KR101304015B1

KR101304015B1 - 조직 공학용 하이드로겔-다공성 생체세라믹 융합형 스캐폴드 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR101304015B1
Application number: KR1020120064113A
Authority: KR
Inventors: 김해원; 유혜선; 홍석정
Original assignee: 단국대학교 산학협력단
Priority date: 2012-06-15
Filing date: 2012-06-15
Publication date: 2013-09-04

Abstract

본 발명은 조직 공학을 위한 융합형 스캐폴드 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 더 자세하게는 세포가 배양된 콜라겐 하이드로겔을 생체세라믹의 기공 내에 포함하는 콜라겐 하이드로겔-다공성 생체세라믹 융합형 스캐폴드 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 이에 따른, 콜라겐 하이드로겔-다공성 생체세라믹 융합형 스캐폴드는 우수한 세포 성장률을 보일 뿐만 아니라, 세포 내 골형성 주요 단백질 유전자 발현을 향상시키는 효과가 있어 골 재생 소재 등의 조직 공학에 적용할 수 있다.

Description

조직 공학용 하이드로겔-다공성 생체세라믹 융합형 스캐폴드 및 이의 제조방법{Hydrogel-porous bioceramic hybrid scaffold for tissue engineering and method for preparation thereof}

본 발명은 조직 공학을 위한 융합형 스캐폴드 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 더 자세하게는 세포가 배양된 콜라겐 하이드로겔을 생체세라믹의 기공 내에 포함하는 콜라겐 하이드로겔-다공성 생체세라믹 융합형 스캐폴드 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

최근 산업재해 및 교통사고의 빈도가 늘고, 고령화 사회로 접어들면서, 경조직 대체용 생체 재료의 수요가 급증하고 있다. 생체고분자 소재의 경우 가공성이 우수하여 응력이 가해지는 경조직에 응용하기 위한 연구가 진행되어 왔으나, 생체 금속과 유사한 골흡수 현상뿐만 아니라 미반응 단량체의 축적에 의한 제2 의 질병 야기로 인해 높은 하중을 받지 않는 인공 피부, 혈액 필터의 기능성 소재에만 한정되어 응용되어 왔다.

골 치료 및 재생에는 중간엽 줄기세포 및 조골세포와 같은 특정한 세포와 그들이 3차원으로 자라날 때까지는 지지체가 필요하며 성장인자와 세포외분자 및 기계적 강도가 요구된다. 뼈는 콜라겐 섬유다발과 콜라겐 피브릴을 따라 침전되어 있는 하이드록시아파타이트(hydroxyapatite) 나노결정들로 이루어진 복합 구조를 가진다. 또한, 뼈는 생명 현상을 유지하기 위해 혈관과 골세포, 점다당체(mucopolysaccharide)를 가지고 있다. 뼈의 구성 성분과 탄성계수의 관계를 살펴보면, 낮은 탄성계수를 가지는 콜라겐 섬유다발이 뼈의 주요 응력 방향을 따라 배열되어 있고 뼈 건조 중량의 70% 정도를 차지하는 하이드록시아파타이트 미네랄 부분이 뼈 강도의 상당 부분을 유지하게 된다.

한편, 생체 활성과 생체흡수성이 우수한 인산칼슘계 화합물을 사용하여 골 이식 대체 재료로 사용하고 있으며, 이 화합물은 골 형성능력 및 인체의 뼈와 가장 근접한 화학적 구조를 가짐으로써, 인체에 우수한 생체적합성을 보인다. 하지만 인산칼슘계 화합물의 경우에는 성형하기가 어렵다는 단점이 있으며, 생체세라믹이라는 한정된 부분으로써 가장 큰 문제점인 취성을 가지고 있기에 인체 내 주입 시 탄성계수 및 압축강도에 대한 문제점을 가지고있다.

이와 같이, 골 이식재로 생체 재료 중 생체 친화성 및 기계적 특성이 요구되는 경조직 대체 생체소재에는 생체세라믹과 생체고분자의 적용이 요구되었다. 생체활성유리는 실리카를 주요성분으로 인, 칼슘을 함유한 재료로 조성에 따라 골융합과 생분해를 통한 골재생을 유도한다. 이들이 방출하는 이온들은 세포가 세포외 미네랄화 매트릭스(extracelluar mineralize matrix)를 형성하도록 한다. 다공성 생체활성유리(MBG, Mesoporous bioactive glass)는 생체활성유리가 나노크기의 기공을 갖는 다공성 구조로 제조되어 비표면적 및 공극률을 증가시켜 생분해성을 높이고 생체적합성을 부여하였다. 또한, MBG를 생체유사체액(SBF, Simulated body fluid)에 침적시킬 경우 높은 비표면적으로 인해 이온들의 교환이 빨라지고, 이에 MBG 표면에 뼈의 모체인 하이드록시아파타이트의 형성이 가속화된다. 따라서, 골재생용 3차원 지지체에 MBG가 포함될 경우 높은 생체 활성을 유도할 수 있다. 하지만, MBG가 생체 활성은 높으나 그 때문에 오히려 많은 양의 칼슘이 용출됨으로 인하여 독성을 나타낼 수도 있는 단점이 있다.

