JP5069572B2 - 間葉系細胞の製造方法、歯の製造方法及び歯形成用間葉系細胞 - Google Patents
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Description
そこで、近年、単離された歯胚細胞を用いた歯胚を再構成させて、この再構成歯胚を移植することによる歯の再生を中心とした検討が行われている。
歯胚の再生方法としては、例えば、特許文献1には、生体から単離された歯胚細胞を、線維芽細胞増殖因子等の生理活性物質の存在下で培養することが記載されている。また、特許文献2には、生体から単離された歯胚細胞及びこれらの細胞に分化可能な細胞のうち少なくとも1種類を、フィブリンを含む担体と一緒に培養することが提案されており、ここでフィブリンを含む担体は、歯胚の目的形状のものを使用して、特有の形態を有する「歯」を形成すると記載されている。
また、組織として機能するには、組織を構成する複数種の細胞が適切な相対位置に配置(細胞配置)され、組織としての方向性を有することが必須である。
本発明の第一の態様は、歯を形成するために用いられる間葉系細胞の製造方法であって、全能性幹細胞を分化誘導剤の存在下で培養して、CD44陽性且つCD29陽性細胞又はCD44陽性且つCD106陽性細胞を含む分化誘導処理後の細胞集団を生成すること、前記分化誘導処理後の細胞集団から、CD44陽性且つCD29陽性細胞又はCD44陽性且つCD106陽性細胞を、歯形成用間葉系細胞として選別すること、選別されたCD44陽性且つCD29陽性細胞、又はCD44陽性且つCD106陽性細胞を分離すること、を含み、前記歯形成用間葉系細胞を含む細胞集団が未分化の全能性幹細胞を含まない間葉系細胞の製造方法を提供する。
本発明の第二の態様は、支持担体の内部に、間葉系細胞及び上皮系細胞のいずれか一方のみから実質的になる第1の細胞集合体と、いずれか他方のみから実質的になる第2の細胞集合体とを混合することなく密着させて配置すること、前記第1及び第2の細胞集合体を前記支持担体の内部で培養すること、を含み、前記間葉系細胞が上記歯形成用間葉系細胞を含む歯の製造方法を提供する。
本発明の第三の態様は、上記の製造方法により得られた全能性幹細胞から誘導されるCD44陽性且つCD29陽性又はCD44陽性且つCD106陽性の歯形成用間葉系細胞を提供する。
本発明の第四の形態は、上記の製造方法により得られた歯形成用間葉系細胞を、歯を形成するために使用する使用方法を提供する。
なお、本発明において「細胞」には、特に断らない限り、個々の細胞が集合して得られる「細胞集団」も包含される。
また、組織として機能するには、組織を構成する複数種の細胞が適切な相対位置に配置(細胞配置)され、組織としての方向性を有することが必須である。
本発明の歯の製造方法は、支持担体の内部に、間葉系細胞及び上皮系細胞のいずれか一方のみから実質的になる第1の細胞集合体と、いずれか他方のみから実質的になる第2の細胞集合体とを混合することなく密着させて配置すること、前記第1及び第2の細胞集合体を前記支持担体の内部で培養すること、を含み、前記間葉系細胞が上記歯形成用間葉系細胞を含む。
本発明の歯形成用間葉系細胞は、全能性幹細胞から誘導されるCD44陽性且つCD29陽性又はCD44陽性且つCD106陽性の歯形成用間葉系細胞である。
また、このような歯形成用間葉系細胞を用いるので、目的とする歯を効率よく製造することができる。
本発明の間葉系細胞の製造方法は、歯を形成するために用いられる間葉系細胞を製造する間葉系細胞の製造方法であって、全能性幹細胞を分化誘導剤の存在下で培養して、CD44陽性且つCD29陽性細胞又はCD44陽性且つCD106陽性細胞を含む分化誘導処理後の細胞集団を生成すること、前記分化誘導処理後の細胞集団から、CD44陽性且つCD29陽性細胞又はCD44陽性且つCD106陽性細胞を、歯形成用間葉系細胞として選別することを含むものである。
本発明において「歯胚」及び「歯芽」は、後述する発生段階に基づいて区別されたものに特に言及する場合に用いられる表現である。この場合の「歯胚」とは、将来歯になることが決定付けられた歯の初期胚であり、歯の発生ステージで一般的に用いられる蕾状期(Bud stage)から鐘状期(Bell stage)までの段階であり、特に歯の硬組織としての特徴である象牙質、エナメル質の蓄積が認められない組織である。一方、「歯芽」とは本発明で用いられる「歯胚」の段階移行の、歯の硬組織の特徴である象牙質、エナメル質の蓄積が始まった段階から歯が歯肉から萌芽して一般的に歯としての機能を発現する前の段階の組織をいう。
