JP5492791B2 - 歯の製造方法 - Google Patents
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Description
本発明は、所望の大きさを有する歯の製造方法等に関する。
歯は、最外層にエナメル質、その内層に象牙質という硬組織を有し、さらにその内側に象牙質を産生する象牙芽細胞、中心部に歯髄を有する器官である。歯は、齲蝕や歯周病によって失われることがあるが、歯の有無は外見や食べ物の味覚に大きく影響するため、歯の再生技術への関心が高まっている。また、健康維持や質の高い生活を維持するためにも、歯の再生技術への関心が高まっている。
歯は、胎児期の発生過程の誘導によって形成され、複数の細胞種によって構築された機能単位である。歯は、成体内の造血幹細胞や間葉系幹細胞のような幹細胞から細胞種が発生する幹細胞システムによって発生するのではないため、現在、再生医療によって進められている幹細胞の移入のみ（幹細胞移入療法）では歯を再生することはできない。歯の発生過程で特異的に発現する遺伝子を同定し、歯胚を人為的に誘導することによる歯の再生も検討されているが、遺伝子を特定しただけでは、歯の再生を完全に誘導することはできない。
歯は、胎児期の発生過程の誘導によって形成され、複数の細胞種によって構築された機能単位である。歯は、成体内の造血幹細胞や間葉系幹細胞のような幹細胞から細胞種が発生する幹細胞システムによって発生するのではないため、現在、再生医療によって進められている幹細胞の移入のみ（幹細胞移入療法）では歯を再生することはできない。歯の発生過程で特異的に発現する遺伝子を同定し、歯胚を人為的に誘導することによる歯の再生も検討されているが、遺伝子を特定しただけでは、歯の再生を完全に誘導することはできない。
そこで、近年、単離された歯胚由来の組織や細胞を用いて歯胚を再構成し、この再構成歯胚を移植することによって再生歯を得る方法が検討されている。
本発明者らは、これまでに、コラーゲンゲルなどからなる支持担体の内部に、少なくともいずれか一方が歯胚由来である間葉系細胞と上皮系細胞のいずれか一方のみから実質的になる第１の細胞凝集塊と、いずれか他方のみから実質的になる第２の細胞凝集塊を接触させて配置し、第１及び第２の細胞凝集塊を支持担体の内部で培養することによって、細胞の分化が効果的に誘導され、特有の細胞配置と方向性を備えた再生歯胚や再生歯を作製できることを見出した（例えば、特許文献１参照）。
さらに、口腔内上皮細胞やその初代培養細胞を上皮系細胞として利用した場合（例えば、特許文献２参照）、羊膜由来細胞を間葉系細胞として利用した場合（例えば、特許文献３参照）、全能性幹細胞を分化誘導した細胞を間葉系細胞として利用した場合（例えば、特許文献４参照）にも、同様に特有の細胞配置と方向性を備えた再生歯胚や再生歯が得られることを示した。
ところで、再生歯胚や再生歯においては、歯は部位によって大きさが異なり、またその大きさに個人差があるため、喪失した歯の部位に適合する歯を再生する観点から、その大きさを制御することが重要である。しかしながら、上述の文献では、再生歯の大きさの制御方法は検討されていない。さらに、上記方法では、再生歯の集合体が得られることもある。この場合には個々の歯を集合体から分離して移植片として用いられるが、歯の集合体に含まれる歯の数や個々の歯の大きさを制御することが困難であることは、これまでの三次元的な細胞操作技術が十分に開発されていないことや、発生生物学における形態制御のメカニズムが十分解明されていないことなどの観点から、容易に予想される。
所望の大きさや形状を有する再生歯の作製方法としては、歯乳頭や象牙質を形成する歯髄由来の間葉系細胞とエナメル形成に寄与する上皮系細胞とを含む歯胚の細胞混合物を、ポリグリコール酸−ポリ酢酸共重合体等からなる生分解性ポリマーを固化させたスキャフォールドに播種し、動物の体内に移植して歯を形成する方法も提案されている。この方法では、所定の形状のスキャフォールドを使用することによって、歯の形状を制御することが試みられている。しかしながら、再生歯は、上皮細胞層と間葉細胞層からなる歯胚に由来しており、歯胚は上皮細胞層と間葉細胞層間でおこる経時的な上皮・間葉相互作用をしながら成長することが知られている。そこで、スキャフォールドを用いると十分な細胞間相互作用が得られなくなるため、スキャフォールドの使用が望ましくないとの意見もある（例えば、非特許文献１参照）。また、スキャフォールドが分解する時間よりも、歯が形成される速度が速いことから、スキャフォールドを巻き込んだ歯が形成される可能性もあり、細胞配置や歯の形状の再現性が必ずしも高くないことが予想される。
一方、一般に正常な歯冠の形状は、再構成歯胚において間葉系組織が完全でなければ得られないと考えられていた。しかし、間葉系組織に代えて間葉系細胞凝集塊（組織を酵素処理等によって分離し、遠心処理によって得られる凝集塊）を用いても、細胞数をより多くすれば、in vitroの培養においてより大きなサイズの歯胚が得られ、歯尖の数も増加することが報告されている（例えば、非特許文献１参照）。しかしながら、この歯胚を生体内に移植しても、正常な歯と比較して歯冠の形状や歯尖の数が変化し、正しい形状の歯が得られていない。当該報告では、上皮系細胞凝集塊と間葉系細胞凝集塊の組み合わせによる再構成でも、正しい形状の歯は得られていない。当該報告では、結局、上皮系組織と間葉系細胞凝集塊を用いた再構成において、間葉系組織を使うことができれば正しい形態を作ることができるものの、歯の製造において単一化した間葉細胞を使わなければならないという制約が、細胞数を増加させることによって部分的に解消されることを示すにとどまっている。
また、上皮系組織と間葉系細胞凝集塊で再構成歯胚を作製した場合、間葉系細胞の数を増加させると、製造される歯の数が増えるが、歯の大きさには影響を与えないとの報告がなされている（非特許文献２）。当該報告では、歯と歯尖の最終的な大きさは、それぞれ間葉系組織と上皮系組織の内在的因子によって決定される、即ち、間葉系細胞と上皮系細胞は、それぞれ歯と歯尖の最終的な大きさに関する内在的な記憶を有していると結論づけている。
また、本発明者らは、製造する歯の数および形態を制御する方法として、上皮系細胞集合体と間葉系細胞集合体とを用いて再構成歯胚を製造する際に、上皮系細胞集合体として、エナメル結節を構成する領域を所望の歯の数と同数含む上皮系組織を用いる方法を見出した（特許文献５）。当該方法によれば、所望の数の歯を含む歯の集合体を得ることができる。しかしながら、エナメル結節を構成する領域を目的とする歯の数と同一の数で含む上皮系組織を入手しなければならない。また、特許文献５では、歯の大きさの制御については検討されていない。
Hu et al. Tissue Engineering Volume 12, Number 8, 2006, 2069-2075
J. Cai et al. Developmental Biology 304 (2007) 499-507
歯は、生えている場所によってその機能に適した大きさ及び形状を有し、同じ臼歯でも場所によって大きさ及び形状が異なる。また、歯の大きさには個人差もある。従って、喪失歯の治療のために再生歯胚や再生歯を作製するときには、移植する個体において適切な機能を果たすように、大きさを制御することが重要である。
また、発明者らの経験によれば、再生歯胚の大きさは種々の条件によって変化し得るものであり、細胞固有の「記憶」によって、再現性よく同じ大きさの歯が得られるものではない。
また、発明者らの経験によれば、再生歯胚の大きさは種々の条件によって変化し得るものであり、細胞固有の「記憶」によって、再現性よく同じ大きさの歯が得られるものではない。
そこで、本発明は、所望の大きさを有する歯、特に歯冠の幅が所望の長さである歯の製造方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、再生歯の歯冠の幅は、支持担体内における間葉系細胞集合体と上皮系細胞集合体の所定方向の接触長さに依存し、それぞれの細胞数には依存しないこと、従って、当該接触長さを調節することによって再生歯の歯冠の幅を制御できることを見出した。さらに、間葉系細胞と上皮系細胞の集合体をそれぞれ略柱状に形成した場合には、その柱の軸方向の接触長さを制御することによって、一方向に所望の長さを有する歯を形成できること；特に、接触長さを所望の長さの±２５％とすることによって、当該所望の長さを有する再生歯が得られること；歯の大きさの制御に伴って、歯尖の数も制御できること；接触長さを所定の数値以下とすることによって、単一の歯が得られること、等を見出し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は、
〔１〕一方向に所望の長さを有する歯を製造する方法であって、
