CN110499283A - Wnt信号通路激活剂在制备改善低碱性磷酸酯酶症干细胞成骨分化能力异常产品中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种Wnt信号通路激活剂在制备改善低碱性磷酸酯酶症干细胞成骨分化能力异常产品中的应用。细胞实验揭示低碱性磷酸酯酶症牙髓干细胞成骨分化能力下降，细胞内经典Wnt信号通路关键调控因子受到抑制，利用经典Wnt信号通路的激活剂LiCl作用于成骨分化能力异常的牙髓干细胞，改善了成骨分化能力异常的牙髓干细胞分化特性。

Description

Wnt信号通路激活剂在制备改善低碱性磷酸酯酶症干细胞成 骨分化能力异常产品中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及Wnt信号通路激活剂在制备改善低碱性磷酸酯酶症干细胞成骨分化能力异常产品中的应用。
背景技术
低碱性磷酸酯酶症(Hypophosphatasia，HPP)是由于肝/骨/肾型碱性磷酸酶基因（ALPL）突变导致其编码的组织非特异性碱性磷酸酶（tissue-nonspecificalkalinephosphatase，TNAP）蛋白活性缺陷造成的骨骼及牙齿骨量下降的遗传性疾病。低碱性磷酸酯酶症发病率高，轻中度为4/1000，重度为1/100000，重者可出现骨骼畸形、高钙血症、严重癫痫及出现呼吸系统并发症导致围产期死亡，严重威胁着人类的健康和生存质量。目前，临床治疗低碱性磷酸酯酶症主要围绕如何减少患者骨量丢失和防止癫痫发生，如：利用特立帕肽结合维生素B6 治疗。现有的治疗方案仅能减缓HPP 发病的时间，不能有效逆转骨量减少的事实，因此不能从根本上解决骨形成和骨再生缺陷这一首要问题。
间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC）是一种具有自我更新和多向分化潜能的成体干细胞，这种干细胞在治疗骨组织、软骨、牙周及神经等组织缺损再生过程发挥重要作用。骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）是从骨髓组织中分离培养的具有向成骨细胞细胞、成软骨细胞、脂肪肪细胞和成纤维细胞等多向分化潜能的干细胞，与骨组织发育和骨组织损伤修复密切相关。低碱性磷酸酯酶症患者体内的间充质干细胞由于ALPL突变可能导致细胞增殖、凋亡和多向分化潜能出现异常，导致使个体的骨骼系统和牙齿发育出现异常。我们研究团队发现低碱性磷酸酯酶症患者的骨髓间充质干细胞成骨细胞分化能力减弱，相反成脂肪细胞分化能力加强，这与低碱性磷酸酯酶症患者骨质下降密切相关。因此，以低碱性磷酸酯酶症患者的间充质干细胞作为寻找治疗低碱性磷酸酯酶症疾病药物的模型，筛选出有效改善或恢复低碱性磷酸酯酶症患者的间充质干细胞分化能力，为临床上治疗低碱性磷酸酯酶症提供方法。
发明内容
本发明针对现有技术存在的问题，提供了Wnt信号通路激活剂在制备改善低碱性磷酸酯酶症干细胞成骨分化能力异常产品中的应用。本发明利用经典Wnt信号通路的激活剂LiCl作用于分化能力异常的干细胞，改善了分化能力异常的干细胞成骨分化特性。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明第一方面，提供了Wnt信号通路激活剂在制备改善低碱性磷酸酯酶症干细胞成骨分化能力异常产品中的应用。
优选地，所述经典Wnt信号通路激活剂为LiCl。
本发明第二方面，提供一种产品，包含治疗有效量的LiCl。所述产品为LiCl注射液，或含LiCl的细胞培养液。
本发明第三方面，提供了LiCl在制备细胞成骨诱导液中的应用。
优选地，所述细胞成骨诱导液包含8-12mM LiCl、8-15nmol/L地塞米松、5-15mmol/Lβ-甘油磷酸钠、 0.05-0.1g/L维生素C、0.5-2%青霉素-链霉素、2.5-10% 胎牛血清，余量为α-MEM培养基。
