KR102064915B1 - 생체모사 수산화인회석 미소구체의 제조 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 생체모사 수산화인회석 미소구체의 제조방법에 관한 발명으로, 구체적으로 생활성 유리 나노입자(BGn)를 제조하는 단계; 생성된 생활성 유리 나노입자를 SBF용액에 침지하여 생활성 유리 나노 응집체를 형성하는 단계; 및 형성된 응집체가 수산화인회석으로 광물화되는 단계를 포함하는, 0.5-50μm 크기의 생체모사 수산화인회석 미소구체(HAM, Hydroxy apatite microsphere)의 제조방법에 관한 것이다.
구체적으로 본 발명의 수산화인회석 미소구체는 BGn이 표면 뿐만 아니라 전체에 걸쳐 광물화작용을 통해 얻어지며 이로인해 다공성 및 넓은 표면적을 갖는 특성을 갖는다. 따라서 상기 미소구체에 단백질을 적재시켜 선형(0차) 및 지속적 방출을 통한 약물전달체로 사용할 수 있다. 또한 칼슘, 포스페이트, 실리케이트를 방출하는 성질을 통해 줄기세포의 생장을 촉진시켜 조직 이식 또는 재생 촉진용의 조성물로 쓰일 수 있다. 나아가 마이크로 크기의 구조를 통해 세포내로 유입되지 않고 세포밖에서 3차원적 상호작용을 통해 스페로이드형 줄기세포 집합체의 생장을 촉진 시켜 조직 이식 또는 재생 촉진용의 조성물로 쓰일 수 있다.
구체적으로 본 발명의 수산화인회석 미소구체는 BGn이 표면 뿐만 아니라 전체에 걸쳐 광물화작용을 통해 얻어지며 이로인해 다공성 및 넓은 표면적을 갖는 특성을 갖는다. 따라서 상기 미소구체에 단백질을 적재시켜 선형(0차) 및 지속적 방출을 통한 약물전달체로 사용할 수 있다. 또한 칼슘, 포스페이트, 실리케이트를 방출하는 성질을 통해 줄기세포의 생장을 촉진시켜 조직 이식 또는 재생 촉진용의 조성물로 쓰일 수 있다. 나아가 마이크로 크기의 구조를 통해 세포내로 유입되지 않고 세포밖에서 3차원적 상호작용을 통해 스페로이드형 줄기세포 집합체의 생장을 촉진 시켜 조직 이식 또는 재생 촉진용의 조성물로 쓰일 수 있다.
Description
본 발명은 생활성 유리 나노입자를 마그네슘, 칼슘, 및 인산 이온을 포함하는 유사 생체 용액(simulated body fluid)에 침지하는 단계를 포함하는, 수산화인회석 미소구체(HAM, Hydroxy apatite microsphere)의 제조방법에 관한 것이다.
미소구체 (Microsphere, MS)는 환경 공학, 크로마토그래피 분리, 의약품 제조, 식품산업 및 생물 의학과 같은 다양한 분야에서 잠재적 인 응용 분야에 큰 주목을 받고 있다. 약물 전달 및 세포/조직 공학에서의 MS의 사용은 비교적 새롭고 빠르게 진화하고 있다. 실제로 미소구체는 마약, 유전자, 단백질 및 성장 인자를 비롯한 치료용 생체 분자를 전달하고 결함이 있는 영역을 확장하고 치료할 수 있는 조직 세포를 지지하는 고유한 플랫폼을 제공한다. 이러한 목적을 위해, 생체 적합성 미소구체의 상이한 조성물을 통해 생체 고분자, 바이오 세라믹, 생활성 유리 및 이들의 복합체로 개발되었다.
생체 활성 무기물의 조성을 가진 미소구체는 뼈 형성 세포 및 조직에 유리한 생물학적 특성으로 인하여 뼈 조직 재생에 유리하다. 칼슘 인산염 (CaP) 및 실리케이트/인산염 계 유리는 골 재생에 사용되는 관련 생체 활성 성분이다. 이러한 조성을 갖는 미소구체를 제조하는 데 사용되는 방법은 화학 침전, 졸-겔, 열수 열, 마이크로파-보조, 분무 열분해, 마이크로 에멀젼, 생체모사적 방법 및 구형화가 있다. 조성과 함께 표면 및 3차원 (3D) 구조 및 나노/미세 구조는 치료 분자의 전달 용량 및 세포 상호작용을 결정할 수 있는 중요한 매개 변수로 고려된다. 예를 들어, 표면적이 큰 수산화인회석 미소구체(수산화인회석 미소구체)는 다량의 약물 분자 또는 단백질을 적재한 다음 천천히 전달할 수 있다. 또한 고도의 다공성 복합 재료는 조직 세포를 보다 잘 캡슐화하고 생물학적 기능을 향상시켜 궁극적으로 줄기 세포 전달 및 뼈 조직 공학에 효과적인 것으로 밝혀졌다.
한편, 생활성 유리(bioactive glass)는 칼슘 및 실리케이트 이온의 방출을 통한 골 형성 및 혈관 신생과 같은 세포 반응을 자극하는 역할을 수행한다. 생활성 유리 나노입자(BGn)는 이러한 생활성 유리가 나노크기의 기공을 갖는 다공성 구조로 제조되어 비표면적 및 공극률을 증가시켜 생분해성을 높이고 생체적합성을 부여하고(대한민국 등록특허 10-0831348) 골융합과 생분해를 통해 골재생을 유도하여 결과적으로 조골세포의 분화 및 증식을 촉진하여 뼈 기질의 강도를 높일 수 있는 것으로 알려져 있다. 또한 이러한 고 다공성/표면적을 갖는 생활성유리 나노입자로부터 만들어진 지지체 표면에 수산화인회석을 광물화시켜 치과적 치료제 또는 약물전달체로써의 가능성을 확인하고자 하는 다양한 시도들이 있어왔다(Charlotte Vichery, Materials 2016, 9, 288). 그러나 광물화작용을 통해 수산화인회석이 생활성 유리 표면에 얇은 층으로만 형성되어 대부분의 생활성 유리가 구체내부에 잔류하여 효과적인 광물화작용이 이루어지지 않는 문제점이 있어왔다. 또한 생활성유리로부터 형성된 수산화인회석 구체가 나노수준으로 작은 경우 세포내로 유입되어 세포밖에서 세포와의 상호작용이 어려워 구체에서 방출되는 이온들 또는 적재한 약물에 의한 세포 증식촉진 등의 효과를 보기 어려운 문제점이 있었다.
이에 본 발명자는 생체모사적 과정을 통한 광물화작용을 통해 나노입자 전체에 걸쳐 수산화인회석이 생성된 수산화인회석 미소구체(HAM, hydroxyapatite microsphere)를 합성하였다. 특히 생활성 유리 나노입자(BGn)를 HA 미소구체의 전구체로 사용하고 이를 유사 생체 용액(Simulated Body Fluid, SBF)에서 침지시켜 표면에 한정되지 않고 구체 전체에 걸친 광물화작용을 유도하였다. 구체적으로 10nm 내지 1000nm 의 크기를 갖는 생활성 유리 나노입자 각각이 SBF에서 수산화인회석으로 바뀌는 광물화작용이 진행되면서 나노입자들의 응집이 일어나 커지면서 마이크로 크기의 미소구체가 형성되었다. 이에 따라, 미소구체의 표면에만 국한되지 않고 전체에 걸쳐 고르게 수산화인회석 광물화작용이 이루어졌음을 확인하였다. 이러한 광물화작용이 지속되면서 나노입자의 응집, 인회석 광물작용 및 마이크로 크기의 수산화인회석 미소구체(수산화인회석 미소구체)로의 융합 및 성장이 일어나며 미소구체의 형태도 밤모양에서 꽃모양으로 변화되어 감을 확인하였다. 이는 세포내로 미소구체가 유입되지 않고 세포 밖에서 세포와 상호작용을 할 수 있어 미소구체로부터 방출되는 이온, 성장인자 및 약물에 의해 세포의 증식 촉진의 효과로 이어질 수 있었다. 따라서 본 발명자는 수산화인회석 미소구체를 포함하는 조성물을 합성하여 높은 다공성, 큰 표면적을 지녀서 치료 이온 또는 단백질을 세포로 전달 할 수 있으며 더 나아가 3D 스페로이드 젤을 통해 세포와 활발한 상호 작용을 통해 줄기세포 증식, 조직 이식 또는 재생 촉진용 조성물로서의 가능성을 확인하였다.
본 발명의 하나의 목적은 생활성 유리 나노입자를 마그네슘, 칼슘, 및 인산 이온을 포함하는 유사 생체 용액에 침지하는 단계를 포함하는, 수산화인회석 미소구체의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 생활성 유리 나노입자가 마그네슘, 칼슘, 및 인산을 포함하는 유사 생체 용액에 침지되어 형성된 수산화인회석 입자가 응집된 미소구체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 제조방법에 의해 제조된 수산화인회석 미소구체에 단백질이 적재(load)된 수산화인회석 미소구체 복합체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 제조방법에 의해 제조된 수산화인회석 미소구체를 분리된 줄기세포에 처리하는 단계를 포함하는, 시험관 내 줄기세포의 증식 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 제조방법에 의해 제조하여 포스페이트 및 실리케이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 이온을 방출하는 것인, 수산화인회석 미소구체 및 스페로이드형 줄기세포 집합체를 유효성분으로 포함하는, 조직 이식 또는 재생 촉진용 조성물을 제공하는 것이다.
이하에서는, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
한편, 본원에서 개시되는 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술되는 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 할 수 없다.
또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 출원에 기재된 본 발명의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다.
상기 과제를 해결하기 위해 본 발명은 하나의 양태로서, 생활성 유리 나노입자를 마그네슘, 칼슘, 및 인산 이온을 포함하는 유사 생체 용액(simulated body fluid)에 침지하는 단계를 포함하는, 수산화인회석 미소구체(수산화인회석 미소구체, Hydroxy apatite microsphere)의 제조방법을 제공한다. 또한 상기 방법에 의해 제조된 수산화인회석 미소구체를 제공한다.
본 발명에서 "생활성 유리"는 유리-세라믹 생체재료(biomaterial)를 의미하는 것으로 생활성 유리는 생체적합성 때문에 조직재생을 위한 임플란트, 지지체로 널리 이용된다. 생활성 유리는 졸-겔(sol-gel)법을 이용하여 합성할 수 있으며 이는 업계에서 잘 알려져 있다. 생활성 유리 용액은 액상의 생활성 유리와 촉매, 용매 등을 포함하며 본 발명의 한 구체예에서 생활성 유리 용액은 칼슘, 인 또는 이들의 혼합물을 더 포함할 수 있다. 칼슘 성분과 인 성분을 포함함으로써 인체 골조직과 지지체간에 화학적 유사성을 갖도록 할 수 있다. 생활성 유리 용액은 생활성 유리, 촉매, 용매, 칼슘 및 인을 혼합하여 전자교반하여 제조할 수 있다. 본 발명의 한 구체예에서, 생활성 유리는 테트라알킬 오르토실리케이트일 수 있다. 예를 들어, 테트라에틸 오르토실리케이트(TEOS) 또는 테트라메틸 오르토실리케이트일 수 있다. 또한 용매는 물, 촉매는 염산, 칼슘클로라이드 및 트리에틸포스페이트(TEP)를 사용할 수 있다. 생활성 유리는 용해로 유래된 것 및 졸-겔로 유래된 것의 두 가지 종류가 있다. 본 발명에서는, 실리카를 기초로 한 졸-겔로 유래된 생활성 유리를 사용할 수 있다.
