CN114981403A - 球状体形成促进剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种以具有吸附性的无机颗粒作为有效成分的球状体形成促进剂；以及一种球状体的形成促进方法，其中，将上述球状体形成促进剂的分散液与细胞悬浮液混合，得到上述球状体形成促进剂中包含的具有吸附性的无机颗粒发生了分散的混合物，对所得到的混合物中包含的细胞进行培养，促进球状体的形成。

Description

球状体形成促进剂

技术领域

本发明涉及球状体形成促进剂、球状体形成用试剂盒、球状体的制造方法以及球状体的形成促进方法。

背景技术

近年来，以人为代表的哺乳类的动物细胞作为研究材料被用于各种各样的研究。

在一直以来进行的动物细胞的平面培养(2D细胞培养)中，细胞以二维方式扩展增殖。因此，为了得到一定数目的培养细胞，需要一定程度的培养面积。此外，由于所培养的细胞是沿二维方向扩展的单层细胞，因此存在细胞本身所具有的功能未必能够再现其在生物体内的状态的课题。

因此，普遍希望利用粘附性动物细胞本来的凝集反应对细胞进行三维(3D)培养。通过3D细胞培养得到的球状体(凝集块)可发挥出与通过2D细胞培养得到的细胞不同的功能，实现与生物体更相近的细胞环境，并且具有高细胞活性。因此，球状体在药物创制中的药物筛选和毒性试验、作为动物实验的替代的安全性评价模型的构建等中有用，作为能够得到实用信息的生物材料也是非常重要的。

在通常的3D细胞培养方法中，重要的是控制细胞的粘附性，对适合用于3D细胞培养方法的支架材料、培养容器、培养基等进行了开发。

例如，作为支架材料使用的多孔质膜、水凝胶等有市售，专利文献1中记载了将通过利用乙酰化剂对壳聚糖进行处理使其凝胶化而制作的壳多糖凝胶用作培养基材来对细胞进行培养的方法。另外，专利文献2中记载了一种在具有特定的平均纤维径、由高分子化合物形成的纤维结构体的纤维表面上固定具有疏水性材料结合部位和细胞粘附部位的嵌合蛋白而成的细胞培养用基材。此外，非专利文献1中记载了通过使用在高分子基体内存在无机层状化合物的水凝胶来控制细胞的粘附性的方案。

关于培养容器，进行了以非粘附处理为目的的微细加工的板、为了收集细胞而设计的U形底板等可用于3D细胞培养方法，这些培养容器也有市售。

此外，专利文献3中记载了通过将细胞试样与高分子混合而成的混合物在球状体形成培养用容器内进行培养而促进球状体形成的技术，该高分子是选自由D-葡萄糖胺、D-半乳糖胺、D-葡萄糖醛酸、L-艾杜糖醛酸以及D-半乳糖组成的组中的一种以上聚合而成的。专利文献4中记载了在包含抗体、凝集素以及细胞粘附分子中的任一者的外源性细胞凝集剂的存在下进行细胞培养的球状体的制造方法。

通过像这样使用特殊的支架材料、培养容器或培养基，能够进行3D细胞培养。但是，这样的支架材料、培养容器或培养基通常价格昂贵。因此，在药物创制中的药物筛选、临床样本的原代培养中的药效筛选、有用蛋白质的生产等需要大量球状体的情况下，费用负担大。

此外，还希望开发出球状体的形成速度高、并且作为对象的生物体组织或细胞种类不受限定的通用性优异的3D细胞培养方法。

蒙脱石等溶胀性层状硅酸盐是粘土矿物的一种，其具有当吸收水等液体时会发生溶胀而带有粘性的性质。蒙脱石由二维扩展的纳米片构成。另外，蒙脱石被水溶胀而发生分散时，可得到具有粘性和触变性(thixotropy)的胶体分散液。蒙脱石在分散液中以分离到单位层的状态存在。分散液中的蒙脱石的结晶层本身具有永久负电荷，钠离子等阳离子以弥补永久负电荷的形式掺入到结晶层中。利用这样的特性，蒙脱石等溶胀性层状硅酸盐一直以来在产业上得到了广泛应用。

例如，专利文献5中记载了包含含有氟原子的层状硅酸盐化合物的蛋白质结晶形成控制剂。此外，专利文献6中记载了一种蛋白质结晶化条件探索剂，其包含具有氟原子和羟基的水溶胀性层状硅酸盐，氟原子通过与羟基的同晶置换而与硅酸盐共价键合。

专利文献7中记载了将采自具有粘膜质体表皮的特定鱼类的从表皮到肌肉组织的部位的体液、或者存在于头足纲的躯干部的体液或由肝脏采集的体液用作球状体形成促进剂的方案。并且，专利文献8中记载了使用硅酸铝或天然水铝英石的粉末除去上述球状体形成促进剂的异味成分以及夹杂物而对球状体形成促进剂进行浓缩或精制的方法。

但是，目前还没有关于溶胀性层状硅酸盐等无机颗粒材料本身促进球状体的形成的实用性报告例。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开2017-55727号公报

专利文献2：日本特开2010-63411号公报

专利文献3：日本特开2017-147944号公报

专利文献4：日本特开2008-22743号公报

专利文献5：日本特开2011-121789号公报

专利文献6：国际公开第2012/133695号

专利文献7：日本特开2011-62129号公报

专利文献8：日本特开2019-163212号公报

非专利文献

非专利文献1：Advanced Materials,2013,Volume 25,Issue 30,p.4069-4086

发明内容

发明所要解决的课题

如上所述，在球状体的制作中，现状是需要使用特殊的支架材料、培养容器或培养基。此外，在球状体的制作中，由于将细胞本来具有的粘附力作为驱动力，因此有时球状体的形成需要长时间。

因此，利用现有的方法难以简便且迅速地对多样的细胞种类通用地进行球状体形成。

因此，本发明提供能够简便且迅速地制作球状体形态的细胞的球状体形成促进剂。

另外，本发明提供能够简便且迅速地形成球状体的球状体制造方法。

另外，本发明的课题在于提供能够促进细胞的凝集或组织化、迅速地形成球状体的球状体形成促进方法。

此外，本发明的课题在于提供能够适合用于上述球状体制造方法或球状体形成促进方法的球状体形成用试剂盒。

用于解决课题的手段

本发明人鉴于上述课题进行了深入研究。其结果发现，由溶胀性层状硅酸盐、高岭石、云母及沸石等硅酸盐、胶态二氧化硅、氧化铝水合物、氧化镁、羟基磷灰石等特定的无机物质构成的颗粒具有促进细胞的凝集或组织化的作用。进而还发现，在将特定的无机颗粒以特定量分散在用于形成球状体的细胞悬浮液中的状态下进行3D细胞培养时，能够以短时间且简便地得到球状体形态的细胞。

本发明是基于这些技术思想而完成。

本发明的上述课题通过下述手段得以解决。

(1)一种球状体形成促进剂，其以具有吸附性的无机颗粒作为有效成分。

(2)如上述(1)项所述的球状体形成促进剂，其中，上述无机颗粒是由选自硅酸盐、胶态二氧化硅、氧化铝水合物、碳酸盐、氧化镁、氢氧化镁、碳酸镁、硅酸镁、硅酸铝、氢氧化铝、氧化镁-氧化铝固溶体、水滑石以及羟基磷灰石中的至少一种无机物质构成的颗粒。

(3)如上述(1)或(2)项所述的球状体形成促进剂，其中，每1mg具有吸附性的上述无机颗粒的牛血清白蛋白的吸附量为10μg以上500μg以下。

(4)如上述(1)～(3)中任一项所述的球状体形成促进剂，其中，上述无机颗粒是由选自由蒙脱石、锂蒙脱石、硅镁石、皂石、贝得石、绿脱石、锌蒙脱石以及溶胀性云母组成的组中的至少一种溶胀性层状硅酸盐构成的颗粒。

(5)如上述(1)～(3)中任一项所述的球状体形成促进剂，其中，上述无机颗粒是由选自由高岭石、以及云母族组成的组中的至少一种页硅酸盐矿物构成的颗粒、或者是由选自由沸石族组成的组中的至少一种架状硅酸盐矿物构成的颗粒。

(6)如上述(1)～(3)中任一项所述的球状体形成促进剂，其中，上述无机颗粒是由胶态二氧化硅构成的颗粒。

(7)如上述(1)～(3)中任一项所述的球状体形成促进剂，其中，上述无机颗粒是由氧化铝水合物构成的颗粒。

(8)一种球状体形成用试剂盒，其包含上述(1)～(7)中任一项所述的球状体形成促进剂。

(9)一种球状体的制造方法，其中，将上述(1)～(7)中任一项所述的球状体形成促进剂的分散液与细胞悬浮液混合，得到上述球状体形成促进剂中包含的具有吸附性的无机颗粒发生了分散的混合物，