支持担体の内部に、間葉系細胞と上皮系細胞のいずれか一方でそれぞれ構成された第１の細胞集合体と第２の細胞集合体を密着させて配置する工程と、
前記第１及び第２の細胞集合体を前記支持担体の内部で培養する工程と、を含み、
前記第１の細胞集合体と前記第２の細胞集合体の所定の一方向の接触長さを調節することによって歯の大きさを調節する、方法；
〔２〕一方向に所望の長さを有する歯を製造する方法であって、
支持担体の内部に、間葉系細胞と上皮系細胞のいずれか一方でそれぞれ構成された第１の細胞集合体と第２の細胞集合体を密着させて配置した構成体を、前記第１の細胞集合体と前記第２の細胞集合体の所定の一方向の接触長さを変更して複数種類作製する工程と、
前記複数種類の構成体を前記支持担体の内部でそれぞれ培養する工程と、
前工程で製造された歯の前記一方向の長さを測定し、該長さと前記接触長さとの相関関係を求める工程と、
前記相関関係に基づいて、一方向に所望の長さを有する歯を得るために必要な前記第１及び第２の細胞集合体の接触長さを算出する工程と、
支持担体の内部に、間葉系細胞と上皮系細胞のいずれか一方でそれぞれ構成された第１の細胞集合体と第２の細胞集合体を、前工程で算出された接触長さを有するように密着させて配置する工程と、
前記第１及び第２の細胞集合体を前記支持担体の内部で培養する工程と、を含む方法；
〔３〕一方向に所望の長さを有する歯を製造する方法であって、
支持担体の内部に、間葉系細胞と上皮系細胞のいずれか一方でそれぞれ構成された略柱状の第１の細胞集合体と第２の細胞集合体を、各柱の軸方向が平行になるように密着させて配置した構成体を、前記第１の細胞集合体と前記第２の細胞集合体の軸方向の接触長さを変更して複数種類作製する工程と、
前記複数種類の構成体を前記支持担体の内部でそれぞれ培養する工程と、
前工程で製造された歯の前記一方向の長さを測定し、該長さと前記接触長さとの相関関係を求める工程と、
前記相関関係に基づいて、一方向に所望の長さを有する歯を得るために必要な前記第１及び第２の細胞集合体の接触長さを算出する工程と、
支持担体の内部に、間葉系細胞と上皮系細胞のいずれか一方でそれぞれ構成された略柱状の第１の細胞集合体と第２の細胞集合体を、軸方向の接触長さが前工程で算出された長さとなるように、かつ、各柱の軸方向が平行になるように密着させて配置する工程と、
前記第１及び第２の細胞集合体を前記支持担体の内部で培養する工程と、を含む方法；
〔４〕近遠心方向及び／又は頬舌方向に所望の長さを有する臼歯を製造する方法であって、
支持担体の内部に、間葉系細胞と上皮系細胞のいずれか一方でそれぞれ構成された略柱状の第１の細胞集合体と第２の細胞集合体を、各柱の軸方向が平行になるように密着させて配置した構成体を、前記第１の細胞集合体と前記第２の細胞集合体の軸方向及び／又は軸と垂直方向の接触長さを変更して複数種類作製する工程と、
前記複数種類の構成体を前記支持担体の内部でそれぞれ培養する工程と、
前工程で製造された臼歯の近遠心方向及び／又は頬舌方向の長さを測定し、前記軸方向の接触長さと臼歯の近遠心方向の長さ、及び／又は、前記軸と垂直方向の接触長さと臼歯の頬舌方向の長さの相関関係を求める工程と、
前記相関関係に基づいて近遠心方向及び／又は頬舌方向に所望の長さを有する臼歯を得るために必要な前記第１の細胞集合体と第２の細胞集合体の軸方向及び／又は軸と垂直方向の接触長さを算出する工程と、
支持担体の内部に、間葉系細胞と上皮系細胞のいずれか一方でそれぞれ構成された略柱状の第１の細胞集合体と第２の細胞集合体を、軸方向及び／又は軸と垂直方向の接触長さが前工程で算出された長さとなるように、かつ、各柱の軸方向が平行となるように密着させて配置する工程と、
前記第１及び第２の細胞集合体を前記支持担体の内部で培養する工程と、を含む方法；
〔５〕一方向に所望の長さを有する歯を製造する方法であって、
支持担体の内部に、間葉系細胞と上皮系細胞のいずれか一方でそれぞれ構成された略柱状の第１の細胞集合体と第２の細胞集合体を、各柱の軸方向が平行になるように密着させ、該第１及び第２の柱状細胞集合体の軸方向の接触長さが前記所望の長さの約±２５％となるように配置する工程と、
前記第１及び第２の細胞集合体を前記支持担体の内部で培養する工程と、を含む方法；
〔６〕前記支持担体内部に前記第１及び第２の細胞集合体を配置する工程は、
前記支持担体内部に前記第１及び第２の細胞集合体を配置した構成体を複数作製する工程と、
前記第１及び第２の細胞集合体の軸方向の接触長さを測定する工程と、
前記測定した接触長さが、前記所望の長さの約±２５％である構成体を選択する工程と、を含む、上記〔５〕に記載の方法；
〔７〕単一の歯を製造する方法であって、
支持担体の内部に、間葉系細胞と上皮系細胞のいずれか一方でそれぞれ構成された第１の細胞集合体と第２の細胞集合体を密着させて配置する工程と、
前記第１及び第２の細胞集合体を前記支持担体の内部で培養する工程と、を含み、
前記第１の細胞集合体と前記第２の細胞集合体の最大接触長さを所定の値以下とする、方法；
〔８〕前記細胞集合体が、いずれも細胞凝集塊である、上記〔１〕から〔７〕のいずれか１項に記載の方法；
〔９〕前記間葉系細胞及び前記上皮系細胞の少なくとも一方が歯胚由来である、上記〔１〕から〔８〕のいずれか１項に記載の方法；
〔１０〕口腔内の歯の欠損部の修復方法であって、
上記〔１〕から〔９〕のいずれか１項に記載の方法で得られた歯を、前記欠損部に移植する工程を含む、方法；
〔１１〕上記〔１〕から〔９〕のいずれか１項に記載の方法で得られた歯を、２個以上に分割することなくそのまま前記欠損部に移植する、上記〔１０〕に記載の方法；
〔１２〕前記間葉系細胞及び前記上皮系細胞は、前記欠損部を有する個体由来である、上記〔１０〕又は〔１１〕に記載の方法；
〔１３〕前記口腔内が、非ヒト哺乳動物の口腔内である、上記〔１０〕から〔１２〕のいずれか１項に記載の方法；
〔１４〕所定の条件下で、一方向に所望の長さを有する歯を製造する方法を設計する方法であって、
上記設計方法は、支持担体の内部に、間葉系細胞と上皮系細胞のいずれか一方でそれぞれ構成された第１の細胞集合体と第２の細胞集合体を、密着させて配置する場合に、所望の大きさの歯を製造するために必要な両細胞集合体の所定の一方向の接触長さを決定する方法を含み、
さらに、前記接触長さを決定する方法は、
支持担体の内部に、間葉系細胞と上皮系細胞のいずれか一方でそれぞれ構成された第１の細胞集合体と第２の細胞集合体を密着させて配置した構成体を、前記第１の細胞集合体と前記第２の細胞集合体の所定の一方向の接触長さを変更して複数種類作製する工程と、
前記複数種類の構成体を前記支持担体の内部でそれぞれ培養する工程と、
前工程で製造された歯の前記一方向の長さを測定し、前記接触長さと歯の一方向の長さとの相関関係を求める工程と、
前記相関関係に基づいて、前記一方向に所望の長さを有する歯を得るために必要な前記第１及び第２の細胞集合体の接触長さを算出する工程と、を含む方法；
〔１５〕所定の条件下で、単一の歯を製造する方法を設計する方法であって、
上記設計方法は、支持担体の内部に、間葉系細胞と上皮系細胞のいずれか一方でそれぞれ構成された第１の細胞集合体と第２の細胞集合体を、密着させて配置する場合に、単一の歯を製造するために必要な両細胞集合体の最大接触長さを決定する方法を含み、
さらに、前記最大接触長さを決定する方法は、
支持担体の内部に、間葉系細胞と上皮系細胞のいずれか一方でそれぞれ構成された第１の細胞集合体と第２の細胞集合体を密着させて配置した構成体を、前記第１の細胞集合体と前記第２の細胞集合体の最大接触長さを変更して複数種類作製する工程と、
前記複数種類の構成体を前記支持担体の内部でそれぞれ培養する工程と、
前工程で製造された歯の数を測定し、単一の歯を得るための前記第１及び第２の細胞集合体の最大接触長さを求める工程と、を含む方法；及び
〔１６〕前記間葉系細胞及び前記上皮系細胞の少なくとも一方が歯胚由来である、上記〔１４〕又は〔１５〕に記載の方法、に関する。
即ち、本発明は、
〔１〕一方向に所望の長さを有する歯を製造する方法であって、
支持担体の内部に、間葉系細胞と上皮系細胞のいずれか一方でそれぞれ構成された第１の細胞集合体と第２の細胞集合体を密着させて配置する工程と、
前記第１及び第２の細胞集合体を前記支持担体の内部で培養する工程と、を含み、
前記第１の細胞集合体と前記第２の細胞集合体の所定の一方向の接触長さを調節することによって歯の大きさを調節する、方法；
〔２〕一方向に所望の長さを有する歯を製造する方法であって、
支持担体の内部に、間葉系細胞と上皮系細胞のいずれか一方でそれぞれ構成された第１の細胞集合体と第２の細胞集合体を密着させて配置した構成体を、前記第１の細胞集合体と前記第２の細胞集合体の所定の一方向の接触長さを変更して複数種類作製する工程と、
前記複数種類の構成体を前記支持担体の内部でそれぞれ培養する工程と、