优选地，所述细胞成骨诱导液包含10mM LiCl、10nmol/L地塞米松、10mmol/Lβ-甘油磷酸钠、 0.05g/L维生素C、1%青霉素-链霉素和5%胎牛血清，余量为α-MEM培养基。
本发明第四方面，提供了LiCl在制备治疗干细胞成骨分化能力异常药物中的应用。
本发明第五方面，提供了LiCl在制备治疗牙硬组织矿化异常药物中的应用。
本发明第六方面，提供了LiCl在体外诱导干细胞成骨分化能力的应用。
本发明第七方面，提供了LiCl在调控干细胞中p-GSK3β和/或active-β-catenin水平的应用。
优选地，所述干细胞为骨髓间充质干细胞或牙髓干细胞。
本发明第八方面，提供了一种激活Wnt信号通路的方法，包含以下步骤：
1）获取成骨分化能力异常的干细胞；
2）使用含LiCl的试剂诱导培养所述成骨分化能力异常的干细胞，持续培养3周以上。
本发明第九方面，提供了一种调控干细胞中p-GSK3β或active-β-catenin水平的方法，包含以下步骤：
1）获取成骨分化能力异常的干细胞；
2）使用含LiCl的试剂诱导培养所述成骨分化能力异常的干细胞，持续培养3周以上。
优选地，所述成骨分化能力异常的干细胞来源于低碱性磷酸酯酶症患者牙齿或从临床上废弃的低碱性磷酸酯酶症患者骨髓组织中分离的间充质干细胞。
优选地，步骤1）中，包含成骨分化能力异常的干细胞经体外扩增培养的过程，所述体外扩增培养为贴壁培养，并传代培养3-5代。
优选地，上述含LiCl的试剂为含8-12mM LiCl的生理盐水或含LiCl的细胞成骨诱导液。
优选地，上述细胞成骨诱导液包含8-12mM LiCl、8-15nmol/L地塞米松、5-15mmol/Lβ-甘油磷酸钠、 0.05-0.1g/L维生素C、0.5-2%青霉素-链霉素、2.5-10% 胎牛血清，余量为α-MEM培养基。
上述分化能力异常的离体牙髓干细胞可为基因突变发生于ALPL基因编码区的任一单个位点或多个位点突变所致碱性磷酸酯酶活力缺陷。本发明的实施例中，上述所用的分化能力异常的离体牙髓干细胞包含2个突变位点的ALPL基因。
上述分化能力异常的离体牙髓干细胞的特征体现在：与正常离体牙髓干细胞相比，细胞的成骨细胞分化能力减弱、细胞内经典Wnt信号通路异常。
本发明的实验证明，低碱性磷酸酯酶症的骨髓间充质干细胞或牙髓干细胞骨向分化能力减弱，细胞内经典Wnt信号通路受到抑制，本发明采用LiCl持续作用于分化能力异常的骨髓间充质干细胞或牙髓干细胞，通过改善细胞经典Wnt信号通路促进分化能力异常的骨髓间充质干细胞或牙髓干细胞向成骨细胞的分化能力；而且本方法采用了一种常见的成本低廉的小分子化合物LiCl，具有简单、高效的特点，实现了改善低碱性磷酸酯酶症分化能力异常的骨髓间充质干细胞货牙髓干细胞的成骨分化能力，为临床上治疗低碱性磷酸酯酶症患者成骨分化能力异常或牙齿矿化异常提供潜在的治疗策略。
附图说明
图1A为正常间充质干细胞形态观察示意图；
图1B为疾病间充质干细胞形态观察示意图；
图2A为ALP染色后正常间充质干细胞成骨分化能力检测示意图；
图2B为ALP染色后疾病间充质干细胞成骨分化能力检测示意图；
图3A为茜素红染色后正常间充质干细胞成骨分化能力检测示意图；
图3B为茜素红染色后疾病间充质干细胞成骨分化能力检测示意图；
图4为间充质干细胞成骨分化能力基因RUNX2、SP7表达检测对照图；
图5为间充质干细胞成骨分化相关基因RUNX2、SP7在mRNA和蛋白水平检测对照图；
图6A为油红O染色后正常间充质干细胞成脂肪分化能力检测示意图；
图6B为油红O染色后疾病间充质干细胞成脂肪分化能力检测示意图；
图7为间充质干细胞成脂肪分化能力相关基因PPAR-γ、LPL表达检测对照图；
图8为间充质干细胞成脂肪分化能力基因PPAR-γ、LPL在mRNA和蛋白水平检测对照图；