본 발명에서 "생활성 유리 나노입자(BGn, bioglass nanoparticle)"는 이러한 생활성 유리를 나노수준의 입자로 만든 것으로, 더 넓은 표면적과 더 많은 기공을 가져 생체 적합성 및 생분해성이 향상되게 된다. 일반적으로 생활성 유리 나노입자는 SiO2 및 CaO를 주성분으로 하고, Na2O, P2O5 또는 이의 조합을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 생활성 유리 나노입자는 SiO2가 70 내지 90 중량부를, CaO는 5 내지 20 중량부를 포함할 수 있다. 또한 보다 구체적으로 상기 생활성 유리 나노입자는 SiO2 70 내지 90 중량뷰와 CaO 5 내지 20 중량부로 이루어질 수 있다.
상기 "생활성 유리 나노입자"는 10 내지 1000nm 의 평균입경을 가질 수 있다. 구체적으로, 10 내지 500nm, 보다 구체적으로 100 내지 500 nm의 평균입경을 가질 수 있다. 여기서, 평균입경이란 입도분포곡선에서 중량백분율의 50 %에 해당하는 입경이다.
이러한 생활성 유리는 a) PEG를 용해시켜 템플레이트 용액을 제조하는 단계; b) 상기 템플레이트 용액에 산화칼슘 전구체를 첨가하여 산화칼슘-템플레이트 혼합용액을 제조하는 단계; c) 상기 산화칼슘-템플레이트 혼합용액에 실리카 전구체 용액을 첨가하면서 초음파 처리하고 교반하여 반응 생성물을 제조하는 단계; 및 d) 상기 반응 생성물을 원심분리한 후 세척하고 건조 및 소성하여 메조다공성 생활성유리 나노입자를 제조하는 단계를 통해 제조될 수 있다.
본 발명에서 "유사 생체 용액(SBF)"는 인체의 혈장 내의 이온상태와 유사하게 만든 인공 혈장 용액을 의미한다. 상기 유사체액은 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 염화마그네슘, 인산나트륨, 황산나트륨, 질산나트륨 및 탄산나트륨 등을 포함하는 용액일 수 있으며, 구체적인 일 실시예에서는 NaCl (142.0mM), KCl (5.0mM), NaHCO3 (4.2mM), CaCl2 (2.5mM), MgCl2 · 6H2O (1.5mM), K2HPO4 · 3H2O (1.0mM) 및 Na2SO4 (0.5 mM)을 증류수에 용해하고, 트리스 -HCl로 pH 7.4로 완충시킨 것을 사용하였다.
본 발명에서 "수산화인회석"은 분자식이 Ca10 (PO4)6(OH)2인 염기성 인산칼슘으로 암석 혹은 골격, 치아에서 모두 발견되는 물질이다. 따라서 생체내 구성성분과 유사하다. 따라서 본 발명의 미소구체 표면에 분포한 수산화인회석은 생분해성과 뛰어난 뼈 형성 능력을 갖게 된다.
본 발명의 다른 하나의 양태로서, 생활성 유리 나노입자가 마그네슘, 칼슘, 및 인산 이온을 포함하는 유사 생체 용액(simulated body fluid)에 침지되어 형성된 수산화인회석 입자가 응집된 미소구체(HAM, Hydroxy apatite microsphere)를 제공한다.
상기 수산화인회석 입자는 본 발명의 하나의 양태로 설명한 전술한 제조방법에 따라 제조될 수 있다.
본 발명에서 "수산화인회석 미소구체"는 2 이상의 BGn이 SBF에 침지되어 BGn의 표면에서 서로 물질교환을 이루면서 BGn의 표면뿐만 아니라 전체에 걸쳐 광물화작용을 통해 수산화인회석이 결정화된 입자들이 과립화되어 마이크로 크기의 미소구체가 생성된다.
이러한 침지과정은 3일 내지 30일 기간에 걸쳐 수행될 수 있으며 바람직하게는 7일 내지 21일에 걸쳐 수행되나 이에 제한되지 않는다. 다만 침지과정이 7일보다 적을 경우 형성되는 수산화인회석 입자의 결정화도가 약해질 수 있으며, 침지과정이 21일을 넘는 경우 형성된 수산화인회석 결정이 다시 녹아나올 수 있다. 따라서 7일 내지 21일의 적절한 침지 과정이 수산화인회석 미소구체 형성에 있어서 중요한 요인이 된다. 이러한 침지 과정을 통해 나노크기의 생활성 유리 입자가 광물화과정을 거쳐 최종적으로 마이크로 크기의 수산화인회석 미소구체를 형성할 수 있다. 또한 이러한 침지 과정은 30℃ 내지 50 ℃에서 수행될 수 있으며 바람직하게는 35℃ 내지 40℃ 에서 수행될 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 또한 침지과정에 사용되는 SBF용액의 pH는 5.0 내지 8.0일 수 있으며 바람직하게는 7.0 내지 7.8이나 이에 제한되지 않는다.
상기 제조 방법으로 생성된 수산화인회석 미소구체의 표면적은 20 내지 90m2/g일 수 있으며 바람직하게는 30 내지 70m2/g이나 이에 제한되지 않는다. 또한 수산화인회석 미소구체의 Ca/P의 비율은 1.0 내지 2.0일 수 있으며 바람직하게는 1.3 내지 1.7이나 이에 제한되지 않는다. 또한 수산화인회석 미소구체의 크기는 0.5 내지 20 ㎛일 수 있으며, 바랍직하게는 1.0 내지 10 ㎛이나 이에 제한되지 않는다.
구체적으로 본 발명의 실시예 1에서는 생활성 유리 나노입자(BGn) 및 수산화인회석 미소구체(수산화인회석 미소구체)을 합성하였다. 도 1a에 도시된 바와 같이, SBF에 침지된 BGn은 응집되기 시작하고, 용해/침전 반응을 통해 인회석으로 광물화되고, 미크론 크기의 구체로 과립화함을 확인하였다.
또한 수산화인회석 미소구체는 3일에서 21일의 기간에 걸쳐 미소구체의 모양이 밤모양에서 꽃모양으로 변화하였다. 상기와 같이 미소구체의 모양이 꽃모양이 변화됨에 따라 수산화인회석의 결정성이 증가되었다.
또한 미소구체의 크기는 3 일째에 ~1.5 ㎛에서 21 일째에 3.2 ㎛로 증가하였음을 확인하였다. 이를 통해 본 발명의 미소구체는 마이크로 크기로 성장하여 기존 나노 구체들에 비해 세포내로 유입되지 않고 세포 밖에서 3차원적 상호작용이 효율적으로 일어날 수 있는 가능성을 지니고 있음을 확인하였다. 즉, 본 발명의 미소구체는 미소구체 표면의 세포들과의 상호작용에 있어서 매개체 역할을 할 수 있다.
본 발명의 수산화 인회석 미소구체는 BGn의 전체에 걸쳐 광물화작용이 일어나 BGn이 서서히 감소하고 수산화인회석으로 결정화되었으며(도 1c, 표 1), Ca/P비율이 1.35에서 1.68로 변화하여(표 1 및 도 3a) 구체 조성이 시간에 따른 인회석과 유사해짐을 알 수 잇었다. 또한 21일째에 미소구체의 비표면적은 63.7 ㎡/g이고, 기공 부피는 0.153 cm3/g이고, 기공 크기는 6.1 nm임을 (표 2, 도 5b) 확인할 수 있었다.
따라서 생활성 유리 나노입자를 생체유사용액에 침지시켜 생활성 유리 나노입자 전체에 걸쳐 균일한 광물화작용을 거쳐 다공성 및 표면적이 크게 증가된 수산화인회석 미소구체를 얻을 수 있었다. 또한 이러한 수산화인회석 미소구체는 칼슘, 포스페이트 및 실리케이트 이온을 방출하여 줄기세포의 조직 이식 또는 재생 촉진을 유도할 수 있다. 또한 본 발명의 수산화인회석 미소구체는 마이크로 크기로 성장하여 기존 나노 구체들에 비해 세포내로 유입되지 않고 세포 밖에서 3차원적 상호작용이 효율적으로 일어날 수 있는 가능성을 지니고 있었다.
본 발명의 다른 양태로서, 상기 제조방법에 의해 제조된 수산화인회석 미소구체에 단백질이 적재(load)된 수산화인회석 미소구체 복합체를 제공한다.
본 발명에서 "시토크롬 C"는 넓은 뜻으로는 헴c를 함유하는 시토크롬을 총칭하며 일반적으로는 고등동식물, 효모, 곰팡이 등의 미토콘드리아에 주로 존재하며 전자전달에 작용하는 양전하를 띄는 단백질을 의미한다.
본 발명에서 "성장인자"는 세포, 조직의 수·중량을 증가시키는 작용이 있는 단백질성의 생리 활성물질을 의미하며 특이적 수용체를 매개하여 표적세포에 작용하게 된다. 이러한 성장인자로는 FGF-2(Fibroblast growth factor-2), FGF-18(Fibroblast growth factor-18), BMP-2(Bone morphogenetic protein-2), BMP-7(Bone morphogenetic protein-7), NGF(Nerve growth factor), BDNF(Brain-derived neurotrophic factor), PDGF(Platelet-derived growth factor), SDF-1(Stromal derived factor-1), VEGF(vascular endothelial growth factor), TGF-β(transforming growth factor-β), EGF(Epidermal growth factor) 및 IGF-1(Insulin growth factor-1)가 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이러한 성장인자는 본 발명의 수산화인회석 미소구체에 우수한 흡착능력을 갖도록 적재될 수 있다. 이들의 성장인자가 적재된 수산화인회석을 개체에게 투여할 경우, 성장인자가 지속적으로 방출되어 개체의 줄기세포와의 상호작용에 기인하여 조직 이식 또는 재생 촉진을 유도할 수 있다.
본 발명에서 "0차 반응(zero-order kinetics)"은 반응이 일어날 때 반응의 속도가 반응물의 농도와 관계없이 진행되는 반응을 일컫는다. 이러한 0차 방출은 시간에 따른 반응물의 농도가 직선적으로 감소되는 선형 방출을 갖게 된다. 상기 선형 방출의 특성을 갖는 의약품은 시간에 따라 일정한 약물을 방출할 수 있어 치료에 있어서 강한 이점으로 작용하게 된다.
