CN116407680A - 3d打印水凝胶骨修复支架、离子交联型壳聚糖基水凝胶的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种3D打印水凝胶骨修复支架的制备方法：将2‑羟基‑4’‑(2‑羟乙氧基)‑2‑甲基苯丙酮、柠檬酸钠、聚乙二醇二丙烯酸酯、短链壳聚糖加入去离子水中，制得打印浆料；进行3D打印后在紫外光下固化，接着依次在柠檬酸钠、三聚磷酸钠的混合离子溶液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液中浸泡；然后分别在磷酸氢二钾溶液、氯化钙溶液交替循环浸泡多次，再浸泡氯化钙溶液使无定形的磷酸钙孵育为羟基磷灰石，得到3D打印水凝胶骨修复支架。本发明还公开了一种离子交联型壳聚糖基水凝胶的制备方法。本发明制备得到力学性能优异、生物相容性好、能与骨很好的整合的修复材料，并且制备过程中不需要对壳聚糖进行改性，没有毒性残留物。
Description
技术领域
本发明涉及水凝胶的技术领域，特别涉及一种3D打印水凝胶骨修复支架、离子交联型壳聚糖基水凝胶的制备方法。
背景技术
随着医学技术的发展，用组织工程技术治疗因疾病、意外事故等导致骨损伤，如骨折、骨关节炎等，成为该领域的一大研究热点，越来越多的研究团队聚焦于用生物材料修复骨缺损。传统的天然聚合物力学性能差，无法满足日常生活中骨所承载的力学强度，人工合成的聚合物又因生物相容性差，限制了其在体内的应用，因此，作为生物医用材料应用到人体，天然聚合物搭载合成聚合物的共同使用成为大势所趋。
甲壳素是自然界中含量第二的多糖，可从虾、螃蟹等壳废弃物中提取出，廉价易得。但由于甲壳素在水溶液和有机溶剂中的溶解性较差，因此没有得到实际应用。壳聚糖是由甲壳素在碱性条件下热化学脱乙酰制得的，壳聚糖能促进细胞生长和基质中的矿物质沉积，其良好的生物相容性最大限度地降低了植入材料引起的局部炎症。尽管壳聚糖本身无毒，但因其一些性质，如溶解性差，力学强度不高，常对壳聚糖进行改性使用，某些修饰可能会使其或多或少具有毒性，任何残留的反应物都应小心去除。
另外，尽管现在开发了很多坚韧的水凝胶用于修复骨缺损，即使材料本身具有促进细胞成骨分化的优点，但其软结构与坚硬骨的结合仍是一大挑战。因此制备一种力学性能优异、生物相容性好同时又能较好地与骨进行整合的壳聚糖基水凝胶支架材料具有十分重要的意义。
发明内容
为了克服现有技术的上述缺点与不足，本发明的目的在于提供一种3D打印水凝胶骨修复支架的制备方法，通过引入短链壳聚糖并利用交替循环浸泡磷酸氢二钾、氯化钙原位沉积羟基磷灰石的方法，制备得到力学性能优异、生物相容性好、在优化材料的成骨功能的同时又能使其与骨很好的整合的水凝胶骨修复材料，并且制备过程中不需要对壳聚糖进行改性，没有毒性残留物。
本发明的另一目的在于提供一种离子交联型壳聚糖基水凝胶，利用短链壳聚糖的离子交联和聚乙二醇二丙烯酸酯PEGDA的共价交联，以及两种交联网络之间的氢键键合，使得该水凝胶表现出优异的力学性能；之后，通过在磷酸氢二钾溶液、氯化钙溶液中交替循环浸泡生成的羟基磷灰石无机相，显著提升了水凝胶的力学强度。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
3D打印水凝胶骨修复支架的制备方法，包括以下步骤：
依次将2-羟基-4’-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮、柠檬酸钠、聚乙二醇二丙烯酸酯PEGDA、短链壳聚糖加入去离子水中，搅拌混合均匀，获得浆料；
其中，引发剂、柠檬酸钠、短链壳聚糖、聚乙二醇二丙烯酸酯PEGDA的质量比为(0.003～0.005)：(0.067-0.133)：(1～2)：1；
将浆料转移至3D打印料筒，离心除去气泡后得到3D打印浆料；
采用挤出式3D打印机进行打印，得到的支架在紫外光下固化后，接着在柠檬酸钠、三聚磷酸钠的混合离子溶液中浸泡，得到离子交联型壳聚糖基水凝胶；