なお本発明において「間葉系細胞」とは、間葉組織由来の細胞を意味し、「上皮系細胞」とは上皮組織由来の細胞を意味する。
また本発明において「歯周組織」とは、歯の主として外層の形成された歯槽骨及び歯根膜をいう。歯槽骨及び歯根膜は、当業者には、組織染色などによって形態的に容易に特定することができる。
本発明に係る歯形成用間葉系細胞を得るために用いられる全能性幹細胞は、少なくとも2以上の細胞に分化可能な多分化能を有する細胞を言い、好ましくは胚性癌腫細胞、胚性幹細胞、胚性生殖幹細胞からなる群より選択されたものを使用することができる。このうち、入手の容易性の観点から胚性癌腫細胞(以下、「EC細胞」という)であることがより好ましい。本発明に適用可能なEC細胞には、神経、睾丸、卵巣などいずれの組織に由来するものであってもよい。このようなEC細胞としては。例えばヒト由来としてはNCR−G3細胞、並びにNTERA−2細胞を挙げることができ、マウス由来としてはc−1300細胞やF9細胞、LT−2細胞、OTT6050細胞、PCC4細胞、P19細胞、METT−1細胞、STT−3細胞などの細胞株を挙げることができる。これらの細胞は、哺乳動物の霊長類(例えばヒト、サルなど)、有蹄類(例えば豚、牛、馬など)、小型哺乳類の齧歯類(例えばマウス、ラット、ウサギなど)の種々の動物に由来するものから、適宜使用目的に応じて選択することができる。例えばマウス由来の胚性癌腫細胞株としては、上記に記載した細胞株やこれらの派生クローンを挙げることができる
例えばDMSOの場合、一般に培地の容量に対して、0.5容量%〜10容量%、処理に対する細胞の生存率及び培養によって得られる目的の細胞の取得効率の観点から、好ましくは2.5容量%〜5容量%、更に好ましくは4容量%〜5容量%の濃度とすることができる。2.5容量%以上の濃度であれば、全能性幹細胞の分化を充分に誘導することができ、一方、5容量%以下の濃度であれば目的の細胞取得の効率を著しく損なうことがない。
また、RAの場合、一般に培地中で0.1μM〜10μM、処理に対する細胞の生存率及び培養によって得られる目的の細胞の取得効率の観点から、好ましくは0.5μM〜5μM、更に好ましくは0.5μM〜2μMの濃度とすることができる。0.1μM以上の濃度であれば、全能性幹細胞の分化を充分に誘導することができ、一方、10μM以下の濃度であれば目的の細胞取得の効率を著しく損なうことがない。
本発明における歯形成用間葉系細胞は、CD44陽性に加えて、CD29及びCD106の少なくともいずれか一方の抗原が陽性となる集団であればよく、CD44、CD29、CD106の3種の抗原が共に陽性となる三重陽性細胞が含まれていてもよい。
他の細胞性状としては他の細胞表面抗原パターンや遺伝子発現パターンを挙げることができる。細胞表現抗原パターンとして、例えばCD14陰性、CD34陰性、CD45陰性等を挙げることができ、これらを単独又は組み合わせて使用することができる。また遺伝子発現パターンとしては、例えばSlug発現、Wnt5a発現、Lhx8発現、BMP4発現、Pax3発現、Pax9発現、Msx1発現、Oct3/4非発現、nanog非発現、Sox9非発現、Sox5非発現等を挙げることができ、これらを単独又は組み合わせて使用することができるが、これらに限定されるものではない。
このような増殖工程の期間は、分化誘導処理後の細胞数及び細胞の状態に基づいて適宜設定することができるが、目的細胞の濃縮効率の観点から一般に3〜30日、好ましくは5〜10日とすることができる。この結果、選別工程の対象となる細胞集団中に、目的とする歯形成用間葉系細胞が含まれることになり、このような細胞集団を選別工程に供することによって、本発明にかかる歯形成用間葉系細胞を効率よく且つ大量に得ることができる。
以下、本発明の歯の製造方法について説明する。
本発明の歯形成用間葉系細胞を用いた好ましい歯の製造方法は、支持担体の内部に、間葉系細胞及び上皮系細胞のいずれか一方のみから実質的になる第1の細胞集合体と、いずれか他方のみから実質的になる第2の細胞集合体とを混合することなく密着させて配置すること(配置工程)、前記第1及び第2の細胞集合体を前記支持担体の内部で培養すること(培養工程)、を含み、前記間葉系細胞が上記歯形成用間葉系細胞を含むものである。
本製造方法では、間葉系細胞と上皮系細胞とを細胞集合体として支持担体の内部で混合することなく密着させた状態で生育させるので、緊密な接触状態によって細胞間相互作用を効果的に再現することができ、内側に象牙質、外側にエナメル質という歯に特有の細胞配置を有する歯を得ることができる。この際、間葉系細胞から実質的になる細胞集合体が本発明にかかる歯形成用間葉系細胞を含むので、特有の細胞配置を有する歯を効率よく大量に製造することができる。