본 발명에서 "지속적 방출(sustained release)"은 약물이 장시간에 걸쳐 작용할 수 있도록 서서히 약이 방출되는 것을 말한다. 지속적 방출의 경우 투여 횟수를 줄일 수 있어 약물에 의한 부작용을 경감할 수 있는 등의 장점이 많다. 본 발명에서는 약물의 방출이 지속적으로 방출되어 5 내지 30일에 걸쳐 일어날 수 있으며, 바람직하게는 7 내지 21일에 걸쳐 일어날 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 "줄기세포"는 인간의 성체줄기세포, 인간의 만능줄기세포, 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cells), 동물의 배아줄기세포 또는 동물의 성체줄기세포인 것을 특징으로 한다.
바람직하게 상기 줄기세포는 성체줄기세포일 수 있다. 본 발명의 용어 "성체줄기세포"는 중간엽 줄기세포, 인간 조직 유래 중간엽 기질세포, 지방, 골수 등의 인간 조직 유래 중간엽 줄기세포, 다분화능 줄기세포 또는 양막 상피세포일 수 있다. 성체줄기세포는 일반적으로 배아줄기세포에 비해 무제한적인 소스와 연구자들이 직면할 수 있는 윤리적 문제를 피할 수 있기 때문에 주목받고 있다. 더욱이, 제대혈로부터 분리한 줄기세포는 골수나 지방조직과 달리 기증자가 추가적인 해를 입을 염려가 없기 때문에 다른 성체줄기세포들 보다 더 큰 장점을 가지고 있다.
보다 바람직하게 본 발명의 줄기세포는 제대 유래 중간엽 줄기세포, 제대혈 유래 중간엽 줄기세포, 골수 유래 중간엽 줄기세포, 지방 유래 중간엽 줄기세포, 근육 유래 중간엽 줄기세포, 신경 유래 중간엽 줄기세포, 피부 유래 중간엽 줄기세포, 양막 유래 중간엽 줄기세포 및 태반 유래 중간엽 줄기세포로 구성된 군에서 선택되는 중간엽 줄기세포일 수 있다.
구체적으로 수산화인회석 미소구체에 시토크롬 C 단백질을 적재하여 수산화인회석 미소구체의 나노구조 및 다공성으로 향상된 표면적이 단백질 적재용량을 증가시키는데 중요한 역할을 한다는 것을 확인하였다. 또한 적재된 시토크롬 C는 지속적 방출되고 0차 방출에 따른 선형방출의 됨을 확인하였다(표 2, 도 6a 내지 6c). 따라서 지속적 방출 및 선형방출이 가능한 수산화인회석 미소구체에 단백질이 적재(load)된 수산화인회석 미소구체 복합체를 얻을 수 있었다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 상기 제조방법에 의해 제조하여 포스페이트 및 실리케이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 이온을 방출하는 것인, 수산화인회석 미소구체를 분리된 줄기세포에 처리하는 단계를 포함하는, 시험관 내 줄기세포의 증식 방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에서는 수산화인회석 미소구체는 칼슘, 포스페이트 및 실리케이트을 비롯한 이온을 최대 28일 방출하는 것으로 나타났으며 방출 패턴은 계단식 선형 패턴, 즉 초기에는 급속(최대 3 일) 후 느려지는 패턴을 보였다(도 7).
본 발명의 다른 실시예에서는 2D 세포배양에서 세포생존력이 미소구체 함량에 의존적임을 확인하였다. 특히 최대 40 μg/ml 미만의 세포에 대한 미소구체의 함량처리는 세포의 생존력을 증가시켰고 이는 미소구체로부터의 적절한 투여량에서 방출된 이온의 효과로 인한 것임을 확인하였다(도 8a 및 도 8b). 따라서 수산화인회석 미소구체를 분리된 줄기세포에 처리하여 시험관 내 줄기세포 증식의 가능성을 확인하였다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 상기 제조방법에 의해 제조하여 포스페이트 및 실리케이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 이온을 방출하는 것인, 수산화인회석 미소구체 및 스페로이드형 줄기세포 집합체를 유효성분으로 포함하는, 조직 이식 또는 재생 촉진용 조성물을 제공한다.
구체적으로 미소구체의 3D 구조에서 본 발명의 마이크로 크기의 미소구체가 세포 내재화없이 스페로이드에서 세포-세포 상호작용을 조절할 수 있음을 확인하였다(도 9a 및 도 9b). 따라서 수산화인회석 미소구체 및 스페로이드형 줄기세포 집합체를 유효성분으로 포함하는, 조직 이식 또는 재생 촉진용 조성물의 가능성을 확인하였다.
본 발명에서 "하이드로겔"은 정제수를 분산매체로 하는 삼차원 친수성 고분자 망상구조를 가진 물질로서, 다량의 수분을 함유하면서도 천연 조직과 같은 유연성을 나타내므로 상처 드레싱, 콘텍트 렌즈, 약제, 화장품, 보형물, 폐수처리제 등을 포함하는 여러 의약, 미용, 환경 산업 분야에서 연구 개발되고 있다.
구체적으로 골형성 조건하에서 콜라겐 하이드로겔을 성장시켰고, 골형성 세포에 대한 MSC의 분화를 ALP(알칼린 포스파타제) 활성으로 평가하여 일반 콜라겐 겔보다 수산화인회석 미소구체/콜라겐 겔에서 배양한 세포의 ALP수준이 유의미하게 높음을 확인하였다(도 9e). 이를 통해 겔 매트릭스에 들어있는 MSC가 자극을 받아 미소구체에 의해 골형성 계통으로 분화됨을 확인하였다. 따라서 수산화인회석 미소구체를 포함하는 콜라겐 하이드로겔 및 줄기세포 집합체를 유효성분으로 포함하는, 조직 이식 또는 재생 촉진용 조성물의 가능성을 확인하였다.
본 발명은 생활성 유리 나노입자를 마그네슘, 칼슘, 및 인산 이온을 포함하는 유사 생체 용액(simulated body fluid)에 침지하는 단계를 포함하는, 수산화인회석 미소구체(HAM, Hydroxy apatite microsphere)의 제조방법에 관한 것이다.
구체적으로 본 발명의 수산화인회석 미소구체는 BGn이 표면 뿐만 아니라 전체에 걸쳐 광물화작용을 통해 얻어지며 이로인해 다공성 및 넓은 표면적을 갖으며, 수산화 인회석이 내외부에 균일하게 응집되어 있는 특성을 갖는다. 따라서 상기 미소구체에 단백질을 적재시켜 선형(0차) 및 지속적 방출을 통한 약물전달체로 사용할 수 있다. 또한 칼슘, 포스페이트, 실리케이트를 방출하는 성질을 통해 줄기세포의 생장을 촉진시켜 조직 이식 또는 재생 촉진용의 조성물로 쓰일 수 있다. 나아가 마이크로 크기의 구조를 통해 세포내로 유입되지 않고 세포밖에서 3차원적 상호작용을 통해 스페로이드형 줄기세포 집합체의 생장을 촉진 시켜 조직 이식 또는 재생 촉진용의 조성물로 쓰일 수 있다.
도 1은 수산화인회석 미소구체형성의 모식도 및 형태를 나타낸다. 도 1a는 SBF에서 생체모사적 과정을 통해 BGn으로부터 수산화인회석 미소구체의 형성과정의 모식도로 (i) BGn 나노입자의 응집, (ii) 밤모양 형태를 띈 인회석 미결정의 광물화작용 및 마이크로 크기 이하 크기의 구체 형성, 및 (iii) 꽃모양의 인회석 결정체의 성숙 및 구체의 혼합 및 마이크로 크기로의 성장을 보여준다. 도 1b는 광물화작용 및 다른 시기의 BGn 응집제로부터 수산화인회석 미소구체 성장을 보여주는 FE-SEM 이미지를 나타낸다. 또한 빨간 상자의 확대된 이미지는 광물 미결정의 나노-형태를 보여준다. 도 1c는 다른 광물화작용 시기마다 측정된 구체 크기를 나타낸다.
도 2는 성장하는 수산화인회석 미소구체의 TEM은 초 미세구조를 보여주며 다른 기간동안 SBF 에 침지하여 BGn 응집체로부터 수산화인회석 미소구체의 성장을 보여주는 HR-TEM 이미지를 나타낸다.
도 3은 수산화인회석 미소구체의 원자 조성을 나타낸다. 도 3a는 시간에 대한 수산화인회석 미소구체에서 Ca/P 비율의 변화를 SEM-EDX로 분석한 것이다; Ca/P 비율은 3일째에 1.35에서 21 일째에 1.68로 증가한 것을 나타낸다. 도 3b는 FIB-SEM 이미지 및 수산화인회석 미소구체14의 중심부를 면밀히 살핀 EDX 시점 (횡단면에서 화살표가 가르키는 부분)으로, 실리케이트가 대략 1~1.5 % 존재함을 나타낸다.
도 4는 발달한 미소구체의 화학적 조성의 변화를 나타낸다. 도 4a는 SBF에서 변형을 거치는 동안 시료의 XRD 패턴을 나타낸다; 형편없이 결정화된 인회석 패턴은 시간이 지남에 따라 잘-형성된 뾰족한 인회석 피크를 나타냈다. 도 4b는 무정형-결정체 변형 지표, 및 도 4c는 결정 크기 및 결정성을 XRD 데이터를 통해 계산한 결과를 나타낸다. 도 4d는 FT-IR 스펙트럼은 실레케이트 및 이의 포스페이트와 관련된 밴드의 점진적인 변화를 보여준다.
도 5는 수산화인회석 미소구체의 다공성 및 표면 전하를 나타낸다. 도 5a 내지 5c는 수산화인회석 미소구체의 다공성 특성을 나타낸다; 14 일째 수산화인회석 미소구체의 N2 흡수/탈기 등온선은 H3 히스테리시스 루프의 유형 등온선으로 확인된 전형적인 다공성 물질 (도 5a), 기공 크기 분포 곡선(도 5b), 및 BET로 측정한 광물화작용 동안 비표면적의 변화 (도 5c), 공정동안 전위의 변화(도 5d)를 보여준다.
도 6은 수산화인회석 미소구체의 단백질 적재 및 방출 패턴을 보여준다. 도 6a는 대표적으로 14 일째의 수산화인회석 미소구체에서 모델 단백질인 시토크롬 C의 적재 곡선으로 랭뮤어 등온선을 잘 따르는 것을 나타낸다. 도 6b는 다른 수산화인회석 미소구체 시료에 의존하는 시트크롬 C의 적재양을 보여준다. 도 6c는 수산화인회석 미소구체로부터 단백질 방출을 나타내며 시트크롬 C 방출은 두단계 방출 프로파일을 보여준다, 즉, 1일에 초기 다량 방출 (~40 % 방출됨; 첫번쩨), 고도로 지속되는 0차 속도 패턴의 선형방출(R2 = 0.988)이 28일(두번째)까지 관찰된다.