前工程で製造された歯の前記一方向の長さを測定し、該長さと前記接触長さとの相関関係を求める工程と、
前記相関関係に基づいて、一方向に所望の長さを有する歯を得るために必要な前記第１及び第２の細胞集合体の接触長さを算出する工程と、
支持担体の内部に、間葉系細胞と上皮系細胞のいずれか一方でそれぞれ構成された第１の細胞集合体と第２の細胞集合体を、前工程で算出された接触長さを有するように密着させて配置する工程と、
前記第１及び第２の細胞集合体を前記支持担体の内部で培養する工程と、を含む方法；
〔３〕一方向に所望の長さを有する歯を製造する方法であって、
支持担体の内部に、間葉系細胞と上皮系細胞のいずれか一方でそれぞれ構成された略柱状の第１の細胞集合体と第２の細胞集合体を、各柱の軸方向が平行になるように密着させて配置した構成体を、前記第１の細胞集合体と前記第２の細胞集合体の軸方向の接触長さを変更して複数種類作製する工程と、
前記複数種類の構成体を前記支持担体の内部でそれぞれ培養する工程と、
前工程で製造された歯の前記一方向の長さを測定し、該長さと前記接触長さとの相関関係を求める工程と、
前記相関関係に基づいて、一方向に所望の長さを有する歯を得るために必要な前記第１及び第２の細胞集合体の接触長さを算出する工程と、
支持担体の内部に、間葉系細胞と上皮系細胞のいずれか一方でそれぞれ構成された略柱状の第１の細胞集合体と第２の細胞集合体を、軸方向の接触長さが前工程で算出された長さとなるように、かつ、各柱の軸方向が平行になるように密着させて配置する工程と、
前記第１及び第２の細胞集合体を前記支持担体の内部で培養する工程と、を含む方法；
〔４〕近遠心方向及び／又は頬舌方向に所望の長さを有する臼歯を製造する方法であって、
支持担体の内部に、間葉系細胞と上皮系細胞のいずれか一方でそれぞれ構成された略柱状の第１の細胞集合体と第２の細胞集合体を、各柱の軸方向が平行になるように密着させて配置した構成体を、前記第１の細胞集合体と前記第２の細胞集合体の軸方向及び／又は軸と垂直方向の接触長さを変更して複数種類作製する工程と、
前記複数種類の構成体を前記支持担体の内部でそれぞれ培養する工程と、
前工程で製造された臼歯の近遠心方向及び／又は頬舌方向の長さを測定し、前記軸方向の接触長さと臼歯の近遠心方向の長さ、及び／又は、前記軸と垂直方向の接触長さと臼歯の頬舌方向の長さの相関関係を求める工程と、
前記相関関係に基づいて近遠心方向及び／又は頬舌方向に所望の長さを有する臼歯を得るために必要な前記第１の細胞集合体と第２の細胞集合体の軸方向及び／又は軸と垂直方向の接触長さを算出する工程と、
支持担体の内部に、間葉系細胞と上皮系細胞のいずれか一方でそれぞれ構成された略柱状の第１の細胞集合体と第２の細胞集合体を、軸方向及び／又は軸と垂直方向の接触長さが前工程で算出された長さとなるように、かつ、各柱の軸方向が平行となるように密着させて配置する工程と、
前記第１及び第２の細胞集合体を前記支持担体の内部で培養する工程と、を含む方法；
〔５〕一方向に所望の長さを有する歯を製造する方法であって、
支持担体の内部に、間葉系細胞と上皮系細胞のいずれか一方でそれぞれ構成された略柱状の第１の細胞集合体と第２の細胞集合体を、各柱の軸方向が平行になるように密着させ、該第１及び第２の柱状細胞集合体の軸方向の接触長さが前記所望の長さの約±２５％となるように配置する工程と、
前記第１及び第２の細胞集合体を前記支持担体の内部で培養する工程と、を含む方法；
〔６〕前記支持担体内部に前記第１及び第２の細胞集合体を配置する工程は、
前記支持担体内部に前記第１及び第２の細胞集合体を配置した構成体を複数作製する工程と、
前記第１及び第２の細胞集合体の軸方向の接触長さを測定する工程と、
前記測定した接触長さが、前記所望の長さの約±２５％である構成体を選択する工程と、を含む、上記〔５〕に記載の方法；
〔７〕単一の歯を製造する方法であって、
支持担体の内部に、間葉系細胞と上皮系細胞のいずれか一方でそれぞれ構成された第１の細胞集合体と第２の細胞集合体を密着させて配置する工程と、
前記第１及び第２の細胞集合体を前記支持担体の内部で培養する工程と、を含み、
前記第１の細胞集合体と前記第２の細胞集合体の最大接触長さを所定の値以下とする、方法；
〔８〕前記細胞集合体が、いずれも細胞凝集塊である、上記〔１〕から〔７〕のいずれか１項に記載の方法；
〔９〕前記間葉系細胞及び前記上皮系細胞の少なくとも一方が歯胚由来である、上記〔１〕から〔８〕のいずれか１項に記載の方法；
〔１０〕口腔内の歯の欠損部の修復方法であって、
上記〔１〕から〔９〕のいずれか１項に記載の方法で得られた歯を、前記欠損部に移植する工程を含む、方法；
〔１１〕上記〔１〕から〔９〕のいずれか１項に記載の方法で得られた歯を、２個以上に分割することなくそのまま前記欠損部に移植する、上記〔１０〕に記載の方法；
〔１２〕前記間葉系細胞及び前記上皮系細胞は、前記欠損部を有する個体由来である、上記〔１０〕又は〔１１〕に記載の方法；
〔１３〕前記口腔内が、非ヒト哺乳動物の口腔内である、上記〔１０〕から〔１２〕のいずれか１項に記載の方法；
〔１４〕所定の条件下で、一方向に所望の長さを有する歯を製造する方法を設計する方法であって、
上記設計方法は、支持担体の内部に、間葉系細胞と上皮系細胞のいずれか一方でそれぞれ構成された第１の細胞集合体と第２の細胞集合体を、密着させて配置する場合に、所望の大きさの歯を製造するために必要な両細胞集合体の所定の一方向の接触長さを決定する方法を含み、
さらに、前記接触長さを決定する方法は、
支持担体の内部に、間葉系細胞と上皮系細胞のいずれか一方でそれぞれ構成された第１の細胞集合体と第２の細胞集合体を密着させて配置した構成体を、前記第１の細胞集合体と前記第２の細胞集合体の所定の一方向の接触長さを変更して複数種類作製する工程と、
前記複数種類の構成体を前記支持担体の内部でそれぞれ培養する工程と、
前工程で製造された歯の前記一方向の長さを測定し、前記接触長さと歯の一方向の長さとの相関関係を求める工程と、
前記相関関係に基づいて、前記一方向に所望の長さを有する歯を得るために必要な前記第１及び第２の細胞集合体の接触長さを算出する工程と、を含む方法；
〔１５〕所定の条件下で、単一の歯を製造する方法を設計する方法であって、
上記設計方法は、支持担体の内部に、間葉系細胞と上皮系細胞のいずれか一方でそれぞれ構成された第１の細胞集合体と第２の細胞集合体を、密着させて配置する場合に、単一の歯を製造するために必要な両細胞集合体の最大接触長さを決定する方法を含み、
さらに、前記最大接触長さを決定する方法は、
支持担体の内部に、間葉系細胞と上皮系細胞のいずれか一方でそれぞれ構成された第１の細胞集合体と第２の細胞集合体を密着させて配置した構成体を、前記第１の細胞集合体と前記第２の細胞集合体の最大接触長さを変更して複数種類作製する工程と、
前記複数種類の構成体を前記支持担体の内部でそれぞれ培養する工程と、
前工程で製造された歯の数を測定し、単一の歯を得るための前記第１及び第２の細胞集合体の最大接触長さを求める工程と、を含む方法；及び
〔１６〕前記間葉系細胞及び前記上皮系細胞の少なくとも一方が歯胚由来である、上記〔１４〕又は〔１５〕に記載の方法、に関する。
本発明によれば、支持担体内部に間葉系細胞集合体と上皮系細胞集合体を密着させて配置する際、間葉系細胞と上皮系細胞の所定方向の接触長さを調節することにより、作製される再生歯胚及び再生歯において当該接触長さ方向の歯冠の幅を制御することができる。
特に、間葉系細胞集合体と上皮系細胞集合体を略柱状に形成した場合、その柱の軸方向の接触長さを制御することによって、当該軸方向に所望の長さを有する歯を形成することができる。
また、所望の大きさの歯を製造できる接触長さの決定を含む歯の製造方法の設計も本発明に従って行うことができる。
また、本発明の方法によれば、各細胞集合体に含まれる細胞数にかかわらず、所定の接触長さを得られれば所望の長さを有する歯を製造できることから、少ない細胞で効率よく所望の大きさを達成することが可能である。
さらに、本発明において、各細胞集合間の接触長さを所定の値以下とすることによって、複数の歯の集合体ではなく、単一の歯として得ることができるので、分離する工程を経ることなく、そのまま移植片として用いることが可能である。
特に、間葉系細胞集合体と上皮系細胞集合体を略柱状に形成した場合、その柱の軸方向の接触長さを制御することによって、当該軸方向に所望の長さを有する歯を形成することができる。
また、所望の大きさの歯を製造できる接触長さの決定を含む歯の製造方法の設計も本発明に従って行うことができる。
また、本発明の方法によれば、各細胞集合体に含まれる細胞数にかかわらず、所定の接触長さを得られれば所望の長さを有する歯を製造できることから、少ない細胞で効率よく所望の大きさを達成することが可能である。
さらに、本発明において、各細胞集合間の接触長さを所定の値以下とすることによって、複数の歯の集合体ではなく、単一の歯として得ることができるので、分離する工程を経ることなく、そのまま移植片として用いることが可能である。