ここで第1の細胞集合体及び第2の細胞集合体は、それぞれ間葉系細胞のみ、又は上皮系細胞のみから実質的に構成されているものである。ここで、間葉系細胞のみから実質的に構成されている細胞集合体は、上述した歯形成用間葉系細胞を含むものである。この歯形成用間葉系細胞を含む細胞集合体は、上述した製造方法に従った調製工程によって調製することができ、一方、上皮系細胞のみから実質的に構成されている細胞集合体は、間葉系細胞から実質的になる細胞集合体とは独立して調製することができる(第1の細胞調製工程及び第2の細胞調製工程)。
第1の細胞集合体第2の細胞集合体は、いずれが上皮系細胞及び間葉系細胞であってもよく、この細胞集合体を構成する細胞の数は、動物の種類や、支持担体の種類、硬さ及び大きさによって異なるが、細胞集合体1個あたり、一般に101〜108個、好ましくは103〜108個とすることができる。
上記間葉系細胞以外の他の間葉系細胞としては、歯胚及び歯胚以外に由来する間葉系細胞を挙げることができる。歯胚以外に由来する間葉系細胞としては、生体内の他の間葉系組織に由来する細胞であり、好ましくは、血液細胞を含まない骨髄細胞や間葉系幹細胞、さらに好ましくは口腔内間葉系細胞や顎骨の内部の骨髄細胞、頭部神経堤細胞に由来する間葉系細胞、前記間葉系細胞を生み出しうる間葉系前駆細胞やその幹細胞等を挙げることができる。
また、歯胚以外に由来する上皮系細胞であってもよく、これには、生体内の他の上皮系組織に由来する細胞を挙げることができる。好ましくは、皮膚や口腔内の粘膜や歯肉の上皮系細胞、さらに好ましくは皮膚や粘膜などの分化した、例えば角化した、あるいは錯角化した上皮系細胞を生み出しうる未熟な上皮系前駆細胞、たとえば非角化上皮系細胞やその幹細胞等を挙げることができる。
好ましくは、周囲組織から歯胚細胞を容易に分離するため及び/又は歯胚組織から上皮組織及び間葉組織を分離するために、酵素を用いてもよい。このような用途に用いられる酵素としては、ディスパーゼ、コラーゲナーゼ、トリプシン等を挙げることができる。
培養に用いられる培地としては、一般に動物細胞の培養に用いられる培地、例えばダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)等を用いることができ、細胞の増殖を促進するための血清を添加するか、あるいは血清に代替するものとして、例えばFGF、EGF、PDGF等の細胞増殖因子やトランスフェリン等の既知血清成分を添加してもよい。なお、血清を添加する場合の濃度は、そのときの培養状態によって適宜変更することができるが、通常10容量%とすることができる。細胞の培養には、通常の培養条件、例えば37℃の温度で5%CO2濃度のインキュベーター内での培養が適用される。また、適宜、ストレプトマイシン等の抗生物質を添加したものであってもよい。
また、細胞の性質を変えないという観点から、間葉系細胞の予備培養や上述した歯形成用間葉系細胞の単なる増殖のための培養では、前述した分化誘導剤を含有しない培地で行うことが好ましい。
なお、ここで支持担体は、第1及び第2の細胞集合体が担体内部で成育することができる程度の厚みを有すればよく、目的とする組織の大きさ等によって適宜設定することができる。
培養工程は、支持担体によって第1の細胞集合体と第2の細胞集合体との接触状態が維持されて行われればよく、第1及び第2の細胞集合体を有する支持担体単独による培養であっても、他の動物細胞の存在下での培養であってもよい。
移植による成育期間としては、移植時の大きさと発生させる歯の大きさによって異なるが、一般に、3〜400日とすることができる。例えば、腎臓皮膜下への移植期間は移植する培養物の大きさと再生させる歯の大きさによっても異なるが、歯の再生と移植先で発生させる歯の大きさの観点から7〜60日間であることが好ましい。
前培養の期間は短期であっても長期であってもよい。長期間、例えば3日以上、好ましくは7日以上とした場合には、歯胚から歯芽に発生させることができるので、移植後に歯ができるまでの期間を短縮することもできるため好ましい。前培養の期間としては、例えば腎臓皮膜下へ移植を行う場合の器官培養として、好ましくは1〜7日とすることが効率よく歯を再生するために好ましい。
このような歯の集合体は、歯特有の細胞配置を有する複数の歯で構成されているため、個々の歯を集合体から分離して、以下に述べるように1つの歯の移植片として用いることができる。この結果、移植片としての歯を効率よく作製することができる。
なお、培養工程は、前記と同様に、器官培養であっても腎臓皮膜下での培養であってもよいが、得られた歯を移植片として用いる場合には、他の動物細胞との接触がなく且つ全行程in vitroで調製することができる器官培養とすることが好ましい。