최근에, 높은 다공도(85-90%) 및 명확한 기공 배열을 갖는 오픈 매크로채널로 구성된 신규한 생체세라믹 다공성 스캐폴드가 개발되었다. 그러나, 이를 골 조직 공학 소재로 사용하였을 경우 몇 가지 문제점이 발생한다. 첫째, 세포를 스캐폴드 내로 접종할 시 대부분의 세포(50% 이상)가 쉽게 스캐폴드의 매크로채널을 통과하여 배양벽의 바닥으로 떨어져, 결과적으로 낮은 세포 접종율을 갖는다. 더욱이, 3차원 스캐폴드를 통한 세포의 균일한 분포를 이루기가 더 어려워지는 문제점이 나타났다.

이에, 본 발명자들은 우수한 세포 증식 활성을 갖는 신규한 조직 공학용 생체세라믹 스캐폴드를 연구하던 중, 세포를 접종한 콜라겐 하이드로겔을 결합시킨 콜라겐 하이드로겔-다공성 생체세라믹 융합형 스캐폴드가 높은 세포 증식 활성 및 강한 기계적 특성을 보이는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 우수한 세포 성장 및 기계적 특성을 갖는 콜라겐 하이드로겔-다공성 생체세라믹 융합형 스캐폴드의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기의 제조방법으로 제조된 콜라겐 하이드로겔-다공성 생체세라믹 융합형 스캐폴드를 제공하는 것이다.

상기의 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 세포를 콜라겐 용액에 주입하는 단계(단계 1); 다공성 생체세라믹 스캐폴드를 상기 세포를 함유한 콜라겐 용액에 침지하는 단계(단계 2); 및 상기 세포를 함유한 콜라겐 용액이 겔화하는 단계(단계 3)를 포함하는, 콜라겐 하이드로겔-다공성 생체세라믹 융합형 스캐폴드의 제조방법을 제공한다.

상기 단계 1은, 세포를 함유한 콜라겐 용액을 제조하기 위하여, 세포를 콜라겐 용액 내에 접종하는 단계이다.

상기 단계 2는, 다공성 생체세라믹 스캐폴드 기공 내에 세포를 접종하기 위하여, 세포를 함유한 콜라겐 용액에 상기 다공성 스캐폴드를 침지하는 단계이다. 이를 통해, 상기 다공성 생체세라믹 스캐폴드의 기공은 상기 세포를 함유한 콜라겐 용액으로 채워질 수 있다. 본 발명의 세포를 함유한 콜라겐 용액은 세포를 접종한 후 2 내지 3주 동안 배양한 것이 바람직하다.

상기 단계 3은, 상기 다공성 생체세라믹 스캐폴드의 기공을 채운 세포를 함유한 콜라겐 용액이 겔화하여 콜라겐 하이드로겔-다공성 생체세라믹 융합형 스캐폴드를 수득하는 단계이다.

또한, 상기 콜라겐 하이드로겔-다공성 생체세라믹 융합형 스캐폴드의 다공성 생체세라믹 스캐폴드는 하기의 제조방법을 통해 제조할 수 있다.

1) 생체 활성 세라믹 파우더를 에탄올에 분산시켜 슬러리화하는 단계;

2) 상기 생체 활성 세라믹 슬러리를 침지 코팅 공정을 이용하여 탄소 몰드에 박막을 형성하는 단계; 및

3) 상기 생체 활성 세라믹 슬러리가 코팅된 탄소 몰드를 열처리하여 다공성 생체세라믹 스캐폴드를 수득하는 단계.

상기 단계 1)은, 상기 생체 활성 세라믹 파우더를 슬러리화하기 위하여, 상기 생체 활성 세라믹 파우더를 에탄올 용액에 분산시킨 후 균일한 분산을 위하여 볼밀링 하는 단계이다. 본 발명의 생체 활성 세라믹 파우더는 인산칼슘계로서, 하이드록시아파타이트(hydroxyapatite), 트리칼슘포스페이트(tricalcium phosphate) 또는 테트라칼슘포스페이드(tetracalcium phosphate) 등을 사용할 수 있으며, 이들의 혼합물도 사용할 수 있다. 상기 생체 활성 세라믹 파우더 혼합물은 중량비로 9:1 내지 1:9로 사용하는 것이 바람직하다. 본 발명의 일 실시예에는 상기 생체 활성 세라믹 파우더 혼합물로 하이드록시아파타이트 및 트리칼슘포스페이트를 50:50 중량비로 혼합하여 사용하였다.

또한, 상기 생체 활성 세라믹 파우더를 에탄올에 분산시, 에탄올에 폴리(비닐 부티랄) 및 트리에틸포스페이트를 포함하는 것이 바람직하다.