对所得到的混合物中包含的细胞进行培养，形成球状体。

(10)一种球状体的形成促进方法，其中，将上述(1)～(7)中任一项所述的球状体形成促进剂的分散液与细胞悬浮液混合，得到上述球状体形成促进剂中包含的具有吸附性的无机颗粒发生了分散的混合物，对所得到的混合物中包含的细胞进行培养，促进球状体的形成。

(11)如上述(9)或(10)项所述的方法，其中，上述无机颗粒是由选自由蒙脱石、锂蒙脱石、硅镁石、皂石、贝得石、绿脱石、锌蒙脱石以及溶胀性云母组成的组中的至少一种溶胀性层状硅酸盐构成的颗粒，

上述混合物中的溶胀性层状硅酸盐的固体成分浓度为0.0003w/v％以上且小于0.333w/v％。

(12)如上述(9)或(10)项所述的方法，其中，上述无机颗粒是由选自由高岭石以及云母族组成的组中的至少一种页硅酸盐矿物构成的颗粒，

上述混合物中的页硅酸盐矿物的固体成分浓度为0.001w/v％以上且小于0.333w/v％。

(13)如上述(9)或(10)项所述的方法，其中，上述无机颗粒是由选自由沸石族组成的组中的至少一种架状硅酸盐矿物构成的颗粒，

上述混合物中的架状硅酸盐矿物的固体成分浓度为0.0005w/v％以上且小于0.333w/v％。

(14)如上述(9)或(10)项所述的方法，其中，上述无机颗粒是由胶态二氧化硅构成的颗粒，

上述混合物中的胶态二氧化硅的固体成分浓度为0.0005w/v％以上且小于0.04w/v％。

(15)如上述(9)或(10)项所述的方法，其中，上述无机颗粒是由氧化铝水合物构成的颗粒，

上述混合物中的氧化铝水合物的固体成分浓度为0.001w/v％以上且小于0.5w/v％。

(16)如上述(9)～(15)中任一项所述的方法，其中，上述细胞是由动物采集的细胞、对由动物采集的细胞进行培养而得到的细胞、对由动物采集的细胞实施各种处理而得到的细胞、或者培养细胞株。

(17)如上述(9)～(16)中任一项所述的方法，其中，上述细胞为哺乳类动物细胞。

(18)如上述(9)～(17)中任一项所述的方法，其中，在悬浮细胞用培养板中培养上述细胞，形成球状体。

发明的效果

本发明的球状体形成促进剂可促进细胞的凝集或组织化，能够简便且迅速地实现球状体的制作。

另外，利用本发明的球状体的制造方法能够简便且迅速地形成球状体。

另外，本发明的球状体的形成促进方法能够实现对细胞的凝集或组织化的促进，能够迅速地形成球状体。

此外，本发明的球状体形成用试剂盒能够适合用于上述球状体的制造方法或球状体的形成促进方法。

本发明的上述以及其他特征和优点可通过适当地参照附图由下述记载进一步得以明确。

附图说明

图1是使用悬浮细胞用培养板，在按照溶胀性层状硅酸盐(氟化钠型锂蒙脱石)的固体成分浓度为0.0052w/v％的方式分散有溶胀性层状硅酸盐的混合物中对人胰腺癌细胞PANC-1株进行3天培养后所形成的球状体的显微镜照片。

图2是使用悬浮细胞用培养板，在按照溶胀性层状硅酸盐(钠型锂蒙脱石粉末)的固体成分浓度为0.0052w/v％的方式分散有溶胀性层状硅酸盐的混合物中对人胰腺癌细胞PANC-1株进行3天培养后所形成的球状体的显微镜照片。

图3是使用悬浮细胞用培养板，在按照溶胀性层状硅酸盐(氟化钠型锂蒙脱石)的固体成分浓度为0.0052w/v％的方式分散有溶胀性层状硅酸盐的混合物中对人肾脏癌细胞ACHN株进行3天培养后所形成的球状体的显微镜照片。

图4是使用悬浮细胞用培养板，在按照溶胀性层状硅酸盐(钠型锂蒙脱石粉末)的固体成分浓度为0.0052w/v％的方式分散有溶胀性层状硅酸盐的混合物中对人肾脏癌细胞ACHN株进行3天培养后所形成的球状体的显微镜照片。

图5是示出在不包含溶胀性层状硅酸盐的细胞悬浮液中对人胰腺癌细胞PANC-1株进行3天培养后的细胞的状态的显微镜照片。

图6是示出在不包含溶胀性层状硅酸盐的细胞悬浮液中对人肾脏癌细胞ACHN株进行3天培养后的细胞的状态的显微镜照片。

图7是在按照溶胀性层状硅酸盐(钠型锂蒙脱石)的固体成分浓度为0.0052w/v％的方式分散有溶胀性层状硅酸盐的混合物中对人胰腺癌细胞PANC-1株进行培养后所形成的球状体的显微镜照片，图7(a)是示出从培养开始起第1天的状态的照片，图7(b)是示出从培养开始起第3天的状态的照片，图7(c)是示出从培养开始起第7天的状态的照片。

图8是在按照溶胀性层状硅酸盐(钠型锂蒙脱石)的固体成分浓度为0.0052w/v％的方式分散有溶胀性层状硅酸盐的混合物中对人肾脏癌细胞ACHN株进行培养后所形成的球状体的显微镜照片，图8(a)是示出从培养开始起第1天的状态的照片，图8(b)是示出从培养开始起第3天的状态的照片，图8(c)是示出从培养开始起第7天的状态的照片。

图9是将人大肠癌细胞HT29在各种无机颗粒的存在下培养4天后的球状体的显微镜照片。图9(a)是按照浓度为0.005w/v％的方式分散有胶态二氧化硅(商品名：SnowtexST-C)的混合物中的球状体的显微镜照片，图9(b)是按照浓度为0.0025w/v％的方式分散有胶态二氧化硅(商品名：Snowtex ST-CXS)的混合物中的球状体的显微镜照片，图9(c)是按照浓度为0.02w/v％的方式分散有氧化铝水合物颗粒(商品名：Alumina Sol AS-200)的混合物中的球状体的显微镜照片，图9(d)是按照浓度为0.08w/v％的方式分散有氧化铝水合物颗粒(商品名：Alumina Sol AS-520-A)的混合物中的球状体的显微镜照片，图9(e)是按照浓度为0.02w/v％的方式分散有页硅酸盐矿物颗粒(商品名：Kaolin JP-100)的混合物中的球状体的显微镜照片，图9(f)是按照浓度为0.04w/v％的方式分散有页硅酸盐矿物颗粒(商品名：MK-100)的混合物中的球状体的显微镜照片。

图10是将人肾脏癌细胞ACHN株在各种无机颗粒的存在下培养5天后的球状体的显微镜照片。图10(a)是按照浓度为0.02w/v％的方式分散有架状硅酸盐矿物颗粒(商品名：Zeoal-ZSM-5)的混合物中的球状体的显微镜照片，图10(b)是按照浓度为0.04w/v％的方式分散有架状硅酸盐矿物颗粒(商品名：HSZ-940NHA)的混合物中的球状体的显微镜照片，图10(c)是按照浓度为0.04w/v％的方式分散有氧化镁颗粒(商品名：KYOWAMAG MF-150)的混合物中的球状体的显微镜照片，图9(d)是按照浓度为0.04w/v％的方式分散有羟基磷灰石颗粒(商品名：SHAp)的混合物中的球状体的显微镜照片。

图11是对于人大肠癌细胞SW620株添加保持有荧光标记物的溶胀性层状硅酸盐(钠型锂蒙脱石)并培养5天后的球状体的双重染色观察图像，图11(a)是明视野中的观察图像，图11(b)是荧光视野中的观察图像，图11(c)是明视野与荧光视野重叠的合成图像。

具体实施方式

本发明中，将具有吸附性的无机颗粒(以下也简称为“吸附性无机颗粒”)用作球状体形成促进剂的有效成分。

如后述的实施例中所证实，吸附性无机颗粒显示出促进细胞的凝集或组织化的作用。此外，通过在分散有特定量的吸附性无机颗粒的状态下进行3D细胞培养，可简便且迅速地形成球状体。

以下基于优选实施方式对本发明的球状体形成促进剂、球状体形成方法、球状体形成促进方法以及球状体形成用试剂盒进行下述说明。但是，本发明并不限于这些。

本说明书中的“3D细胞培养”是指在人工制作的环境下将细胞在与其周围环境三维相互作用的同时进行培养的方法。3D细胞培养与2D细胞培养不同，其能够在体外(in vitro)使细胞与在体内(in vivo)的细胞同样地在所有方向上增殖。

并且，通过3D细胞培养，利用特定细胞所具有的粘附性聚集而成的细胞的微小块为“球状体”。

本发明中使用的无机颗粒具有吸附性。本说明书中的“吸附性”是指对于血清成分、生长因子等蛋白质具有吸附性。此外，本发明中使用的无机颗粒或者在无机颗粒上吸附有蛋白质的复合颗粒通过也吸附在形成球状体的各个细胞表层上，促进细胞彼此的凝集，形成球状体。