本発明に係る所望の歯を製造する方法は、支持担体の内部に、間葉系細胞と上皮系細胞のいずれか一方でそれぞれ構成された第１の細胞集合体と第２の細胞集合体とを密着させて配置する工程と、第１及び第２の細胞集合体を支持担体の内部で培養する工程と、を含み、第１と第２の細胞集合体の一方向の接触長さを調節することによって歯の大きさを調節することを特徴とする。
本発明において、「歯」とは、内側に象牙質及び外側にエナメル質の層を連続して備えた組織をいい、歯冠や歯根を有する方向性を備えた組織を意味する。歯の方向性は歯冠や歯根の配置によって特定することができる。歯冠や歯根は、形状や組織染色などに基づいて目視にて確認することができる。歯冠とは、エナメル質と象牙質の層構造を有する部分をいい、歯根にはエナメル質の層は存在しない。
象牙質及びエナメル質は、当業者が、組織染色などによって形態的に容易に特定することができる。また、エナメル質は、エナメル芽細胞の存在によって特定することができ、エナメル芽細胞の存在は、アメロジェニンの有無によって確認することができる。一方、象牙質は、象牙芽細胞の存在によって特定することができ、象牙芽細胞の存在は、デンチンシアロプロテインの有無によって確認することができる。アメロジェニン及びデンチンシアロプロテインの確認は、この分野で周知の方法によって容易に実施することができ、例えば、in situハイブリダイゼーション、抗体染色等を挙げることができる。
本発明において「歯胚」及び「歯芽」は、発生段階に基づいて区別されたものに特に言及する場合に用いられる表現である。この場合の歯胚とは、将来歯になることが決定付けられた歯の初期胚であり、歯の発生ステージで一般的に用いられる蕾状期（Bud stage）から鐘状期（Bell stage）までの段階のものを指し、特に歯の硬組織としての特徴である象牙質、エナメル質の蓄積が認められない組織である。一方、「歯芽」とは、本発明で用いられる「歯胚」の段階より後の組織を指し、歯の硬組織の特徴である象牙質、エナメル質の蓄積が始まった段階から、歯が歯肉から萌出して一般的に歯としての機能を発現する前の段階の組織をいう。歯胚から歯への発生は、蕾状期、帽状期、鐘状前記及び後記の各ステージを経て行われる。蕾状期では、上皮系細胞が間葉系細胞へと肥厚するように陥入し、帽状期では、上皮系細胞が間葉系細胞を包み込むように陥入する。鐘状期前記及び鐘状期後期に至ると、上皮系細胞部分が外側のエナメル質となり、間葉系細胞部分が内部に象牙質を形成するようになる。歯胚の発生は、サイトカインなどを介した上皮系細胞と間葉系細胞との細胞間相互作用によって制御され、歯が形成される。
本発明において「間葉系細胞」は、間葉組織由来の細胞及びその細胞を培養して得られる細胞を意味し、「上皮系細胞」は、上皮組織由来の細胞及びその細胞を培養して得られる細胞を意味する。
また、本発明において「歯周組織」とは、歯の主として外層に形成された歯槽骨及び歯根膜をいう。歯槽骨及び歯根膜は、当業者が、組織染色などによって形態的に容易に特定することができる。
また、本発明において「歯周組織」とは、歯の主として外層に形成された歯槽骨及び歯根膜をいう。歯槽骨及び歯根膜は、当業者が、組織染色などによって形態的に容易に特定することができる。
本発明における、「支持担体の内部に、間葉系細胞と上皮系細胞のいずれか一方でそれぞれ構成された第１の細胞集合体と第２の細胞集合体を密着させて配置する工程（以下、「配置工程」と呼ぶこともある。）」は、例えば、特許文献１乃至５に記載されており、その開示は全体として本明細書に参照として組み込まれる。
上記第１の細胞集合体と第２の細胞集合体は、それぞれ実質的に間葉系細胞のみ、又は上皮系細胞のみで構成されている。「実質的に間葉系細胞のみで構成されている」とは、本発明において、ある細胞集合体が間葉系細胞のみから構成されている場合と同じ機能を果たすことを意味し、間葉系細胞となる細胞以外のものをできるだけ含まない状態をいう。「実質的に上皮系細胞のみからなる」という場合も同様である。
ここで、細胞集合体とは、細胞が密着した状態をいい、組織であっても、ばらばらの細胞から調製された細胞凝集塊であってもよい。組織を用いれば、細胞配置や形状の正しい歯が得られやすいという利点があるが、入手できる量に制約がある場合もある。細胞凝集塊は、培養細胞も用いることができるので、比較的入手しやすく好ましい。本発明に係る方法によれば、細胞凝集塊を用いても、細胞配置や形状の正しい再生歯を得ることができる。
ここで、細胞集合体とは、細胞が密着した状態をいい、組織であっても、ばらばらの細胞から調製された細胞凝集塊であってもよい。組織を用いれば、細胞配置や形状の正しい歯が得られやすいという利点があるが、入手できる量に制約がある場合もある。細胞凝集塊は、培養細胞も用いることができるので、比較的入手しやすく好ましい。本発明に係る方法によれば、細胞凝集塊を用いても、細胞配置や形状の正しい再生歯を得ることができる。
細胞集合体を構成する間葉系細胞及び上皮系細胞は、それらを用いて形成した再構成歯胚から再生歯が発生する限り、生体内のどの組織に由来するものであってもよい。好ましくは、生体内での細胞配置を再現して特有の構造及び方向性を有する歯を効果的に形成させる観点からは少なくともいずれか一方を歯胚由来とする。また、間葉系細胞及び上皮系細胞がいずれも歯胚由来であることがより好ましい。当該歯胚は、細胞の分化段階の幼若性と均質性の観点から、蕾状期から帽状期のものであることが好ましい。
歯胚以外に由来する間葉系細胞として、生体内の他の間葉系組織に由来する細胞を用いることもできる。好ましくは、血液細胞を含まない骨髄細胞や間葉系細胞、さらに好ましくは口腔内間葉系細胞や顎骨の内部の骨髄細胞、頭部神経堤細胞に由来する間葉系細胞、これらの間葉系細胞に分化しうる間葉系前駆細胞やその幹細胞等である。間葉系細胞として、羊膜由来細胞を用いる例が特許文献３に、全能性幹細胞を分化誘導した細胞を用いる例が特許文献４に記載されており、その開示は全体として本明細書に参照として組み込まれる。
歯胚以外に由来する上皮系細胞として、生体内の他の上皮系組織に由来する細胞を用いることもできる。好ましくは、皮膚や口腔内の粘膜や歯肉の上皮系細胞、さらに好ましくは皮膚や粘膜などの分化した、例えば角化した、あるいは錯角化した上皮系細胞に分化しうる未熟な上皮系前駆細胞、例えば非角化上皮系細胞やその幹細胞等である。口腔内上皮細胞やその初代培養細胞を上皮系細胞として用いる例が特許文献２に記載されており、その開示は全体として本明細書に参照として組み込まれる。
歯胚及び他の組織は、哺乳動物の霊長類（例えばヒト、サルなど）、有蹄類（例えばブタ、ウシ、ウマなど）、小型哺乳類のげっ歯類（例えばマウス、ラット、ウサギなど）のほか、イヌ、ネコなど種々の動物の顎骨等から採取することができる。歯胚及び組織の採取は、通常、組織の採取で用いられる条件をそのまま適用すればよく、無菌状態で取り出し、適当な保存液に保存すればよい。なお、ヒトの歯胚としては、第３大臼歯いわゆる親知らずの歯胚のほか、胎児歯胚を挙げることができるが、自家組織の利用の観点から、親知らずの歯胚を用いることが好ましい。また、マウスの場合、胎児齢10日から16日の歯胚を用いることが好ましい。
歯胚からの間葉系細胞及び上皮系細胞の調製は、まず周囲の組織から単離された歯胚を、形状に従って、歯胚間葉組織及び歯胚上皮組織に分離することによって行われる。この際、分離を容易に行うため酵素を用いてもよい。酵素としては、ディスパーゼ、コラーゲナーゼ、トリプシン等を挙げることができる。
本発明における細胞凝集塊は、間葉組織または上皮組織に由来する細胞が凝集したものを意味し、間葉組織又は上皮組織をばらばらに分散させて得た細胞、あるいは当該細胞の初代または継代培養によって得た細胞を凝集させて調製することができる。
細胞を分散させるためには、ディスパーゼ、コラーゲナーゼ、トリプシン等の酵素を用いてもよい。十分な細胞数を得るために、細胞凝集塊を調製する前に分散した細胞の初代または継代培養を行う場合、培養に用いられる培地としては、一般に動物細胞の培養に用いられる培地、例えばダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）等を用いることができる。細胞の増殖を促進するための血清を添加するか、あるいは血清に代替するものとして、例えばＦＧＦ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ等の細胞増殖因子やトランスフェリン等の既知血清成分を添加してもよい。なお、血清を添加する場合の濃度は、そのときの培養状態によって適宜変更することができるが、通常10％前後とすることができる。細胞の培養には、通常の培養条件、例えば約37℃の温度で5％CO2濃度のインキュベーター内での培養が適用される。また、適宜、ストレプトマイシン等の抗生物質を添加したものであってもよい。
