CN115074324A - Wnt3a-Wnt10a生物牙根复合体及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明首次发现牙周膜/牙骨质与牙本质/牙髓具有独特的Wnt信号通路，并提供了通过Wnt3a调控牙髓干细胞Wnt信号通路从而有效促进牙周膜牙骨质再生潜能的方法。同时，本发明还构建了Wnt3a生物牙根支架，从而实现单一一种牙髓干细胞再生生物牙根。

Description

Wnt3a-Wnt10a生物牙根复合体及其制备方法
技术领域
本发明涉及干细胞治疗领域，更为具体的，本发明涉及一种促进牙周膜牙骨质再生潜能的Wnt3a-Wnt10a生物牙根复合体及其制备方法。
背景技术
各种原因造成的牙齿缺失一直困扰人类的身心健康，缺失牙齿的修复方法伴随着人类的进步也由简单粗糙变得复杂精细，尽管如此，目前常用的修复方法诸如活动义齿、固定义齿、种植体等都是机械性的修复，存在着各种缺陷，缺乏真正生理意义上的修复，不能满足人类的需要。为此，如何利用人工方法再造出具有生物学活性的牙齿以修复缺牙，实现牙再生（tooth regeneration）是目前国内外学者着力研究的热点课题之一。
牙根是整个牙齿主要的支持和承重部分，在咀嚼过程中发挥着不可替代的作用。牙根主体结构为牙本质，具有较高的密度和一定的孔隙结构，成分上约70%为无机矿物，20%为有机物，10%为水分，微观结构为无机矿物以纳米微粒形式有序排列在胶原分子之间与分子表面的矿化胶原结构。牙根的外周有一层牙周膜（periodontium）及牙骨质。该牙周膜组织也被称为牙周韧带（periodontal ligament），由细胞（成纤维细胞、成骨细胞、成牙骨质细胞、破骨细胞等）、细胞外基质、胶原纤维、神经、血管等组成，具有支持牙齿、感觉、营养和更新牙骨质和牙槽骨等多方面的功能，是牙根必不可少的组成部分。
牙根再生（root regeneration）指利用组织工程的方式，再生出具有天然结构的牙根，并结合冠修复缺失牙的一种方法。因具有牙本质、牙周膜及牙骨质结构，还可实现形态及功能的修复，再生的牙根可以安装人造牙冠，而人造牙冠在外形与功能上都可与天然牙冠相媲美，从而构建出具有完整结构和功能的牙齿，故而在牙齿组织工程研究中具有独特的优势。
目前生物牙根再生技术方案主要存在依赖两种细胞（牙髓干细胞以及牙周膜干细胞）、操作复杂，因此导致临床应用被制约。同时这两种细胞还存在成功率低和再生周期长等问题。牙髓干细胞已经进入临床试验阶段，实现单一牙髓干细胞同时再生生物牙根（牙周膜、牙骨质、牙本质），将极大推动其临床应用。已有证据证明牙髓干细胞可再生牙周膜，但如何促进牙骨质及牙本质再生潜能缺乏足够方法。Wnt信号在牙胚发育中表达，研究证实经典Wnt 信号通路和非经典Wnt 信号通路在牙胚发育和成牙本质细胞分化过程中均发挥重要的调节作用。Wnt 家族包含19 个成员，分别与各自的Frizzled(FZD) 受体结合后，可分别激活细胞内经典和非经典Wnt 通路。但如何应用Wnt信号体外促进牙源性干细胞成牙分化尚不清楚。
发明内容
为了填补现有技术的空白，本发明的发明人通过研究，首次发现牙周膜/牙骨质与牙本质/牙髓具有独特的Wnt信号通路，并在此基础上提供了利用Wnt3a调控牙髓干细胞Wnt信号通路从而有效促进牙周膜牙骨质再生潜能的方法及应用。具体的，本发明提供如下的技术方案：
本发明的第一个方面，提供一种体外促进牙周膜牙骨质再生潜能的方法，所述方法为，利用Wnt3a调控牙髓干细胞Wnt信号通路自非经典向经典转化。
本发明的第二个方面，提供一种体外促进牙髓干细胞向牙周膜及牙骨质分化的方法，所述方法为，将牙髓干细胞在含有Wnt3a的培养基中培养。
本发明的第三个方面，提供一种Wnt3a缓释凝胶在制备促进牙髓干细胞修复牙周膜及牙骨质的产品中的应用。
在一种实施方式中，所述Wnt3a缓释凝胶的制备方法为：
