JP5578648B2 - スフェロイド形成促進剤 - Google Patents
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Description
非特許文献1に開示されるマウス肝臓を利用する技術では、そもそもプロテオグリカンの抽出が極めて困難であり、簡便に素材を得られないという問題点が存在する。また、特許文献1では、請求項4にいくつかの生物種が挙げられているが、どれが簡便に促進できる材料となりうるのか開示されていないという問題点がある。
本発明は、鳥取県にて水揚げされる魚類の新規利用を目的として、魚類由来のプロテオグリカンないしグルコサミノグリカンの抽出方法(本願出願人による特開2007−314458号)の関連研究において発見された知見に基づきなされた発明である。
まず、鳥取県で水揚げされる、ノロゲンゲ、ベランスカレイ、タナカゲンゲについて、その表皮体液にスフェロイド形成促進作用があるかを調べ、その後、他の魚種等について検討した。
まず、ノロゲンゲの魚皮と筋肉の間の間隙物質(粘液部分)をピペットで採取し、0.22μmのメンブランフィルターで濾過した。なお、遠心分離によってもこの体液を採取できることも別途確認した。この濾過液を、細胞培養液DMEM−10%FBSに1wt%〜10wt%添加し、肝臓ガン細胞HepG2細胞を72時間培養した。なお、添加の効果を見るため、無添加のものでも培養をおこなった。
次に、ベランスカレイ(ヒレグロカレイ)の皮を用いて実験をおこなった。ベランスカレイも粘膜質の体表皮を有するが、ノロゲンゲほど豊富には体液がないので、凍結融解による体液採取を試みた。皮25gを剥ぎ取って−40℃に凍結し、2週間後に解凍した。凍結融解時に出てくる液体、すなわちドリップは9.8g得られた。ドリップを遠心分離し、上澄み部分をメンブラン濾過した。濾過液をDMEM−10%FBSに0.5wt%〜10wt%添加し、HepG2細胞を70時間培養した。
次に、タナカゲンゲの皮を用いて実験をおこなった。なお、タナカゲンゲも表皮に特有のヌメリがある。まず、皮(若干の筋肉組織を含む)117gを凍結融解し、ドリップ24.5gを得た。これを遠心分離し、上澄み部分をメンブランフィルターで濾過滅菌をおこなった。濾過液をDMEM−10%FBSに0.3wt%〜10wt%添加し、HepG2細胞を72時間培養した。
次に、実験1〜3と同様な表皮性状を有する沖キス(ニギス)の全体、ハタハタの全体、エイ(可食部すなわちヒレ部分の切り身)、タラ(皮のみ。ただし、若干の筋肉組織を含む)を用いて実験をおこなった。また、マグロ(肝臓のみ。すりつぶすことなどせず、そのまま冷凍)を用いて実験をおこなった。実験は、材料それぞれを凍結融解してドリップを取り出し、遠心分離後、上澄み部分をメンブランフィルター滅菌した。この濾過液をDMEM−10%FBSに1wt%、3wt%、5wt%、10wt%添加し、HepG2細胞のスフェロイド化を観察した。
(表1)
△△:スフェロイド微妙であって細胞死を含む状態
△:スフェロイド判定微妙
×:スフェロイドなし
次に、実験例5で用いたドリップをエーテル処理して脱脂し遠心分離して脂質部分を除去した液分で実験をおこなった。なお、エーテル分については、臭いが抜けるまで、アスピレーターで揮発させた。3日培養のものと、14日培養のものの結果を、それぞれ、表2および3に示す。
○:スフェロイド明瞭
△△:スフェロイド微妙であって細胞死を含む状態
△:スフェロイド判定微妙
×:スフェロイドなし
○:スフェロイド明瞭
△△:スフェロイド微妙であって細胞死を含む状態
△:スフェロイド判定微妙
×:スフェロイドなし
次に、鳥取県で水揚げされる、イカ・タコの頭足類から得られる体液にスフェロイド形成促進作用があるかを調べた。
イカの内臓(主に肝臓)76gを−40℃に冷凍し、8日後に解凍して3gのドリップを得た。これを遠心分離して固形物を除去した。液体分を二つに分け、一つはそのまま、もう一つはエーテル処理して脱脂し遠心分離して脂質部分を除去した液分で実験をおこなった。なお、後者については、臭いが抜けるまで、アスピレーターでエーテル分を揮発除去した。
次に、イカ(全体)の凍結融解液の効果を確認した。イカ212gから凍結融解により3.2gのドリップを得、遠心分離後上澄みをメンブランフィルター滅菌した。この液を同様に3wt%〜10wt%添加した結果を図6に示す(72時間培養)。10wt%添加では細胞死も同時に起こっており、3wt%〜5wt%の添加でスフェロイド化が生じていることがわかる。
イカのドリップでスフェロイド化することがわかったので、タコのドリップを検討することとした。タコの胴部(俗に頭と称される)可食部(筋肉および皮)97g並びに肝臓76gを凍結融解して、それぞれ5.3g並びに9.9gのドリップを得た。遠心分離した上澄みをメンブランフィルター滅菌した。このドリップを0.3wt〜10wt%培養液に添加し、HepG2細胞のスフェロイド化を観察した。また、凍結融解させないで胴内から採取できる体液を掻き出し、同様に培養実験をおこなった。
(表4)
○:スフェロイド
△:スフェロイド判定微妙
×:スフェロイドなし
Claims (3)
- 粘膜質の体表皮を有する、ゲンゲ、カレイ、エイ、または、ニギスの、表皮から筋肉組織までの部位より採取された体液を用いたことを特徴とするスフェロイド形成促進剤。
- 前記体液が、前記部位を圧搾もしくは遠心分離して得られる体液、または、前記部位を凍結融解によるドリップとして得られる体液であることを特徴とする請求項1に記載のスフェロイド形成促進剤。
- 採取後に脂質を除去した体液を用いたことを特徴とする請求項1または2に記載のスフェロイド形成促進剤。
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