将离子交联型壳聚糖基水凝胶在三羟甲基氨基甲烷缓冲液Tris-HCl中浸泡；然后分别在磷酸氢二钾溶液、氯化钙溶液交替循环浸泡多次，使离子交联型壳聚糖基水凝胶上原位沉积无定形的磷酸钙，再浸泡氯化钙溶液使无定形的磷酸钙孵育为羟基磷灰石，得到3D打印水凝胶骨修复支架。
优选的，所述柠檬酸钠、三聚磷酸钠的混合离子溶液中，柠檬酸钠的质量浓度为3～5％，三聚磷酸钠的质量浓度为3～5％。
优选的，所述磷酸氢二钾溶液的浓度为250～300mM。
优选的，所述氯化钙溶液的浓度为450～500mM。
优选的，所述在磷酸氢二钾溶液、氯化钙溶液交替循环浸泡多次，具体为：
在磷酸氢二钾溶液、氯化钙溶液交替循环浸泡1～5次，每次浸泡时间为30～120s。
优选的，所述在柠檬酸钠、三聚磷酸钠的混合离子溶液中浸泡，具体为：
在柠檬酸钠、三聚磷酸钠的混合离子溶液中浸泡10～80分钟。
优选的，所述在紫外光下固化，具体为：
在紫外光下固化3～30分钟。
优选的，所述将离子交联型壳聚糖基水凝胶浸泡在三羟甲基氨基甲烷缓冲液Tris-HCl中，具体为：
将离子交联型壳聚糖基水凝胶浸泡在pH 9.0～pH 9.2的三羟甲基氨基甲烷缓冲液Tris-HCl中10～12小时。
优选的，所述浸泡氯化钙溶液使无定形的磷酸钙孵育为羟基磷灰石，具体为：
在36～37℃下浸泡pH11.0～pH11.2的氯化钙溶液，反应20～24小时使无定形的磷酸钙孵育为羟基磷灰石。
离子交联型壳聚糖基水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
依次将2-羟基-4’-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮、聚乙二醇二丙烯酸酯PEGDA、短链壳聚糖加入去离子水中，搅拌混合均匀，获得溶胶；
其中，引发剂、短链壳聚糖、聚乙二醇二丙烯酸酯PEGDA的质量比为(0.003～0.005)：(1～2)：1；
将溶胶在紫外光下固化后，接着在柠檬酸钠、三聚磷酸钠的混合离子溶液中浸泡，得到离子交联型壳聚糖基水凝胶。
与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果：
(1)本发明的3D打印水凝胶骨修复支架的制备方法通过引入短链壳聚糖并利用原位沉积羟基磷灰石的方法，制备得到力学性能优异、生物相容性好、在优化材料的成骨功能的同时又能使其与骨很好的整合的水凝胶骨修复材料，并且制备过程中不需要对壳聚糖进行改性，没有毒性残留物。
(2)本发明的3D打印水凝胶骨修复支架的制备方法，通过在浆料中预先添加微量的柠檬酸钠，制备的浆料可满足可3D打印的精度要求，满足了生物材料在修复过程中高精度、个性化定制的需求，极大地扩宽了离子交联型壳聚糖基水凝胶的应用范围。
(3)本发明的3D打印水凝胶骨修复支架的制备方法，基于水凝胶的半渗透性，通过循环浸泡含有钙、磷元素的溶液，使水凝胶原位沉积羟基磷灰石，提升了骨修复支架的压缩强度；在优化材料的成骨功能的同时，又能使其与骨很好的整合，制备过程简便易操作。
(4)本发明的离子交联型壳聚糖基水凝胶，利用短链壳聚糖的离子交联和聚乙二醇二丙烯酸酯PEGDA的共价交联，以及两种交联网络之间的氢键键合，使得该水凝胶表现出优异的力学性能，同时，通过循环浸泡磷酸氢二钾溶液、氯化钙溶液生成羟基磷灰石无机相，显著提升了水凝胶的力学强度。
附图说明
图1为本发明的实施例1、对比例1～3的离子交联型壳聚糖基水凝胶的拉伸应力-应变曲线图。
图2为本发明的实施例2、对比例4的3D打印水凝胶骨修复支架的X射线衍射对比图。
图3为本发明的实施例2、对比例4～5的3D打印水凝胶骨修复支架的压缩应力应变曲线对比图。
图4为本发明的实施例2的水凝胶内部羟基磷灰石的钨灯丝扫描电镜图。
图5为本发明的实施例2、对比例4～5的3D打印水凝胶骨修复支架的碱性磷酸酶ALP活性对比图。