細胞を凝集させるためには、例えば、細胞懸濁液を遠心処理すればよい。間葉系細胞及び上皮系細胞の細胞凝集塊は、両者を密着させたときに確実に細胞相互作用するよう、それぞれを高密度の状態にしておくことが好ましい。高密度の状態とは、組織を構成する際の密度と同等程度であることをいい、例えば、5×107個/ml〜1×109個/ml、好ましくは1×108個/ml〜1×109個/ml、最も好ましくは2×108個/ml〜8×108個／mlである。細胞凝集塊を高密度にする方法は特に限定されないが、例えば、細胞を遠心処理によって凝集させ沈殿化する方法によって行うことができる。遠心処理は細胞の活性を損なわずに簡便に高密度化できるため好ましい。遠心処理は、300×g〜1200×g、好ましくは500×g〜1000×gの遠心力を与える回転数で3分間〜10分間行えばよい。300×gよりも低い遠心処理では、細胞密度を十分に高くできなくなる傾向があり、一方、1200×gよりも高い遠心処理では、細胞が損傷を受ける場合がある。
遠心分離によって高密度の細胞凝集塊を調製する場合には、通常、細胞の遠心分離をするために用いられるチューブ等の容器に細胞の懸濁液を調製してから遠心分離を行い、沈殿物としての細胞を残して上清をできるだけ除去すればよい。このとき、目的とする細胞以外の成分（例えば、培養液、緩衝液等）は、細胞の容量と等量以下であることが好ましく、目的とする細胞以外の成分を含まないことが最も好ましい。このような高密度の細胞集合体を後述する方法により支持担体内で密着させれば、細胞が緊密に接触し、細胞間相互作用が効果的に発揮される。
本発明で用いられる支持担体としては、細胞を内部で培養可能なものであればよく、好ましくは、上記培地との混合物である。支持担体の材料は特に限定されないが、例えば、コラーゲン、アガロースゲル、カルボキシメチルセルロース、ゼラチン、寒天、ハイドロゲル、セルマトリクス（商品名）、メビオールゲル（商品名）、マトリゲル（商品名）、エラスチン、フィブリン、ラミニン、細胞外マトリクス混合物、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、乳酸／グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）等を挙げることができる。これらの支持担体は、細胞集合体を内部に配置したときに、配置した位置をほぼ維持可能な程度の硬度を有するものであればよく、ゲル状、繊維状、固体状のものを挙げることができる。中でも、適切な硬さや保持力を有するコラーゲン、アガロースゲル、カルボキシメチルセルロース、ゼラチン、寒天、ハイドロゲル、セルマトリクス、メビオールゲル、マトリゲル、細胞外マトリクス混合物、エラスチン、フィブリン、ラミニンが好ましい。細胞の位置を維持可能な硬さとは、例えば、三次元培養に適応可能な硬さ、即ち、細胞の配置を保持できると共に、増殖による肥大化を阻害しない硬さであればよく、当業者は容易に決定することができる。
また、本発明に用いられる支持担体は、細胞が分散することなく、細胞集合体の密着状態を保持可能な保持力を備えている。密着した状態とは、上述した高密度の間葉系細胞及び上皮系細胞の細胞集合体が、間葉系細胞と上皮系細胞の接触面付近においても同程度の高さの密度を維持している状態を意味する。密着状態を保持可能な支持担体は、例えば、コラーゲンの場合、最終濃度2 mg/ml〜3mg/mlの濃度、即ちJIS-K6503-1996に準拠した方法（12.7mm径のプランジャーで4mm押し下げるのに必要な荷重として測定）によって120g〜250gのゼリー強度となる濃度での使用が適切な硬さを提供する。他の種類の支持担体においても、同様の評価方法によって同様の強度があれば本発明の支持担体として好ましく用いられる。また１種又は複数種の支持担体を混合することによって、目的とするゼリー強度に相当する硬さの支持担体を得てもよい。
第１及び第２の細胞集合体を支持担体内に配置する方法は特に限定されないが、細胞集合体が細胞凝集塊である場合は、例えば上述した遠心分離で得られる沈殿物をマイクロシリンジ等で支持担体内に挿入して配置することができる。細胞集合体が組織である場合には、シリンジの針の先端などを用いて支持担体内の任意に位置に配置することができる。
本発明において第１と第２の細胞集合体を支持担体に密着させて配置する方法は特に限定されないが、例えば、一方の細胞集合体を支持担体内に配置したあと、他方の細胞集合体をそれに押しつけるように配置することによって、両者を密着させることができる。より具体的には、支持担体内において上記シリンジの針の先端の位置を適宜変更することで一方の細胞集合体を他方の細胞集合体に押し付けることが可能である。なお、細胞集合体として上皮系組織又は間葉系組織を用いる場合には、当該組織が元々の歯胚において間葉系組織又は上皮系組織と接触していた面を、他方の細胞集合体に接触するように配置することが好ましい。
また、配置した後に、支持担体を固化する工程を設けることも好ましい。これにより、細胞がさらに凝集して、より高密度な状態とすることができる。例えば、コラーゲンゲルの場合、培養温度下で数分〜数十分間静置することによって固化することができる。このとき、細胞集合体内に細胞以外の成分が少なければ少ないほど、より高密度な状態が実現される。
また、配置した後に、支持担体を固化する工程を設けることも好ましい。これにより、細胞がさらに凝集して、より高密度な状態とすることができる。例えば、コラーゲンゲルの場合、培養温度下で数分〜数十分間静置することによって固化することができる。このとき、細胞集合体内に細胞以外の成分が少なければ少ないほど、より高密度な状態が実現される。
本発明における、「第１及び第２の細胞集合体を支持担体の内部で培養する工程（以下、「培養工程」と呼ぶこともある。）は、例えば、特許文献１乃至５に記載されており、その開示は全体として本明細書に参照として組み込まれる。
培養期間は、支持担体内部に配置された細胞数、細胞集合体の状態、培養の条件、動物種等によって異なり、当業者が適宜選択することができる。口腔内に移植した際に機能的な歯として萌出するためには、少なくとも１日培養することが好ましく、３日以上がより好ましい。
培養期間を長くすることによって、象牙質及びエナメル質の蓄積、歯冠の形成、及び歯根の形成のように、再構成歯胚の形成をより進行させることができる。所望の状態を得るために、例えば、６日以上、３０日以上、５０日以上、１００日以上、又は３００日以上培養してもよく、培養の途中で、培地や培養条件を変更することもできる。
培養期間を長くすることによって、象牙質及びエナメル質の蓄積、歯冠の形成、及び歯根の形成のように、再構成歯胚の形成をより進行させることができる。所望の状態を得るために、例えば、６日以上、３０日以上、５０日以上、１００日以上、又は３００日以上培養してもよく、培養の途中で、培地や培養条件を変更することもできる。
支持担体内部における培養工程は、第１及び第２の細胞集合体を内包する支持担体を単独で培養してもよく、他の動物細胞等の存在下で培養してもよい。
支持担体を単独で培養する場合、培養条件は、一般的な動物細胞の培養に用いられる条件とすることができる。また、培養には、哺乳動物由来の血清を添加してもよく、またこれらの細胞の増殖や分化に有効であることが知られている各種細胞因子を添加してもよい。このような細胞因子としては、ＦＧＦ、ＢＭＰ等を挙げることができる。
支持担体を単独で培養する場合、培養条件は、一般的な動物細胞の培養に用いられる条件とすることができる。また、培養には、哺乳動物由来の血清を添加してもよく、またこれらの細胞の増殖や分化に有効であることが知られている各種細胞因子を添加してもよい。このような細胞因子としては、ＦＧＦ、ＢＭＰ等を挙げることができる。
細胞集合体のガス交換や栄養供給の観点、及び他の動物細胞との接触・混入がなく、且つ全工程をin vitroで行うことができるという観点から、支持担体内部における培養を、器官培養とすることが好ましい。器官培養では、一般に、動物細胞の増殖に適した培地上に多孔性の膜をフロートさせ、その膜上に第１及び第２の細胞集合体を内包する支持担体を載置して培養を行う。ここで用いられる多孔性の膜は、0.3〜5μm程度の孔を多数有するものであることが好ましく、例えば、セルカルチャーインサート（商品名）やアイソポアフィルター（商品名）を挙げることができる。
一方、支持担体内部における培養を他の動物細胞の存在下で行うと、動物細胞からの各種サイトカイン等の作用を受けて、早期に特有の細胞配置を有する歯を形成することができる。他の動物細胞の存在下で培養する場合は、単離細胞や培養細胞を用いて生体外で培養してもよく、また、第１及び第２の細胞集合体を内包する支持担体ごと生体に移植して培養してもよい。