图9-图10为间充质干细胞的细胞内经典Wnt信号通路检测示意图；
图11A-图12为LiCl对低碱性磷酸酯酶症分化能力异常的间充质干细胞的形态和细胞毒性检测示意图；
图13A-13B为LiCl对低碱性磷酸酯酶症分化能力异常的间充质干细胞的经典Wnt信号通路恢复检测对照示意图；
图14A为进行ALP染色后正常间充质干细胞的成骨分化能力检测示意图；
图14B为进行ALP染色后疾病间充质干细胞的成骨分化能力检测示意图；
图14C为进行ALP染色后LiCl对低碱性磷酸酯酶症分化能力异常的间充质干细胞的成骨分化能力恢复检测示意图；
图15A为进行茜素红染色后正常间充质干细胞的成骨分化能力检测示意图；
图15B为进行茜素红染色后疾病间充质干细胞的成骨分化能力检测示意图；
图15C为进行茜素红染色后LiCl对低碱性磷酸酯酶症分化能力异常的间充质干细胞的成骨分化能力恢复检测示意图；
图16为间充质干细胞成骨分化能力基因RUNX2、SP7表达检测对照图；
图17为间充质干细胞成骨分化相关基因RUNX2、SP7在mRNA和蛋白水平检测对照图；
图18A为正常间充质干细胞的成脂肪分化能力恢复检测示意图；
图18B为疾病间充质干细胞的成脂肪分化能力恢复检测示意图；
图18C为LiCl对低碱性磷酸酯酶症分化能力异常的间充质干细胞的成脂肪分化能力恢复检测示意图；
图19为间充质干细胞成脂肪分化能力相关基因PPAR-γ、LPL表达检测对照图；
图20为间充质干细胞成脂肪分化能力相关基因PPAR-γ、LPL在mRNA和蛋白水平检测对照图；
图21为本发明实施例2中牙髓干细胞成骨分化能力相关基因RUNX2、SP7表达检测对照图；
图22为本发明实施例2中牙髓干细胞成骨分化能力相关基因PPAR-γ、LPL在mRNA和蛋白水平检测对照图；
图23A为本发明实施例2中进行茜素红染色后正常牙髓干细胞的成骨分化能力检测示意图；
图23B为本发明实施例2中进行茜素红染色后患病牙髓干细胞的成骨分化能力检测示意图；
图24A为本发明实施例2中进行茜素红染色后正常牙髓干细胞的矿化结节数量检测示意图；
图24B为本发明实施例2中进行茜素红染色后患病牙髓干细胞的矿化结节数量检测示意图；
图25为本发明实施例2中牙髓干细胞的细胞内经典Wnt信号通路检测示意图；
图26为本发明实施例2中牙髓干细胞成骨分化能力相关基因RUNX2、SP7表达检测对照图；
图27为本发明实施例2中牙髓干细胞成骨分化能力相关基因RUNX2、SP7在mRNA和蛋白水平检测对照图；
图28A为本发明实施例2中茜素红染色后的患者牙髓干细胞成骨分化能力检测示意图；
图28B为本发明实施例2中茜素红染色后的LiCl对低碱性磷酸酯酶症分化能力异常的牙髓干细胞成骨分化能力恢复检测示意图；
图29A为本发明实施例2中茜素红染色的患病牙髓干细胞矿化结节数量检测示意图；
图29B为本发明实施例2中茜素红染色的LiCl对低碱性磷酸酯酶症分化能力异常的牙髓干细胞矿化结节数量恢复检测示意图；
图30为本发明实施例2中牙髓干细胞经典Wnt信号通路改善示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行详细地描述。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明实施例用到的主要试剂如下：
（1）临床上废弃的低碱性磷酸酯酶症患者骨髓组织；
（2）临床上废弃的低碱性磷酸酯酶症患者牙齿；
（3）Percoll分离液(美国Pharmacia , S17-0891-01)；
（4）PBS缓冲液购自北京康为世纪生物科技有限公司(CW0040S)；
（5）α-MEM培养基购自美国gibco公司(11900-024)；
（6）LiCl购自Sigma公司。
（7）本发明实施例中细胞成骨诱导液可以按如下方法配制:含10nmol/L地塞米松、10mmol/Lβ-甘油磷酸钠、0 .05g/L维生素C、1%青霉素-链霉素、5% 胎牛血清的α-MEM培养基。