도 7은 수산화인회석 미소구체의 이온 용출을 나타낸다. 트리스-버퍼 용액 (pH 7.4)에 침지된 미소구를 나타내며, ICP-AES에 의해 칼슘, 포스페이트, 및 실리케이트 이온의 방출을 28일까지 측정한 결과를 나태난다.
도 8은 2D 배양 및 3D 세포-스페로이드 형성에서 수산화인회석 미소구체의 세포 상호작용을 나타낸다. 도 8a는 2D 세포 배양의 개략적 도식을 나타낸. 도 8b는 24시간 및 48시간에서 다른 함량의 수산화인회석 미소구체에서 배양된 세포의 생존력(최대 320 μg/ml)을 나타낸다. 미소구체에서 배양된 쥐 치수에서 얻은 MSC 세포에 대해 CCK 세포 생존력을 측정한 결과를 나타낸다. 모든 함량의 수산화인회석 미소구체 대비 대조군(수산화인회석 미소구체 없음)에 대해 24시간 동안 차이가 없었지만, 48시간에서 40㎍/ml ('생존 범위')까지 세포 생존력은 농도 의존적이었고 그 이후 더 높은 농도에서 감소했다. 통계적 유의성은 1 및 10 μg/ml 수산화인회석 미소구체 대비 수산화인회석 미소구체가 없는 대조군에 대해 나타냈다(* p <0.05). 도 8c는 3D 세포 스페로이드 형성에서 수산화인회석 미소구체의 삽입을 보여주는 개략도를 나타내며 도 8d는 3일 동안 세포 스페로이드 형성 과정에서 처리된 미소구체(2 μg/ml의 수산화인회석 미소구체) 및 다른 배율의 SEM으로 찍은 세포 스페로이드 이미지이다.
도 9는 3D 하이드로겔 메트릭스에서 수산화인회석 미소구체의 세포 상호작용을 나타낸다. 도 9a는 수산화인회석 미소구체가 치수로부터 얻은 인간 MSC의 증식 및 골형성 분화 작용에 미치는 영향을 조사하기 위해 고려하는 수산화인회석 미소구체(33 % 또는 50 %)를 포함하는 세포-부하된 하이드로겔을 보여주는 개략도를 나타낸다. 도 9b는 CCK 분석에 의한 세포 생존력, 및 도 9c는 성장배지 조건에서 하이드로겔(콜라겐 및 33 % 및 50 % 수산화인회석 미소구체 혼입된 콜라겐)내에서 배양한 세포의 생균(녹색) 및 사멸(적색) 염색의 형광 현미경 이미를 나타낸다. 도 9d는 팔로이딘(녹색) 및 DAPI(파란색) 염색법으로 염색된 세포의 공초점 현미경 이미지를 나타내며 도 9e는 골형성 배지 조건하에서 하이드로겔(콜라겐 및 50 % 수산화인회석 미소구체가 혼입된 콜라겐) 내에서 배양 dsDNA 함량으로 정규화된 ALP 활성을 나타낸다. 그룹간에 통계적 유의성이 나타났다(*p < 0.05).
도 2는 성장하는 수산화인회석 미소구체의 TEM은 초 미세구조를 보여주며 다른 기간동안 SBF 에 침지하여 BGn 응집체로부터 수산화인회석 미소구체의 성장을 보여주는 HR-TEM 이미지를 나타낸다.
도 3은 수산화인회석 미소구체의 원자 조성을 나타낸다. 도 3a는 시간에 대한 수산화인회석 미소구체에서 Ca/P 비율의 변화를 SEM-EDX로 분석한 것이다; Ca/P 비율은 3일째에 1.35에서 21 일째에 1.68로 증가한 것을 나타낸다. 도 3b는 FIB-SEM 이미지 및 수산화인회석 미소구체14의 중심부를 면밀히 살핀 EDX 시점 (횡단면에서 화살표가 가르키는 부분)으로, 실리케이트가 대략 1~1.5 % 존재함을 나타낸다.
도 4는 발달한 미소구체의 화학적 조성의 변화를 나타낸다. 도 4a는 SBF에서 변형을 거치는 동안 시료의 XRD 패턴을 나타낸다; 형편없이 결정화된 인회석 패턴은 시간이 지남에 따라 잘-형성된 뾰족한 인회석 피크를 나타냈다. 도 4b는 무정형-결정체 변형 지표, 및 도 4c는 결정 크기 및 결정성을 XRD 데이터를 통해 계산한 결과를 나타낸다. 도 4d는 FT-IR 스펙트럼은 실레케이트 및 이의 포스페이트와 관련된 밴드의 점진적인 변화를 보여준다.
도 5는 수산화인회석 미소구체의 다공성 및 표면 전하를 나타낸다. 도 5a 내지 5c는 수산화인회석 미소구체의 다공성 특성을 나타낸다; 14 일째 수산화인회석 미소구체의 N2 흡수/탈기 등온선은 H3 히스테리시스 루프의 유형 등온선으로 확인된 전형적인 다공성 물질 (도 5a), 기공 크기 분포 곡선(도 5b), 및 BET로 측정한 광물화작용 동안 비표면적의 변화 (도 5c), 공정동안 전위의 변화(도 5d)를 보여준다.
도 6은 수산화인회석 미소구체의 단백질 적재 및 방출 패턴을 보여준다. 도 6a는 대표적으로 14 일째의 수산화인회석 미소구체에서 모델 단백질인 시토크롬 C의 적재 곡선으로 랭뮤어 등온선을 잘 따르는 것을 나타낸다. 도 6b는 다른 수산화인회석 미소구체 시료에 의존하는 시트크롬 C의 적재양을 보여준다. 도 6c는 수산화인회석 미소구체로부터 단백질 방출을 나타내며 시트크롬 C 방출은 두단계 방출 프로파일을 보여준다, 즉, 1일에 초기 다량 방출 (~40 % 방출됨; 첫번쩨), 고도로 지속되는 0차 속도 패턴의 선형방출(R2 = 0.988)이 28일(두번째)까지 관찰된다.
도 7은 수산화인회석 미소구체의 이온 용출을 나타낸다. 트리스-버퍼 용액 (pH 7.4)에 침지된 미소구를 나타내며, ICP-AES에 의해 칼슘, 포스페이트, 및 실리케이트 이온의 방출을 28일까지 측정한 결과를 나태난다.
도 8은 2D 배양 및 3D 세포-스페로이드 형성에서 수산화인회석 미소구체의 세포 상호작용을 나타낸다. 도 8a는 2D 세포 배양의 개략적 도식을 나타낸. 도 8b는 24시간 및 48시간에서 다른 함량의 수산화인회석 미소구체에서 배양된 세포의 생존력(최대 320 μg/ml)을 나타낸다. 미소구체에서 배양된 쥐 치수에서 얻은 MSC 세포에 대해 CCK 세포 생존력을 측정한 결과를 나타낸다. 모든 함량의 수산화인회석 미소구체 대비 대조군(수산화인회석 미소구체 없음)에 대해 24시간 동안 차이가 없었지만, 48시간에서 40㎍/ml ('생존 범위')까지 세포 생존력은 농도 의존적이었고 그 이후 더 높은 농도에서 감소했다. 통계적 유의성은 1 및 10 μg/ml 수산화인회석 미소구체 대비 수산화인회석 미소구체가 없는 대조군에 대해 나타냈다(* p <0.05). 도 8c는 3D 세포 스페로이드 형성에서 수산화인회석 미소구체의 삽입을 보여주는 개략도를 나타내며 도 8d는 3일 동안 세포 스페로이드 형성 과정에서 처리된 미소구체(2 μg/ml의 수산화인회석 미소구체) 및 다른 배율의 SEM으로 찍은 세포 스페로이드 이미지이다.
도 9는 3D 하이드로겔 메트릭스에서 수산화인회석 미소구체의 세포 상호작용을 나타낸다. 도 9a는 수산화인회석 미소구체가 치수로부터 얻은 인간 MSC의 증식 및 골형성 분화 작용에 미치는 영향을 조사하기 위해 고려하는 수산화인회석 미소구체(33 % 또는 50 %)를 포함하는 세포-부하된 하이드로겔을 보여주는 개략도를 나타낸다. 도 9b는 CCK 분석에 의한 세포 생존력, 및 도 9c는 성장배지 조건에서 하이드로겔(콜라겐 및 33 % 및 50 % 수산화인회석 미소구체 혼입된 콜라겐)내에서 배양한 세포의 생균(녹색) 및 사멸(적색) 염색의 형광 현미경 이미를 나타낸다. 도 9d는 팔로이딘(녹색) 및 DAPI(파란색) 염색법으로 염색된 세포의 공초점 현미경 이미지를 나타내며 도 9e는 골형성 배지 조건하에서 하이드로겔(콜라겐 및 50 % 수산화인회석 미소구체가 혼입된 콜라겐) 내에서 배양 dsDNA 함량으로 정규화된 ALP 활성을 나타낸다. 그룹간에 통계적 유의성이 나타났다(*p < 0.05).
이하, 하기 실시예에 의하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들로 한정되는 것은 아니다.
실시예
1.
BGn
제조 및 특성 확인
1-1. 물질의 준비
분석적인 등급 전구체는 Sigma-Aldrich에서 구입하여 더 이상 정제하지 않고 그대로 사용했다. 전구체는 테트라에틸 오르토실리케이트(TEOS, C8H204Si, 98 %), 칼슘 나이트레이트 테트라하이드레이트[Ca(NO3)2 · 4H2O, 99 %], 폴리(에틸렌글리콜), [PEG, (C2H4)·nH2O, Mn = 10000] 수산화나트륨 (NH4OH, 수 중 28.0 % NH3, 금속 기준 99.99 % 이상), 메탄올 무수(CH3OH, 99.8 %), SBF 약품, 트리스-하이드록시 메틸아미노메탄, 1N 염산(1N HCl), 인산염 완충 식염수(PBS) 소 심장에서 얻은 시토크롬 c를 포함한다. 수성 매질을 포함하는 실험에서 고도로 정제된 탈이온수 (18.2 MΩ.cm, Millipore Direct-Q 시스템)를 사용했다.
1-2.
BGn의
sol-gel 합성
다공성 생활성 유리의 잘 형성된 나노 미소구체를 PEG를 주형으로 하는 초음파/졸-겔 방법으로 준비하였다. 85 % SiO2 및 15 % CaO를 함유하는 몰 유리 조성물은 나노 입자 제조를 위한 기초가 된다. 먼저 PEG 0.5 mmol을 알칼리성 메탄올 용액 (pH 12.5) 120 ml에 가용화시킨 다음 Ca (NO3)2·4H2O 0.76 밀리몰에 용해시켰다. 두 번째로, 4.3 mmol TEOS의 메탄올 용액을 격렬히 교반하고 초음파(20 분 동안)를 가하면서 전용액(former solution)에 적가했다. 24시간 후에 교반을 중단하고, 얻어진 침전물을 용액으로부터 분리하고, 물로 세척한 다음, 원심 분리/재분산 공정(매분 5000rpm으로 5분씩)에 의해 에탄올로 세척하였다. 수집된 침전물을 70 ℃에서 밤새 건조시킨 다음, 건조된 분말을 공기 흐름하에 600 ℃에서 5시간 동안 열처리하였다. 최종적으로, 분말은 추가 사용을 위해 진공 상태에서 보관하였다.