特に、生体内に移植して行う培養は、歯及び／又は歯周組織の形成を早期に行うことができるので好ましい。生体として用いられる動物は、哺乳動物、好ましくは、豚、マウス等の非ヒト哺乳動物を挙げることができ、歯胚組織と同一の種であることが特に好ましい。歯胚組織と同一の種でない動物に移植して培養する場合は、免疫不全に改変した動物を用いることが好ましい。生体内成育に好適な生体部位としては、動物細胞の器官や組織をできる限り正常に発生させるために、腎皮膜下、腸間膜、皮下等が好ましい。
移植後の培養期間は、移植時の歯の大きさと発生させる歯の大きさによって異なるが、一般に３日〜４００日とすることができる。例えば、腎皮膜下に移植する場合、移植する歯胚の大きさと再生させる歯の大きさによっても異なるが、７日〜６０日程度が好ましい。
移植後の培養期間は、移植時の歯の大きさと発生させる歯の大きさによって異なるが、一般に３日〜４００日とすることができる。例えば、腎皮膜下に移植する場合、移植する歯胚の大きさと再生させる歯の大きさによっても異なるが、７日〜６０日程度が好ましい。
生体に移植して培養する場合、生体外で前培養を行ってもよい。前培養によって細胞間の結合と第１及び第２の細胞集合体間の結合を強固にし、細胞間相互作用をより強固にすることができる。その結果、細胞間相互作用も強固にすることができ、全体の成育期間を短縮することができる。
前培養の期間は特に限定されないが、例えば、３日以上、好ましくは７日以上とすることにより、歯胚から歯芽に成長させることができるので、移植後の培養期間を短縮することができる。例えば、腎皮膜下に移植して培養を行い、その前培養として器官培養を行う場合、当該器官培養は１〜７日とすることが好ましい。
前培養の期間は特に限定されないが、例えば、３日以上、好ましくは７日以上とすることにより、歯胚から歯芽に成長させることができるので、移植後の培養期間を短縮することができる。例えば、腎皮膜下に移植して培養を行い、その前培養として器官培養を行う場合、当該器官培養は１〜７日とすることが好ましい。
上記配置工程及び培養工程によって得られる歯は、内側に象牙質、外側にエナメル質という歯特有の細胞配置（構造）を有するものであり、好ましくは、歯の先端（歯冠）と歯根を正しい位置に有する方向性も備えたものであり、歯としての機能を十分に果たすものである。従って、歯の代替物として広く利用することが可能である。また、歯の発生過程を解明するための研究に有用なリサーチツールとして用いることもできる。
さらに、培養期間を延長することによって、歯そのものに加え、歯を顎骨上で支持し固定化する歯槽骨や歯根膜などの歯周組織も形成させることができる。これにより、移植後の歯の実用性をさらに高めることができる。また、歯周組織のみを分離して利用することも可能である。
本発明は、上記配置工程において、第１の細胞集合体と第２の細胞集合体の所定の一方向の接触長さを調節することによって、得られる歯の一方向の長さを調節することを特徴とする。
接触長さは、支持担体内に配置する細胞集合体の大きさ、形状、位置等によって調節することができる。例えば、支持担体内にマイクロシリンジで細胞凝集塊を配置する場合、シリンジの針の径を変更したり、細胞凝集塊を押し出しながら針の先端を支持担体内で移動させたりすることによって、細胞集合体の大きさ、形状、位置を適宜変更することができ、２つの細胞集合体の任意の方向の接触長さを調節できる。細胞集合体として間葉系組織と上皮系組織を用いる場合には、支持担体内に配置する前に当該組織の形状や大きさを調節し、これを支持担体内に配置する位置を調節することによって、２つの細胞集合体の接触長さを調節することができる。
接触長さは、支持担体内に配置する細胞集合体の大きさ、形状、位置等によって調節することができる。例えば、支持担体内にマイクロシリンジで細胞凝集塊を配置する場合、シリンジの針の径を変更したり、細胞凝集塊を押し出しながら針の先端を支持担体内で移動させたりすることによって、細胞集合体の大きさ、形状、位置を適宜変更することができ、２つの細胞集合体の任意の方向の接触長さを調節できる。細胞集合体として間葉系組織と上皮系組織を用いる場合には、支持担体内に配置する前に当該組織の形状や大きさを調節し、これを支持担体内に配置する位置を調節することによって、２つの細胞集合体の接触長さを調節することができる。
また、支持担体内に第１及び第２の細胞集合体を密接させて配置した構成体を複数作製し、両細胞集合体の接触長さを測定し、測定した接触長さが目的の長さである構成体を選択することによっても、所望の接触長さを有する再構成歯胚を得ることができ、このような工程も本発明における「接触長さの調節」に含まれる。接触長さの測定は、たとえば位相差顕微鏡で観察することによって行うことができる。
ここで、歯の一方向の長さとは、任意の方向の歯冠の幅を意味し、例えば、頬舌方向（歯列に垂直な方向）の幅や、近遠心方向（歯列と平行な方向）幅が好適に採用されるがこれらに限定されない。歯冠の幅の測定は、当業者が適宜行うことができる。
なお、第１の細胞集合体と第２の細胞集合体の所定の一方向の接触長さを調節して再生歯胚を形成すると、通常、発生した歯の歯冠において、その接触長さと同一方向の長さが調節される。
本発明に係る一方向に所望の長さを有する歯を製造する方法の一態様は、支持担体の内部に、第１の細胞集合体と第２の細胞集合体を密着させて配置した構成体を、第１の細胞集合体と第２の細胞集合体の所定の一方向の接触長さを変更して複数種類作製する工程と、当該複数種類の構成体を支持担体の内部でそれぞれ培養する工程と、当該工程で製造された歯の一方向の長さを測定し、接触長さと歯の一方向の長さとの相関関係を求める工程と、その相関関係に基づいて一方向に所望の長さを有する歯を得るために必要な第１の細胞集合体と第２の細胞集合体の接触長さを算出する工程と、を含む。
支持担体の内部に、第１の細胞集合体と第２の細胞集合体を密着させて配置した構成体を、第１の細胞集合体と第２の細胞集合体の一方向の接触長さを変更して複数種類作製し、当該複数種類の構成体を支持担体の内部でそれぞれ培養する工程は、上述の配置工程、培養工程、及び接触長さの調節方法の説明に従って行うことができる。
接触長さと歯の一方向の長さの相関関係は、公知の方法又はそれに準ずる方法に従って求めることができる。例えば、接触長さと歯の長さ（歯冠の幅）の関係を表す各種のグラフを作成してもよく、接触長さと歯の長さの関係を表す式を作成してもよい。また、ある歯の長さを与える接触長さの分布を調べ、所定の歯の大きさを与える接触長さの範囲を決定してもよい。
求めた相関関係に基づいて一方向に所望の長さを有する歯を得るために必要な第１の細胞集合体と第２の細胞集合体の接触長さを算出する工程は、例えば上記式やグラフに求める歯の大きさを挿入して求めることができる。
こうして、必要な接触長さを決定した後は、上記複数の構成体についての配置工程とほぼ同様の条件で、支持担体内に第１の細胞集合体と第２の細胞集合体が当該接触長さで密着するように配置し、上記複数の構成体についての培養条件とほぼ同様の条件で培養することによって、所望の大きさの歯を得ることができる。ここで、ほぼ同様の条件とは、接触長さを同一にした場合に、一方向に同じ長さを有する歯が再現性よく得られる条件を意味する。接触長さ決定のための配置工程・培養工程と、一方向に所望の長さを有する歯を製造するための配置工程・培養工程とにおいて、例えば、支持担体の種類や、温度、培地の組成、培養する場所（器官培養か生体内培養か）等の培養条件を同一にすることが好ましい。
また、支持担体内に第１及び第２の細胞集合体を配置する際には、将来発生する歯において所望の長さを有するべき部位となることが想定される部分の接触長さを上記算出された長さとすることが好ましい。第１及び第２の細胞集合体の接触面のいずれの方向が、将来発生する歯においていずれの方向になるかは、当業者が適宜決定することができる。例えば、近遠心方向の長さＡが頬舌方向の長さＢより長い臼歯を製造する際には、第１及び第２の細胞集合体の接触面が略長方形となるようにし、その長い方の辺が近遠心方向の長さＡを与える接触長さとなるように配置すればよい。
また、支持担体内に第１及び第２の細胞集合体を配置する際には、将来発生する歯において所望の長さを有するべき部位となることが想定される部分の接触長さを上記算出された長さとすることが好ましい。第１及び第２の細胞集合体の接触面のいずれの方向が、将来発生する歯においていずれの方向になるかは、当業者が適宜決定することができる。例えば、近遠心方向の長さＡが頬舌方向の長さＢより長い臼歯を製造する際には、第１及び第２の細胞集合体の接触面が略長方形となるようにし、その長い方の辺が近遠心方向の長さＡを与える接触長さとなるように配置すればよい。