なお、得られた歯又は歯周組織を移植片として用いる場合には、製造方法における培養工程を、他の動物細胞との接触がなく且つ全行程in vitroで調製することができる器官培養としたものであることが好ましい。
これにより、歯の移植を、特有の細胞配置と方向性を備えた複数の歯を同時に得て、効率よく実施することができる。
即ち、本発明の治療方法は、本発明による製造方法によって得られた歯及び/又は歯周組織を、欠損及び/又は損傷部位へ移植することを含む。これにより、欠損及び/又は損傷部位の上記症状を治療及び/又は緩和することができる。
本発明の他の治療方法は、本発明における培養工程のみ、或いは、配置工程及び培養工程を、欠損及び/又は損傷部位において実施させることを含む。この場合、支持担体としては、上述したものに加えて、欠損及び/又は損傷部位の周囲組織そのものを支持担体として適用してもよい。これにより、生体内での周辺組織からのサイトカイン等によって、より迅速に欠損及び/又は損傷部位の治療等を行うことができる。
[実施例1]
1. EC細胞の培養方法
EC細胞は、AT805細胞(129系EC細胞であるOTT6050の派生クローン、理化学研究所バイオリソースセンター細胞材料開発室より入手)を使用した。AT805細胞の培養は、10容量%牛胎児血清(FCS:JRH又はJBS、Hyclone社製)及び55μM 2−メルカプトエタノール(GIBCO社製)を添加したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM:SIGMA社又はコージンバイオ社製)を用いて行った。EC細胞は通常、100mmディッシュあたり5〜8×105個の濃度で播種し、一日おきに全量培地交換と継代培養を繰り返した。継代培養では、細胞をHCMFバッファ(pH7.4、10mM Hepes、136.9mM NaCl、0.34mM Na2HPO3、13.9mMグルコース、5.37mM KCl)にて1回洗浄後、最終濃度0.025%のトリプシン−EDTA・2Na(GIBCO社製)を溶解した酵素溶液を5ml添加し、37℃にて1分間酵素処理を行った。その後、等量の10%FCS添加DMEMを加えて細胞を分散させた後、遠心分離によって沈殿回収した細胞を再度懸濁し、新たな培養ディッシュへ播種し、継代培養した。
トリプシン処理により回収したEC細胞を、終濃度0.5〜5容量%のジメチルスルホキシド(DMSO:SIGMA社製)を添加した10容量%FCS添加DMEMで懸濁し、1.0×106個/100mmディッシュの濃度で播種した。5%CO2濃度条件下で37℃にて培養し、14時間後、HCMFバッファにて細胞を1回洗浄し、培養液を10容量%FCS添加DMEMに培地交換した。
また、各DMSO濃度で処理した場合のDMSO−EC細胞の割合について、表1に示す。表1に示されるように、DMSO処理濃度に依存して、CD44陽性かつCD29陽性の細胞は増加することが判明した。なお、5容量%DMSOで処理したEC細胞は、ほとんどの細胞が処理直後に死滅するため、処理後の培養日数が他の処理濃度より長く必要になる一方で、培養後に得られたCD44陽性かつCD29陽性の細胞は高い割合であることが明らかになった。
以後の実験には、5容量%のDMSOを用いて得られた細胞を用いた。
DMSO−EC細胞のクローン化には、クローニングリングによるコロニーの分離、あるいは限界希釈法によって行った。
クローニングリングによる細胞の取得では、DMSO−EC細胞を培養ディッシュに低濃度(約100個)で播種し、増殖によってできたコロニーの細胞数が10個以上になったところで、滅菌済みのシリコングリースをクローニングリングの一端に塗り、培地を取り除いたディッシュ底面に、細胞のコロニーを囲うようにして貼り付けた。その後、クローニングリング内でトリプシン処理を行い、細胞を回収して、増殖した細胞から順次、培養のスケールアップを行ない、クローンを取得した。
限界希釈法によるクローンの取得は、上記方法により取得したDMSO−EC細胞をHCMFバッファにて1回洗浄後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収された細胞数を計測し、1細胞/200μl/ウエル(説明)になるように96ウエル培養プレートに播種した。3〜5日後に単一のコロニーであることを確認した。その後5日ごとに、半量の培地交換を行いながら培養を継続し、増殖した細胞から順次、培養のスケールアップを行ない、クローンを取得した。
これにより、DMSO−EC細胞由来のクローン1(DMSO−ECクローン1:Clone #1)及びクローン2(DMSO−ECクローン2:Clone #2)を得た。