1-3.
BGn의
특성
1-3-1.
BGn의
형태 분석
SBF에서 형성된 수산화인회석 미소구체의 전구체로 사용된 BGn은 도 1에 도시된 것처럼 100nm 미만의 크기와 실리케이트 85.4 % 및 칼슘 14.6 %의 조성을 갖는다. 도 1a에 도시된 바와 같이, SBF에 침지된 BGn은 응집되기 시작하고, 용해/침전 반응을 통해 인회석으로 광물화되고, 미크론 크기의 구체로 성장하였다.
1-3-2.
BGn의
다공성, 표면적 분석
비표면적, 기공 부피, 및 기공 크기를 N2 흡수-탈기 측정으로부터 측정하였다. 등온선은 자동 표면적 및 기공크기 분석기(Quadrasorb SI, Quantachrom instruments Ltd., USA)에서 -196.15 ℃에서 얻었다. 분석하기 전에 진공 하에서 12시간 이상 150℃에서 진공하에 탈기시켰다. (FloVac degasser, Quantachrom instruments Ltd., USA). 비표면적을 Brunauer-Emmett-Teller (BET) 방법에 따라 계산하였고 기공 크기 분포를 NCLFT (non-local density functional theory) 방법을 사용하여 분석하였다.
실시예
2.
생체모사적
광물화작용에
따른
수산화인회석
미소구체의 제조 및 특성 확인
2-1.
수산화인회석
미소구체의 성장
시험에 필요한 물질의 준비는 실시예 1-1과 같이 준비하였다. BGn의 응집체로부터의 수산화인회석 미소구체의 생체모사적 성장을 SBF에서 수행했다. SBF를 NaCl(142.0 mM), NaHCO3(4.2 mM), KCl(5.0 mM), K2HPO4 · 3H2O(1.0 mM), MgCl2 · 6H2O(1.5 mM), CaCl2(2.5 mM) 및 Na2SO4로 준비한 후, 37 ℃에서 트리스-HCl에 의해 pH 7.4로 완충된 탈이온수에 넣었다. 수산화인회석 미소구체 생체모사적 성장을 위해 BGn을 0.1 % wt/vol의 SBF(예: 10ml SBF 중 10mg BGn)에 분산시켰다. 그 다음 BGn/SBF 용액을 플라스틱 상자에 부어 BGn을 침전시키고 상자 바닥에 분산시켰다. 상자를 37 ℃에서 배양한 후 배양기간 동안 SBF를 정기적으로 새로 교체하였다. 최종적으로, 각각의 소정 시점에서, 용액을 상자로부터 수집하고 팔콘 튜브(falcon tube)로 옮긴 다음, 광물화된 물질을 원심분리하였다. 분리된 물질을 탈이온수 및 에탄올로 부드럽게 헹구고 마지막으로 70 ℃에서 밤새 건조하였다.
2-2.
수산화인회석
미소구체의 특성
2-2-1.
수산화인회석
미소구체의 형태 분석
SBF에서 HA 미소구체로의 변환 및 광물화작용시 BGn의 형태학적 및 조성적 변화를 에너지-분산 X선 분광기(Bruker, Quantax instruments)가 장착된 분야 방사 스캐닝 전자 현미경 (FE-SEM, Tescan, MIRA II LMH, 체코)에 의해 시간에 따라 측정하였다. 관찰하기 전에 시료를 자동 마그네트론 스퍼터 코터 (magnetron sputter coater, Cressington 108 Auto Spater Coater, 영국)를 사용하여 120 초 동안 백금으로 코팅하였다. 고분해능 투과 전자 현미경 (HR-TEM, JEM-3010, JEOL, Japan)을 이용하여 시료의 나노 형태를 관찰하고 결정 회절 패턴을 SAED (selective area electron diffraction)로 분석하였다.
도 1b와 같이 FE-SEM을 공정 중 표면 형태의 변화를 조사하기 위해 사용하였다. 3 일째에 ~ 1μm 크기의 구체가 형성됨을 관찰하였고, 7 일째에 명확히 보였다. 구체의 면밀한 검사로 표면에 밤모양 미결정이 나타났으며 밤모양 형태를 보였다. 주위 나노입자 응집체(BGn)는 3일에서 7일까지 실질적으로 감소되었다. 10일에 구형 크기는 BGn 응집체의 거의 완전한 소실로 ~2 ㎛로 증가하였고 미소구체의 표면 형태는 밤모양에서 꽃모양 형태로 변했다 최대 14 일의 시간이 자나면서, 거의 모든 미결정은 꽃모양 형태가 되었다. 또한 미소구체의 모양이 꽃모양으로 변화됨에 따라 수산화인회석의 결정성이 증가됨을 확인하였다. 미소구체의 크기는 SEM 이미지로부터 측정한 바와 같이, 3 일째에 ~ 1.5 ㎛에서 21 일째에 3.2 ㎛로 증가하였다(도 1c, 표 1).
[표 1]
BGn 응집체로부터 결정 성장 동안의 나노-구조 변화를 TEM에 의해 더 분석하였다(도 2). TEM 이미지는 FE-SEM 표면 형태를 반영하여 BGn 응집체로부터 인회석의 결정화 및 성장 과정을 명확하게 보여 주었다. 3 일째, 미결정 구체가 다수의 BGn 응집체로 둘러싸여 형성되었고, 7 일째에 BGn의 수가 감소하면서 크기가 커졌다. 14일 후, 구체 크기가 더욱 증가하고, BGn 응집체가 거의 존재하지 않았다. 또한 미결정 구체를 선택된 영역 전자 회절 (SAED) 패턴에 의해 분석하였다. 처음에 (3일) 확산된 고리형 패턴(무정형 우세)이 관찰되었고, 시간에 따라 점의 배열이 발달되었고 이는 HA 결정의 결정학상의 평면 (002), (211), (222), (213), 및 (004)에 의해 결정되었다. 구체적으로 10 내지 1000nm 의 크기를 갖는 생활성 유리 나노입자 각각이 SBF에서 수산화인회석으로 바뀌는 광물화작용이 진행되면서 나노입자들의 응집이 일어나 커지면서 마이크로 크기의 미소구체가 형성되었다. 이에 따라, 미소구체의 표면에만 국한되지 않고 전체에 걸쳐 고르게 수산화인회석 광물화작용이 이루어졌음을 확인하였다.
2-2-2.
수산화인회석
미소구체의 화학적 조성 및 화학결합 분석
미소구체를 횡단된 이온빔-필드 방출 주사 전자 현미경 (FIB-FESEM, LYRA3 GMH, Tescan, Czech Republic)을 사용하여 교차 단면으로 만들었다. 30 kV의 에너지와 5 nA의 빔 전류를 갖는 갈륨 이온 빔은 선택된 위치에서 표적 미소구체를 분쇄했다. 분쇄 중에 형성된 2 차 전자는 시료의 동시 이미징을 가능하게 했다. 시료를 45°로 기울이고 빔 전류를 5 nA로 조정하면 이온 빔 스캐닝 중 표본 손상을 줄일 수 있다. FIB-FESEM에 결합된 EDX 분석기 (Bruker, Quantax 기기)를 사용하여 코어에서 미소구체의 원자 조성을 검출하였다.
화학결합 구조는 약화된 총 반사율-푸리에 변환 적외선 분광법 (ATR-FTIR)에 의해 확인하였다. Gladi ATR diamond crystal accessory (PIKE Technologies, USA)를 사용하여 2000-400 cm-1의 범위에서 4 cm-1 (FT-IR, Varian 640-IR, 호주)의 분해능으로 스펙트럼을 수집했다.
광물화작용 과정 중 미결정 구체의 조성을 SEM-EDX 분석으로 더 조사하였다. 광물화작용 시간이 3일에서 21일로 증가함에 따라 Ca/P 비율은 1.35에서 1.68로 변화하였고(표 1 및 도 3a), 구체 조성이 시간에 따른 인회석의 화학양론(stoichiometry)에 훨씬 가깝게 변화했다는 것을 시사하였다. 미소구체의 내부 구조(도 3b에 제시된 14 일째에 수산화인회석 미소구체의 단면 반구)를 EDX 분석기가 장착된 FIB-SEM을 사용하여 측정하였고, 여기에서 이온빔-절단 도구와 X선 검출기는 형태를 시각화하고 구의 내부 영역의 조성을 검출하기 위해 동기화하였다. 구의 중심(빨간색 화살표로 표시)은 Ca 및 P 원소 (Ca/P = 1.57 원자 비)의 존재를 나타냈다.
2-2-3.
수산화인회석
미소구체의 위상 및
결정화정도
분석
시료의 위상을 X 선 회절 (XRD)에 의해 분석하였다. X 선을 40 mA와 40 kV(Rigaku, Ultima IV, Japan)에서 Cu Kα 방사선 (λ = 1.5418Å)을 사용하여 생성하였다. 데이터를 회절 각 (2θ) 4 °에서 70 °까지 0.02°의 스텝 크기와 2°/min의 스캐닝 속도로 얻었다.
XRD 패턴에 기초하여, HA 위상(I211)의 주요 회절 피크(211)와 BGn(IA)의 무정형 할로의 강도비를 무정형에서 결정질로의 변형의 지수(T)로 사용했다. 시료안의 결정질 위상의 분율에 상응하는, 결정성의 정도 (%)는 하기의 방정식에 따라 평가되며 여기서 I300 은 반사(300)의 세기이며, I112/300 은 (112) 및 (300)사이 중공의 세기 이다. nm의 결정질 크기 (L)는 또한 하기의 방정식을 사용하여 XPD 패턴에서 관찰된 피크 팽창으로부터 평가되며, 여기서 K는 결정질의 모양과 관련되어 있으며 거의 0.94와 동일하고, λ는 X-선의 파장 (CuKα 방사선에서 0.15406 nm) 이며, β(1/2) 는 선택된 회절 피크의 최대 반치폭(FWHM)이며, θ( hkl ) 은 hkl 계획에서 브레그 회절각이다. 반사는 결정질 크기 계산에서 선택되며 HA 결정 구조의 c-축을 따르는 결정 성장을 나타낸다.
무정형에서 결정질로의 변형의 지수, T = I211/IA
결정화도 % = 1 - I112/300/I300
결정질 크기 L( hkl )= Kλ/β(1/2) Cosθ( hkl )
XRD 결과에 근거하여, 변형 지수-결정질과 비결정질 비율을 광물화작용 동안 계산하였다(도 4b). 이 지수는 3 일째에 1.2에서 21 일째에 4.0으로 증가했다. 또한, HA 결정 크기 및 결정도를 평가하였다(도 4c, 표 1). 결정화되는 광물화작용 3일 후 ~10 %였고, 21일 후에는 24 %로 증가했다. 유사하게, HA 결정 크기는 3일 후에 ~5 nm로 증가했으며, 21일 후에 ~17 nm로 증가했다.