（8）本实施例的细胞成脂肪诱导液可以按如下方法配制：60uM吲哚美辛、0 .5mM3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、10ug/mL胰岛素、0 .1mM维生素C、0 .5uM氢化可的松、1%青霉素-链霉素、5% 胎牛血清的α-MEM培养基。
（9）本发明实施例中胰酶消化液按如下方法配制：将胰酶溶于pH值为7 .4的PBS缓冲液，配置成质量百分含量为0.25%的胰酶消化液。
本发明实施例中基因表达采用实时荧光定量PCR法检测，实施按如下方法进行：利用 TRIzol(TaKaRa)提取细胞总RNA，应用TaKaRa公司PrimeScriptTMRT Master Mix(RR036A) 试剂盒将RNA反转录成cDNA；采用TaKaRa公司SYBR Premix Ex Taq II RR820A试剂盒在 BIO-RAD CFX96 Real-time System进行实时荧光定量PCR反应。反转录反应：37℃5min， 85℃5s；实时荧光定量PCR反应：95℃预变性3min，95℃变性15s，60℃退火60s，40个循 环进行PCR扩增。GAPDH作为内参,采用△△Ct方法进行分析。PCR采用的引物见表1
表1实时定量PCR引物列表
本发明实施例中蛋白表达采用免疫印迹法法检测，实施按如下方法进行：采用碧云天的蛋白 质免疫印迹法及免疫共沉淀细胞裂解液(P0013)裂解细胞提取细胞总蛋白，碧云天聚氰基丙烯 酸正丁酯蛋白浓度测定试剂盒(P0012S)进行蛋白定量；采用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行蛋白分 离，采用湿转方法200毫安2h将蛋白转移至聚偏氟乙烯膜，室温5％BSA封闭1h，抗体孵育 4℃过夜，二抗37℃孵育2h，采用化学发光法在天能化学发光仪检测。抗体具体稀释浓度： Runx2(1:1000，Abcam)，SP7(1:1000，Abcam),PPAR-γ(1:500，Abcam)，LPL(1:500，Santa Cruz Biotechnology)，RANKL(1:1000，Abcam)，GSK-3β(1:1000，Abcam)，p-GSK-3(1:1000， Abcam)，β-catenin(1:1000，Abcam)，active-β-catenin(1:500，Millipor)andβ-actin(1:4000， Abcam)
本发明实施例中ALP染色采用碧云天碱性磷酸酶染色试剂盒进行染色。
本发明实施例中茜素红染色检测，按如下方法进行：细胞用4%多聚甲醛固定20min，PBS洗涤2次，1%茜素红染色37℃孵育30min，双蒸馏水洗涤2次，相机拍照。
本发明实施例中油红O染色检测，实施按如下方法进行：细胞用4%多聚甲醛固定20min，PBS洗涤2次，加入油红O工作液室温染色10min，PBS洗涤2次，显微镜下拍照。
实施例1
一、低碱性磷酸酯酶症分化能力异常的间充质干细胞的获取及检测
1.低碱性磷酸酯酶症分化能力异常的间充质干细胞的获取
将临床上废弃的患者骨髓组织利用Percoll分离液进行白膜层细胞分离。步骤如下：将稀释好的Percoll分离液与骨髓样本混匀，2000rpm离心20min；离心后液体出现分层，用枪吸取白膜层细胞至新的离心管中，加入PBS缓冲液洗涤，1000rpm离心10min；离心后弃掉上清液再次用PBS缓冲液洗涤细胞，8000rpm离心5min；离心后用细胞培养液悬浮细胞 ,接种至含有5-10%的胎牛血清的α-MEM培养基中贴壁培养，培养环境为：CO2浓度为5%，O2浓度为20%，温度为37℃的加湿细胞培养箱。每次传代时间为2-3天，得到3-5代的分化能力异常的间充质干细胞。