关于无机颗粒所具有的吸附性，可以通过常规方法来判断，例如可以使用牛血清白蛋白(以下也简称为“BSA”)试剂来测定无机颗粒所具有的吸附能力。例如，在溶解有BSA的溶解液中加入特定量的胶体颗粒分散液，之后通过离心分离进行固液分离，对该上清成分中的BSA量进行定量。由于无机颗粒所吸附的BSA转移到离心分离后的固体成分中，因此通过从此处的BSA量减去上清成分中的BSA量，能够计算出无机颗粒所吸附的BSA量。这样能够判断无机颗粒所具有的蛋白质吸附能力。具有蛋白质吸附能力的无机颗粒对球状体的形成有效，可用于本发明。

作为本发明中使用的无机颗粒，只要具有吸附性、无损于本发明的效果就没有特别限制，优选为由选自硅酸盐、胶态二氧化硅、氧化铝水合物、碳酸盐、氧化镁、氢氧化镁、碳酸镁、硅酸镁、硅酸铝、氢氧化铝、氧化镁-氧化铝固溶体、水滑石以及羟基磷灰石中的至少一种无机物质构成的颗粒。其中优选由选自由硅酸盐、胶态二氧化硅以及氧化铝水合物组成的组中的至少一种无机物质构成的颗粒，更优选由硅酸盐构成的颗粒。由硅酸盐构成的颗粒中，特别优选由溶胀性层状硅酸盐构成的颗粒。

本发明中，通过3D细胞培养促进球状体形成的理由(机理)尚不明确。但是，认为其原因在于，形成球状体的细胞的培养液中包含的血清或者生长因子等蛋白质与吸附性无机颗粒相互吸附，其结果，所形成的由蛋白质和吸附性无机颗粒构成的复合物本身吸附在细胞的表面，起到作为支架的作用，由此促进球状体的形成。

特别是推测，本发明中可优选使用的由溶胀性层状硅酸盐构成的颗粒作为纳米级的平板颗粒存在于培养基中，由此，在球状体形成中，溶胀性层状硅酸盐构成了小的支架。此外还认为，由于溶胀性层状硅酸盐的层表面带有负电荷，因此培养基中的蛋白质(血清成分)吸附在溶胀性层状硅酸盐上，藉由溶胀性层状硅酸盐而将蛋白质供给至细胞表面。

可作为本发明的球状体形成促进剂的有效成分使用的“硅酸盐”是指包含具有以1个或数个硅原子作为中心且其被电阴性配位体包围的结构的阴离子的化合物。大多数硅酸盐具有硅原子被4个氧原子包围的四面体结构。根据硅酸盐的种类，该四面体连接的程度有所不同，根据四面体连接的方式，有成对、簇状、环状、链状、双链状、层状、三维网眼状等结构的多种结构。

上述硅酸盐中，本发明中可特别优选使用的“溶胀性层状硅酸盐”是指下述化合物：其显示出水溶胀性，并且具有二维的单位层多层层积而成的层结构，该层结构至少由硅原子和电阴性的配位体构成。层状硅酸盐可以具有四面体片和/或八面体片的单独层、或者它们的混合片。四面体片具有4个氧离子(O^2-)包围作为标准元素的硅离子(Si⁴⁺)的结构，3个顶点与相邻的四面体共用，该结构形成六角形网络，连接成片状。八面体片是镁离子(Mg^{2 +})或铝离子(Al³⁺)被6个氧离子(O^2-)或氢氧根离子(OH^-)包围的八面体共用稜并二维扩展而成的。四面体片与八面体片组合时，四面体片的顶点的氧离子被共用。进而，通过四面体片中的一部分被同晶置换成铝离子、八面体片中的一部分被同晶置换成铝离子、镁离子、铁离子(Fe²⁺、Fe³⁺)或锂离子(Li⁺)等，产生负电荷。或者通过使四面体片和八面体片的一部分存在空隙也产生负电荷。在层间以中和这些负电荷的形式存在阳离子。

溶胀性层状硅酸盐具有溶胀性、增稠性、触变性、阳离子交换性等各种特性。此外，由于溶胀性层状硅酸盐为无机物质，因此几乎不会受到基于微生物的分解或变质作用，在人体中也是优异的材料。此外，由于本发明中使用的层状硅酸盐具有水溶胀性，因此即使在细胞悬浮液中也不容易发生自然沉降。因此，能够提供均匀分散性优异、可长期稳定地保持均匀的分散状态的球状体形成促进剂。

本发明中可使用的溶胀性层状硅酸盐优选来自属于蒙脱石族的矿物。属于蒙脱石族的矿物具有2:1型的层结构。蒙脱石的一次颗粒的厚度为1nm，是展宽为20nm～2μm的板状结晶。如上所述，在水分散液中，钠离子等阳离子以弥补蒙脱石的结晶层本身所具有的永久负电荷的形式掺入在结晶层中(参照“粘土手册”、第三版、日本粘土学会编、2009年5月、第65页)。

作为可在本发明中使用的溶胀性层状硅酸盐的具体例，可以举出蒙脱石、锂蒙脱石、硅镁石、皂石、贝得石、绿脱石、锌蒙脱石以及溶胀性云母。

可在本发明中使用的溶胀性层状硅酸盐可以在不损害本发明的效果的范围内具有任意的阳离子交换容量。溶胀性层状硅酸盐的阳离子交换容量优选为10meq/100g以上、更优选为30meq/100g以上。合适范围的阳离子交换容量对溶胀性层状硅酸盐赋予适合于蛋白质(血清成分)吸附的负电荷。关于可在本发明中使用的溶胀性层状硅酸盐，从实现优异的溶胀性和分散稳定性的方面出发优选为钠等1价阳离子型的硅酸盐，从实现优异的溶胀性和分散稳定性的方面出发更优选为钠等1价阳离子型的溶胀性层状硅酸盐。需要说明的是，溶胀性层状硅酸盐的阳离子交换容量的测定方法可以通过依据Schollenberger法(粘土手册第三版、日本粘土学会编、2009年5月、第453-454页)的方法进行测定。更具体地说，可以通过日本膨润土工业会标准试验方法JBAS-106-77中记载的方法进行测定。例如，蒙脱石的浸出阳离子量可以如下计算出：相对于蒙脱石0.5g使用100mL的1M乙酸铵水溶液，用时4小时以上使蒙脱石的层间阳离子浸出，通过ICP光谱分析、原子吸光分析等测定并计算出所得到的溶液中的各种阳离子的浓度。另外，可在本发明中使用的溶胀性层状硅酸盐的阳离子交换容量的上限值没有特别限制，但120meq/100g以下是较为实际的。

作为硅酸盐，除了溶胀性层状硅酸盐以外，还可以使用由硅酸盐构成的硅酸盐矿物。可以使用的硅酸盐矿物没有特别限制，可以举出橄榄石(olivine group)、石榴石(garnet)、锆石(zircon)、硅线石(sillimanite)、红柱石(andalusite)、蓝晶石(kyanite)、钛石(titanite)、黄晶(topaz)、十字石(staurolite)、硅灰硼石(datolite)、褐锰矿(braunite)、硬绿泥石(chloritoid)、粒硅锰石(alleghanyite)、尖晶石(spurrite)、蓝线石(dumortierite)、马来亚石(malayaite)、翠铜矿(dioptase)、硅锌矿(willemite)、硅铍石(phenakite)、锰橄榄石(knebelite)、灰锰橄榄石(glaucochroite)、硅镁石(humite)、硅硼钙铁矿(homilite)、蓝柱石(euclase)、硅铍钇矿(gadolinite)等岛状硅酸盐矿物；黄长石(melilite)、钙铝黄长石(gehlenite)、硬柱石(lawsonite)、黝帘石(zoisite)、斜黝帘石(clinozoisite)、绿帘石(epidote)、红帘石(piemontite)、褐帘石(allanite-(Ce))、符山石(vesuvianite、idocrase)、异极矿(hemimorphite)、黑柱石(ilvaite、lievrite)、氯黄晶(zunyite)、羟硅铍石(bertrandite)等俦硅酸盐矿物；斧石族(axinite group)、绿柱石(beryl)、菫青石(cordierite)、大隅石(osumilite)、杉石(sugilite)、锆锂大隅石(sogdianite)、电气石(tourmaline)等环硅酸盐矿物；辉石族(pyroxene group)、似辉石族(pyroxenoid group)、针钠钙石(pectolite)、硅铁灰石(babingtonite)、角闪石族(amphibole group)、纤硅铜矿(plancheite)等链状硅酸盐矿物；高岭石(kaolinite)、埃洛石(halloysite)、蛇纹石(serpentine)、硅镁镍矿(garnierite)、叶蜡石(pyrophyllite)、滑石(talc)、云母族(mica group)、绿泥石族(chlorite group)、蛭石(vermiculite)、白钙沸石(gyrolite)、纤水硅钙石(okenite)、葡萄石(prehnite)、鱼眼石族(apophyllitegroup)、硅孔雀石(chrysocolla)等页硅酸盐矿物；长石族(feldspar group)、似长石族(feldspathoid group)、柱石(scapolite)、沸石族(zeolite group)、白榴石(leucite)、铵白榴石(ammonioleucite)、红硅钙锰石(inesite)、赛黄晶(danburite)、日光榴石(helvite)、铍榴石(danalite)等架状硅酸盐矿物。其中优选高岭石(kaolinite)、埃洛石(halloysite)、蛇纹石(serpentine)、硅镁镍矿(garnierite)、叶蜡石(pyrophyllite)、滑石(talc)、云母族(mica group)、绿泥石族(chlorite group)、蛭石(vermiculite)、白钙沸石(gyrolite)、纤水硅钙石(okenite)、葡萄石(prehnite)、鱼眼石族(apophyllitegroup)、硅孔雀石(chrysocolla)等页硅酸盐矿物；长石族(feldspar group)、似长石族(feldspathoid group)、柱石(scapolite)、沸石族(zeolite group)、白榴石(leucite)、铵白榴石(ammonioleucite)、红硅钙锰石(inesite)、赛黄晶(danburite)、日光榴石(helvite)、铍榴石(danalite)等架状硅酸盐矿物，更优选高岭石(kaolinite)、云母族(mica group)、沸石族(zeolite group)。