상기 단계 2)는, 탄소 몰드에 생체 활성 세라믹 슬러리 박막을 형성시키기 위하여, 침지 코팅 공정을 수행하는 단계이다. 상기 침지 코팅 공정은 탄소 몰드를 상기 생체 활성 세라믹 슬러리에 침지하는 단계, 이를 회수하여 건조하는 단계로 수행될 수 있다. 이러한 침지 코팅 공정은 1 내지 10회 반복할 수 있다.

상기 단계 3)은, 다공성 생체세라믹 스캐폴드를 수득하기 위하여, 상기 생체 활성 세라믹 슬러리가 코팅된 탄소 몰드를 열처리하는 단계이다. 상기 탄소 몰드 열처리는 승온속도 1℃/min으로 800℃로 가열한 후 3시간 동안 유지하고, 승온속도 10℃/min으로 1250℃로 가열한 후 1시간 동안 유지하는 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 상기의 제조방법으로 제조된 콜라겐 하이드로겔-다공성 생체세라믹 융합형 스캐폴드를 제공한다.

발명의 일 실시예에 따르면, 상기 제조방법으로 제조된 콜라겐 하이드로겔-다공성 생체세라믹 융합형 스캐폴드는 우수한 세포 생존 및 증식이 나타났으며, 향상된 기계적 특성을 확인할 수 있었다.

본 발명에 따른 콜라겐 하이드로겔-다공성 생체세라믹 융합형 스캐폴드는 우수한 세포 성장률을 보일 뿐만 아니라, 알칼리성 인산가수분해효소 활성을 증가시킴으로써 골형성 반응을 증가시키는 효과가 있다.

또한, 기계적 특성이 우수하며, 세포 내 골형성 주요 단백질 유전자 발현을 향상시키는 효과가 있어 골 재생 소재 등의 조직 공학에 적용할 수 있다.

도 1은, 본 발명의 일 실시예에 따른 (a) 다공성 생체세라믹 스캐폴드의 모식도, (b) 중간엽줄기세포(MSCs)-콜라겐 용액을 다공성 생체세라믹 스캐폴드에 결합시키는 단계를 나타내는 모식도, (c) 다공성 생체세라믹 스캐폴드를 중간엽줄기세포-콜라겐 용액과 결합시키기 전과 후를 나타낸 광학 이미지 및 (d) 다공성 생체세라믹 스캐폴드 및 콜라겐 하이드로겔이 결합된 다공성 생체세라믹 융합형 스캐폴드 내 세포의 분산 및 성장 모식도를 나타낸 것이다.
도 2는, 본 발명의 일 실시예에 따른 중간엽줄기세포를 콜라겐 하이드로젤 용액에 접종한 후 세포 생존율 및 세포 성장을 (a) 배양 3일 후의 중간엽줄기세포 접종 밀도에 따른 세포 생존율, (b) 1×10⁶ 세포를 접종한 후 공초점현미경(CLSM) 이미지 및 (c) 1×10⁵ 세포를 접종한 후 공초점현미경(CLSM) 이미지로 나타낸 것이다.
도 3은, 본 발명의 일 실시예에 따른 (a) 세포 배양 3일 후 콜라겐 하이드로겔-다공성 생체세라믹 융합형 스캐폴드, (b) 세포 배양 3일 후 다공성 생체세라믹 스캐폴드, (c) 및 (e) 세포 배양 14일 후 콜라겐 하이드로겔-다공성 생체세라믹 융합형 스캐폴드 및 (d) 및 (f) 세포 배양 14일 후 다공성 생체세라믹 스캐폴드의 공초점현미경(CLSM) 이미지를 나타낸 것이다.
도 4는, 본 발명의 일 실시예에 따른 배양 기간(3일, 7일 및 14일)에 따른 콜라겐 하이드로겔-다공성 생체세라믹 융합형 스캐폴드 및 다공성 생체세라믹 스캐폴드의 세포 증식 그래프를 나타낸 것이다.
도 5는, 본 발명의 일 실시예에 따른 배양 기간(7일, 10일 및 14일)에 따른 콜라겐 하이드로겔-다공성 생체세라믹 융합형 스캐폴드 및 다공성 생체세라믹 스캐폴드의 ALP(알칼리성 인산가수분해효소) 활성 그래프를 나타낸 것이다.
도 6은, 본 발명의 일 실시예에 따른 배양 기간(5일, 10일 및 15일)에 따른 콜라겐 하이드로겔-다공성 생체세라믹 융합형 스캐폴드 및 다공성 생체세라믹 스캐폴드 내의 (a) Col I(타입 I 콜라겐), (b) OPN(osteopontin) 및 (c) BSP(bone sialoprotein)의 유전자 발현 그래프를 나타낸 것이다.
도 7은, 본 발명의 일 실시예에 따른 콜라겐 하이드로겔-다공성 생체세라믹 융합형 스캐폴드 및 다공성 생체세라믹 스캐폴드 내의 OPN, OCN 및 GAPDH의 Western blot 결과를 나타낸 것이다.
도 8은, 본 발명의 일 실시예에 따른 배양 기간(21일 및 28일)에 따른 콜라겐 하이드로겔-다공성 생체세라믹 융합형 스캐폴드 및 다공성 생체세라믹 스캐폴드 내에 세포의 칼슘 퇴적양 그래프를 나타낸 것이다.
도 9는, 본 발명의 일 실시예에 따른 콜라겐 하이드로겔-다공성 생체세라믹 융합형 스캐폴드 및 다공성 생체세라믹 스캐폴드의 (a) 세포 배양 전 응력-변형율 곡선, (b) 세포 배양 30일 후 응력-변형율 곡선 및 (c) 세포 배양 전 후의 압축 강도 그래프를 나타낸 것이다.