또한 FT-IR 분석은 공정 중 화학 결합 구조의 변화를 보여주었다(도 4d). BGn과 관련된 실리케이트 밴드(450cm-1 및 796cm-1)가 광물화된 인회석의 인산염 밴드(560cm-1 및 603cm- 1)로 명확하게 전환되었다. ~ 1057 cm-1의 실리케이트 밴드는 7 일째에 1029 cm-1로, 그리고 14 일째에 1015 cm-1로 최종 이동(PO43-로 지정됨)으로 이동하였다. 광물화된 인회석은 탄산염 그룹 (CO3 2-)에 의해 ~870 cm-1, 1415 cm-1 및 1455 cm-1에서 명백한 밴드로 탄산염화되었다; 이 탄산염화된 HA는 경조직의 천연 인회석을 모방하는 것으로 알려져 있어 생분해성과 뛰어난 뼈 형성 능력을 나타냈다.
2-2-4.
수산화인회석
미소구체의 다공성 및 표면적 분석
수산화인회석 미소구체의 다공성 및 표면적은 실시예 1-3-2와 같은 방식으로 측정하였다. N2 흡착/탈착 측정을 수행하여 미소구체 비표면적과 다공성을 평가하였다. 대표적인 시료(14 일째 수산화인회석 미소구체)의 등온선은 H3 히스테리시스 루프의 유형 IV 등온선으로 확인된 전형적인 다공성 물질(도 5a)을 보여 주었다. 높은 P/P0에서 어떠한 제한된 흡착을 나타내지 않는 H3 히스테리시스 루프는 슬릿 형태의 기공에 기인한다. BET 방정식과 NLDFT 모델을 사용하여 등온선을 분석한 결과, 미소구체의 비표면적은 63.7 ㎡/g이고, 기공 부피는 0.153 cm3/g이고, 기공 크기는 6.1 nm이다 (기공 크기 분포는 도 5b에 도시되어 있음). 광물화작용에 의한 미소구체의 비표면적 변화는 도 5c에 기록되어있다. 초기 시료(BGn)의 비표면적은 54 ㎡/g로 3일 광산화작용 동안 약간 감소(38.2 ㎡/g)되었지만, 광물 작용이 길어짐에 따라 다시 표면적이 증가하여 21 일째에 67.9 m2/g 에 도달하였다(표 2).
[표 2]
표면적의 초기 감소는 BGn 표면상의 인회석 침착이 BGn의 다공성구조를 유지할 수 있었음에 기인하지만, 새로 형성된 광물 미결정의 나노구조는 초기 BGn보다 높은 수준으로 표면적을 증가시킬 수 있었다. 인회석 미소구체의 높은 표면적 및 다공성 특성은 특히 치료용 분자의 적재 및 전달에서 잠재적인 응용 가능성을 보여준다.
2-2-5.
수산화인회석
미소구체의
표면전하
분석
표면 전하를 레이저 도플러 전기영동(LDE) 장치(Zetasizer Nano ZS, Malvern Instruments, UK)를 사용하여 제타 (ζ) 표면 전위 측정으로 조사하였다. 제타 전위를 20V/cm의 적용되는 자기 강도로 pH 7.4에서 물 (25 ℃)에서 측정되었다. 각 측정 값이 평균 40 개의 서브 런(subrun)이 되도록 5 회 측정하였다.
분자적재를 시험하기 전에, 미소구체의 제타 (ζ) 표면 전위를 측정했다. 표면 전위를 시간에 대한 광물화작용의 함수로 기록하였다(표 2 및 도 5d). 제타 (ζ) 표면 전위는 처음에는 -29 mV (BGn)이었고, 광물화작용에 의해 3 일째에 -11.9 mV로 감소하였고, 21 일 후에 -19.4 mV로 약간 증가하였다. 초기 감소는 BGn의 음전하를 담당하는 표면 수산기(-OH)의 감소로 인한 것일 수 있다. 종합적으로 광물화된 인회석 미소구체는 음으로 하전되어 평균 6.1 nm의 공극이 많은 다공성 및 높은 표면적을 가지며, 이는 미소구체가 치료 분자의 적재에 특히 효과적일 수 있음을 시사한다.
실시예
3.
수산화인회석
미소구체의 단백질 흡수 및 방출 시험
3-1. 실험 과정
시토크롬 C를 HA 미소구체의 단백질 흡착 동역학을 조사하기 위한 모델 단백질로 사용하였다. 이를 위해, 수산화인회석 미소구체14의 5mg/ml의 시료를 시토크롬 C에 침지하였다. 다양한 농도의 시토크롬 C 용액에 넣고 37 ℃에서 2시간 동안 배양했다. 흡착된 시토크롬 C의 양을 시토크롬 C의 농도가 낮아짐을 통해 확인하였다. UV-VIS 분광광도기 및 시토크롬의 표준 곡선을 사용하여 흡착 시험 후 C 용액을 측정하였다(λmax = 409nm). 또한, 시트크롬 c의 흡착을 다른 광물화작용 시간에 수집 한 농도에 대해서도 검사 하였다. 이 시험을 위해, 5mg/ml의 시료를 2mg/ml의 시트크롬 용액에 침지하여 37 ℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 시트크롬 c의 흡착량은 상기한 바와 같이 계산하였다. 그 다음, 시토크롬 C의 흡착량은 하기의 방정식에 따라 계산되고 도시되었으며, 여기에서 qe는 시트크롬의 양(mg)이고, C0 및 Ce는 시트크롬의 초기 및 평형 농도로 각각 mg/ml이며, V는 용액의 부피(ml), W는 사용된 HA 미소구체의 중량 (mg)이다.
q e 값은 C e 값에 대해 플롯팅하고 변형된 랭뮤어 등온선 모델(Langmuir isotherm model)을 하기의 방정식에 따라 곡선 피팅(curve fitting)에 적용하였으며, 여기서 qm은 흡착된 최대량이고 K는 측정할 수 있는 운동 상수(kinetic constant)이다.
미소구체로부터의 시토크롬 C의 방출을 37 ℃에서 2시간 동안 2 mg/ml 용액의 시트크롬을 적재한 5mg의 미소구체(14일간 광물화)를 사용하여 시험관 내에서 연구하였다. 시료를 1 ml의 PBS에 여러시간 동안 침지시켰고 방출 매질을 각 시점에서 완전히 꺼내어 1 ml의 신선한 PBS로 교체하였다. 수집된 매질은 UV-VIS 흡수 분광법에 의해 측정한 시토크롬 C양에 대해 분석하였다. UV-VIS 흡수 분광법에 의해 측정하였다. 시험을 3회로 실시하였다.
q e = (C 0 - C e ) x (V/W)
q e = q m KC e /(1+KC e )
3-2. 실험 결과
단백질 적재연구를 위해, 시트크롬 C를 매우 양전하(PI = 10.2)를 띈 모델 분자로 사용하였다. 시트코름 C를 종종 분자량과 PI 값의 유사성으로 인하여 성장인자, 즉 FGF2의 모델단백질로 사용하였다. 미소구체에 시토크롬 C의 적재양(대표적인 시료로 14 일째에 수산화인회석 미소구체)을 처음에 적재용액에 사용한 시토크롬 C 함량의 함수로 기록하였다(도 6a). 적재양은 처음에 증가한 다음 최대 0.11 mg(mg 미소구체 마다)에서 유지되었다. 실험 데이터는 고체표면에 대한 단백질흡착의 전형적인 현상대로 R2 = 0.997로 측정되며 랭뮤어 흡착 등온선에 잘 맞았다. 시토크롬 C의 최대 흡착량을 다르게 광물화된 모든 미소구체에 대해서도 측정하였다(도 6b). BGn에 대한 데이터도 비교하였다. 1 mg의 BGn에 대한 단백질의 적재량은 ~70 ㎍이었고, 광물화작용 3 일째에 제조된 미소구체에 적재량은 약간(55 ㎍) 감소하였으나, 광물화작용 시간이 증가함에 따라 지속적으로 증가하였고, 결과적으로 단백질 함량은 21 일에 ~ 120 ㎍이었다(표 2). 단백질 적재용량의 추세는 표면적과 유사하며(미결정 나노구조 및 다공성으로 인해) 향상된 표면적이 단백질 적재용량을 증가시키는데 중요한 역할을 한다는 것을 알았다. 광물화된 미소구체로부터 시트크롬 C의 방출을 PBS(pH 7.4, 37 ℃)에서 검사하였다(도 6c). 시험을 실시한 4주 동안 시트크롬 C는 거의 지속적으로 방출되었고, 거의 0 차 속도로 방출되었으며 다량방출은 24 시간이 될 때까지만 발생하였다. 방출은 높은 선형성을 보였다(R2 = 0.988). 적재된 단백질 분자의 약 60 %는 강력한 정전기 상호 작용을 통해 미소구체의 표면에 단단히 결합되어 있다. 그러나 인회석 미소구체에 느슨하게 결합 된 단백질 분자(~40 %)는 처음에 다량방출되었다. 그러나 그이후에 타켓 분자(즉, 성장 인자)가 일정한 간격으로 (수 주에서 수개월에 걸쳐) 전달될 수 있으며 이는 손상된 조직의 재생 과정에서 매우 필요하므로, 약물전달에 있어서 아주 특별한 장점으로 여겨진다.
실시예
4.
수산화인회석
미소구체의 이온 용출 시험
4-1. 실험 과정
미소구체에서 방출된 이온을 유도 결합 플라즈마 원자 방출 (ICP-AES, OPTIMA 4300 DV, Perkin-Elmer, USA)을 사용하여 측정하였다. 30mg의 미소구체를 pH 7.4 및 37 ℃의 트리스 완충액 10ml에 침지하였다. 각각의 미리 결정된 시점에서, 15000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 전체 방출 매질을 수집하고 ICP-AES에 의해 실리케이트, 칼슘 및 포스페이트 이온을 측정하기 위해 상청액을 회수한 후 새로운 배지를 다음 시행 때 첨가하였다. 시험을 3회로 실시하였다.
4-2. 실험 결과
BGn에서 생성된 인회석 미소구체는 칼슘, 포스페이트 및 실리케이트을 비롯한 이온을 방출하는 것으로 나타났다. 수성 매질 (pH 7.4, 37 ℃)에서의 시험관 내 용출 프로파일을 ICP-AES로 기록하였고(도 7), 칼슘 및 포스페이트 이온과 함께 실리케이트 이온의 방출에 집중하였다. BGn에서 생성된 인회석 미소구체는 칼슘 및 포스페이트 이온을 최대 28일 동안 계속 방출하였고, 방출 패턴은 계단식 선형 패턴, 즉 초기에는 급속(최대 3 일) 후 느려지는 패턴을 보였다; 제1단계에서의 칼슘의 방출속도는 11.4 ppm/일 (0.29 mM/일)이고, 포스페이트 이온에 대해서는 6.03 ppm/일(0.195 mM/일) 이었다. 제2단계에서의 칼슘의 방출속도는 1.13 ppm/일 (28 μM/일) 이고 28 μM/일), 포스페이트 이온의 경우 0.72 ppm/일(23 μM/일) 이었다. 한편, 실리케이트 이온 방출은 최대 3일(~65 %)까지 선형적이고 점차적으로 최대치에 이를때까지(14 일) 느려졌다. 결과적으로, 방출 속도는 3일 동안 22.6 ppm/일(0.80 mM/일), 14주 동안 0.22 ppm/일(7.8 μM/일) 이었다.