可在本发明中优选使用的“胶态二氧化硅”是指二氧化硅(SiO₂)或其水合物的胶体。

另外，“氧化铝水合物”是指包括氢氧化铝在内的、由化学式Al₂O₃·nH₂O表示的结晶和凝胶的总称。

本发明中使用的吸附性无机颗粒在水分散液中的粒径根据测定条件等而不同，但通常通过以水为分散介质的粒度分布测定来确定，可以在不损害本发明效果的范围内任意设定。从使吸附性无机颗粒在细胞悬浮液中效率良好地均匀分散的方面出发，吸附性无机颗粒的中值径优选为10nm以上、更优选为20nm以上，优选为10000nm以下、更优选为5000nm以下。

吸附性无机颗粒的中值径的测定中，在分散粒度为纳米级的情况下，优选利用光子相关法进行测定，可以使用作为扩散系数当量直径得到的粒度分布中的中值径来表示。测定中，可以使用将吸附性无机颗粒分散于水中后稀释至0.1质量％左右的稀释液来进行测定。作为测定装置，只要是市售的使用光子相关法的装置即可。例如可以举出堀场制作所制造的SZ-100系列。此外还可以举出Malvern公司制造的Zetasizer Nano系列、大塚电子公司制造DLS-6500系列等。

吸附性无机颗粒为微米级的情况下，可以使用激光衍射·散射法测定中值径。作为测定装置，例如可以举出堀场制作所制造的LA-960系列、Malvern公司制造的Mastersizer系列、大塚电子公司制造的ELSZ系列。

本发明中使用的吸附性无机颗粒的粘度可以在不损害本发明的效果的范围内任意地设定。例如，对于可以在本发明中优选使用的溶胀性层状硅酸盐，使用B型粘度计在60转/分钟的条件下测定的25℃的1质量％水分散液的粘度优选为100mPa·s以下、更优选为50mPa·s以下。通过将粘度设定为这样的范围，在用于细胞培养的浓度调整中进行分散液的稀释时，能够容易地进行准确的分散液的计量。

本发明中使用的吸附性无机颗粒能够吸附蛋白质。蛋白质的吸附量使用作为代表性试剂的BSA来进行。例如，相对于1mg/mL的BSA溶解液1mL，分别添加0.2mL的1质量％吸附性无机颗粒的分散液、或者作为比较的蒸馏水，利用涡旋振荡器进行混合，利用旋转器反应1小时后，使用离心分离机使颗粒沉降，采集上清，对上清中包含的BSA进行定量。然后，通过与未添加吸附性无机颗粒时的上清进行比较，可以对吸附性无机颗粒上的BSA吸附量进行定量。

在蛋白质的定量中，可以使用Bradford法、BCA法、Lowly法等。每1mg本发明中使用的吸附性无机颗粒的BSA吸附量优选为10μg以上、更优选为15μg以上、更优选为20μg以上、更优选为30μg以上、更优选为40μg以上、更优选为100μg以上、更优选为200μg以上、进一步优选为300μg以上。每1mg吸附性无机颗粒的BSA吸附量的上限没有特别限制，500μg以下是较为实际的，优选为490μg以下。预测无机颗粒通过吸附蛋白质，作为能够对细胞有效地提供生长因子的支架发挥作用。

作为本发明中使用的吸附性无机颗粒，可以为天然物，也可以按照常规方法进行合成。

作为吸附性无机颗粒使用天然物的情况下，天然物可以包含夹杂物或杂质，但从促进球状体形成的方面出发，优选去除夹杂物或杂质。

作为溶胀性层状硅酸盐的合成方法，例如可以举出水热合成法、熔融合成法、高压合成法、固体反应法、火焰熔融法和变质法。溶胀性层状硅酸盐的合成方法可以参照日本特开2008-13401号公报中记载的方法。作为胶态二氧化硅的主要合成法，代表性的方法为基于四氯化硅的热分解的AEROSIL合成这样的气相合成法、以水玻璃为原料的方法、醇盐的水解这样的液相合成法。氧化铝水合物通常通过在高温下将铝土矿溶解于氢氧化钠中的拜耳法来生成。

另外，本发明中，也可以使用市售的吸附性无机颗粒。

作为溶胀性层状硅酸盐的市售品，例如可以举出：Kunipia-F(中值径：347.4nm、BSA吸附量：222μg/mg、阳离子交换容量：108meq/100g、25℃的1质量％水分散液的粘度：4mPa·s)、Sumecton-SA(中值径：85.7nm、BSA吸附量：437μg/mg、阳离子交换容量：70meq/100g、25℃的1质量％水分散液的粘度：5mPa·s)、Sumecton-SWN(中值径：64.4nm、BSA吸附量：485μg/mg、阳离子交换容量：49meq/100g、25℃的1质量％水分散液的粘度：6mPa·s)、Sumecton-SWF(中值径：69.8nm、BSA吸附量：388μg/mg、阳离子交换容量：73meq/100g、25℃的1质量％水分散液的粘度：16mPa·s)、Sumecton-ST(中值径：42.4nm、BSA吸附量：474μg/mg、阳离子交换容量：30meq/100g、25℃的1质量％水分散液的粘度：2mPa·s)(商品名、Kunimine Industries公司制造)、Somasif ME、Somasif MEB-3(均为商品名、Katakura&Co-op Agri公司制造)、PDM-5B、PDM-800(均为商品名、Topy Industries Ltd.公司制造)等。

作为除溶胀性层状硅酸盐以外的层状硅酸盐的市售品，可以举出Kaolin JP-100(中值径：5.4μm、BSA吸附量：23μg/mg、竹原化学工业公司制造)、MK-100(中值径：5.1μm、BSA吸附量：24μg/mg、Katakura&Co-op Agri公司制造)、1000F、FG-15F(均为商品名、日本滑石公司制造)、Hydrite TS90、Hydrite UF90(均为商品名、林化成公司制造)、Zeoal 4A(中值径：51.6nm、BSA吸附量：15μg/mg、中村超硬公司制造)、Zeoal ZSM-5(中值径：168.0nm、BSA吸附量：17μg/mg、中村超硬公司制造)、HSZ-940NHA(中值径：3.2μm、BSA吸附量：34μg/mg、东曹公司制造)、HSZ-820NHA(中值径：6.2μm、BSA吸附量：30μg/mg、东曹公司制造)、HSZ-320NAA(中值径：8.2μm、BSA吸附量：12μg/mg、东曹公司制造)。

作为胶态二氧化硅的市售品，可以举出Snowtex-C(中值径：45.9nm、BSA吸附量：47μg/mg)、Snowtex-CXS(中值径：46.0nm、BSA吸附量：89μg/mg)、Snowtex-30(中值径：16.0nm、BSA吸附量：79μg/mg)、Snowtex Na型(ST-XS、ST-S、ST-50-T、ST-30L、ST-YL、ST-ZL、MP-1040、MP-2040、MP-4540M、ST-UP、ST-PS-S、ST-PS-M)、Snowtex O型(ST-OXS、ST-OS、ST-O、ST-O-40、ST-OL、ST-OYL、ST-OUP、ST-PS-SO、ST-PS-MO)、Snowtex N型(ST-NXS、ST-NS、ST-N、ST-N-40)、Snowtex C型(ST-CM)、Snowtex AK型(ST-AK、ST-AK-L、ST-AK-YL)(均为商品名、日产化学公司制造)。