2.低碱性磷酸酯酶症分化能力异常的间充质干细胞分化能力的检测
1)贴壁后低碱性磷酸酯酶症分化能力异常的间充质干细胞形态观察
将正常和低碱性磷酸酯酶症疾病来源的3代间充质干细胞用胰酶消化后细胞计数以5×104接种在12孔板中培养12h，第二天普通光学显微镜10×物镜观察:结果如图1A-图1B所示，图1A为为正常间充质干细胞形态观察示意图，图1B为为疾病来源的间充质干细胞形态观察示意图。从结果中可以看出正常和疾病来源的间充质干细胞的都呈现多角的菱形细胞形状，细胞大小并无显著变化。
2)贴壁后低碱性磷酸酯酶症分化能力异常的间充质干细胞成骨分化能力检测
将正常和低碱性磷酸酯酶症疾病来源的3代间充质干细胞用胰酶消化后细胞计数分别以5×104和2×105接种到12孔板和6孔板中培养，培养至显微镜下观察细胞融合度达到90%以上，利用细胞成骨诱导液向成骨细胞方向诱导分化，成骨诱导分化1周进行ALP染色、成骨分化相关基因mRNA和蛋白水平检测；成骨诱导分化3周进行茜素红染色。结果如图2A-图3B显示，图2A为ALP染色后正常间充质干细胞成骨分化能力检测示意图；图2B为ALP染色后疾病间充质干细胞成骨分化能力检测示意图；图3A为茜素红染色后正常间充质干细胞成骨分化能力检测示意图；图3B为茜素红染色后疾病间充质干细胞成骨分化能力检测示意图。可以看出，低碱性磷酸酯酶症分化能力异常的间充质干细胞的ALP染色和矿化结节数量较正常对照组明显减少；基因表达检测结果如图4-图5显示，图4为间充质干细胞成骨分化能力基因RUNX2、SP7表达检测对照图；图5为间充质干细胞成骨分化相关基因RUNX2、SP7在mRNA和蛋白水平检测对照图。可以看出，成骨分化相关基因RUNX2、SP7在mRNA和蛋白水平上显著下降。
3)贴壁后低碱性磷酸酯酶症分化能力异常的间充质干细胞成脂肪分化能力检测
采用2)中同样的方法接种细胞，待细胞融合度达到95%以上，利用成脂肪诱导液向脂肪细胞方向分化，成脂肪诱导分化1周进行成脂肪分化相关基因mRNA和蛋白水平检测；使用细胞成脂肪诱导液成脂肪诱导分化3周进行油红O染色。油红O染色结果如图6A显示，图6A为油红O染色后正常间充质干细胞成脂肪分化能力检测示意图。可以看出，低碱性磷酸酯酶症分化能力异常的间充质干细胞较正常对照组相比，其油红O染色阳性的含脂滴细胞增多；基因表达检测结果如图7-图8显示，图7为间充质干细胞成脂肪分化能力相关基因PPAR-γ、LPL表达检测对照图；图8为间充质干细胞成脂肪分化能力基因PPAR-γ、LPL在mRNA和蛋白水平检测对照图。可以看出，成脂肪分化相关基因PPAR-γ、LPL在mRNA和蛋白水平上显著上升。
3.低碱性磷酸酯酶症分化能力异常的间充质干细胞的细胞内经典Wnt信号通路检测
将正常和低碱性磷酸酯酶症疾病来源的3-5代间充质干细胞消化后细胞计数以2×105接种在6孔板中培养48h，提取总RNA和蛋白进行经典Wnt通路中关键调控因子和下游靶基因表达。信号通路相关结果如图9-图10显示，图9-图10为间充质干细胞的细胞内经典Wnt信号通路检测示意图。可以看出，低碱性磷酸酯酶症分化能力异常的间充质干细胞的细胞内p-GSK3β、active-β-catenin水平显著下降，同时下游靶基因c-Myc、RUNX2、CyclinD表达减少，以上结果提示分化能力异常的间充质干细胞经典Wnt信号通路受到抑制。
二、恢复低碱性磷酸酯酶症分化能力异常的间充质干细胞分化能力
1.LiCl对低碱性磷酸酯酶症分化能力异常的间充质干细胞的形态和细胞毒性检测