（1）将250 mg氧化海藻酸钠溶解于1 ml蒸馏水中得到氧化海藻酸钠溶液；
（2）吸取100 mg Wnt3a，加入到氧化海藻酸钠溶液中，搅拌均匀；
（3）将250 mg 己二酸二酰肼（ADH）改性的聚谷氨酸溶解于1 ml蒸馏水中。然后，将其加入到氧化海藻酸钠溶液中，轻轻搅拌胶凝溶液，直到水凝胶形成。
在一种实施方式中，所述产品为生物牙根或医用填料。
本发明的第四个方面，提供一种牙髓干细胞再生生物牙根，其中，该生物牙根包含支架材料及凝胶，所述支架为中空圆柱形，材料包括但不限于胶原或PCL，支架具有与天然牙根相似的外形，支架外表面涂有Wnt3a缓释凝胶。
在一种实施方式中，所述支架内部为盲孔或者通孔结构。
在一种实施方式中，所述支架内部装载细胞、生长因子、药物等。
在一种实施方式中，所述支架内部可供细胞长入。
在一种实施方式中，所述支架内部吸附有Wnt10a纳米微球。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1天然牙根各组织Wnt信号表达谱（牙周膜、牙骨质、牙髓牙本质），Smart-seq测序结果表明牙周膜及牙骨质主要表达Wnt3a、Wnt10b及Wnt11，并主要激活经典Wnt信号通路；牙髓牙本质主要表达Wnt5a、Wnt6及Wnt10a，并主要激活非经典Wnt信号通路；
图2单细胞测序结果：牙髓干细胞主要表达Wnt5a及Wnt5b，并主要激活非经典Wnt信号通路；
图3 PCR结果：Wnt3a促进牙髓干细胞向牙周膜及牙骨质分化（CAP、CEMP为牙骨质特异性指标，ALP、COL1为牙周膜指标，OCN、OPN、BSP、OSX、RUNX2为共同指标）；
图4 Western blot结果：Wnt3a可上调Axin2及CTNNB1经典Wnt信号通路，对非经典Wnt信号通路分子p38MAPK及pMEK1/2无明显作用，说明Wnt3a调控牙髓干细胞自非经典向经典Wnt信号通路转变；
图5：Wnt3a缓释凝胶构建示意图（polyglutamic acid：聚谷氨酸，sodium algaacid：海藻酸钠，Na+钠离子）；
图6：构建小型猪牙周及牙骨质缺损模型，利用Wnt3a缓释凝胶及牙髓干细胞膜片，植入缺损区域，结果表明Wnt3a缓释凝胶可显著促进牙髓干细胞修复再生牙周及牙骨质缺损（Blank为空白对照，DPSCs为单纯牙髓干细胞膜片植入，DPSCs+Wnt3a为牙髓干细胞膜片联合Wnt3a缓释凝胶）。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1 提供天然牙根组织（牙周膜、牙骨质、牙髓牙本质）及牙髓干细胞Wnt信号 表达谱
1.临床收集门诊拔除的智齿及正畸牙齿。
2.分别刮除牙周膜、牙骨质及牙本质牙髓组织。
3. smart seq
（1）细胞裂解：分离获得单个细胞，并将单个细胞转移至低渗裂解缓冲溶液（裂解液中含有RNase抑制剂）中进行裂解，转录组释放于裂解液中。
（2）逆转录：加入MMLV逆转录酶、dNTP、oligo(dT)VN Primer、MgCl2等，对mRNAs进行反转录，获得cDNA第一条链，同时由于MMLVRT的末端转移酶活性会向cDNA的5’末端加上非模板化的胞嘧啶（C）残基。
（3）第二链合成：引物2对所加的C碱基进行互补配对，然后引导MMLVRT再次发挥聚合作用，得到双链cDNA。
（4）PCR扩增：cDNA合成之后，进行12-18个循环的cDNA PCR扩增（100 pg的总RNA，需要15个循环，对于10 pg的总RNA，可以进行18个循环），将扩增的cDNA用于构建标准的Illumina测序文库。
4.PCR验证：分别取牙周膜、牙骨质及牙本质牙髓组织，PCR验证关键基因。
5.10X单细胞测序
（1）将样本制备成单细胞悬浮液，细胞质检然后进行细胞计数和细胞活性测定，最终使细胞活性高于90%，细胞浓度为700～1200个细胞/μL。