作为氧化铝水合物的市售品，可以举出Alumina Sol AS-200(中值径：204.0nm、BSA吸附量：453μg/mg、日产化学公司制造)、Alumina Sol AS-520-A(中值径：76.8nm、BSA吸附量：267μg/mg、日产化学公司制造)、Alumina Sol-10A、Alumina Sol-A2、Alumina Sol-10C、Alumina Sol-F1000(均为商品名、Kawaken Fine Chemicals公司制造)。

作为其他吸附性无机颗粒的具体例，可以举出：Alcamizer、Magceler、DHT-4A、DHT-4A-2、DHT-4C、Kyoward 500(均为商品名、协和化学公司制造)等碳酸盐；KYOWAMAG、KYOWAMAGMF、Pyrokisuma 5301、Pyrokisuma 3320、Magsarat、Magmic、高纯度氧化镁500-04R(均为商品名、协和化学公司制造)等氧化镁；Kisuma(商品名、协和化学公司制造)等氢氧化镁；碳酸镁TT(商品名、Naikai Salt Industries公司制造)等碳酸镁；Kyoward 600(商品名、协和化学公司制造)等硅酸镁；Kyoward 700(商品名、协和化学公司制造)等硅酸铝；Kyoward 200(商品名、协和化学公司制造)等氢氧化铝；KW-2000(商品名、协和化学公司制造)等氧化镁-氧化铝固溶体；STABIACE HT(商品名、堺化学工业公司制造)等水滑石；SHAp、nano-SHAp(均为商品名、SofSera公司制造)、HAP(商品名、MP Biomedicals公司制造)等羟基磷灰石。

此外，出于提高分散性的目的，可在本发明中使用的市售的吸附性无机颗粒可以通过进行粉碎来调整粒径。例如可以适当地使用干式粉碎等的喷射式粉碎机、湿式粉碎等的珠磨机、加压湿式粉碎装置等，进一步减小市售的吸附性无机颗粒的粒径。

本发明的球状体形成方法中，首先制备将吸附性无机颗粒以规定的浓度进行分散的分散液。为了促进球状体的形成，需要使吸附性无机颗粒在分散液中均匀地存在，优选预先将吸附性无机颗粒分散在水或缓冲液等水溶液中，将所得物与分散介质混合。由此能够抑制分散液中的吸附性无机颗粒的凝集或沉淀。

本发明中使用的吸附性无机颗粒可以仅为一种，也可以将两种以上混合使用。

本发明中，分散液中的吸附性无机颗粒的浓度可以适当地设定。例如，分散液中的吸附性无机颗粒的固体成分浓度为0.001质量％以上是较为实际的，优选为0.003质量％以上、更优选为0.01质量％以上。固体成分浓度的上限值小于1.000质量％是较为实际的，优选为0.600质量％以下、更优选为0.500质量％以下、更优选为0.250质量％以下、进一步优选为0.125质量％以下。

若吸附性无机颗粒的固体成分浓度过低，则吸附性无机颗粒的量不足以促进球状体形成。另外，在制成特定浓度的混合液时，培养基中的成分会被过分稀释。另一方面，吸附性无机颗粒的固体成分浓度若过高，则在吸附性无机颗粒与培养基成分混合时，凝集物会变得过多，因此不适合用于3D细胞培养。

作为用于制备吸附性无机颗粒的分散液的分散介质，只要对形成球状体的细胞无毒性、无损于细胞的增殖性和功能就没有特别限定。作为具体例，可以举出水、缓冲液、细胞培养用培养基。作为缓冲液，例如可以举出磷酸生理盐水(PBS)、HEPES缓冲液、Hanks缓冲液。作为培养用培养基，例如可以举出D-MEM、E-MEM、MEMα、RPMI、Ham’s F-12。可在本发明中使用的吸附性无机颗粒的分散液中可以在不损害本发明的效果的范围内进一步包含各种添加剂。

接着，将所制备的吸附性无机颗粒的分散液与将形成球状体的细胞试样悬浮在溶剂中而成的细胞悬浮液进行混合。

作为用于制备细胞悬浮液的溶剂，只要对形成球状体的细胞无毒性、无损于细胞的增殖性和功能就没有特别限定。作为具体例，可以举出水、缓冲液、细胞培养用培养基。作为缓冲液，例如可以举出磷酸生理盐水(PBS)、HEPES缓冲液、Hanks缓冲液。作为培养用培养基，可以举出D-MEM、E-MEM、MEMα、RPMI、Ham’s F-12。本发明中使用的细胞悬浮液中可以在不损害本发明效果的范围内进一步包含各种添加剂。例如可以举出酚红指示剂、以HEPES为代表的缓冲剂、EDTA、L-谷氨酰胺、青霉素等抗生素、FUNGINOL等抗真菌剂。

在吸附性无机颗粒的分散液和细胞悬浮液中的至少任一者中包含在球状体的形成中通常使用的血清成分。作为可在本发明中使用的血清成分，可以举出胎牛血清(FBS)、小牛血清、马血清、猪血清。在血清中包含以蛋白质为中心的生长因子，在所谓无血清培养基中可以使用细胞因子等生长因子。另外，在吸附性无机颗粒的分散液与细胞悬浮液中的至少任一者中可以包含人血小板溶解物(hPL)。

本发明中，通过将细胞悬浮液与吸附性无机颗粒的分散液进行混合，吸附在吸附性无机颗粒上的血清成分被供给至细胞表面。

与细胞悬浮液混合的吸附性无机颗粒的量只要是足以得到球状体形成促进效果的量即可，可以根据细胞悬浮液与吸附性无机颗粒的分散液的混合物中的细胞种类、构成细胞数、培养环境等任意地设定。

例如，作为吸附性无机颗粒使用溶胀性层状硅酸的情况下，细胞悬浮液与溶胀性层状硅酸盐的分散液的混合物中的溶胀性层状硅酸盐的固体成分浓度优选为0.0003w/v％以上、更优选为0.0005w/v％以上、更优选为0.0006w/v％以上、更优选为0.0010w/v％以上、更优选为0.0027w/v％以上。溶胀性层状硅酸的固体成分浓度的上限值优选小于0.333w/v％、优选为0.1667w/v％以下、更优选为0.0833w/v％以下、进一步优选为0.0417w/v％以下。

作为吸附性无机颗粒使用除溶胀性层状硅酸以外的上述硅酸盐中的页硅酸盐矿物的情况下，细胞悬浮液与页硅酸盐矿物的分散液的混合物中的页硅酸盐矿物的固体成分浓度优选为0.001w/v％以上、更优选为0.005w/v％以上、更优选为0.01w/v％以上、更优选为0.02w/v％以上。页硅酸盐矿物的固体成分浓度的上限值优选小于0.333w/v％、优选为0.1667w/v％以下、更优选为0.0833w/v％以下、进一步优选为0.0417w/v％以下。另外，在使用架状硅酸盐矿物的情况下，细胞悬浮液与架状硅酸盐矿物的分散液的混合物中的架状硅酸盐矿物的固体成分浓度优选为0.0005w/v％以上、更优选为0.001w/v％以上、更优选为0.002w/v％以上、更优选为0.0025w/v％以上。架状硅酸盐矿物的固体成分浓度的上限值优选小于0.333w/v％、优选为0.1667w/v％以下、更优选为0.08w/v％以下、进一步优选为0.04w/v％以下。

作为吸附性无机颗粒使用胶态二氧化硅的情况下，细胞悬浮液与胶态二氧化硅的分散液的混合物中的胶态二氧化硅的固体成分浓度优选为0.0005w/v％以上、更优选为0.001w/v％以上、更优选为0.002w/v％以上、更优选为0.0025w/v％以上。胶态二氧化硅的固体成分浓度的上限值优选小于0.04w/v％、优选为0.02w/v％以下、更优选为0.01w/v％以下、进一步优选为0.005w/v％以下。

作为吸附性无机颗粒使用氧化铝水合物的情况下，细胞悬浮液与氧化铝水合物的分散液的混合物中的氧化铝水合物的固体成分浓度优选为0.001w/v％以上、更优选为0.005w/v％以上、更优选为0.01w/v％以上、更优选为0.02w/v％以上、更优选为0.04w/v％以上。氧化铝水合物的固体成分浓度的上限值优选小于0.5w/v％、优选为0.333w/v％以下、更优选为0.1667w/v％以下、进一步优选为0.08w/v％以下。

吸附性无机颗粒的固体成分浓度若过低，则吸附性无机颗粒的量不足以促进球状体形成。另一方面，吸附性无机颗粒的固体成分浓度若过高，则吸附性无机颗粒在混合物中形成凝胶，阻碍球状体的形成。

本发明中，吸附性无机颗粒的分散液、分散液与细胞悬浮液混合而成的混合物中包含的吸附性无机颗粒的固体成分浓度可以按照常规方法来确定。例如，将包含溶胀性层状硅酸盐等吸附性无机颗粒的分散液或混合物通过冷冻干燥等进行干燥，进行化学组成分析、亚甲基蓝吸附量、阳离子交换容量的测定，由此可以确定复合的吸附性无机颗粒的固体成分浓度。