将正常和低碱性磷酸酯酶症疾病来源的3-5代间充质干细胞消用胰酶化后细胞计数分别以5×104和3×103接种在12孔板中培养12h，和96孔板中培养1、3、5、7天，贴壁后第1天加入10mM LiCl，培养24h普通光学显微镜10×物镜观察细胞形态变化，第1、3、5、7天利用MTT方法检测LiCl对细胞的增殖活性影响。形态学观察结果如图11A-图11B显示，图11A-图11B为LiCl对低碱性磷酸酯酶症分化能力异常的间充质干细胞的形态和细胞毒性检测示意图。可以看出，LiCl对低碱性磷酸酯酶症分化能力异常的间充质干细胞并无明显影响，MTT实验如图12显示，LiCl对两种间充质干细胞的细胞增殖并无显著毒副作用。
2.LiCl对低碱性磷酸酯酶症分化能力异常的间充质干细胞的分化能力恢复检测
1) LiCl对低碱性磷酸酯酶症分化能力异常的间充质干细胞的经典Wnt信号通路恢复检测
将正常和低碱性磷酸酯酶症疾病来源的3-5代间充质干细胞消化后细胞计数分别以2×105以合适密度接种在6孔板中培养12h，然后向低碱性磷酸酯酶症疾病来源的3-5代间充质干细胞加入10mM LiCl培养24h，提取总RNA和蛋白检测经典Wnt通路中关键调控因子和下游靶基因表达。结果如图13A-13B显示，图13A-13B为LiCl对低碱性磷酸酯酶症分化能力异常的间充质干细胞的经典Wnt信号通路恢复检测对照示意图。可以看出，LiCl处理后的低碱性磷酸酯酶症分化能力异常的间充质干细胞的细胞内p-GSK3β、active-β-catenin水平显著上升，同时下游靶基因c-Myc、RUNX2、Cyclin D表达增加，提示分化能力异常的间充质干细胞经典Wnt信号通路激活。
2) LiCl对低碱性磷酸酯酶症分化能力异常的间充质干细胞的成骨分化能力恢复检测
将正常和低碱性磷酸酯酶症疾病来源的3代间充质干细胞消化后细胞计数分别以5×104和2×105接种到12孔板和6孔板中培养，培养至显微镜下观察细胞融合度达到90%以上向成骨细胞诱导分化，成骨诱导分组为：正常组、疾病组和疾病+LiCl组，正常组和疾病组使用未添加LiCl的细胞成骨诱导液进行诱导，疾病+LiCl组使用添加有LiCl的成骨诱导液进行诱导。诱导期间每3天更换新鲜成骨诱导液；待成骨诱导分化1周进行ALP染色、成骨分化相关基因mRNA和蛋白水平检测；待成骨诱导分化3周进行茜素红染色。结果如图14A-图17显示，图14A为进行ALP染色后正常间充质干细胞的成骨分化能力检测示意图；图14B为进行ALP染色后疾病间充质干细胞的成骨分化能力检测示意图；图14C为进行ALP染色后LiCl对低碱性磷酸酯酶症分化能力异常的间充质干细胞的成骨分化能力恢复检测示意图；图15A为进行茜素红染色后正常间充质干细胞的成骨分化能力检测示意图；图15B为进行茜素红染色后疾病间充质干细胞的成骨分化能力检测示意图；图15C为进行茜素红染色后LiCl对低碱性磷酸酯酶症分化能力异常的间充质干细胞的成骨分化能力恢复检测示意图；图16为间充质干细胞成骨分化能力基因RUNX2、SP7表达检测对照图；图17为间充质干细胞成骨分化相关基因RUNX2、SP7在mRNA和蛋白水平检测对照图。可以看出，疾病+LiCl组相比疾病组，其ALP染色和矿化结节数量明显增加，成骨分化相关基因RUNX2、SP7在mRNA和蛋白水平上显著升高。提示LiCl具有恢复低碱性磷酸酯酶症分化能力异常的间充质干细胞成骨分化能力。
3) LiCl对低碱性磷酸酯酶症分化能力异常的间充质干细胞的成脂肪分化能力恢复检测
采用上述2)中同样的方法接种细胞，待细胞融合度达到95%以上向脂肪细胞方向分化，成脂肪诱导分组为：正常组、疾病组和疾病+LiCl组，正常组和疾病组使用未添加LiCl的细胞成脂肪诱导液进行诱导，疾病+LiCl诱导组使用添加有LiCl的成脂肪诱导液进行诱导。诱导期间每3天更换新鲜细胞成脂肪诱导液；待成脂肪诱导分化1周进行成脂肪分化相关基因mRNA和蛋白水平检测；待成脂肪诱导分化3周进行油红O染色。结果如图18A-图20显示，图18A为正常间充质干细胞的成脂肪分化能力恢复检测示意图；图18B为疾病间充质干细胞的成脂肪分化能力恢复检测示意图；图18C为LiCl对低碱性磷酸酯酶症分化能力异常的间充质干细胞的成脂肪分化能力恢复检测示意图；图19为间充质干细胞成脂肪分化能力相关基因PPAR-γ、LPL表达检测对照图；图20为间充质干细胞成脂肪分化能力相关基因PPAR-γ、LPL在mRNA和蛋白水平检测对照图。可以看出，疾病+LiCl组相比疾病组，其油红O染色阳性的含脂滴细胞数量明显减少，且成脂肪分化相关基因PPAR-γ、LPL在mRNA和蛋白水平上显著下降。提示LiCl具有抑制低碱性磷酸酯酶症分化能力异常的间充质干细胞成脂肪分化的能力。