（2）取75μL Master Mix＋细胞悬浮液、40μL的含有barcode信息的凝胶珠和280μL的油滴分别加入到Chromium Chip B的不同小室，经由微流体“双十字”交叉系统形成油滴包裹的凝胶珠（Gel Bead-In-EMulsions，GEMs）。有效的GEMs包含凝胶珠、单细胞、MasterMix和油。
（3）收集GEMs，并将其全部混合，凝胶珠在每个油滴内自动溶解释放大量Barcode引物序列，细胞裂解释放mRNA，mRNA与逆转录酶、凝胶珠上的poly dT反转录引物以及dNTP底物相接触，在逆转录酶的作用下发生逆转录反应，产生用于测序的带有Barcode和UMI信息的cDNA一链，再以SMART扩增方法完成第二链合成。
（4）cNDA片段化油滴破碎，磁珠纯化cDNA一链，然后以cDNA为模板进行PCR扩增。
（5）cDNA扩增完成后，首先利用化学方法将cDNA打断成200-300bp左右的片段，通过末端修复、加A进行cDNA片段筛选，P7 adaptor接头连接Read2测序引物，并通过PCR扩增引入样品Index，最后进行片段筛选，从而构建含有P5和P7接头的cDNA文库。
（6）构建的文库
（7）文库完成以后，进行库检，cDNA文库库检合格后，直接在Illumina的测序仪上进行测序。测序完成之后，进行数据分析。
6. 结果：
测序结果表明牙周膜及牙骨质主要表达Wnt3a、Wnt10b及Wnt11，并主要激活经典Wnt信号通路；牙髓牙本质主要表达Wnt5a、Wnt6及Wnt10a，并主要激活非经典Wnt信号通路（图1）。
单细胞测序结果表明，牙髓干细胞主要表达Wnt5a及Wnt5b，并主要激活非经典Wnt信号通路（图2）。
实施例2 Wn3a促进牙髓干细胞牙周膜牙骨质分化
1、分离培养牙髓干细胞
分离培养人牙髓干细胞，培养至第3代，按照1*106/孔接种于6孔板中。分为空白对照组、牙骨质诱导组、Wnt3a组。
2、各组培养基如下：
空白对照组：基础培养基（间充质干细胞培养基MSCM，货号7501，ScienCell公司）；
牙骨质诱导组：牙骨质向诱导分化培养基；
Wnt3a组：牙骨质向诱导分化培养基+100ng/ml Wnt3a重组蛋白；
3、体外成骨诱导分化
牙骨质向诱导分化培养基：在基础培养基的基础上，加10 mmol/L β-甘油磷酸钠、10 nmol/L 地塞米松和50 mg/L 维生素C。分别在培养3天，7天，10天，14天时提取RNA。
4、Realtime PCR
（1）引物序列
1) GAPDH
Forward: 5’- CGGACCAATACGACCAAATCCG-3’
Reverse: 5’- AGCCACATCGCTCAGACACC-3’
2）CAP
forward5’-GGTGTGGCTCATTACTCACAG -3’
reverse 5’- GGTCAAGAAGGCTGAATGTGT -3’
3）CEMP
forward 5’- CATACTGCCCTCCAGCACCA-3’
reverse 5’- TGAGTGCCACGG ATGACCA-3’
4）ALP
Forward: 5’- GACCTCCTCGGAAGACACTC-3’
Reverse: 5’- TGAAGGGCTTCTTGTCTGTG-3’
5）COL-1
Forward: 5’- ACAGGGCTCTAATGATGTTGAA-3’
Reverse: 5’- AGGCGTGATGGCTTATTTGT-3’
6) OPN
Forward: 5’- ATGATGGCCGAGGTGATAGT-3’
Reverse: 5’- ACCATTCAACTCCTCGCTTT-3’
7) OCN
Forward: 5’- TCCCTGTACACTGGCAGTTC-3’
Reverse: 5’- TTGTCCAGGTCACAGGTCTC-3’
8) BSP