이하, 하기 제조예 및 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 제조예 및 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

실시예 : 중간엽줄기세포 (MSCs)-콜라겐 하이드로겔 /다공성 생체세라믹 스캐폴드

1) 다공성 생체세라믹 스캐폴드

다공성 생체세라믹 스캐폴드의 전구체로서 이상성 구조 하이드록시아파타이트(hydroxyapatite, HA) 및 트리칼슘포스페이트(tricalcium phosphate, TCP, β-form)를 50:50 중량비로 사용하였다. 다공성 생체세라믹 스캐폴드를 제조하기 전, mini-CNC 장치(MDX-20, Roland DGA, Hamamatsu, Japan)을 사용하여 5×5×5 mm³의 큐빅형 탄소 몰드를 제조하였다. 상기 하이드록시아파타이트 및 트리칼슘포스페이트 파우더를 슬러리화하기 위하여 폴리(비닐 부티랄) 및 트리에틸 포스페이트를 함유한 에탄올 용액에 첨가한 후 균일한 분산을 위하여 볼밀링 하였다. 그 후, 침지 코팅 공정을 이용하여 상기 탄소 몰드 표면에 상기 슬러리를 코팅하여 박막층을 형성시켰다. 생체세라믹 박막이 형성된 탄소 몰드는 승온속도 1℃/min으로 800℃로 가열한 후 3시간 유지하고, 승온속도 10℃/min으로 1250℃로 가열한 후 1시간 유지하는 방법으로 열처리하여 다공성 생체세라믹 스캐폴드를 제조하였다. 제조된 다공성 생체세라믹 스캐폴드는 이후 실험을 위하여 autoclave에서 살균하였다.

2) 중간엽줄기세포(MSCs)-콜라겐 하이드로겔/다공성 생체세라믹 융합형 스캐폴드

ⓛ 중간엽줄기세포(MSCs) 배양 및 중간엽줄기세포(MSCs)-콜라겐 하이드로겔 혼합물

중간엽줄기세포(MSCs)는 랫트의 골수에서 수득하였다. 세포는 현탁화하고 37℃, 5% 이산화탄소의 습한 공기분위기 조건에서 1% 항생제/향진균제 및 10% 우태아 혈청(fetal bovine serum)이 더해진 α-MEM(minimal essential medium)을 포함하는 배지에서 배양하였다. 부착세포는 이후 실험을 위하여 확장하고 2 내지 3 계대배양하였다. 콜라겐 용액은 ×10 DMEM(Dulbecco's-modified eagle medium) 및 중화된 1N 수산화나트륨과 혼합하였을 때 겔화되는 rat tail collagen type I(BD biosciences)를 사용하였다. 다양한 농도의 중간엽줄기세포(1×10⁴, 1×10⁵ 및 1×10⁶cells)을 세포 배양기에서 37℃로 저장하는 동안 겔화할 수 있는 1 ㎖ 콜라겐 용액에 주입하고, 2 내지 3주 배양하였다. 배양 후, 콜라겐 하이드로겔 매트릭스 내부의 세포의 배양상태를 관찰 한 결과, 1×10⁶ 중간엽줄기세포를 주입한 콜라겐 하이드로겔은 상당히 수축한 반면, 다른 농도의 중간엽줄기세포를 주입한 콜라겐 하이드로겔은 수축하지 않았다. 따라서, 1×10⁵ cell/콜라겐 용액 ㎖ 농도로 제조된 중간엽줄기세포-콜라겐 하이드로겔 혼합물을 다공성 생체세라믹 스캐폴드 복합체 제조에 사용하였다.