방출 프로파일은 HA용출에 대한 다른 데이터와 유사하였고, 다만 칼슘의 경우 약간 방출양이 높았다. 더 중요한 것은, 광물화된 미소구체에 BGn이 존재했기 때문에 현재의 인회석 미소구체는 상당한 수준의 실리케이트 이온을 방출할 수 있었다. 실제로 칼슘 이온 방출은 칼슘 포스페이트 바이오 세라믹의 공통적인 특징으로 세포의 증식 및 광물화작용을 자극한다. 반면에, 생리 활성 유리에서 주로 관찰되는 현상인 실리케이트 이온의 방출은 혈관신생 및 뼈 형성과 같은 많은 생물학적 사건에서 필수적인 역할을 한다. 따라서 실리콘은 종종 HA 구조(실리케이트 치환 된 HA)에 혼입되어 생물학적 활성 및 뼈 형성을 향상시킨다. 게다가, 최근 연구들은 실리카 미소구체로부터 방출되도록 고안된 실리케이트 이온의 직접적인 역할을 강조하여 내피세포기능의 자극에서 실리케이트-방출 물질의 치료적 역할이 있음을 밝혔다. 다중 이온 방출의 이러한 측면은 다른 종래 인회석 미소구체와는 다른 본 발명의 인회석 미소구체의 고유한 장점이며, 생물학적 기능에 대한 이온 효과가 여전히 흥미로운 연구로 남아 있다.
실시예
5.
수산화인회석
미소구체의 2D 배양에서
세포상호작용
시험
5-1.
간엽
줄기세포의 준비
쥐의 치수에서 유래된 간엽 줄기세포 (MSCs)를 5 주령 스프라그 돌리(Sprague Dawley) 숫쥐(180-200g)의 절치에서 단국대학교 동물 관리위원회의 승인을 받은 지침에 따라 수득했다(번호 12-027). 또한, 사람 치수에서 얻은 간엽 줄기세포를 19-20세 연령의 건강한 기증자의 번째 어금니에서 단국대학교 치과 병원의 제도 검토위원회(Institutional Review Board) 의 승인을 받은 지침에 따라 수득했다. 두 경우 모두, 추출된 펄프 조직을 37 ℃에서 2시간 동안 타입 I 콜라게나제(3mg/ml) 및 디스파아제(4mg/ml) 용액으로 분해시켰다. 수득한 단일 세포 용액을 10 % 태아 소 혈청(FBS, Corning, 35-015-CV), 2mM 글루타멕스(Gibco, 35050-061), 100μM L-아스코르브 산(Sigma, A4544), 1 %페니실린/스트렙토마이신(PS, Gibco, 15140-122)을 첨가한 α-변형된 최소 필수 배지(α-MEM, HyClone, SH30265.01)로 100 mm2 배양 접시에 씨딩하고, 5 % CO2 가습 환경에서 37 ℃로 유지하였다. 부착 세포는 콜로니를 형성한 후 수집하고 추가 시험을 위해 여러 계대로 계대 배양하였다.
5-2. 2D 배양에서 세포 생사판별
수산화인회석 미소구체의 시험관내 시트크롬 독성을 세포 배양에서 시험하였다. 세포를 웰 당 9 x 103 세포의 밀도로 24-웰 플레이트에 넣고 10 % FBS와 1 % PS가 첨가된 α-MEM에서 배양한 후 37 ℃, 5 % CO2의 가습 대기의 배양기(incubator)에 넣었다. 수산화인회석 미소구체14를 에틸렌옥사이드 가스로 멸균한 다음 시험 전에 PBS로 세척하였다. 배양 24시간 후, 배지를 교체하고 수산화인회석 미소구체14를 상이한 농도(0-320 ㎍/ml)로 첨가하였다. 배양 24시간 및 48시간 후, 세포를 PBS로 세척한 후 제조사의 지시에 따라 400μl의 CCK-8 시약(Dojindo, 일본)을 각 웰에 첨가하였다. 흡광도는 파장 450 nm (n = 3)에서 마이크로플레이트 판독기 (BioRad, USA)를 사용하여 3시간 배양한 후에 측정하였다.
5-3. 실험 결과
생체모사적으로 성장한 인회석 미소구체에는 몇가지 고유한 특성이 있다; 크기가 수 마이크로 크기이며, 가변적인 결정성, 다공성 구조, 단백질의 높은 적재용량 및 지속적 방출, 및 치료적 이온의 방출을 갖는 생체모사적 인회석 조성물.; 따라서, 그들의 생물의학적 응용은 주로 조직 세포와의 상호작용으로부터 유추할 수 있다. 첫째, 배양 접시에 씨딩한 MSCs(쥐의 펄프 조직으로부터 유래)에 대해 다양한 함량을(최대 320 μg/ml) 구체에 도포하여 미소구체와 세포의 직접적인 상호 작용이 관찰한 후(도. 8a), 세포 생존율을 24시간 및 48시간 후에 측정하였다. 24 시간에, 미소구체에 처리한 세포의 생존력은 미소구체-함량 의존성 없는 대조군(미소구체가 없는)과 비슷하였다(도 8b). 48시간에, 세포 생존력은 미소구체 함량에 매우 의존적이었다; 낮은 함량에서 최대 40 μg/ml까지 세포 생존력은 대조군(1 μg/ml로 기록된 최고 수준)에 비해 현저하게 향상되었지만, 보다 높은 함량으로 처리하면 세포 생존률이 현저하게 감소했다. 따라서 40 μg/ml 미만의 세포에 대한 미소구체의 처리는 세포 성장을 유지할 수 있는 안전한 범위로 여겨진다. 특히, 저함량 (1 및 10 ㎍/㎖)에서 현저히 증가된 세포 생존력은 미소구체로부터의 적절한 투여량에서 방출된 이온의 효과로 인한 것으로 볼 수 있다.
실시예
6.
수산화인회석
미소구체의 3D 세포
스페로이드
형성에 따른
세포상호작용
시험
6-1. 3D 세포
스페로이드
형성
시험에 사용된 간엽 줄기세포는 실시예 5-1과 같이 수득하였다. 스페로이드를 4 % 아가로즈를 사용하여 제작된 오목한 마이크로-몰드를 통해 형성하였다. 오목한 마이크로-몰드를 이전에 설명한 바와 같이 간단한 3D 미세가공 기술을 사용하여 준비하였다. 수산화인회석 미소구체14(2 ㎍/㎖) 유무에 관계없이 세포 현탁액 (8×103 세포)을 각 오목한 마이크로-몰드에 두고 3일간 배양하였다. 세포 응집과 스페로이드 형성을 광학 현미경으로 초기에 확인하였고, 3일 후에 SEM으로 고정 및 시각화를 위해 스페로이드를 수집하였다. 스페로이드를 2.5 % 글루타르 알데하이드 (Sigma Aldrich)로 10분 동안 실온에서 고정시켰다. 고정 후, 스페로이드를 등급화된 시리즈 에탄올 (75 %, 95 % 및 100 %, 각각 5분)로 탈수시켰다. 마지막으로, 스페로이드를 1.1.1.3.3.3-헥사메틸디실라잔(Alfa Aesar)으로 처리한 다음 건조시켰다. SEM 관찰 이전에, 스 페로이드는 90초 동안 백금으로 스퍼터-코팅하였다.
6-2. 3D 세포
스페로이드의
세포 상호작용 확인
미소구체(2 μg/ml)를 MSC와 혼합한 다음, 스페로이드 형성을 가능하게 하는 미세하게 제조된 웰에 이를 도포하였다(도 8c). 우리는 미소구체의 크기가 세포 내재화없이 스페로이드에서 세포-세포 상호작용을 조절하는 것이 적절하다고 생각했다. 세포 스페로이드의 SEM 형태는 세포 구조물에 존재하는 인회석 미소구체를 나타냈다(도 8d). 수많은 세포가 광범위한 표적 골격 과정을 통해 활발히 퍼지는 것으로 밝혀졌고, 미소구체는 세포 과정의 중간에 분포했다. 세포 스페로이드 형성에서 미소구체의 기능적 효과를 확인하기 위해서는 심층적인 연구가 더 필요하지만, 현재의 세포 이미지는 세포 스페로이드 공학을 이뤄내기 위해 미소구체를 사용할 수 있음을 보여준다.
실시예
7.
수산화인회석
미소구체 함유
하이드로겔의
세포상호작용
시험
7-1.
수산화인회석
미소구체 함유
하이드로겔
형성
세포(사람 MSC)를 콜라겐 타입 I 하이드로겔 (Corning, Cat. No. 354236) 또는 33 % 또는 50 %의 수산화인회석 미소구체를 함유한 복합 하이드로겔에 캡슐화하였다. 간단히 콜라겐 타입 I 하이드로겔을 콜라겐 용액(사전에 0.02N 아세트산으로 희석됨)을 10xDMEM과 혼합하여 2mg/ml의 최종 농도로 제조 하였다. 세포 캡슐화 전에, 콜라겐 용액을 1N NaOH에 의해 중화시킨 후, 세포를 100 ㎕에 재현탁시키고 용액에 첨가하였다.
7-2-1. 세포 생존력(cell viability) 및 증식 확인 실험 과정
시험에 사용된 간엽 줄기세포는 실시예 5-1과 같이 수득하였다. 하이드로겔 내의 세포를 세포 성장 배지에서 배양하였다. 세포 증식을 생존 세포에 존재하는 탈수소 효소의 효소반응 후 포르마잔 생성물의 비색 형성을 측정하는 CCK 검정(Cell Counting Kit-8; Dojindo)을 사용하여 3, 5 및 7 일에 측정하였다. 광학 밀도는 분광 광도계를 사용하여 450 nm에서 측정하였다.