图6为本发明的对比例4的3D打印水凝胶骨修复支架上的细胞活死染色图。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明作进一步地详细说明，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
本实施例的离子交联型壳聚糖基水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
1)依次将8mg光引发剂i2959、2g聚乙二醇二丙烯酸酯PEGDA、3g短链壳聚糖加到30ml去离子水中，搅拌混合均匀，获得溶胶；
2)将步骤1)的溶胶放在紫外光灯箱中进行紫外光固化30分钟，获得经过光交联后的单网络水凝胶；
3)将步骤2)的单网络水凝胶浸泡在柠檬酸钠、三聚磷酸钠的混合离子溶液80分钟；其中，柠檬酸钠、三聚磷酸钠的混合离子溶液由5g柠檬酸钠粉末和5g三聚磷酸钠粉末加到100ml去离子水中制备而成。
本实施例制备得到的离子交联型壳聚糖基水凝胶材料的拉伸应力-应变曲线如图1中的DN-TC所示。
对比例1
本对比例的水凝胶材料的制备方法，包括以下步骤：
1)依次将8mg光引发剂i2959、2g聚乙二醇二丙烯酸酯PEGDA、3g短链壳聚糖加到30ml去离子水中，搅拌混合均匀，获得溶胶；
2)将步骤1)的溶胶放在紫外光灯箱中进行紫外光固化30分钟，获得经过光交联后的单网络水凝胶。
本对比例制备得到的离子交联型壳聚糖基水凝胶材料的拉伸应力-应变曲线如图1中的CS/PEGDA所示。
对比例2
本对比例的水凝胶材料的制备方法，包括以下步骤：
1)依次将8mg光引发剂i2959、2g聚乙二醇二丙烯酸酯PEGDA、3g短链壳聚糖加到30ml去离子水中，搅拌混合均匀，获得溶胶；
2)将步骤1)的溶胶放在紫外光灯箱中进行紫外光固化30分钟，获得经过光交联后的单网络水凝胶；
3)将步骤2)的单网络水凝胶浸泡在质量浓度为10％的柠檬酸钠离子溶液，浸泡时间为80分钟。
本对比例制备得到的离子交联型壳聚糖基水凝胶材料的拉伸应力-应变曲线如图1中的DN-Cit所示。
对比例3
本对比例的水凝胶材料的制备方法，包括以下步骤：
1)依次将8mg光引发剂i2959、2g聚乙二醇二丙烯酸酯PEGDA、3g短链壳聚糖加到30ml去离子水中，搅拌混合均匀，获得溶胶；
2)将步骤1)的溶胶放在紫外光灯箱中进行紫外光固化30分钟，获得经过光交联后的单网络水凝胶；
3)将步骤2)的单网络水凝胶浸泡在质量浓度为10％的三聚磷酸钠离子溶液，浸泡时间为80分钟。
本对比例制备得到的离子交联型壳聚糖基水凝胶材料的拉伸应力-应变曲线如图1中的DN-Tpp所示。
结合实施例1、对比例1～3及图1，可以看出浸泡离子溶液后的壳聚糖基水凝胶实施例1、对比例2、对比例3其拉伸强度明显高于对比例1，其中实施例1中的混合离子溶液浸泡交联得到的离子交联型壳聚糖基水凝胶DN-TC的拉伸强度接近1.7Mpa，比单一溶液浸泡得到的DN-Tpp、DN-Cit要好。
实施例2
本实施例的3D打印水凝胶骨修复支架的制备方法，包括以下步骤：
1)依次将8mg光引发剂、0.2g柠檬酸钠、2g聚乙二醇二丙烯酸酯PEGDA、3g短链壳聚糖加入30mL去离子水，搅拌混合均匀，获得浆料；
2)将浆料转移至打印料筒，转速5000rpm离心2分钟，除去制备过程中产生的气泡，获得可3D打印浆料；
3)设置挤出式3D打印机的打印参数：新建打印模型，支架打印压力为0.12Mpa，打印速度为10mm/s，打印针头直径为0.41mm，确定打印路径，开始打印支架；
4)将步骤3)获得的支架放在紫外光灯箱中光固化30分钟，接着浸泡在柠檬酸钠、三聚磷酸钠混合离子溶液中，浸泡时间为80分钟，获得离子交联型壳聚糖基水凝胶。其中，柠檬酸钠、三聚磷酸钠的混合离子溶液由5g柠檬酸钠粉末和5g三聚磷酸钠粉末加到100ml去离子水中制备而成；
5)将步骤4)获得的可3D打印离子交联型壳聚糖基水凝胶，浸泡在pH 9.0的三羟甲基氨基甲烷缓冲液Tris-HCl，过夜；