② 중간엽줄기세포(MSCs)-콜라겐 하이드로겔/다공성 생체세라믹 융합형 스캐폴드

상기 실시예 2)의 ①에서 제조된 중간엽줄기세포(MSCs)-콜라겐 하이드로겔을 이용하여 중간엽줄기세포(MSCs)-콜라겐 하이드로겔/다공성 생체세라믹 융합형 스캐폴드를 제조하였다. 상기 실시예 1)에서 제조된 다공성 생체세라믹 10개를 베슬(vessel) 안에 놓은 후 상기 실시예 2)의 ①에서 제조된 중간엽줄기세포(MSCs)-콜라겐 하이드로겔 용액을 첨가하였다. 중간엽줄기세포(MSCs)-콜라겐 하이드로겔 용액의 양은 중간엽줄기세포(MSCs)-콜라겐 하이드로겔 용액으로 완벽하게 채워진 다공성 생체세라믹의 공극율에 기준하여 사용하였다. 또한, 실린지 펌프를 이용하여 다공성 생체세라믹 기공 내부에 중간엽줄기세포(MSCs)-콜라겐 하이드로겔 용액이 가득 채워질 수 있도록 하였다. 2 내지 3분 후, 중간엽줄기세포(MSCs)-콜라겐 하이드로겔/다공성 생체세라믹 융합형 스캐폴드는 37℃에서 5% 이산화탄소를 갖는 습한 분위기 배양기에 저장하였다.. 10분 후, 중간엽줄기세포(MSCs)-콜라겐 하이드로겔/다공성 생체세라믹 융합형 스캐폴드는 24-well plate로 옮기고 배지와 함께 첨가하였다.

비교예 : 중간엽줄기세포(MSCs)를 직접 접종한 다공성 생체세라믹 스캐폴드

상기 실시예 1)에서 제조된 다공성 생체세라믹 스캐폴드에 중간엽줄기세포를 직접 접종하였다. 중간엽줄기세포는 실시예 2)의 ①에서와 같은 방법으로 수득하여 사용하였다.

상기 실시예 및 비교예의 스캐폴드의 제조과정에 대한 모식도 및 광학 이미지를 도 1에 나타내었다.

도 1a에 나타난 바와 같이, 실시예 1)의 다공성 생체세라믹 스캐폴드는 5×5×5 mm³의 크기를 갖는 큐빅형 이상성 생체세라믹 스캐폴드 이며, 기공은 서클 "C" 및 스퀘어 "S"형의 두 개의 다른 타입으로 생성되었다. 기공 크기는 2D 이미지 분석 기준으로 330×330 ㎛², φ=570 ㎛(서클 타입)이었으며, 기공률는 평균 91.9%로 측정되었다.

도 1b 및 도 1c에 나타난 바와 같이, 37℃에서 10분 동안 배양기 내에 저장하여 겔 형성이 발생하는 동안, 중간엽줄기세포-콜라겐 하이드로겔 용액은 진공 무균 조건 하에 3D 스캐폴드의 기공 내부에 채워졌다.

도 1d에 나타난 바와 같이, 세포를 직접 접종한 스캐폴드의 경우 중간엽줄기세포가 스캐폴드의 표면에만 성장하지만, 콜라겐 하이드로겔 내부에 함유된 중간엽줄기세포는 콜라겐 섬유 분자의 네트워크를 통하여 3차원 적으로 분산되고 성장할 것으로 나타났다.

실험예 1: 접종 밀도에 따른 중간엽줄기세포의 생존능 분석

접종 밀도가 총 세포 생존능에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 콜라겐 하이드로겔에 1×10⁴, 1×10⁵ 및 1×10⁶중간엽줄기세포를 접종하고 3일 후에 세포 생존능을 확인하였다. MTS 색소환원법으로 접종 밀도 및 세포 수 간의 상관관계를 나타내었으며, 그 결과를 도 2a에 나타내었다.

또한, 세포 생존능 분석을 위하여 공초점 현미경(confocal microscopy) 분석을 실시하였으며, 그 결과를 도 2b 및 도 2c에 나타내었다.

도 2b 및 도 2c에 나타난 바와 같이, 1×10⁶ 중간엽줄기세포를 접종한 경우 1×10⁵ 중간엽줄기세포를 접종한 것과 비교하여 많은 세포가 존재하였으며, 1×10⁴ 중간엽줄기세포를 접종 한 경우엔 매우 소량의 세포가 관찰되었다. 또한, 1×10⁶ 중간엽줄기세포를 접종한 경우 14일 후 상당한 콜라겐 하이드로겔 수축을 확인하였다. 따라서, 1×10⁵ 중간엽줄기세포를 다공성 생체세라믹 스캐폴드에 접종하여 이후 실험에 사용하였다.