本发明中使用的细胞试样中包含的细胞只要是能够形成球状体的细胞即可，优选粘附性细胞。另外，细胞悬浮液中包含的细胞可以仅为一种，也可以包含两种以上的细胞。

吸附性无机颗粒的分散液与细胞悬浮液的混合液中的细胞数没有特别限制，可以考虑细胞种类、培养条件、球状体的使用目的等适当地设定。例如优选为1细胞/μL以上10000细胞/μL以下、更优选为10细胞/μL以上1000细胞/μL以下。

球状体的形成中使用的细胞没有特别限制，可以是由动物采集的细胞、对由动物采集的细胞进行培养而得到的细胞、对由动物采集的细胞实施各种处理而得到的细胞、培养细胞株等任一种细胞。作为细胞来源的动物的种类没有特别限定，例如优选使用人、猴、狗、猫、兔、猪、牛、小鼠、大鼠等哺乳类动物细胞。

所使用的细胞是由动物采集的细胞的情况下，作为可在本发明中使用的细胞，可以为上皮组织细胞、肌肉组织细胞、结缔组织细胞、神经组织细胞中的任一种。采集部位没有特别限定，可以是来自骨、肌肉、内脏、神经、脑、骨、皮肤、血液等的体细胞、生殖细胞、胚胎干细胞(ES细胞)等中的任一种细胞。另外，作为实施了各种处理而得到的细胞，可以举出诱导性多能干细胞细胞(iPS细胞)、分化诱导后的细胞。作为培养细胞株，可以由ATCC(美国典型培养物保藏中心，American Type Culture Collection)、ECACC(欧洲认证细胞培养物收藏中心，Europian Collection of Cell Cultures)等获得，也可以使用由临床组织采集的组织细胞的原代培养细胞。

可在本发明中使用的细胞可以是处于任何细胞周期的细胞，可以为未分化的细胞，也可以为分化后的细胞。另外，可以为正常的细胞，也可以是由癌组织等病理组织采集的细胞。

将细胞悬浮液与吸附性无机颗粒的分散液混合而得到的混合物中包含的细胞按照常规方法在球状体形成培养用容器内进行培养。

可在本发明中使用的培养用容器只要是粘附细胞用培养板、悬浮细胞用培养板等在常规的球状体培养法中用于细胞培养的容器的形态即可，关于材质、形状、尺寸没有特别限定。另外，从能够降低吸附性无机颗粒的用量的方面出发，更优选使用可抑制细胞-细胞间以外的粘附的容器、例如悬浮细胞用培养板。作为球状体形成培养用容器的材料，可以举出玻璃、不锈钢、塑料等，但并不限定于这些。作为球状体形成培养用容器，可以举出皿、管、烧瓶、瓶、板等，但并不限于这些。

可以在球状体形成培养用容器中进行用于实现支架的处理或操作。但是，如上所述，在分散液中也发挥出作为支架材料的功能的溶胀性层状硅酸盐等吸附性无机颗粒可以在不使用通常使用的支架材料的情况下进行培养，因而从抑制成本的方面出发是优选的。

球状体形成培养用容器内的培养条件只要是适合于所使用的细胞种类的环境即可，例如可以使用在所使用的细胞种类的培养中推荐的市售培养用培养基，设定为所使用的细胞种类的培养中推荐的温度条件等。另外，关于培养时间，也可以根据所使用的细胞种类、细胞数、目标球状体的尺寸而任意地设定。

例如，将溶胀性层状硅酸盐等吸附性无机颗粒的分散液与细胞悬浮液的混合物在适于细胞培养的环境下、例如在5％CO₂气氛中在37℃环境下保持任意时间。由此可迅速实现球状体的形成。

本发明的球状体形成用试剂盒包含以吸附性无机颗粒作为有效成分的球状体形成促进剂。本发明的球状体形成用试剂盒可以包含球状体形成培养用容器、用于制备溶胀性层状硅酸盐等吸附性无机颗粒的分散液的分散介质、用于制备细胞悬浮液的溶剂、球状体的形成所需要的血清成分、细胞培养用培养基等。通过像这样将促进球状体形成所需要的试剂、器具等制成试剂盒，能够更简便且在短时间内进行球状体形成。

实施例

以下基于实施例进一步详细地说明本发明，但本发明并不限于此。

需要说明的是，下述实施例中，在各种吸附性无机颗粒的中值径为纳米级的情况下，使用无机颗粒的0.1质量％水分散液，利用纳米颗粒分析装置(nano Partica SZ-100V2、堀场制作所制)测定中值径。另外，关于微米级的颗粒，使用激光衍射/散射式粒度分布测定装置(Partica LA-950V2、堀场制作所公司制造)测定中值径。

另外，关于BSA相对于无机颗粒的吸附量，相对于1mg/mL的BSA溶液1mL，分别添加0.2mL的1质量％吸附性无机颗粒的分散液、或者作为空白的蒸馏水，利用涡旋振荡器搅拌后，利用旋转器(MTR-103、AS-1公司制造)反应1小时，之后使用离心分离机使颗粒沉降，采集上清，利用Bradford法定量，与空白进行比较，由此对BSA吸附量进行定量。需要说明的是，1mg/mL的BSA溶液是通过将BSA(富士胶片和光纯药公司制造)粉末用蒸馏水溶解而制备的。另外，离心分离是利用高速离心机(CT15E、日立工机控股公司制造)在15000G下实施15分钟。上清中的BSA的定量通过使用TaKaRa Bradford蛋白检测试剂盒(Takara Bio公司制造)利用分光光度计(ASV11D-H、AS-1公司制造)测定595nm的吸光度来实施。关于吸附量，将由空白的BSA量减去无机颗粒分散液反应上清的BSA量所得到的值作为吸附性无机颗粒上的BSA吸附量。

(试验例1)使用溶胀性层状硅酸盐的3D细胞培养

[制备例1-1]

将氟化钠型锂蒙脱石(商品名：Sumecton-SWF、Kunimine Iindustries公司制造、以下也简称为“SWF”)100g投入到80质量％异丙醇水溶液(水/异丙醇＝20/80(质量比))2kg中。之后使用螺旋桨搅拌机(AS ONE公司制造)在25℃下以100rpm将混合物搅拌20分钟。将所得到的悬浮液用布氏漏斗抽滤，进行固液分离，得到脱水滤饼。对于所得到的滤饼，通过通入80质量％异丙醇水溶液(水/异丙醇＝20/80(质量比))2kg并过滤来进行清洗，反复进行2次同样的基于通液、过滤的清洗。回收清洗后的脱水滤饼，利用105℃的干燥机进行干燥，回收干燥后的粉末。

测定所得到的粉末的阳离子交换容量，结果为73.3meq/100g。之后使用自转公转混合器(Thinky公司制造)将该粉末与蒸馏水进行混合，得到锂蒙脱石的固体成分浓度为1质量％的分散液1。另外，分散液中的氟化钠型锂蒙脱石的中值径为42.1nm。此外，相对于氟化钠型锂蒙脱石1mg，BSA吸附量为388μg/mg。

[制备例1-2]

除了使用钠型锂蒙脱石粉末(商品名：Sumecton-SWN、Kunimine Iindustries公司制造、以下也简称为“SWN”)来代替氟化钠型锂蒙脱石粉末以外，与制备例1同样地得到锂蒙脱石的固体成分浓度为1质量％的分散液2。

所得到的粉末的阳离子交换容量为53.1meq/100g。另外，分散液中的钠型锂蒙脱石的中值径为71.0nm。此外，相对于钠型锂蒙脱石1mg，BSA吸附量为485μg/mg。

[3D细胞培养]

(1)培养基的制备-1

相对于作为细胞培养用培养基的RPMI-1640(富士胶片和光纯药公司制造、以下也简称为“RPMI”)、D-MEM(富士胶片和光纯药公司制造、以下也简称为“DMEM”)或者E-MEM(富士胶片和光纯药公司制造、以下也简称为“EMEM”)100质量份，添加FBS(Gibco公司制造)10质量份。使用该培养基来制备使用各种细胞并调整了细胞数的细胞悬浮液，将所得到的悬浮液100μL接种在96孔板(粘附细胞用培养板)(商品名：组织培养板VTC-P96、Violamo制造，以下也简称为“Violamo”)和悬浮细胞用培养板(商品名：未处理96孔微孔板、Iwaki制造，以下也简称为“Iwaki”))这两种板中。将接种在板中的细胞数示于表1～4。所使用的细胞为人胰腺癌细胞PANC-1株(以下也简称为“PANC-1”)、人肾脏癌细胞ACHN株(以下也简称为“ACHN”)、人神经胶质瘤(星形胶质细胞瘤)细胞U-251MG株(以下也简称为“U251MG”)、以及人膀胱癌细胞UMUC3(以下也简称为“UMUC3”)，这些细胞由美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得。