6)次日，将步骤5)获得的水凝胶交替循环浸泡300mM磷酸氢二钾溶液、500mM氯化钙溶液原位沉积无定形的磷酸钙，浸泡时间为120s，交替循环浸泡次数为5次；
7)上述水凝胶经过循环浸泡后，在37℃下浸泡pH11.0的500mM氯化钙溶液，反应24小时使无定形的磷酸钙孵育成羟基磷灰石，得到3D打印水凝胶骨修复支架。
本实施例制备的3D打印水凝胶骨修复支架的XRD测试结果如图2中的CaP-c-TC所示。
本实施例制备的3D打印水凝胶骨修复支架的压缩应力应变曲线如图3中的CaP-c-TC所示。
本实施例制备的3D打印水凝胶骨修复支架的内部羟基磷灰石的钨灯丝扫描电镜图如图4所示，从图中可看出水凝胶内部网络上附有大量的白色颗粒。
使用BCA蛋白浓度检测试剂盒和碱性磷酸酶检测试剂盒对培养在本实施例的水凝胶支架上的细胞进行碱性磷酸酶ALP活性定量实验，结果如图5中的CaP-c-TC所示。
对比例4
本实施例的3D打印水凝胶骨修复支架的制备方法，包括以下步骤：
1)依次将8mg光引发剂、0.2g柠檬酸钠、2g聚乙二醇二丙烯酸酯PEGDA、3g短链壳聚糖加入30mL去离子水，搅拌混合均匀，获得浆料；
2)将浆料转移至打印料筒，转速5000rpm离心2分钟，除去制备过程中产生的气泡，获得可3D打印浆料；
3)设置挤出式3D打印机的打印参数：新建打印模型，支架打印压力为0.12Mpa，打印速度为10mm/s，打印针头直径为0.41mm，确定打印路径，开始打印支架；
4)将步骤3)获得的支架放在紫外光灯箱中光固化30分钟，接着浸泡质量浓度为10％的柠檬酸钠、三聚磷酸钠混合离子溶液，浸泡时间为80分钟，得到3D打印水凝胶骨修复支架。
本对比例制备的3D打印水凝胶骨修复支架的XRD测试结果如图2中的DN-c-TC所示。
本对比例制备的3D打印水凝胶骨修复支架的压缩应力应变曲线如图3中的DN-c-TC所示。
使用BCA蛋白浓度检测试剂盒和碱性磷酸酶检测试剂盒对培养在本对比例的水凝胶支架上的细胞进行碱性磷酸酶ALP活性定量实验，结果如图5中的DN-c-TC所示。
使用细胞活死荧光染色试剂盒，对接种在本对比例制备的3D打印水凝胶骨修复支架上的细胞进行活死染色，结果如图6所示，活细胞在荧光下呈绿色，从图中可看出大量的活细胞黏附在支架上，说明该支架材料生物相容性好。
对比例5
1)依次将8mg光引发剂、0.2g柠檬酸钠、2g聚乙二醇二丙烯酸酯PEGDA、3g短链壳聚糖加入30mL去离子水，搅拌混合均匀，获得浆料；
2)将浆料转移至打印料筒，转速5000rpm离心2分钟，除去制备过程中产生的气泡，获得可3D打印浆料；
3)设置挤出式3D打印机的打印参数：新建打印模型，支架打印压力为0.12Mpa，打印速度为10mm/s，打印针头直径为0.41mm，确定打印路径，开始打印支架；
4)将步骤3)获得的支架放在紫外光灯箱中光固化30分钟，接着浸泡质量浓度为10％的柠檬酸钠离子溶液，浸泡时间为80分钟，得到3D打印水凝胶骨修复支架。
本对比例制备的3D打印水凝胶骨修复支架的压缩应力应变曲线如图3中的DN-c-Cit所示。
使用BCA蛋白浓度检测试剂盒和碱性磷酸酶检测试剂盒对培养在本对比例的水凝胶支架上的细胞进行碱性磷酸酶ALP活性定量实验，结果如图5中的的DN-c-Cit所示。
结合实施例2、对比例4及图2，可知，实施例2的XRD谱图明显出现羟基磷灰石的特征峰，说明水凝胶经过循环浸泡含钙、磷元素的溶液后生成的磷酸钙无机相为羟基磷灰石。
结合实施例2、对比例4～5及图3可知，实施例2的引入无机相的3D打印水凝胶骨修复支架CaP-c-TC的压缩强度优于未引入无机相的水凝胶DN-c-Cit、DN-c-TC。