실험예 2: 세포 성장 분석

상기 실시예 및 비교예의 중간엽줄기세포가 접종된 각각 스캐폴드 내 중간엽줄기세포 조직학적 양상은 confocal laser scanning microscopy(CLSM: LSM 510, Carl Zeiss)를 사용하여 확인하였다. 중간엽줄기세포는 4% 파라폼알데하이드(paraformaldehyde)로 고정하고, 0.1% Trion X-100으로 처리하였다. 1% 소혈청알부민(BSA)에 희석한 Alexa Fluor 546 phalloidin(Invitrogen A22283)을 1시간 동안 첨가하여 F-actin을 착색하였다. DAPI(Invitrogen P36935)를 포함한 ProLong® Gold antifade reagent를 stain nuclei로 사용하였으며, 분석 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타난 바와 같이, 중간엽줄기세포-콜라겐 하이드로겔을 다공성 생체세라믹 융합형 스캐폴드에 접종한 3일 후에는 중간엽줄기세포가 콜라겐 매트릭스 도처에서 불규칙적인 배열로 나타났다. 반면에, 다공성 생체세라믹 스캐폴드에 직접적으로 중간엽줄기세포를 접종한 경우에는 중간엽줄기세포가 스캐폴드의 벽에서만 일부 나타났으며, 2D 단분자막 내에 세포 배양의 일반적인 방추형 형태학으로 나타나는 것을 확인할 수 있었다. 14일 후, 중간엽줄기세포-콜라겐 하이드로겔/다공성 생체세라믹 융합형 스캐폴드의 경우에는 조직의 전체에서 중간엽줄기세포를 확인할 수 있었다. 반면, 중간엽줄기세포를 직접 주입한 다공성 생체세라믹 스캐폴드의 경우에는 여전히 스캐폴드 벽에만 일부 나타났다.

또한, 세포증식 분석을 위하여 MTS 분석키트(CellTiter 96 Aqueous One solution, Promega)를 사용하였다. 세포 수집을 위하여, 콜라겐 하이드로겔은 10 ㎎ 콜라케나제(collagenase) Type I(Worthington)을 사용하여 37℃에서 1시간 동안 용해하였다. 용액을 1500 rpm에서 3분 동원 원심분리 한 후 용액으로부터 세포를 수집하였다. CellTiter 96 aqueous One Solution Reagent(Promega, Madison, WI)를 각 well에 첨가하였다. 배양 3시간 후, 세포 생존능은 490 nm 광학밀도에서 ELISA microplate reader로 정량적으로 분석하였으며, 도 4에 결과를 나타내었다.

도 4에 나타난 바와 같이, 중간엽줄기세포-콜라겐 하이드로겔/다공성 생체세라믹 융합형 스캐폴드 및 중간엽줄기세포를 직접 접종한 다공성 생체세라믹 스캐폴드 둘 다 3일부터 14일까지 현저한 세포질 증가를 나타내었으며, 3일 및 14일에 콜라겐 하이드로겔/다공성 생체세라믹 융합형 스캐폴드가 다공성 생체세라믹 스캐폴드와 비교하여 유의적인 세포질 증가를 보였다(각각 p<0.05 및 p<0.01). 배양 3일째에는 콜라겐 하이드로겔-다공성 생체세라믹 융합형 스캐폴드에서 약 40% 더 많은 세포가 확인되었으나, 7일 및 14일째에는 두 스캐폴드 간에 총 관련 세포수가 감소하였다.

실험예 3: 알칼리성 인산가수분해효소( Alkaline phosphateas , ALP ) 활성 측정

상기 실시예 및 비교예의 스캐폴드에서의 중간엽줄기세포의 골육종 분화 레벨을 확인하기 위하여, 중간엽줄기세포의 알칼리성 인산가수분해효소 활성을 스캐폴드 접종 7, 10 및 14일째에 측정하였다. 중간엽줄기세포 및 분비물은 콜라게나제(타입 I)를 사용하여 digestion 후 각 스캐폴드(콜라겐 하이드로겔-다공성 생체세라믹 융합형 스캐폴드 및 다공성 생체세라믹 스캐폴드)로부터 수집하였다. 중간엽줄기세포 펠렛은 원심분리를 통해 수집하였다. 총 단백질은 DC 단백질 분석키트(BioRad)를 이용하여 분석하였다. 효소작용을 위하여, 각 샘플은 기질로서 p-나이트로페닐 포스페이트를 사용한 알칼리성 인산가수분해효소 반응 매질에 첨가하였다. p-나이트로페놀 효소 생성물의 레벨은 405 nm 흡광도에서 ELISA microplate reader를 이용하여 측정하였다. 알칼리성 인산가수분해효소 활성 레벨은 소혈청알부민(BSA)을 사용하여 만든 protein standard curve로부터 분석하였다. 각 측정은 3회 반복하였으며, 그 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타난 바와 같이, 콜라겐 하이드로겔-다공성 생체세라믹 융합형 스캐폴드에서 일관된 활성 증가가 나타났으며(p<0.01), 특히 14일째에 현저한 증가를 확인할 수 있었다. 다공성 생체세라믹 스캐폴드에 비교하여 콜라겐 하이드로겔-다공성 생체세라믹 융합형 스캐폴드에서 약 5배의 알칼리성 인산가수분해효소 활성 증가가 확인되었으며, 콜라겐 하이드로겔/다공성 생체세라믹 융합형 스캐폴드에서 배양 10일째 및 14일째 사이에 골형성 전환이 화럿ㅇ화 되었다. 반면에, 다공성 생체세라믹 스캐폴드에서는 골형성 전환 활성이 나타나지 않는 것을 확인할 수 있었다.