Forward: 5'- CAGGCCACGATATTATCTTTACA-3'
Reverse: 5'- CTCCTCTTCTTCCTCCTCCTC-3'
9) OSX
Forward: 5’- CCTCCTCAGCTCACCTTCTC-3'
Reverse: 5'- GTTGGGAGCCCAAATAGAAA-3’
10) RUNX2
Forward: 5’- TCTTAGAACAAATTCTGCCCTTT-3'
Reverse: 5'- TGCTTTGGTCTTGAAATCACA-3’
（2）实验步骤：
A. RNA 提取前的实验准备：
1)DEPC水的配制：每600 ml水中加入600μl DEPC，配成DEPC水，摇床过夜，次日，高温高压灭菌30分钟；
2)一次性枪头、离心管等塑料制品，用0.1% DEPC 的水溶液浸泡过液，第二天高压灭菌，再用烘箱烘干；
3)玻璃器皿、研钵180 °C烘烤4 小时；
4)溶液的准备：用0.1% DEPC 处理水配制，于37°C至少处理12 小时，然后进行高压灭菌。
B. RNA 提取
1)样品处理：细胞用1 ml Trizol裂解液裂解；
2)将匀浆样品剧烈震荡混匀，再放置冰上10分钟，使得核酸蛋白复合物完全分离；
3)4°C 12000 g 离心5 分钟，取上清，转入一个新的无RNase的离心管中；
4)每1 ml 样品加入0.2 ml 氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15秒以上，放置于冰上3分钟；
5)4°C 12000g 离心15 分钟，将最上层转移到新管中；
6)缓慢加入等体积异丙醇，颠倒混匀，冰上孵育10分钟，使RNA沉淀；
7)4°C 12000 g 离心10分钟，弃掉上清；
8)加入1 ml 75%乙醇，颠倒混匀以洗涤沉淀，4°C 7500g离心5分钟，弃掉废液；
9)敞开盖口空气中干燥5-10分钟，20 μl超纯水溶解沉淀，56°C下孵育10分钟可助溶。
10) 检测RNA OD值：
上酶标仪，应用Gen5软件测量RNA浓度和OD260/280比值，通常在1.6-2.0之间为正常。
C. 反转录PCR
1)使用前先将每份溶液混匀、离心；计算RNA的量，5μg除以RNA浓度计算所需的μl数；
2)Microtube管中配制模板RNA/引物混合液，取模板RNA 按照前面计算的 μl数，加入随机引物或Oligo-(dT)、dNTP (mix) 各1 μl；总量为5 μl；
3)70°C保温5分钟后迅速在冰上急冷5分钟以上，微型离心机离心10秒，冰上暂存；
4)准备逆转录反应混合液，15μl体系，冰上配制。每个样品中加入4μl 5×PCR反应缓冲液，3μl MgCl2，1μlPCR Nucleotide Mix(终浓度为0.5mM each dNTP)，0.5 μl RNAseInhibit，剩下的用双蒸水补齐，离心10秒，混合均匀；
5)退火：25°C，5分钟；
6)延伸：42°C，1小时；
7)灭活逆转录酶，70°C保温15分钟，4°C冷却。
D. 检测cDNA OD值：
上酶标仪，应用Gen5软件测量 DNA浓度和OD260/280比值，通常在1.6-2.0之间为正常。
E. Realtime PCR
1) 配置Real-time PCR 反应体系如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
2) Real-time PCR 反应体系如下：
Figure 122189DEST_PATH_IMAGE002
F. 定量PCR的计算公式：
第一步，计算△Ct=基因Ct值-内参GAPDH的Ct值；
第二步，计算△△Ct=处理的△Ct-对照的△Ct；
第三步，计算2的负△△Ct次幂；
最后结果对照是1，其他处理大于1，说明该基因表达上调；小于1说明该基因表达下调。
G. Western blot