また、本発明に係る一方向に所望の長さを有する歯を製造する方法の別の態様は、支持担体の内部に、間葉系細胞と上皮系細胞のいずれか一方でそれぞれ構成された略柱状の第１の細胞集合体と第２の細胞集合体を、各柱の軸方向が平行になるように密着させて配置した構成体を、第１の細胞集合体と第２の細胞集合体の軸方向の接触長さを変更して複数種類作製する工程と、複数種類の構成体を支持担体の内部でそれぞれ培養する工程と、前工程で製造された歯の前記一方向の長さを測定し、該長さと接触長さとの相関関係を求める工程と、その相関関係に基づいて、一方向に所望の長さを有する歯を得るために必要な第１及び第２の細胞集合体の接触長さを算出する工程と、を含む。
接触長さの異なる構成体を複数種類作製する工程と、続く培養工程は、上述の配置工程、培養工程、接触長さの調節方法等の説明に従って行うことができる。接触長さと歯の一方向の長さの相関関係は、上述のとおり、式、グラフ等によって表わすことができ、所定の歯の長さを与える接触長さの範囲を決定することもできる。続いて、これらの相関関係に基づいて、一方向に所望の長さを有する歯を得るために必要な第１及び第２の細胞集合体の接触長さを求めることができる。
本発明において「略柱状」は、例えば略円柱状、略角柱状等、一方向に延びる細長い形状を意味する。細胞集合体が組織である場合は、組織を略柱状に成形してから支持担体内に配置すればよい。また、細胞集合体が細胞凝集塊である場合には、例えばマイクロシリンジの針の先端を支持担体内に配置し、針の先端を移動させながら細胞を押し出すことによって、支持担体内に略円柱状の細胞凝集塊を配置することが可能である。
こうして、必要な接触長さを決定した後は、上記複数の構成体についての配置工程とほぼ同様の条件で、支持担体内に略柱状の第１の細胞集合体と第２の細胞集合体が当該接触長さで密着するように配置し、上記複数の構成体についての培養条件とほぼ同様の条件で培養することによって、一方向に所望の長さを有する歯を得ることができる。
本発明に係る歯を製造する方法の別の態様は、近遠心方向及び／又は頬舌方向に所望の長さを有する臼歯を製造する方法であって、支持担体の内部に、間葉系細胞と上皮系細胞のいずれか一方でそれぞれ構成された略柱状の第１の細胞集合体と第２の細胞集合体を、各柱の軸方向が平行になるように密着させて配置した構成体を、第１の細胞集合体と第２の細胞集合体の軸方向及び／又は軸と垂直方向の接触長さを変更して複数種類作製する工程と、複数種類の構成体を前記支持担体の内部でそれぞれ培養する工程と、前工程で製造された臼歯の近遠心方向及び／又は頬舌方向の長さを測定し、軸方向の接触長さと臼歯の近遠心方向の長さ、及び／又は、軸と垂直方向の接触長さと臼歯の頬舌方向の長さの相関関係を求める工程と、を含む。
上述のとおり、一般に、臼歯は頬舌方向の幅より近遠心方向の幅のほうが長いので、細胞集合体を柱状とする場合、軸方向の接触長さの制御によって近遠心方向の歯冠の幅を、軸と垂直方向の接触長さの制御によって頬舌方向の歯冠の幅を、それぞれ制御することが可能である。
軸方向の接触長さと軸と垂直方向の接触長さの変更は、どのような方法で行ってもよいが、例えば、柱状細胞集合体の長さ、径、両細胞集合体の軸同士の距離等を変更することによって行うことができる。細胞集合体が組織である場合は、支持担体内に配置する前に、所望の径と長さに成形し、支持担体内での位置を調節することによって、軸方向の接触長さと軸と垂直方向の接触長さを変更することができる。また、細胞集合体が細胞凝集塊である場合には、例えば、マイクロシリンジを用いて支持担体内に配置する際、針の径を変更することによって細胞集合体の径も変更することができ、支持担体内で針の先端を移動させる距離を変更することによって細胞集合体の軸方向の長さを変更することができる。また、一つの細胞集合体を配置した後、もう一つの細胞集合体を配置する位置を調節することによって、両細胞集合体の軸同士の距離を変更することができる。軸同士の距離をより近づけて両者を押し付けあうように配置することによって、細胞集合体の接触面は一般に大きくなり、これによって軸方向の接触長さと軸と垂直方向の接触長さを変更できる。
その他の配置工程、培養工程、各種長さの相関関係を求める工程等は、すでに説明した方法に従って行うことができる。
こうして、軸方向の接触長さ及び／又は軸と垂直方向の接触長さを決定した後は、上記複数の構成体についての配置工程とほぼ同様の条件で、支持担体内に略柱状の第１の細胞集合体と第２の細胞集合体が当該接触長さを有するように密着させて配置し、上記複数の構成体についての培養条件とほぼ同様の条件で培養することによって、近遠心方向及び／又は頬舌方向に所望の長さを有する臼歯を得ることができる。
また、本発明に係る一方向に所望の長さを有する歯を製造する方法の別の態様は、配置工程において、第１及び第２の細胞集合体を略柱状に、且つ、各柱の軸方向が平行になるように密着させて配置し、第１及び第２の細胞集合体の軸方向の接触長さが、上記所望の長さの±２５％、好ましくは±１０％となるように配置する工程を含む。
本発明者らは、後述のとおり、支持担体内に、略円柱状の間葉系細胞凝集塊と上皮系細胞凝集塊を、円柱の軸方向が平行になるように密着させて配置したところ、製造される歯の長さが、当該円柱の軸方向の接触長さに依存することを見出した。さらに、接触長さを所望の長さの約±２５％、好ましくは約±１０％とすることにより、近遠心方向の歯冠の幅が所望の長さである歯を得られることを見出した。したがって、例えば、近遠心方向の歯冠の幅が約Ｘμｍである歯を作製したい場合には、第１及び第２の細胞集合体を略柱状とし、軸方向の接触長さを０．７５Ｘμｍ〜１．２５Ｘμｍ、好ましくは０．９Ｘμｍ〜１．１Ｘμｍ程度とすればよい。
略柱状の第１及び第２の細胞集合体の接触長さを制御する方法は、既に説明した方法に従って行うことができる。
また、軸方向に目的の長さを有する細胞集合体を用意するのではなく、支持担体内に略柱状の第１及び第２の細胞集合体を密接させて配置した構成体を複数作製し、両細胞集合体の軸方向の接触長さを測定し、測定した接触長さが目的の長さである構成体を選択し、当該構成体を培養工程に供してもよい。接触長さの測定は、例えば位相差顕微鏡で観察することによって行うことができる。
また、軸方向に目的の長さを有する細胞集合体を用意するのではなく、支持担体内に略柱状の第１及び第２の細胞集合体を密接させて配置した構成体を複数作製し、両細胞集合体の軸方向の接触長さを測定し、測定した接触長さが目的の長さである構成体を選択し、当該構成体を培養工程に供してもよい。接触長さの測定は、例えば位相差顕微鏡で観察することによって行うことができる。
また、本発明に係る単一の歯を製造する方法は、支持担体の内部に、間葉系細胞と上皮系細胞のいずれか一方でそれぞれ構成された第１の細胞集合体と第２の細胞集合体を密着させて配置する工程と、第１及び第２の細胞集合体を支持担体の内部で培養する工程と、を含み、第１の細胞集合体と第２の細胞集合体の最大接触長さを所定の値以下とすることを特徴とする。
本発明者らは、特許文献１の方法では、意図しない歯の集合体が得られる場合があったところ、第１及び第２の細胞集合体の接触長さを制御し、歯の大きさを制御することによって、再現性よく単一の歯が得られることを見出した。これは、歯胚に形成される歯の数を規定する第１エナメル結節が、所定の距離以内には一つ以上形成されないことによるものと考えられる。単一の歯を製造できれば、得られた歯を移植する前に分離する必要がなく有用である。
なお、本発明に係る単一の歯を製造する方法において、「最大接触長さ」とは、第１の細胞集合体と第２の細胞集合体の接触面に含まれる任意の直線のうち最長の直線の長さを意味する。
また、本発明に係る単一の歯を製造する方法をマウスに適用する場合、第１及び第２の細胞集合体の接触長さは、３０００μm以下とすることが好ましく、１５００μm以下とすることがさらに好ましい。なお、当該接触長さは１００μm以上であることが好ましく、２００μm以上であることがさらに好ましい。接触長さの制御は、既述の説明に従って行うことができる。
本発明において、単一の歯とは、一本の歯として生体に移植できる構成をいい、歯冠、歯根、歯髄、象牙質が一続きになっていること、それぞれの歯の周囲に歯根骨や歯槽骨が形成されていること等を特徴とする。当業者であれば、製造された歯の本数を容易に認定することができる。
本発明に係る口腔内の歯の欠損部の修復方法は、本発明に係る歯を製造する方法で製造された歯を欠損部に移植する工程を含む。本方法によれば、欠損部の大きさに適合する歯を製造し移植することが可能である。
本発明に係る口腔内の歯の欠損部の修復方法においては、本発明に係る方法で製造された歯胚又は歯のいずれの段階のものも移植することができる。すでに歯冠の形成が認められていれば歯冠が口腔内側となるように配置することが好ましい。歯冠の形成が認められない段階の場合には、歯冠相当部の上皮細胞層又は再構成歯胚の上皮細胞層を口腔内側となるように配置することが好ましい。また、再構成歯胚の上皮・間葉細胞層の開放部分が口腔内側とは反対側となるように配置することも好ましい。これにより、歯の先端部（歯冠）が、口腔内側となり、周囲の歯と同様の方向性をもたせることができる。