살아있는 세포와 죽은 세포를 LIVE/DEAD® 생존 능력 키트 (Invitrogen, L3224)를 사용하여 측정했다. 3, 5 및 7일 동안 하이드로겔에서 세포를 배양한 후, 2 μM 칼세인 AM과 4 μM 에티듐 호모다이머-1 (EthD-1)로 만든 용액을 37℃에서 30 분간 처리하였다. 형광 현미경 (BX-50, Olympus, Japan) 하에서 생존 세포(녹색 양성) 및 죽은 세포(적색 양성)를 시각화하였다
7-2-2. 세포 생존력 및 증식 확인 실험 결과
3D 하이드로겔에 담긴 세포의 상호작용을 콜라겐 겔 매트릭스 내에 수산화인회석 미소구체를 혼입시켜 측정하였다(도 9a). 여기서 세포-미소구체의 상호 작용은 미소구체로부터 이온 방출을 세포 기능에 영향을 미칠 수 있는 3D 조직-모사 겔 매트릭스를 통해 확인한다. 수산화인회석 미소구체 : Col = 1 : 2 (33 % 수산화인회석 미소구체) 및 1 : 1 (50 % 수산화인회석 미소구체)의 2 가지 상이한 비율로 콜라겐 겔에 미소구체를 혼입하였으며, 겔 (성장배지 포함)에서 세포의 생존력은 최대 7 일(도 9b)로 기록되었다(도 9b). 모든 하이드로 겔에서 세포는 유사한 세포 생존력 수준정도로 활발히 성장했다. 살아있는(녹색+)/죽은(빨간색+) 세포 검정에서, 수산화인회석 미소구체/Col 젤 매트릭스의 세포의 대부분은 살아있는 것으로 관찰되었다. 그 결과 겔 매트릭스에 분포된 미소구체가 세포 생존력 및 증식을 높은 수준으로 유지할 수 있음을 확인하였다(도 9c).
7-3-1. 세포
골형성에
대한 영향 확인 실험 과정
골형성 배지에는 10 mM 베타-글리세로포스페이트, 10 nM 덱사메타손 및 50 μg/mL 아스코르브산이 추가로 포함되어있다. 신선한 배지로 매일 교체하였다. 하이드로겔에서 세포의 형태를 골형성 배양 기간동안 검사하였다. 각 배양기간(3, 7 및 12일)에, 캡슐화된 세포를 4 % 파라 포름알데히드로 20분 동안 고정시킨 다음, 0.2 % 트리톤 X-100에 5분 동안 노출시켰다. 모든 시료를 움직이는 셰이커(rocking shaker)에서 PBS(x3, 각 5분)로 세척하였다. 그 다음 3 % 소혈청 알부민(Sigma, A3912)으로 30분 동안 차단시켰다. 차단 용액으로 희석된 Alexa Fluor 546-conjugated phalloidin (Invitrogen, A22283)을 30분 동안 시트 크롬 골격의 액틴 필라멘트를 염색하기 위해 각 부위에 첨가한 후 세척하였다. DAPI 핵산 염색 시약 (4,6-디아미디노-2-페닐인돌디하이드로클로라이드, Invitrogen, D1306)을 사용하여 세포핵의 dsDN를 염색한 후 세척하였다. 세포 이미지를 공초점 레이저 스캐닝 현미경 (Zeiss LSM 700)에 의해 촬영하였다.
알칼린 포스파타제의 존재 하에서 p-니트로페닐 포스페이트의 p-니트로페놀로의 전환을 검정하는 ALP 활성에 의해 MSC의 골형성 분화를 측정하였다. 각 배양기간 (3, 7 및 12 일)에, 세포가 가득찬 하이드로겔 시료를 PBS로 5분간 세척하여 배지를 제거한 후 1 %의 I 형 콜라게나제로 37 ℃에서 1시간 동안 분해시켰다. 콜라겐 분해 후, 시료를 3000 rpm으로 원심분리하여 세포펠렛을 수집하고 PBS(x3)로 세척하여 분해된 콜라겐 용액을 제거하였다. 펠렛을 추가 검사를 위해 즉시 -20 ℃에서 보관했다. 이어서, 펠렛을 3회의 냉동-해동 공정에 노출시킨 다음, 10분 동안 0.2 % 트리톤-X100을 첨가하여 세포를 파쇄시킨 다음, 볼텍싱하였다. 그 다음 4 ℃에서 15000 rpm으로 20분간 원심 분리하고 상청액을 수집하였다. 상청액을 2-아미노-2-메틸-1-프로판올 완충액 1.5M (Sigma-Aldrich, A5888), 포스파타제 기질 용액 20mM (Sigma-Aldrich, P4744) 및 MgCl2 1mM과 1:1:1의 비율로 혼합한 다음 37℃에서 2시간 동안 배양하였다. 1M NaOH를 사용하여 동일한 부피에서 반응을 정지시켰다. p-니트로페닐 포스페이트 생산은 405 nm에서 흡광도를 측정하여 결정한 다음 p-니트로페닐 포스페이트 (Sigma-Aldrich, N7660)의 알려진 농도로 준비한 표준 곡선을 사용하여 전환시켰다.
ALP 결과는 dsDNA 검출 키트 (Quant-iT Picogreen, Invitrogen P7589)를 사용하여 얻은 각 분석에 대한 이중 가닥 DNA (dsDNA) 함량으로 정규화하였고, dsDNA의 양은 제조자의 지시에 따라 얻어졌다. 간략히, 시료를 암흑에서 5분 동안 배양하고 형광 강도를 예를 들어 485 nm/em. 530 nm에서 측정하였다. 제조자의 지시에 따라 표준 곡선을 사용하여 형광 강도를 DNA 함량으로 변환시켰다.
7-3-2. 세포
골형성에
대한 영향 확인 실험 결과
세포를 골형성 조건하에 하이드로겔에서 성장시켰다. 세포는 12일간의 시험 기간 동안 겔 매트릭스 내에서 활성화된 시트크롬 골격과정을 보였다(도 9d). 고도로 연장된 축(spindle)-모양의 형태는 전형적으로 콜라겐 섬유소를 따라 성장한 세포에서 관찰되었다; 따라서 콜라겐 겔 매트릭스에서 50 % 수산화인회석 미소구체의 존재는 그러한 세포 과정을 억제하지 않는 것처럼 보였다. 마지막으로, 골형성 세포에 대한 MSC의 분화를 ALP(알칼린 포스파타제) 활성으로 평가하였다. 콜라겐 겔보다 수산화인회석 미소구체/콜라겐 겔에서 배양한 경우 세포의 ALP 수준(세포 dsDNA 함량으로 표준화 됨)이 유의미하게 높았으며(도 9e), 이는 겔 매트릭스에 들어있는 MSC가 자극을 받아 미소구체에 의해 골형성 계통으로 분화됨을 시사했다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
Claims (22)
- 생활성 유리 나노입자를 마그네슘, 칼슘, 및 인산 이온을 포함하는 유사 생체 용액(simulated body fluid)에 침지하여 광물화작용하는 단계를 포함하고,
상기 광물화작용하는 단계는 7일 내지 21일간 수행되며,
상기 생활성 유리 나노입자는,
a) PEG를 용해시켜 템플레이트 용액을 제조하는 단계;
b) 상기 템플레이트 용액에 산화칼슘 전구체를 첨가하여 산화칼슘-템플레이트 혼합용액을 제조하는 단계;
c) 상기 산화칼슘-템플레이트 혼합용액에 실리카 전구체 용액을 첨가하면서 초음파 처리하고 교반하여 반응 생성물을 제조하는 단계; 및
d) 상기 반응 생성물을 원심분리한 후 세척하고 건조 및 소성하여 메조다공성 생활성유리 나노입자를 제조하는 단계;
를 포함하는 제조방법에 의해 제조되는 것인, 마이크로 크기의 수산화인회석 미소구체(HAM, Hydroxy apatite microsphere)의 제조방법. - 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 생활성 유리 나노입자는 SiO2 70 내지 90 중량부와 CaO 5 내지 20 중량부를 포함하는 것인, 제조방법.
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 유사 생체 용액의 pH는 7.0 내지 7.8인 것인, 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 생활성 유리 나노입자는 10 내지 1000nm의 평균입경을 갖는 것인, 제조방법.
- 제1항의 마이크로 크기의 수산화인회석 미소구체(HAM, Hydroxy apatite microsphere)의 제조방법에 따라 제조되어 생활성 유리 나노입자가 마그네슘, 칼슘, 및 인산 이온을 포함하는 유사 생체 용액(simulated body fluid)에 침지되어 형성된 수산화인회석 미소구체(HAM, Hydroxy apatite microsphere).
- 제7항에 있어서, 상기 수산화인회석 미소구체의 표면적(surface area)은 30 내지 70m2/g인 것인, 수산화인회석 미소구체.
- 제7항에 있어서, 상기 수산화인회석 미소구체의 Ca/P 비율은 1.3 내지 1.7인 것인, 수산화인회석 미소구체.
- 제7항에 있어서, 상기 수산화인회석 미소구체의 크기는 1.0 내지 10 ㎛인 것인, 수산화인회석 미소구체.
- 제7항의 수산화인회석 미소구체에 단백질이 적재(load)된 수산화인회석 미소구체 복합체.
- 제11항에 있어서 상기 단백질은 시토크롬 C, 골형성 단백질 및 성장인자(growth factor) 중에서 선택되는 것인, 수산화인회석 미소구체 복합체.
- 제12항에 있어서, 상기 성장인자는, FGF-2(Fibroblast growth factor-2), FGF-18(Fibroblast growth factor-18), BMP-2(bone morphogenetic growth factor 2), BMP-7(Bone morphegenetic protein-7), NGF(Nerve growth factor), BDNF(Brain-derived neurotrophic factor), PDGF(platelet-derived growth factor), SDF-1(Stromal derived factor-1), VEGF(vascular endothelial growth factor), TGF-β(Transforming growth factor-β), EGF(Epidermal growth factor) 및 IGF-1(Insulin growth factor-1)로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것인, 수산화인회석 미소구체 복합체.
- 제11항에 있어서 상기 단백질의 방출이 0차 반응속도를 따른 선형방출 및 7 내지 28일에 걸쳐 지속적 방출을 나타내는 것인, 수산화인회석 미소구체 복합체.
- 제7항의 수산화인회석 미소구체를 분리된 줄기세포에 처리하는 단계를 포함하는, 시험관 내 줄기세포의 증식 방법.
- 삭제
- 제15항에 있어서, 상기 줄기세포는 인간의 성체줄기세포, 인간의 만능줄기세포, 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cells), 동물의 배아줄기세포 또는 동물의 성체줄기세포인 것을 특징으로 하는 증식방법.
- 제17항에 있어서, 상기 성체줄기세포는 중간엽 줄기세포, 인간 조직 유래 중간엽 기질세포(mesenchymal stromal cell), 인간 조직 유래 중간엽 줄기세포, 다분화능 줄기세포 또는 양막상피세포인 것인 증식방법.
- 제7항의 수산화인회석 미소구체 및 스페로이드형 줄기세포 집합체를 유효성분으로 포함하는, 조직 이식 또는 재생 촉진용 조성물.
- 제19항에 있어서, 상기 수산화인회석 미소구체는 콜라겐 하이드로겔에 혼입되는 것인, 조직 이식 또는 재생 촉진용 조성물.
- 삭제
- 제19항 또는 제20항에 있어서, 상기 조직 이식 또는 재생 촉진은 줄기세포 증식에 의한 것인, 조성물.
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