(2)培养基的制备-2

相对于作为细胞培养用培养基的D-MEM(富士胶片和光纯药公司制造)100质量份，混合FBS(Gibco公司制造)5质量份。使用该培养基来制备使用各种细胞并调整了细胞数的细胞悬浮液，将所得到的悬浮液100μL接种在96孔板(悬浮细胞用培养板)(商品名：未处理96孔微孔板、Iwaki制)中。将接种在板中的细胞数示于表4。所使用的细胞为人神经胶质瘤(glioma)细胞KNS-81株(以下也简称为“KNS81”)、人神经胶质母细胞瘤(glioblastoma)细胞LN-299株(以下也简称为“LN299”)，这些细胞由美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得。

(3)溶胀性层状硅酸盐的添加

相对于制备例1-1和1-2中制备的分散液1和2，使用灭菌水按照分别稀释至2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、128倍、256倍或512倍的方式制备分散液。相对于接种在96孔板中的细胞悬浮液100μL，添加分散液1和2、以及将它们进行稀释调整后的分散液(分别相当于1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.031、0.016、0.008、0.004、0.002w/v％)50μL。需要说明的是，培养时的培养基中的溶胀性层状硅酸盐的最终浓度分别为0.33、0.17、0.083、0.042、0.021、0.010、0.0052、0.0026、0.0013、0.00065w/v％。添加溶胀性层状硅酸盐后的板在37℃、5％CO₂气氛下在温箱中进行培养。

(4)球状体形成的评价

利用显微镜对培养后的板进行观察，确认有无形成球状体。

将有无形成球状体的结果示于表1～4中。需要说明的是，还一并示出了在不使用制备例1-1和1-2中制备的分散液的情况下进行3D细胞培养时的结果。关于表1～4的“培养后的细胞的状态”，“一维”是指观察到的细胞为以单独的球状存在的细胞。“二维”是指观察到的细胞为不定形地粘附在板上的以1层存在的细胞，未确认到球状体的形成。“三维”是指能够确认到球状体的形成。并且，“三维样”是指并非为完全的球状体状但存在一部分球状体样的细胞。

另外，使用悬浮细胞用培养板，在按照溶胀性层状硅酸盐的固体成分浓度为0.0052w/v％的方式分散有溶胀性层状硅酸盐的混合物中对人胰腺癌细胞PANC-1株或人肾脏癌细胞ACHN株进行3天培养，将示出培养后的细胞状态的显微镜照片示于图1(本发明例8)、图2(本发明例20)、图3(本发明例12)以及图4(本发明例24)中。此外，在不包含溶胀性层状硅酸盐的细胞悬浮液中对人胰腺癌细胞PANC-1株或人肾脏癌细胞ACHN株进行3天培养，将示出培养后的细胞状态的显微镜照片示于图5(参考例2)和图6(参考例4)中。

此外，在按照分散液2的溶胀性层状硅酸盐的固体成分浓度为0.0052w/v％的方式分散有溶胀性层状硅酸盐的混合物中对人胰腺癌细胞PANC-1株和人肾脏癌细胞ACHN株进行培养，将示出培养1天后、3天后及7天后的细胞的状态变化的显微镜照片分别示于图7和图8中。

表3

表4

不存在下溶胀性层状硅酸盐的情况下(参考例1～4)，即使进行3天细胞培养，也未形成球状体(参照图5和图6)。

与之相对，通过在溶胀性层状硅酸盐的存在下进行3D细胞培养(本发明例1～36)，在从培养开始起最短第1天、大致第3天左右形成了球状体(参照图1～4和图7、图8)。

这些结果表明，在3D细胞培养条件下分散在细胞悬浮液中的溶胀性层状硅酸盐可不受细胞种类限定地促进细胞的凝集或组织化，具有促进球状体形成的作用。此外，通过使用溶胀性层状硅酸盐，能够在不使用特殊的支架材料、培养容器或培养基的条件下制作球状体。

此外，由表1～4所示的结果也可知，在球状体的制作中，需要将混合物中的溶胀性层状硅酸盐的固体成分浓度设定在特定的范围内。

具体地说，在培养基中不添加溶胀性层状硅酸盐的条件下进行培养时，未确认到球状体的形成，所培养的细胞全部为单层细胞(参考例1和3)。另一方面，在混合物中的溶胀性层状硅酸盐的固体成分浓度过高的情况下，未形成纯粹的球状体(比较例1)、或者为不均匀的球状体样的状态(比较例2)。

与之相对，如本发明例1～36的结果所示，为了形成球状体，重要的是将分散在细胞悬浮液中的溶胀性层状硅酸盐的固体成分浓度设定在特定范围内。此外，如图7和图8所示，在培养开始的第二天观察到了球状体的形成(参照图7(a)和图8(a))，在培养开始后第3天、进而直至第7天确认到了球状体的成长(参照图7(b)和图7(c)、以及图8(b)和图8(c))。

(试验例2)使用各种吸附性无机颗粒的3D细胞培养

[制备例2-1]

将胶态二氧化硅(商品名：Snowtex ST-C、日产化学公司制造、固体成分浓度20.5质量％)与蒸馏水混合，得到1质量％的胶态二氧化硅分散液。

分散液中的胶态二氧化硅的中值径为45.9nm。此外，相对于胶态二氧化硅1mg，BSA吸附量为47μg/mg。

[制备例2-2]

将胶态二氧化硅(商品名：Snowtex ST-CXS、日产化学公司制造、固体成分浓度15质量％)与蒸馏水混合，得到1质量％的胶态二氧化硅分散液。

分散液中的胶态二氧化硅的中值径为45.5nm。此外，相对于胶态二氧化硅1mg，BSA吸附量为89μg/mg。

[制备例2-3]

将氧化铝水合物颗粒(商品名：Alumina Sol AS-200、日产化学公司制造、固体成分浓度10.6质量％)与蒸馏水混合，得到1质量％的氧化铝水合物分散液。

分散液中的氧化铝水合物颗粒的中值径为204.0nm。此外，相对于氧化铝水合物颗粒1mg，BSA吸附量为453μg/mg。

[制备例2-4]

将氧化铝水合物颗粒(商品名：Alumina Sol AS-520-A、日产化学公司制造、固体成分浓度21质量％)与蒸馏水混合，得到1质量％的氧化铝水合物分散液。

分散液中的氧化铝水合物颗粒的中值径为77.0nm。此外，相对于氧化铝水合物颗粒1mg，BSA吸附量为267μg/mg。

[制备例2-5]

将页硅酸盐矿物颗粒(商品名：Kaolin JP-100、竹原化学工业公司制造)与蒸馏水混合，得到1质量％的页硅酸盐矿物分散液。

分散液中的页硅酸盐矿物颗粒的中值径为5.4μm。此外，相对于页硅酸盐矿物颗粒1mg，BSA吸附量为23μg/mg。

[制备例2-6]

将页硅酸盐矿物颗粒(云母)(商品名：MK-100、Katakura&Co-op Agri公司制造)与蒸馏水混合，得到1质量％的页硅酸盐矿物分散液。

分散液中的页硅酸盐矿物颗粒的中值径为5.1μm。此外，相对于页硅酸盐矿物颗粒1mg，BSA吸附量为24μg/mg。

[3D细胞培养]

相对于RPMI(富士胶片和光纯药公司制造)100质量份，添加FBS(Gibco公司制造)10质量份，制备培养基。使用所得到的培养基，将制备例2-1～2-6中得到的分散液稀释，注入到96孔板(Iwaki)中。将人大肠癌细胞HT29株(以下也简称为“HT29”)按照1,000细胞/50μL接种在其中。HT29株由美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得。将接种细胞后的板在37℃、5％CO₂气氛下在温箱中培养4天。

利用荧光显微镜(商品名：Biozero、基恩士公司制造)对培养后的板进行观察，确认有无形成球状体。将其结果示于图9。

如图9所示，可知通过使用制备例2-1～2-6中得到的分散液也可形成球状体。

进一步改变制备例2-1～2-6中得到的分散液中所包含的各种无机颗粒的浓度进行球状体的形成，确定形成球状体的无机颗粒的固体成分浓度。

将其结果示于表5。

表5

由表5所示的结果可知，在球状体的制作中，需要将混合物中的各种无机颗粒的固体成分浓度设定在特定范围内。

(试验例3)使用各种吸附性无机颗粒的3D细胞培养

[制备例3-1]

将架状硅酸盐矿物颗粒(沸石)(商品名：Zeoal-ZSM-5、中村超硬公司制造、固体成分浓度32质量％)与蒸馏水混合，得到1质量％的架状硅酸盐分散液。

分散液中的架状硅酸盐矿物颗粒的中值径为248.5nm。此外，相对于架状硅酸盐矿物颗粒1mg，BSA吸附量为17μg/mg。

[制备例3-2]

将架状硅酸盐矿物颗粒(沸石)(商品名：HSZ-940NHA、东曹公司制造)与蒸馏水混合，得到1质量％的架状硅酸盐分散液。

分散液中的架状硅酸盐矿物颗粒的中值径为3.2μm。此外，相对于架状硅酸盐矿物颗粒1mg，BSA吸附量为34μg/mg。

[制备例3-3]