DMSO−EC細胞の性状
(1)位相差顕微鏡像
上記で得られたクローン1及び2の形態と、EC細胞、DMSO−EC細胞、並びにEC細胞由来軟骨系前駆細胞であるATDC5細胞(理化学研究所バイオリソースセンター細胞材料開発室より入手)の形態をそれぞれ位相差顕微鏡で観察した。
この結果、EC細胞は、コロニー内の細胞が小さく、高い密度で増殖するほか、コロニー周辺が盛り上がっており、典型的な全能性幹細胞様の形態であることが観察された。これに対して、DMSO−ECやDMSO−ECクローン1及び2、ATDC5細胞はいずれも、コロニーを構成するひとつずつの細胞の面積が大きく、付着性細胞としての特徴である単一層を形成しており、特徴的なEC細胞の形態と明らかに異なる形態を示した。このような付着性の細胞形態は、EC細胞よりは間葉系細胞に類似している。
EC細胞、DMSO−EC、DMSO−ECクローン1及び2、ATDC5細胞における各種遺伝子発現をリアルタイムPCR(RT−PCR)により解析し、各種マーカー遺伝子の発現を検討した。
EC細胞、並びにDMSO−EC、DMSO−ECクローン1及び2、ATDC5細胞からの全RNAの抽出は、TRIzol Reagent(Invitrogen社製)を用いて行なった。解析する細胞の培養液を除去し、100mmの培養ディッシュに直接2mlのTRIzol Reagentを滴下し、Cell Scraper(Falcon社製)で充分混合した後、エッペンチューブに回収し、ポリトロンホモゲナイザー(ポリトロン社製)でホモジナイズを行った。その後のRNA抽出までの操作は、添付の使用説明書に従った。細胞・組織から抽出された全RNAは、DEPC処理水に溶解し、分光光度計にて濃度算定を行った後、−30℃に保存した。
PCR及び解析は、ABI PRISM 7000(Applied Biosystems社製)を使用して行った。ポリメラーゼはSYBR Premix Ex Taq(TAKARA社製)を使用し、内在性コントロールはβ−アクチンを用いた。RT−PCR専用96ウエルプレートに1サンプルあたり、SYBR Premix Ex Taq (TAKARA社製)を13μl、20倍に希釈したcDNA反応溶液を2μl、1μMの濃度のプライマーをそれぞれ5μl、滅菌水を5μl添加し、最終容量25μlの反応系を調製し、PCR反応を常法に従って行なった。また、それぞれの遺伝子についてコントロールの反応を行って検量線を作成し、それぞれの定量化を行った。解析に使用したプライマーの配列を表2及び表3に示した。
遺伝子発現は、それぞれの細胞におけるβ−アクチンの発現量により標準化し、β−アクチン発現量を一定にした場合の相対的な発現量で比較した。結果を表4に示す。
一方、歯の間葉細胞のマーカー群では、EC細胞ではMsx1とBMP−7が発現しているほかはいずれの遺伝子も発現していないのに対して、DMSO−EC細胞、並びにそのクローン化細胞では、Msx1、Pax9、Wnt5a、Lhx8が特異的に高発現していた。BMP4、Runx2、Dlx1は、DMSO−EC細胞、並びにそのクローン化細胞とATDC5細胞で、発現量に多少の差異はあるものの発現が認められた。
また軟骨細胞における特異的なマーカー遺伝子であるSox9、Sox5の発現は、ATDC5細胞でのみ高発現しており、DMSO−EC細胞とそのクローン化細胞は軟骨系への分化をしていない細胞であると判断された。
従って、DMSOによって、EC細胞が神経堤細胞様ないしは間葉系細胞様の細胞へ分化誘導されたことは明らかであった。
EC細胞から分化誘導した細胞の歯形成能の評価
次に、本発明によって得られたDMSO−EC細胞、そのクローン化細胞の象牙芽細胞への分化能、並びに歯の象牙質形成能を、以下のように行って、確認した。
C57BL/6マウス(SLCより購入)の胎齢14.5日、胚仔から下顎切歯歯胚組織を顕微鏡下で常法により摘出した。摘出した下顎切歯歯胚組織をPBS(−)で洗浄し、PBS(−)に最終濃度1.2U/mlのディスパーゼ II (Roche, Mannheim, Germany)を添加した酵素液で室温にて12.5分間処理した後、10%FCS(JRH Biosciences, Lenexa, KS)を添加したDMEM(Sigma, St. Louis, MO)で3回洗浄した。さらにDNaseI溶液 (Takara, Siga, Japan)を最終濃度70U/mlになるよう添加し歯胚組織を分散させ、25G注射針 (Terumo, Tokyo, Japan)を用いて外科的に歯胚上皮組織を分離した。
再構成歯胚の作製には、上記で調製された歯胚上皮組織と、間葉系細胞として、EC細胞、DMSO−EC細胞、DMSO−ECクローン1及び2のいずれかの評価対象細胞とを用いた。