蛋白样品的制备(在冰上进行):
1) 取出孵育箱中的细胞，PBS液洗2次，吸干；
2) 加入裂解液(RIPA buffer和PMSF混合液)(1 ml RIPA配10ul PMSF：均在－20℃保存)；
3) 放冰上用细胞刮尽可能把细胞刮下来；
4) 吸出液体至1.5 ml的EP管中；
5) 漩涡震荡30s/次，每5 min/次，共5次；
6) 放4℃离心机13000 rpm离心15 min；
7) 吸取上清液(含蛋白)于EP管中，分为两部分：用于测蛋白浓度，其他用于电泳；
8) 加6*Loading buffer，99℃，10 min，储存于-20℃。
聚丙烯酰胺凝胶电泳:
配制分离胶与浓缩胶，先配制分离胶，用双蒸水压胶，待完全凝固后吸干双蒸水，加上配制好的浓缩胶，插上齿梳，待凝固后拔出齿梳，置于电泳槽中。蛋白样品按每孔20 ug加样至上样品孔。先以80 V电压电泳至染料前沿进入分离胶，提高电压至100 V，继续电泳至溴酚蓝到达分离胶底部。
转膜:
1) 依据胶的大小剪取膜和滤纸6片，放入转膜液中平衡10 min。PVDF膜先在100 %甲醇里浸润15 s，将膜和滤纸浸泡于甘氨酸转移缓冲液中；
2) 装配转移三明治：海绵+3层滤纸+胶+膜+3层滤纸+海绵，每层放好后，用试管赶去气泡；
3) 将转移槽置于冰浴中，放入三明治(黑色面对黑色面)，加转膜液，插上电极，100V，1h(电流约为200-250 mA)；
4) 转膜结束后，切断电源，取出杂交膜。
免疫杂交与显色:
1) TBS 洗膜10 min，室温，摇动；
2) 置膜于25 ml 封闭缓冲液中封闭1h，室温，摇动，封闭剂：5%脱脂奶粉(用TBST配)；
3) TBS/T洗3次，每次10 min；
4) 加入1：1000稀释的一抗，室4℃过夜，缓慢摇动；
5) 15 ml TBS/T洗3次，每次10 min；
6) 加入1：3000稀释的辣根过氧化酶(HRP)标记的二抗，室温孵育1h，缓慢摇动；
7) 15 ml TBS/T洗3次，每次10 min；
8) ECL法显影。
5. 结果：
PCR结果显示（图3），Wnt3a促进牙髓干细胞向牙周膜及牙骨质分化（CAP、CEMP为牙骨质特异性指标，ALP、COL1为牙周膜指标，OCN、OPN、BSP、OSX、RUNX2为共同指标）。Westernblot结果发现（图4），Wnt3a可上调Axin2及CTNNB1经典Wnt信号通路，对非经典Wnt信号通路分子p38MAPK及pMEK1/2无明显作用，说明Wnt3a调控牙髓干细胞自非经典向经典Wnt信号通路转变。
实施例3 Wnt3a缓释凝胶促进牙髓干细胞修复牙周膜及牙骨质
一、氧化海藻酸钠的制备：
1.避光的条件下，向100毫升蒸馏水中加入1.0克海藻酸钠和0.054克高碘酸钠，室温搅拌反应。
2.在2.0小时后加入1.5毫升乙二醇终止反应，得到氧化海藻酸钠，将所得的氧化海藻酸钠通过透析袋（MWCO 2500）纯化48小时，然后进行冷冻干燥。
二、改性聚谷氨酸(PGA)作为交联剂的制备：
1.将0.57 g的己二酸二酰肼(ADH)，1.0 g的聚谷氨酸(PGA)和1.0 g的N-羟基琥珀酰亚胺溶于100 ml水中。
2.将pH调节至5.0〜5.5，之后加入0.60 g的1-乙基-3-（3′-二甲基氨基丙基）碳二亚胺，反应持续12.0小时。
3.然后将所得的ADH改性的PGA通过透析袋（MWCO 2500）进行纯化，透析48小时之后冷冻干燥。
三、Wnt3a复合水凝胶的制备：
1.将250 mg氧化海藻酸钠溶解于1 ml蒸馏水中得到氧化海藻酸钠溶液（注：氧化海藻酸钠溶解性不好，在50℃水浴下，加入1 ml蒸馏水后缓慢搅拌成均匀胶状）。
2.吸取100mg Wnt3a，加入到氧化海藻酸钠溶液中，搅拌均匀。
3.将250 mg ADH改性的聚谷氨酸溶解于1 ml蒸馏水中。然后，将其加入到氧化海藻酸钠溶液中，轻轻搅拌胶凝溶液，直到水凝胶形成（图5）。