将氧化镁颗粒(商品名：KYOWAMAGMF-150、协和化学公司制造)与蒸馏水混合，得到1质量％的氧化镁分散液。

分散液中的氧化镁颗粒的中值径为6.6μm。此外，相对于氧化镁颗粒1mg，BSA吸附量为104μg/mg。

[制备例3-4]

将羟基磷灰石颗粒(商品名：SHAp、SofSera公司制造)与蒸馏水混合，得到1质量％的羟基磷灰石分散液。

分散液中的羟基磷灰石颗粒的中值径为7.0μm。此外，相对于羟基磷灰石颗粒1mg，BSA吸附量为17μg/mg。

[3D细胞培养]

相对于RPMI(富士胶片和光纯药公司制造)100质量份，添加FBS(Gibco公司制造)10质量份，制备培养基。使用所得到的培养基，将制备例3-1～3-4中得到的分散液稀释，注入到96孔板(Iwaki)中。将人肾脏癌细胞ACHN株按照1,000细胞/50μL接种在其中。将接种细胞后的板在37℃、5％CO₂气氛下在温箱中培养5天。

利用荧光显微镜(商品名：Biozero、基恩士公司制造)对培养后的板进行观察，确认有无形成球状体。将其结果示于图10。

如图10所示，可知通过使用制备例3-1～3-4中得到的分散液也可形成球状体。

(试验例4)无机颗粒吸附性的确认

为了明确由本发明形成的球状体中的吸附性无机颗粒的效果以及存在部位，在SWF上保持荧光标记物，对球状体的状态进行观察。

作为SWF的荧光标记物，将罗丹明6G(关东化学公司制造)溶解在蒸馏水中，制备成2mM的水溶液。相对于制备例1-1的分散液1000μL，加入蒸馏水500μL以及2mM罗丹明6G水溶液500μL，利用涡旋振荡混合器进行混合。使混合后的分散液通过注射器过滤器(孔径0.45μm)，得到在SWF上保持有罗丹明6G的复合颗粒(R6G-SWF)的分散液(0.5wt％R6G-SWF分散液)。

相对于DMEM(富士胶片和光纯药公司制造)100质量份，混合FBS(Gibco公司制造)10质量份，得到10％FBS/D-MEM培养基。使用该培养基对0.5wt％R6G-SWF分散液进行稀释，调整复合颗粒的浓度为0.02w/v％。进一步使培养基通过注射器过滤器(孔径5μm)，之后在96孔板(Iwaki制)中按照50μL/孔加入培养基。按照50μL/孔在其中接种利用10％FBS/D-MEM培养基调整的人大肠癌细胞SW620株(1000细胞/50μL)。SW620株由美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得。将接种细胞后的板在37℃、5％CO₂气氛下在温箱中进行培养。

从培养开始起第5天使用NucBlue Live ReadyProbes试剂(ThermoFisherScientific公司制造)进行核染色，将96孔板(Greiner Bio-One公司制造)中形成的球状体移出，使用共聚焦激光显微镜(Cell Voyager CV8000、横河电机公司制造、激发波长405nm-561nm、检测波长445/45nm-600/37nm、60倍)以0.3μm间隔进行Z-stack拍摄。基于所得到的数据利用分析软件(Cell Pathfinder、横河电机公司制造)制作MIP(最大密度投影，Maximum Intensity Projection)图像。

将其结果示于图11。

在所得到的MIP图像中，活细胞的核被染色成蓝色。在MIP图像中明确了形成球状体的细胞的存在部位。通过本发明，活细胞凝集、形成了球状体，被染色成红色的R6G-SWF分布在活细胞的周围。如此，通过使无机颗粒吸附在细胞表面，可促进球状体的形成。

另外，R6G-SWF在球状体中心部大量存在，由此可知，它们在球状体形成的初期存在于细胞表层，球状体自身向外侧增殖、生长。

根据上述结果，可将吸附性无机颗粒用作球状体形成促进剂的有效成分。此外，在3D细胞培养中，通过将分散在细胞悬浮液中的吸附性无机颗粒的固体成分浓度设定在特定范围，可不受细胞种类限定地促进细胞的凝集或组织化，能够简便且迅速地培养出球状体形态的细胞。

将本发明与其实施方式一起进行了说明，但申请人认为，只要没有特别指定，不应将本发明限定于说明的任何细节，应在不违反所附权利要求书所示的发明构思和范围的情况下进行广义解释。

本申请基于2020年3月19日在日本提交的日本特愿2020-049062要求优先权，在此将其作为参考并引用其内容作为本说明书记载的一部分。

Claims (18)

1.一种球状体形成促进剂，其以具有吸附性的无机颗粒作为有效成分。

2.如权利要求1所述的球状体形成促进剂，其中，所述无机颗粒是由选自硅酸盐、胶态二氧化硅、氧化铝水合物、碳酸盐、氧化镁、氢氧化镁、碳酸镁、硅酸镁、硅酸铝、氢氧化铝、氧化镁-氧化铝固溶体、水滑石以及羟基磷灰石中的至少一种无机物质构成的颗粒。

3.如权利要求1或2所述的球状体形成促进剂，其中，每1mg具有吸附性的所述无机颗粒的牛血清白蛋白吸附量为10μg以上500μg以下。

4.如权利要求1～3中任一项所述的球状体形成促进剂，其中，所述无机颗粒是由选自由蒙脱石、锂蒙脱石、硅镁石、皂石、贝得石、绿脱石、锌蒙脱石以及溶胀性云母组成的组中的至少一种溶胀性层状硅酸盐构成的颗粒。

5.如权利要求1～3中任一项所述的球状体形成促进剂，其中，所述无机颗粒是由选自由高岭石以及云母族组成的组中的至少一种页硅酸盐矿物构成的颗粒、或者是由选自由沸石族组成的组中的至少一种架状硅酸盐矿物构成的颗粒。

6.如权利要求1～3中任一项所述的球状体形成促进剂，其中，所述无机颗粒是由胶态二氧化硅构成的颗粒。

7.如权利要求1～3中任一项所述的球状体形成促进剂，其中，所述无机颗粒是由氧化铝水合物构成的颗粒。

8.一种球状体形成用试剂盒，其包含权利要求1～7中任一项所述的球状体形成促进剂。

9.一种球状体的制造方法，其中，将权利要求1～7中任一项所述的球状体形成促进剂的分散液与细胞悬浮液混合，得到所述球状体形成促进剂中包含的具有吸附性的无机颗粒发生了分散的混合物，对所得到的混合物中包含的细胞进行培养，形成球状体。

10.一种球状体的形成促进方法，其中，将权利要求1～7中任一项所述的球状体形成促进剂的分散液与细胞悬浮液混合，得到所述球状体形成促进剂中包含的具有吸附性的无机颗粒发生了分散的混合物，对所得到的混合物中包含的细胞进行培养，促进球状体的形成。

11.如权利要求9或10所述的方法，其中，

所述无机颗粒是由选自由蒙脱石、锂蒙脱石、硅镁石、皂石、贝得石、绿脱石、锌蒙脱石以及溶胀性云母组成的组中的至少一种溶胀性层状硅酸盐构成的颗粒，

所述混合物中的溶胀性层状硅酸盐的固体成分浓度为0.0003w/v％以上且小于0.333w/v％。

12.如权利要求9或10所述的方法，其中，

所述无机颗粒是由选自由高岭石以及云母族组成的组中的至少一种页硅酸盐矿物构成的颗粒，

所述混合物中的页硅酸盐矿物的固体成分浓度为0.001w/v％以上且小于0.333w/v％。

13.如权利要求9或10所述的方法，其中，

所述无机颗粒是由选自由沸石族组成的组中的至少一种架状硅酸盐矿物构成的颗粒，

所述混合物中的架状硅酸盐矿物的固体成分浓度为0.0005w/v％以上且小于0.333w/v％。

14.如权利要求9或10所述的方法，其中，

所述无机颗粒是由胶态二氧化硅构成的颗粒，

所述混合物中的胶态二氧化硅的固体成分浓度为0.0005w/v％以上且小于0.04w/v％。

15.如权利要求9或10所述的方法，其中，

所述无机颗粒是由氧化铝水合物构成的颗粒，

所述混合物中的氧化铝水合物的固体成分浓度为0.001w/v％以上且小于0.5w/v％。

16.如权利要求9～15中任一项所述的方法，其中，所述细胞是由动物采集的细胞、对由动物采集的细胞进行培养而得到的细胞、对由动物采集的细胞实施各种处理而得到的细胞、或者培养细胞株。

17.如权利要求9～16中任一项所述的方法，其中，所述细胞为哺乳类动物细胞。

18.如权利要求9～17中任一项所述的方法，其中，在悬浮细胞用培养板中培养所述细胞，形成球状体。

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