歯胚再構築に使用する評価対象細胞群を、それぞれトリプシン処理によりディッシュから回収した。シリコングリースを塗布した1.5mlマイクロチューブ(Eppendorf, Hamburg, Germany)に、10%FCS(JRH)添加DMEM(Sigma)で懸濁した評価対象細胞を入れ、遠心分離(580×g)により細胞を沈殿として回収した。遠心後の培養液の上清をできる限り除去し、再度遠心操作を行い、実体顕微鏡で観察しながら細胞の沈殿周囲に残存する培養液をGELoader Tip 0.5−20μL(エッペンドルフ社製)を用いて完全に除去し、再構成歯胚作製に用いるそれぞれの評価対象細胞を準備した。
ピペットチップ16で先にゲルドロップ10(図3A参照)内に配置された細胞凝集体12は、ゲルドロップ10内で球体を構成する(図3B参照)。この後に他方の細胞凝集体14を押し込むことによって、球体の細胞凝集体12がつぶされて、他方の細胞凝集体14を包むようになることが多い(図3C参照)。その後にゲルドロップ10を固化させることにより、細胞間の結合が強固になる(図3D参照)。
ゲル中で作製した高密度再構成歯胚は、CO2インキュベーターに10分間静置してCellmatrix type I-A (Nitta Gelatin)を固形化した。10容量%FCS(JRH社製)、0.1mg/mlのL−アスコルビン酸(Sigma社製)、2mMのL−グルタミン(GIBCO社製)添加したDMEM(Sigma社製)に、セルカルチャーインサート(ポアサイズが0.4ミクロンのPETメンブレン;BD社製)が接するように培養容器を準備した。培養容器のセルカルチャーインサートの膜上に、再構成歯胚を、支持担体である周囲のゲルと共に移して、器官培養した。
14.5日齢、下顎切歯歯胚上皮組織とEC細胞の高密度再構成歯胚では、EC細胞の異常増殖により再構成歯胚は肥大化し、HE染色においても歯の間葉細胞に由来する象牙芽細胞や象牙質は観察されなかった。
これに対し、DMSO−EC細胞、DMSO−ECクローン1及び2では、上皮組織との相互作用が誘導され、位相差顕微鏡像においても歯胚の器官培養と同様に組織誘導が観察された。またさらに、DMSO−EC細胞、DMSO−ECクローン1及び2ではいずれも、外側にエナメル質、内側に象牙質を有する再構成歯胚を形成できることがHE染色像から確認でき、歯に特有の組織構造が形成可能であることが示された。
これらのことから、DMSO−EC細胞、DMSO−ECクローン1及び2は、歯胚上皮細胞との相互作用によって、歯の間葉組織である象牙芽細胞へ分化し、歯に特有の象牙質を産生できることは明らかであった。また高密度再構成歯胚法によって、器官培養においても、外側にエナメル質、内側に象牙質、内部に歯髄細胞、歯の先端と歯根を有する歯に特有の組織構造を有する歯を形成できることが明らかであった。
腎皮膜下移植方法
次に、DMSO−EC細胞、DMSO−ECクローン1及び2の細胞と14.5日齢胎児下顎切歯歯胚上皮細胞とから、高密度再構成歯胚を作製し、得られた再構成歯胚をC57BL6マウス(日本クレア社から入手)腎皮膜下に移植して、歯形成能を評価した。
実施例3と同様にして作製した再構成歯胚を、48時間から96時間、器官培養を行った後、周囲のゲルごと8週齢のNOD−SCIDマウス(チャールズリバー社から入手)の腎皮膜下に移植して異所的な歯の発生を進行させ、解析を行った。
腎皮膜下に移植した場合には、移植後10〜30日目に周囲の腎組織ごと再構成歯胚を摘出した。摘出組織を、4%パラホルムアルデヒド−リン酸緩衝液で6時間固定した後、4.5%EDTA溶液(pH7.4)を用いて24時間の中性脱灰を行った。その後、常法によりパラフィン包埋して、10μmの切片を作製した。組織学的解析のためには常法に従い、HE染色を行った。
腎皮膜下移植では、14.5日齢胎児切歯歯胚を移植した場合には、内側に象牙質及び外側にエナメル質を有する特徴的な構造の歯を16日の期間で腎皮膜下移植により発生させることができた(図4参照)。14.5日齢胎児切歯歯胚に由来する歯胚上皮組織と歯胚間葉細胞(図4A参照)、歯胚上皮組織とDMSO−EC細胞(図4B参照)、歯胚上皮組織とDMSO−ECクローン(クローン#1、図4C参照)による再構成歯胚では、腎皮膜下移植によって移植後14日目には、正常歯胚をそのまま腎皮膜下へ移植した場合と同様に、外側のエナメル芽細胞、エナメル質、その内側に象牙質、象牙芽細胞が容易に認められた。できた歯は、先端と歯根を有しており、正常発生の歯と同様の構造を有していた。