实施例2
一、低碱性磷酸酯酶症分化能力异常的间充质干细胞的获取及检测
1.低碱性磷酸酯酶症分化能力异常的间充质干细胞的获取
收集临床上废弃的患者牙齿，将牙齿在超净工作台中去除牙体表面的结缔组织，用含有双抗的PBS反复冲洗数次，用锤子将牙齿砸碎并分离出牙髓组织至适当的完全培养基，用枪轻轻吹打使牙髓组织分散呈小细胞团块或均一的单细胞悬液，在含有5-10%的胎牛血清的α-MEM培养基(gibco，11900-024)中贴壁培养，每次传代时间为2-3天，得到1-5代的分化能力异常的牙髓干细胞。培养环境为：CO2浓度为5%，O2浓度为20%，温度为37℃的加湿细胞培养箱。每次传代时间为2-3天，得到1-5代的分化能力异常的牙髓干细胞。
2.低碱性磷酸酯酶症分化能力异常的牙髓干细胞成骨分化能力的检测
将正常和低碱性磷酸酯酶症疾病来源的5代牙髓干细胞用胰酶消化后细胞计数分别以2×105接种到6孔板中培养，培养至显微镜下观察细胞融合度达到90%以上，利用细胞成骨诱导液向成骨细胞方向分化,成骨诱导分化1周进行成骨分化相关基因mRNA和蛋白水平检测；成骨诱导分化3周进行茜素红染色。基因表达检测结果如图21-图22显示，图21为本发明实施例2中牙髓干细胞成骨分化能力相关基因RUNX2、SP7表达检测对照图；图22为本发明实施例2中牙髓干细胞成骨分化能力相关基因PPAR-γ、LPL在mRNA和蛋白水平检测对照图。可以看出，成骨分化相关基因RUNX2、SP7在mRNA和蛋白水平上显著下降。茜素红染色结果如图，低碱性磷酸酯酶症分化能力异常的牙髓干细胞的矿化结节数量较正常对照组明显减少。
3.低碱性磷酸酯酶症分化能力异常的牙髓干细胞的细胞内经典Wnt信号通路检测
将正常和低碱性磷酸酯酶症疾病来源的5代牙髓干细胞消化后细胞计数以2×105接种在6孔板中培养48h，提取总RNA和蛋白进行经典Wnt通路中关键调控因子。信号通路相关结果如图25显示，图25为本发明实施例2中牙髓干细胞的细胞内经典Wnt信号通路检测示意图。可以看出，低碱性磷酸酯酶症分化能力异常的牙髓干细胞的细胞内p-Gsk3β、active-β-catenin水平显著下降提示分化能力异常的牙髓干细胞经典Wnt信号通路受到抑制。
二、改善牙低碱性磷酸酯酶症分化能力异常的牙髓干细胞分化能力
1.LiCl对低碱性磷酸酯酶症分化能力异常的牙髓干细胞的经典Wnt信号通路改善检测
将正常和低碱性磷酸酯酶症疾病来源的5代牙髓干细胞消化后细胞计数分别以2×105以合适密度接种在6孔板中培养12h，然后向低碱性磷酸酯酶症分化能力异常的牙髓干细胞加入10mM LiCl培养24h，提取总RNA和蛋白检测经典Wnt通路中关键调控因子和下游靶基因表达。结果如图30显示, 图30为本发明实施例2中牙髓干细胞经典Wnt信号通路改善示意图。可以看出，LiCl处理后的低碱性磷酸酯酶症分化能力异常的牙髓干细胞的细胞内p-Gsk3β、active-β-catenin水平显著上升提示分化能力异常的牙髓干细胞经典Wnt信号通路激活。
2.LiCl对低碱性磷酸酯酶症分化能力异常的牙髓干细胞的成骨分化能力改善检测