실험예 4: 중합효소 연쇄반응( quantitative polymerrase chain reaction , Q-PCR)을 통한 유전자발현 측정

상기 실시예 및 비교예의 스캐폴드에서의 중합효소 연쇄반응을 통한 유전자발현 특성을 분석하였다. 최대 15일 배양 후, total cellular RNA는 RNasey mini Kit(Qiagen, Hilden)을 사용하여 분리하였다. 그리고 first-standard cDNA synthesis Kit(PrimeScript RT reagent Kit, Bioneer, Korea)를 사용하여 cDNA로 변환하였다. 역전사효소반응은 2 ㎍ total RNA를 사용하여 수행하였으며, 중간엽줄기세포의 골육종 분화는 콜라겐 타입 I(Col I), bone sialoprotein(BSP) 및 osteopotin(OPN)을 포함한 분화 마커 내에 차이에 근거하여 모니터하였다. 또한, β-actin을 mRNA 레벨 정상화를 위하여 스탠다드 하우스키핑 유전자로서 사용하였다. 중합효소 연쇄반응용 유전자 서열은 하기 표 1에 나타내었다.

유전자	서열
β-actin	Forward-GCT ACG AGC TGC CTG ACG G Reverse-GAG GCC AGG ATG GAG CC
BSP	Forward-ATA GGC AAC GAG TAC AAC AC Reverse-GTA TCC AGA TGC AAA GAC AG
OPN	Forward-ATC TGA GTC CTT CAC TG Reverse-GGG ATA CTG TTC ATC AGA AA
Col I	Forward-TGT TCG TGG TTC TCA GGG TAG Reverse-TTG TCG TAG CAG GGT TCT TTC

실시간 중합효소 연쇄반응 생산물 누적량을 기록하고 SYBR Green PCR kit(Quantace)를 사용하여 수량화하였다. 중합효소 연쇄반응 후, 다른 유전자의 확장 효과는 상대적 Ct method를 이용하여 분석하였다. 각 측정은 3회 반복하였으며, 그 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6에 나타난 바와 같이, 콜라겐 하이드로겔/다공성 생체세라믹 융합형 스캐폴드에 콜라겐 타입 I(Col I) 유전자 발현은 배양 5일 및 10일에 꽤 높은 수치를 나타냈으며(다공성 생체세라믹 스캐폴드에 비교하여 둘다 p<0.01), 배양 15일에는 Col I 발현이 다공성 생체세라믹 스캐폴드와 유사하게 낮아졌다. 동시에, OPN 및 BSP 발현은 5일 및 10일에서는 유사한 수치를 나타내었으나, 배양 15일에는 다공성 생체세라믹 스캐폴드와 비교하여 콜라겐 하이드로겔/다공성 생체세라믹 융합형 스캐폴드에서 현저하게 증가하였다. 특히 BSP의 경우 콜라겐 하이드로겔/다공성 생체세라믹 융합형 스캐폴드 내 중간엽줄기세포에서 다공성 생체세라믹 스캐폴드 내 중간엽줄기세포와 비교하여 약 6배 발현이 증가하였다.

실험예 5: Western blot 을 통한 단백질 합성 분석

상기 실시예 및 비교예 스캐폴드 내에서 합성한 골 단백질 레벨을 측정하기 위하여 Western blot 분석을 수행하였다. 21일 동안 배양한 후, 세포를 프로테아제 억제인자를 함유한 RIPA 버퍼와 함께 준비하였다. 용해물은 4℃에서 14,000 rpm으로 15분 동안 원심분리하였다. 상청액은 수집하였고, 단백질 농도는 Bio-Rad assay를 사용하여 분석하였다. 시료는 10% SDS-PAGE(sodium dodecyl shplhate-polyacrylamide gel electrophoresis, 단백질 정성분석방법)에 주입하고 이동막(transfer membrane)에 옮겼다. 막(membrane)은 2% 소혈청알부민(BSA)를 사용하여 1시간 동안 0.25% Tween 20이 함유된 Tris 버퍼 saline 내에 봉쇄하였다. 막은 primary antibody against OCN(마우스 단일클론, Abcam, Cambridge, MA), OPN(토끼 다클론, Abcam, Cambridge, MA) 또는 GAPDH(sc25778; Santa Cruz Biotechnology)와 함께 배양한 후 겨자무과산화효소와 결합된 2차 항체와 배양하였다. 밴드는 X-ray 필름에 노출한 후 ECL Plus Kit(Amercham Pharmacia Biotech)를 사용하여 확인하였으며, 도 7에 나타내었다.

도 7에 나타난 바와 같이, OCN의 총 단백질이 OPN의 총 단백질보다 낮았음에도 불구하고, 67-kD OPN 생성물의 단백질 레벨은 콜라겐 하이드로겔/다공성 생체세라믹 융합형 스캐폴드에서 눈에 띄게 나타났다.