结合实施例2、对比例4～5及图5，可知，实施例2的碱性磷酸酶活性要明显高于对比例4和对比例5，对比例4的ALP活性高于对比例5。分析可知，在存在成骨诱导液的条件下，虽然对比例5的浸泡柠檬酸钠的可3D打印壳聚糖基水凝胶也能促进细胞成骨分化，但实施例2、对比例4的第7天和第14天ALP活性明显高于对比例5。这一实验结果说明循环浸泡后生成的羟基磷灰石层和含三聚磷酸根的壳聚糖基水凝胶均具有促进细胞成骨分化的作用，但原位沉积羟基磷灰石的成骨效果较好。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受所述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.3D打印水凝胶骨修复支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
依次将2-羟基-4’-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮、柠檬酸钠、聚乙二醇二丙烯酸酯PEGDA、短链壳聚糖加入去离子水中，搅拌混合均匀，获得浆料；
其中，引发剂、柠檬酸钠、短链壳聚糖、聚乙二醇二丙烯酸酯PEGDA的质量比为(0.003～0.005)：(0.067-0.133)：(1～2)：1；
将浆料转移至3D打印料筒，离心除去气泡后得到3D打印浆料；
采用挤出式3D打印机进行打印，得到的支架在紫外光下固化后，接着在柠檬酸钠、三聚磷酸钠的混合离子溶液中浸泡，得到离子交联型壳聚糖基水凝胶；
将离子交联型壳聚糖基水凝胶在三羟甲基氨基甲烷缓冲液Tris-HCl中浸泡；然后分别在磷酸氢二钾溶液、氯化钙溶液交替循环浸泡多次，使离子交联型壳聚糖基水凝胶上原位沉积无定形的磷酸钙，再浸泡氯化钙溶液使无定形的磷酸钙孵育为羟基磷灰石，得到3D打印水凝胶骨修复支架。
2.根据权利要求1所述的3D打印水凝胶骨修复支架的制备方法，其特征在于，所述柠檬酸钠、三聚磷酸钠的混合离子溶液中，柠檬酸钠的质量浓度为3～5％，三聚磷酸钠的质量浓度为3～5％。
3.根据权利要求1所述的3D打印水凝胶骨修复支架的制备方法，其特征在于，所述磷酸氢二钾溶液的浓度为250～300mM。
4.根据权利要求1所述的3D打印水凝胶骨修复支架的制备方法，其特征在于，所述氯化钙溶液的浓度为450～500mM。
5.根据权利要求1所述的3D打印水凝胶骨修复支架的制备方法，其特征在于，所述在磷酸氢二钾溶液、氯化钙溶液交替循环浸泡多次，具体为：
在磷酸氢二钾溶液、氯化钙溶液交替循环浸泡1～5次，每次浸泡时间为30～120s。
6.根据权利要求1所述的3D打印水凝胶骨修复支架的制备方法，其特征在于，所述在柠檬酸钠、三聚磷酸钠的混合离子溶液中浸泡，具体为：
在柠檬酸钠、三聚磷酸钠的混合离子溶液中浸泡10～80分钟。
7.根据权利要求1所述的3D打印水凝胶骨修复支架的制备方法，其特征在于，所述在紫外光下固化，具体为：
在紫外光下固化3～30分钟。
8.根据权利要求1所述的3D打印水凝胶骨修复支架的制备方法，其特征在于，所述将离子交联型壳聚糖基水凝胶浸泡在三羟甲基氨基甲烷缓冲液Tris-HCl中，具体为：
将离子交联型壳聚糖基水凝胶浸泡在pH 9.0～pH 9.2的三羟甲基氨基甲烷缓冲液Tris-HCl中10～12小时。
9.根据权利要求1所述的3D打印水凝胶骨修复支架的制备方法，其特征在于，所述浸泡氯化钙溶液使无定形的磷酸钙孵育为羟基磷灰石，具体为：
在36～37℃下浸泡pH11.0～pH11.2的氯化钙溶液，反应20～24小时使无定形的磷酸钙孵育为羟基磷灰石。
10.离子交联型壳聚糖基水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
依次将2-羟基-4’-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮、聚乙二醇二丙烯酸酯PEGDA、短链壳聚糖加入去离子水中，搅拌混合均匀，获得溶胶；
其中，引发剂、短链壳聚糖、聚乙二醇二丙烯酸酯PEGDA的质量比为(0.003～0.005)：(1～2)：1；
将溶胶在紫外光下固化后，接着在柠檬酸钠、三聚磷酸钠的混合离子溶液中浸泡，得到离子交联型壳聚糖基水凝胶。
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