将正常和低碱性磷酸酯酶症疾病来源的5代牙髓干细胞消化后细胞计数以2×105接种到6孔板中培养，培养至显微镜下观察细胞融合度达到90%以上向成骨细胞诱导分化，成骨诱导分组为： 患病组和患病+LiCl组，患病组使用不含LiCl的细胞成骨诱导液进行成骨诱导分化，患病+LiCl组使用含LiCl的细胞成骨诱导液进行成骨诱导分化，诱导期间每3天更换新鲜细胞成骨诱导液；待成骨诱导分化1周进行成骨分化相关基因mRNA和蛋白水平检测；待成骨诱导分化3周进行茜素红染色。结果如图26-图27显示，图26为本发明实施例2中牙髓干细胞成骨分化能力相关基因RUNX2、SP7表达检测对照图；图27为本发明实施例2中牙髓干细胞成骨分化能力相关基因RUNX2、SP7在mRNA和蛋白水平检测对照图。可以看出，患病+LiCl组相比患病组，其成骨分化相关基因RUNX2、SP7在mRNA和蛋白水平上显著升高，茜素红染色如图28A-图29B显示其矿化结节数量明显增加，提示LiCl具有改善低碱性磷酸酯酶症分化能力异常的牙髓干细胞成骨分化能力。
以上所述，仅为本申请的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何在本申请揭露的技术范围内的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。因此，本申请的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (16)

1.Wnt信号通路激活剂在制备改善低碱性磷酸酯酶症干细胞成骨分化能力异常产品中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述经典Wnt信号通路激活剂为LiCl。
3.一种产品，其特征在于，包含治疗有效量的LiCl。
4.LiCl在制备细胞成骨诱导液中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述细胞成骨诱导液包含8-12mM LiCl、8-15nmol/L地塞米松、5-15mmol/Lβ-甘油磷酸钠、 0.05-0.1g/L维生素C、0.5-2%青霉素-链霉素、2.5-10% 胎牛血清，余量为α-MEM培养基。
6.LiCl在制备治疗干细胞成骨分化能力异常药物中的应用。
7.LiCl在制备治疗牙硬组织矿化异常药物中的应用。
8.LiCl在体外诱导干细胞成骨分化能力的应用。
9.LiCl在调控干细胞中p-GSK3β和/或active-β-catenin水平的应用。
10.根据权利要求1，6-9任一项所述的应用，其特征在于，所述干细胞为骨髓间充质干细胞或牙髓干细胞。
11.激活Wnt信号通路的方法，其特征在于，包含以下步骤：
1）获取成骨分化能力异常的干细胞；
2）使用含LiCl的试剂诱导培养所述成骨分化能力异常的干细胞，持续培养3周以上。
12.调控干细胞中p-GSK3β或active-β-catenin水平的方法，其特征在于，包含以下步骤：
1）获取成骨分化能力异常的干细胞；
2）使用含LiCl的试剂诱导培养所述成骨分化能力异常的干细胞，持续培养3周以上。
13.根据权利要求10或11所述的方法，其特征在于，所述成骨分化能力异常的干细胞来源于低碱性磷酸酯酶症患者牙齿或从临床上废弃的低碱性磷酸酯酶症患者骨髓组织中分离的间充质干细胞。
14.根据权利要求10或11所述的方法，其特征在于，步骤1）中，包含成骨分化能力异常的干细胞经体外扩增培养的过程，所述体外扩增培养为贴壁培养，并传代培养3-5代。
15.根据权利要求10或11所述的方法，所述含LiCl的试剂为含8-12mM LiCl的生理盐水或含LiCl的细胞成骨诱导液。
16.根据权利要求10或11所述的方法，所述细胞成骨诱导液包含8-12mM LiCl、8-15nmol/L地塞米松、5-15mmol/Lβ-甘油磷酸钠、 0.05-0.1g/L维生素C、0.5-2%青霉素-链霉素、2.5-10% 胎牛血清，余量为α-MEM培养基。
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