺度牺牲材料，形成宏观尺度牺牲结构；最后接收平台移动到电流体动力学直写工位打印微观尺度牺牲材料，形成微观尺度牺牲结构，至此，经过三个工位的转换完成一层同时含有骨支架材料和宏微观尺度牺牲材料的打印；最终，三个工位在运动程序的控制下不断转换并复合打印成形含有宏微观尺度牺牲结构的骨支架；
d.将步骤c中制备的含有宏微观尺度牺牲结构的骨支架放置在含有细胞培养液、环境条件为37℃、5% CO2的细胞培养箱中进行培养，宏微观尺度牺牲结构随着培养周期逐渐降解，在骨支架内部形成多尺度三维预制血管网络；同时，宏微观尺度牺牲结构中的内皮细胞逐渐迁移到牺牲结构表面并粘附到多尺度三维预制血管网络形成内皮细胞层；
e．步骤d中获得的含有多尺度三维预制血管网络表面粘附有内皮细胞层，随着培养周期的增加，内皮细胞相互作用，逐渐形成血管网络；由于内皮细胞的存在，骨支架材料中的骨髓间充质干细胞逐渐分化为成骨细胞，在与内皮细胞的相互促进作用过程中，成骨细胞加速合成分泌骨基质并矿化，内皮细胞则加速血管网络的形成，从而实现功能性大块生物骨支架的制备，加速大块骨缺损的修复。
2.根据权利要求1所述复合细胞的预血管化大块生物骨支架构建方法，其特征在于，在步骤a、b中，水凝胶Ⅰ和水凝胶Ⅱ分别为明胶和海藻酸钠。
3.根据权利要求1所述复合细胞的预血管化大块生物骨支架构建方法，其特征在于，在步骤a、b中，水凝胶Ⅰ和水凝胶Ⅱ分别为壳聚糖和海藻酸钠。
4.根据权利要求1或2所述复合细胞的预血管化大块生物骨支架构建方法，其特征在于，在步骤a、b中，水凝胶Ⅰ和水凝胶Ⅱ分别为明胶和海藻酸钠，在步骤a配制明胶溶液时，加入羟基磷灰石粉末以提高支架力学性能，且明胶粉末与羟基磷灰石粉末质量比为5：1；将经高温烘烤并经紫外灯消毒的明胶和羟基磷灰石粉末一并倒入细胞培养液，配制好浓度适合宏观挤出打印的明胶溶液。
5.根据权利要求1或3所述复合细胞的预血管化大块生物骨支架构建方法，其特征在于，在步骤a、b中，水凝胶Ⅰ和水凝胶Ⅱ分别为壳聚糖和海藻酸钠，在步骤a配制壳聚糖溶液时，加入羟基磷灰石粉末以提高支架力学性能，且壳聚糖粉末与羟基磷灰石粉末质量比为3：1；将经高温烘烤并经紫外灯消毒的壳聚糖和羟基磷灰石粉末一并倒入细胞培养液，配制好浓度适合宏观挤出打印的壳聚糖溶液。
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