실험예 6: 칼슘 측정

상기 실시예 및 비교예 스캐폴드에서 세포 무기질화 동안 생성된 칼슘은 Calcium E-Test Kit(Wako)을 사용하여 정량적으로 측정하였다. 21일 및 28일 동안 중간엽줄기세포를 배양한 콜라겐 하이드로겔/다공성 생체세라믹 융합형 스캐폴드 및 미세 다공성 생세 세라믹 스캐폴드는 각각 세척하고 분비된 세포외 기질(ECM)은 스캐폴드로부터 수집하였다. 용해 및 원심분리 후, 시료 펠렛은 시료 내 석회화를 위하여 1N 염산용액에 첨가하였다. 칼슘은 560 nm 흡광도에서 칼슘 스탠다드 곡선 기준과 측정 수치를 통해 수량화하였다. 분석은 3번 반복하였으며, 결과를 도 8에 나타내었다.

도 8에 나타난 바와 같이, 시간이 지남에 따라 칼슘 레벨이 증가하였다. 콜라겐 하이드로겔/다공성 생체세라믹 융합형 스캐폴드 및 다공성 생체세라믹 스캐폴드 둘 다에서 연장된 배양으로 중간엽줄기세포의 석회화 매트릭스 생성이 향상될 수 있음을 확인하였다(각각 p<0.05 및 p<0.01). 더욱이, 21일 및 28일 둘 다에서 콜라겐 하이드로겔/다공성 생체세라믹 융합형 스캐폴드에서 칼슘 퇴적량이 크게 증가하는 것을 확인하였다(p<0.05, 두 기간 모두).

실험예 7: 기계적 특성

상기 실시예 및 비교예의 스캐폴드의 기계적 특성은 30일 동안 중간엽줄기세포 배양 이전 및 이후에 시험하였다. 압축하중은 크로스헤드 속도 10 mm/min으로 Intron 3344를 사용하여 각 스캐폴드(5×5×5 mm³)에 적용하였다. 응력-변형율 곡선은 각 스캐폴드의 최종 균열 전에 기록하였으며, 압축강도는 시험동안 기록된 최고 압축에서 분석하였다. 시험은 각 그룹당 5 스캐폴드 샘플씩 수행하였으며, 평균 수치 및 표준편차를 얻었으며, 결과를 도 9에 나타내었다.

도 9에 나타난 바와 같이, 콜라겐 하이드로겔/다공성 생체세라믹 융합형 스캐폴드의 경우 적재 하중이 현저하게 증가하였다. 또한, 30일 배양 후의 각 스캐폴드의 적재하중이 향상되는 것을 확인할 수 있었으며, 콜라겐 하이드로겔/다공성 생체세라믹 융합형 스캐폴드가 다공성 생체세라믹 스캐폴드와 비교하여 높은 압축 강도를 견뎌내는 것을 확인할 수 있었다(p<0.01).

Claims

세포를 콜라겐 용액에 주입하는 단계;
다공성 생체세라믹 스캐폴드를 상기 세포를 함유한 콜라겐 용액에 침지하는 단계; 및
상기 세포를 함유한 콜라겐 용액이 겔화하는 단계를 포함하는,
콜라겐 하이드로겔-다공성 생체세라믹 융합형 스캐폴드의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 세포를 함유한 콜라겐 용액은 세포를 접종한 후 2 내지 3주 동안 배양한 것을 특징으로 하는,
콜라겐 하이드로겔-다공성 생체세라믹 융합형 스캐폴드의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 다공성 생체세라믹 스캐폴드는,
생체 활성 세라믹 파우더를 에탄올에 분산시켜 슬러리화하는 단계;
상기 생체 활성 세라믹 슬러리를 침지 코팅 공정을 이용하여 탄소 몰드에 박막을 형성하는 단계; 및
상기 생체 활성 세라믹 슬러리가 코팅된 탄소 몰드를 열처리하여 다공성 생체세라믹 스캐폴드를 수득하는 단계로 제조되는 것을 특징으로 하는,
콜라겐 하이드로겔-다공성 생체세라믹 융합형 스캐폴드의 제조방법.
제3항에 있어서, 상기 생체 활성 세라믹 파우더는 인산칼슘계로서, 하이드록시아파타이트(hydroxyapatite), 트리칼슘포스페이트(tricalcium phosphate), 테트라칼슘포스페이트(tetracalcium phosphate) 또는 이들의 혼합물인 것을 특징으로 하는,
콜라겐 하이드로겔-다공성 생체세라믹 융합형 스캐폴드의 제조방법.
제4항에 있어서, 상기 생체 활성 세라믹 파우더 혼합물은 중량비로 9:1 내지 1:9인 것을 특징으로 하는,
콜라겐 하이드로겔-다공성 생체세라믹 융합형 스캐폴드의 제조방법.
제3항에 있어서, 상기 탄소 몰드 열처리는 승온속도 1℃/min으로 800℃로 가열한 후 3시간 동안 유지하고, 승온속도 10℃/min으로 1250℃로 가열한 후 1시간 동안 유지하는 것을 특징으로 하는,
콜라겐 하이드로겔-다공성 생체세라믹 융합형 스캐폴드의 제조방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 제조방법으로 제조된 콜라겐 하이드로겔-다공성 생체세라믹 융합형 스캐폴드.