四、牙髓干细胞膜片制备：
步骤1、选用符合生产质量管理规范（GMP）条件下培养的自体或异体牙髓干细胞，将生长旺盛的第二或第三代牙周膜干细胞接种在10cm培养皿，培养成分为α-MEM培养基（含15%胎牛血清， 2 mmol/L谷氨酰胺，100 U/ ml青霉素，100 μg/ ml 链霉素，20.0μg/ml维生素C），每三天换液；
步骤2、培养10-14天后，培养皿边缘细胞出现皱褶，用较钝刀片或细胞刮子将细胞膜片整体揭下来，过程中细胞膜片不要干燥；
所述符合生产质量管理规范（GMP）条件下培养的异体干细胞还可以为以下牙源性干细胞及非牙源性干细胞，如牙囊干细胞、牙周膜干细胞、根尖牙乳头干细胞、脱落乳牙干细胞、牙龈干细胞、骨髓干细胞、脂肪干细胞。
步骤3、小型猪牙周膜牙骨质缺损模型，行牙髓干细胞膜片植入术；
手术过程：
（1）麻醉：速眠新Ⅱ+氯胺酮 15mg/kg 肌肉注射麻醉。备皮后使用2%碘伏进行头面部及口腔内消毒，铺巾。阿替卡因局部浸润麻醉。
（2）选取小型猪下颌双侧第一恒磨牙为实验牙，做沟内切口及垂直切口，翻开黏骨膜瓣后，采用去骨方法暴露小型猪下颌第一恒磨牙近中颊根，做3 mm×5 mm×7 mm大小的骨缺损。即：去除近中邻面牙槽骨3 mm×5 mm×7 mm、去除近中颊根颊侧骨板及远中牙槽骨（3 mm×5 mm，龈向深度平近中邻面）；在近中颊根根面，做2 mm深、高7mm、宽5 mm大小的牙骨质缺损。
（3）近中颊根根面均匀涂上Wnt3a复合水凝胶，并将牙髓干细胞膜片植入缺损区，原位缝合。
步骤4、种植手术后，小型猪当天肌肉注射（抗生素）青霉素80万u/只，连续三天给予添加青霉素饲料喂养。分别于术后1周、2周、4周观察伤口愈合情况，有无感染。
五、结果：
在生物牙根植入2个月后取组织进行CT评价，发现Wnt3a组牙根牙周膜及牙骨质缺损均显著愈合，说明Wnt3a具有显著促进牙髓干细胞修复牙周膜及牙骨质缺损的作用（图6）。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (10)

1.一种体外促进牙周膜牙骨质再生潜能的方法，其特征在于，所述方法为，利用Wnt3a调控牙髓干细胞Wnt信号通路自非经典向经典转化。
2.一种体外促进牙髓干细胞向牙周膜及牙骨质分化的方法，其特征在于，所述方法为，将牙髓干细胞在含有Wnt3a的培养基中培养。
3.一种Wnt3a缓释凝胶在制备促进牙髓干细胞修复牙周膜及牙骨质的产品中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述Wnt3a缓释凝胶的制备方法为：
（1）将250 mg氧化海藻酸钠溶解于1 ml蒸馏水中得到氧化海藻酸钠溶液；
（2）吸取100mg Wnt3a，加入到氧化海藻酸钠溶液中，搅拌均匀；
（3）将250 mg 己二酸二酰肼（ADH）改性的聚谷氨酸溶解于1 ml蒸馏水中，然后，将其加入到氧化海藻酸钠溶液中，轻轻搅拌胶凝溶液，直到水凝胶形成。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述产品为生物牙根或医用填料。
6.一种牙髓干细胞再生生物牙根，其特征在于，其中，该生物牙根包含支架材料及凝胶，所述支架为中空圆柱形，材料包括但不限于胶原或PCL，支架具有与天然牙根相似的外形，支架外表面涂有Wnt3a缓释凝胶。
7.如权利要求6所述的生物牙根，其特征在于，所述支架内部为盲孔或者通孔结构。
8.如权利要求6所述的生物牙根，其特征在于，所述支架内部装载细胞、生长因子、药物等。
9.如权利要求8所述的生物牙根，其特征在于，所述支架内部可供细胞长入。
10.如权利要求6所述的生物牙根，其特征在于，所述支架内部吸附有Wnt10a纳米微球。
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