歯形成の頻度は、EC細胞及びATDC細胞が0%であるのに対して、DMSO−EC細胞では51.3±8.8%、DMSO−ECクローン1では23.3%±16.7%、クローン2では33.3%±47.1%であった。
14.5日齢胎児切歯歯胚に由来する歯胚上皮組織とDMSO−EC細胞を腎皮膜下へ移植し、14日後に摘出した組織について、In situハイブリダイゼーションにより、エナメル質の構成分子であるアメロジェニンと、象牙質の構成要素であるデンチンシアロホスホプロテイン(DSPP)のmRNAの発現、並びに歯根膜特異的な遺伝子であるペチロスタチンmRNAの発現を解析した。
その結果から、HE染色像におけるエナメル芽細胞ではアメロジェニンmRNAの発現が、象牙芽細胞ではDSPP mRNAの発現がそれぞれ認められた。またペリオスタチンmRNAの発現が認められた。このことから硬組織形成に関与する分子のmRNAは、それぞれが適切にその産生細胞において明らかに発現していた。また歯根膜で発現するペリオスチンが検出されたことから歯周組織が形成されていることが示唆された。
レチノイン酸による誘導
(1)CD44陽性かつCD29陽性の細胞の取得のためのEC細胞の分化誘導の方法
実施例1と同様にして、トリプシン処理にて回収されたAT805細胞を1.0×106個/100mmディッシュの濃度で播種し、翌日、終濃度0〜10.0μMのレチノイン酸(RA)(SIGMA社製)を添加した10容量%FCS DMEMに置換して刺激を加えた。培養72時間後、HCMFバッファにて2回洗浄を行い、全量10容量%FCS DMEMで培地交換を行った。
3日毎に10容量%FCS DMEMを用いて半量培地交換を行いながら培養を7日間継続し、適宜観察を行った。RA処理後増殖してきた、未分化細胞を含む細胞集団をHCMFにて1回洗浄後、3mMのEDTA−0.5% BSA−PBS(−)を添加し、37℃でインキュベートして回収した。回収後の細胞はCD44 FITC(BD Pharmingen)及びCD29(BD Pharmingen)PEにより二重染色を行い、CD44陽性かつCD29陽性の細胞をEpics ALTRA(Beckman Coulter)を用いて分離取得することで、未分化細胞を除いた分化した細胞集団のみを得た。この細胞をRA−EC細胞と名付けた。結果を図5に示す。
また、各RA濃度で処理した場合のRA−EC細胞の割合について表5に示す。表5に示されるようにRA濃度に依存して、CD44陽性且つCD29陽性細胞が変化することが判明した。
またRA処理後のCD44陽性且つCD29陽性細胞について実施例2(2)と同様に遺伝子の発現について確認したところ、DMSO−EC細胞と同様に、Oct3/4陰性、Nanog陰性、Slug陽性、Pax3陽性、Wnt1陽性の細胞であることが判明した。
上記のようにして得られたCD44陽性且つCD29陽性細胞(RA濃度2μM)を用いて、実施例3と同様にして歯胚再構築及び器官培養を行い、評価した。器官培養14日後には、歯胚上皮細胞との相互作用によって、歯の間葉組織である象牙芽細胞へ分化した。また高密度再構成歯胚法によって、外側にエナメル質、内側に象牙質、内部に歯髄細胞を有する歯に特有の組織構造を有する歯が形成された(図6参照)。
またRA処理後のCD44陽性且つCD29陽性細胞について実施例4(2)と同様にしてアメロジェニン及びDSPP、ペルオスタチンの発現を確認したところ、DMSO−ECと同様に各mRNAの発現が認められた。このことから、硬組織、歯根膜を含む歯周組織が形成されていることが示唆された。
(1)CD44陽性かつCD106陽性の細胞の取得のためのEC細胞の分化誘導の方法
実施例1と同様にしてトリプシン処理により回収したAT805細胞を、1.0×106個/100mmディッシュの濃度で播種し、翌日、終濃度2μMのRA(SIGMA社製)を添加した10容量%FCS DMEMに置換して刺激を加えた。培養72時間後、HCMFバッファにて2回洗浄を行い、全量10容量%FCS DMEMで培地交換を行った。翌日、HCMFバッファにて2回洗浄を行い、死細胞を除去した後、さらに10容量%FCS DMEMで培養を継続した。以降1日おきに培地交換を行い、7日間培養した。
上記処理により取得された未分化細胞を含む細胞集団はHCMFにて1回洗浄後、3mM EDTA−0.5% BSA−PBS(−)を添加し、37℃でインキュベートして回収した。回収後の細胞はCD44 FITC(BD Pharmingen)及び抗CD106抗体(CD106(BD Pharmingen)PE)により二重染色を行い、CD44陽性且つCD106陽性フラクションをEpics ALTRA(Beckman Coulter)を用いて分離取得することで、未分化細胞を除いた分化した細胞集団のみを得た。結果を図7に示す。
上記のようにして得られたCD44陽性且つCD106陽性細胞を用いて、実施例3と同様にして歯胚再構築及び器官培養を行い、評価した。器官培養14日後には、歯胚上皮細胞との相互作用によって、歯の間葉組織である象牙芽細胞へ分化した。また高密度再構成歯胚法によって、外側にエナメル質、内側に象牙質内部に歯髄細胞を有する歯に特有の組織構造を有する歯が形成された。
またこれらのCD44陽性且つCD106陽性のDMSO−EC細胞について実施例2(2)と同様に遺伝子の発現について確認した。この結果、CD44陽性且つCD29陽性DMSO−EC細胞と同様に、Oct3/4陰性、Nanog陰性、Slug陽性、Pax3陽性、Wnt1陽性の細胞であることが示された。
更に、実施例4(2)と同様にしてアメロジェニン及びDSPP、ペルオスタチンの発現を確認したところ、DMSO−ECと同様に各mRNAの発現が認められた。このことから、硬組織、歯根膜を含む歯周組織が形成されていることが示唆された。
実施例6(2)及び(3)と同様にして、DMSO−EC細胞についてCD44 FITC及びCD106 PEを用いて二重染色したところ、CD44陽性且つCD106陽性細胞の存在が示された。これらのCD44陽性且つCD106陽性のDMSO−EC細胞について実施例2と同様に遺伝子の発現について確認したところ、CD44陽性且つCD29陽性DMSO−EC細胞と同様に、Oct3/4陰性、Nanog陰性、Slug陽性、Pax3陽性、Wnt1陽性の細胞であることが判明した。
ここで得られたCD44陽性且つCD106陽性細胞の細胞集団を用いて、実施例3及び実施例4(2)と同様に歯胚再構築、器官培養及びmRNAの発現を行い評価した。その結果、歯胚上皮細胞との相互作用による特有の組織構造を有する歯が形成された。また実施例4(2)と同様にしてアメロジェニン及びDSPP、ペルオスタチンの発現が認められた。このことから、硬組織、歯根膜を含む歯周組織の形成が可能であることが示唆された。
従って、本発明によれば、全能性幹細胞から歯形成用間葉系細胞を得ることができ、効率よく大量に歯を作製することができる。
12 細胞凝集塊(第1の細胞集合体)
14 細胞凝集塊(第2の細胞集合体)
16 ピペットチップ
Claims (10)
- 歯を形成するために用いられる間葉系細胞の製造方法であって、
全能性幹細胞を分化誘導剤の存在下で培養して、CD44陽性且つCD29陽性細胞又はCD44陽性且つCD106陽性細胞を含む分化誘導処理後の細胞集団を生成すること、
前記分化誘導処理後の細胞集団から、CD44陽性且つCD29陽性細胞又はCD44陽性且つCD106陽性細胞を、歯形成用間葉系細胞として選別すること、
選別されたCD44陽性且つCD29陽性細胞、又はCD44陽性且つCD106陽性細胞を分離すること、
を含み、前記歯形成用間葉系細胞を含む細胞集団が未分化の全能性幹細胞を含まない当該製造方法。 - 前記歯形成用間葉系細胞が更に、Slug遺伝子、Pax3遺伝子、Msx1遺伝子及びPax9遺伝子からなる群より選択された少なくとも1つを発現しているものである請求項1記載の製造方法。
- 前記歯形成用間葉系細胞が更に、Slug遺伝子及びPax3遺伝子を共に発現しているものである請求項1記載の製造方法。
- 前記全能性幹細胞が、胚性幹細胞、胚性癌腫細胞、胚性生殖幹細胞からなる群より選択された少なくとも1つである請求項1〜3のいずれか1項記載の製造方法。
- 前記全能性幹細胞が、胚性癌腫細胞であることを特徴とする請求項4記載の製造方法。
- 前記分化誘導剤が、ジメチルスルホキシド及びレチノイン酸から選択された少なくとも一方である請求項1〜5のいずれか1項記載の製造方法。
- 前記分離が、選別されたCD44陽性且つCD29陽性細胞、又はCD44陽性且つCD106陽性細胞をクローニングすることを含む請求項1〜請求項6のいずれか1項記載の製造方法。
- 支持担体の内部に、間葉系細胞及び上皮系細胞のいずれか一方のみから実質的になる第1の細胞集合体と、いずれか他方のみから実質的になる第2の細胞集合体とを混合することなく密着させて配置すること、
前記第1及び第2の細胞集合体を前記支持担体の内部で培養すること、
を含み、前記間葉系細胞が請求項1〜請求項7のいずれか1項記載の製造方法により得られた上記歯形成用間葉系細胞を含むものである歯の製造方法。 - 前記培養が、歯周組織が形成するまで継続するものである請求項8記載の歯の製造方法。
- 前記上皮系細胞が歯胚由来のものである請求項8又は請求項9記載の歯の製造方法。
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