欠損部とは、抜歯等により歯肉に設けられた部分を意味し、形状に特に制限はない。再生した歯胚又は歯を埋設可能である限り、欠損場所、目的とする歯の種類は特に限定されない。
欠損部は、通常、顎骨、口腔の歯槽骨などに位置する。また歯の喪失に伴って歯槽骨量が低下している場合には、欠損部位に対してＧＴＲ法（guided tissue regeneration：組織再生誘導法）など、インプラントの埋設のために臨床で用いられる公知の方法により骨の再生を行って骨量を増加させてもよい。歯胚または歯を孔部へ配置した後は、通常の処理に従って、縫合等を行うことが好ましい。
欠損部は、通常、顎骨、口腔の歯槽骨などに位置する。また歯の喪失に伴って歯槽骨量が低下している場合には、欠損部位に対してＧＴＲ法（guided tissue regeneration：組織再生誘導法）など、インプラントの埋設のために臨床で用いられる公知の方法により骨の再生を行って骨量を増加させてもよい。歯胚または歯を孔部へ配置した後は、通常の処理に従って、縫合等を行うことが好ましい。
本発明に係る口腔内の歯の欠損部の修復方法では、移植対象を、歯の製造に用いた歯胚を摘出した動物と同種とすることが好ましく、歯胚を摘出した個体と同一個体とすることがさらに好ましい。動物としては、ヒト、ウシ、ウマ、ブタ、イヌ、ネコ、マウス等を含む哺乳動物を挙げることができる。非ヒト哺乳動物とすることも好ましい。
また、本発明は、所定の条件下で一方向に所望の長さを有する歯を製造する方法を設計する方法も提供する。所定の条件下とは、支持担体、培地、培養方法等が特定された条件を意味する。所定の条件下で一方向に所望の長さを有する歯を製造する方法を設計する方法によって設計された製造方法を、当該所定の条件下で実施することによって、一方向に所望の長さを有する歯を得ることができる。
本発明に係る上記設計方法は、支持担体の内部に、間葉系細胞と上皮系細胞のいずれか一方でそれぞれ構成された第１の細胞集合体と第２の細胞集合体を、密着させて配置する場合に、一方向に所望の長さを有する歯を製造するために必要な両細胞集合体の接触長さを決定する方法を含む。
ここで、接触長さを決定する方法は、支持担体の内部に、間葉系細胞と上皮系細胞のいずれか一方でそれぞれ構成された第１の細胞集合体と第２の細胞集合体を密着させて配置した構成体を、前記第１の細胞集合体と前記第２の細胞集合体の所定の一方向の接触長さを変更して複数種類作製する工程と、その複数種類の構成体を前記支持担体の内部でそれぞれ培養する工程と、前工程で製造された歯の一方向の長さを測定し、接触長さと歯の大きさとの相関関係を求める工程と、その相関関係に基づいて、一方向に所望の長さを有する歯を得るために必要な第１及び第２の細胞集合体の接触長さを算出する工程と、を含む。
本発明に係る上記設計方法は、支持担体の内部に、間葉系細胞と上皮系細胞のいずれか一方でそれぞれ構成された第１の細胞集合体と第２の細胞集合体を、密着させて配置する場合に、一方向に所望の長さを有する歯を製造するために必要な両細胞集合体の接触長さを決定する方法を含む。
ここで、接触長さを決定する方法は、支持担体の内部に、間葉系細胞と上皮系細胞のいずれか一方でそれぞれ構成された第１の細胞集合体と第２の細胞集合体を密着させて配置した構成体を、前記第１の細胞集合体と前記第２の細胞集合体の所定の一方向の接触長さを変更して複数種類作製する工程と、その複数種類の構成体を前記支持担体の内部でそれぞれ培養する工程と、前工程で製造された歯の一方向の長さを測定し、接触長さと歯の大きさとの相関関係を求める工程と、その相関関係に基づいて、一方向に所望の長さを有する歯を得るために必要な第１及び第２の細胞集合体の接触長さを算出する工程と、を含む。
また、本発明は、所定の条件下で、単一の歯を製造する方法を設計する方法も提供する。
本発明の上記設計方法は、支持担体の内部に、間葉系細胞と上皮系細胞のいずれか一方でそれぞれ構成された第１の細胞集合体と第２の細胞集合体を、密着させて配置する場合に、単一の歯を製造するために必要な両細胞集合体の最大接触長さを決定する方法を含む。
さらに、最大接触長さを決定する方法は、支持担体の内部に、間葉系細胞と上皮系細胞のいずれか一方でそれぞれ構成された第１の細胞集合体と第２の細胞集合体を密着させて配置した構成体を、第１の細胞集合体と第２の細胞集合体の最大接触長さを変更して複数種類作製する工程と、複数種類の構成体を支持担体の内部でそれぞれ培養する工程と、前工程で製造された歯の数を測定し、単一の歯を得るための前記第１及び第２の細胞集合体の最大接触長さを求める工程と、を含む。
本発明の上記設計方法は、支持担体の内部に、間葉系細胞と上皮系細胞のいずれか一方でそれぞれ構成された第１の細胞集合体と第２の細胞集合体を、密着させて配置する場合に、単一の歯を製造するために必要な両細胞集合体の最大接触長さを決定する方法を含む。
さらに、最大接触長さを決定する方法は、支持担体の内部に、間葉系細胞と上皮系細胞のいずれか一方でそれぞれ構成された第１の細胞集合体と第２の細胞集合体を密着させて配置した構成体を、第１の細胞集合体と第２の細胞集合体の最大接触長さを変更して複数種類作製する工程と、複数種類の構成体を支持担体の内部でそれぞれ培養する工程と、前工程で製造された歯の数を測定し、単一の歯を得るための前記第１及び第２の細胞集合体の最大接触長さを求める工程と、を含む。
なお、本明細書において用いられる用語は、特定の実施態様を説明するために用いられるのであり、発明を限定する意図ではない。
また、本明細書において用いられる「含む」との用語は、文脈上明らかに異なる理解をすべき場合を除き、記述された事項（部材、ステップ、要素、数字など）が存在することを意図するものであり、それ以外の事項（部材、ステップ、要素、数字など）が存在することを排除しない。
異なる定義が無い限り、ここに用いられるすべての用語（技術用語及び科学用語を含む。）は、本発明が属する技術の当業者によって広く理解されるのと同じ意味を有する。ここに用いられる用語は、異なる定義が明示されていない限り、本明細書及び関連技術分野における意味と整合的な意味を有するものとして解釈されるべきであり、理想化され、又は、過度に形式的な意味において解釈されるべきではない。
本発明の実施態様は模式図を参照しつつ説明される場合があるが、模式図である場合、説明を明確にするために、誇張されて表現されている場合がある。
第一の、第二のなどの用語が種々の要素を表現するために用いられるが、これらの要素はそれらの用語によって限定されるべきではないことが理解される。これらの用語は一つの要素を他の要素と区別するためのみに用いられているのであり、 例えば、第一の要素を第二の要素と記し、同様に、第二の要素は第一の要素と記すことは、本発明の範囲を逸脱することなく可能である。
また、本明細書において用いられる「含む」との用語は、文脈上明らかに異なる理解をすべき場合を除き、記述された事項（部材、ステップ、要素、数字など）が存在することを意図するものであり、それ以外の事項（部材、ステップ、要素、数字など）が存在することを排除しない。
異なる定義が無い限り、ここに用いられるすべての用語（技術用語及び科学用語を含む。）は、本発明が属する技術の当業者によって広く理解されるのと同じ意味を有する。ここに用いられる用語は、異なる定義が明示されていない限り、本明細書及び関連技術分野における意味と整合的な意味を有するものとして解釈されるべきであり、理想化され、又は、過度に形式的な意味において解釈されるべきではない。
本発明の実施態様は模式図を参照しつつ説明される場合があるが、模式図である場合、説明を明確にするために、誇張されて表現されている場合がある。
第一の、第二のなどの用語が種々の要素を表現するために用いられるが、これらの要素はそれらの用語によって限定されるべきではないことが理解される。これらの用語は一つの要素を他の要素と区別するためのみに用いられているのであり、 例えば、第一の要素を第二の要素と記し、同様に、第二の要素は第一の要素と記すことは、本発明の範囲を逸脱することなく可能である。
上記設計方法においても、間葉系細胞及び上皮系細胞は、それらを用いて形成した再構成歯胚から再生歯が発生する限り、生体内のどの組織に由来するものであってもよい。好ましくは、少なくともいずれか一方を歯胚由来とし、より好ましくは両方を歯胚由来とする。
以下において、本発明を、実施例を参照してより詳細に説明する。しかしながら、本発明はいろいろな態様により具現化することができ、ここに記載される実施例に限定されるものとして解釈されてはならない。
（１）歯胚上皮系細胞と歯胚間葉系細胞の調製
歯の形成を行うために歯胚の再構築を行った。実験モデルとしてマウスを用いた。
C57BL/6Nマウス（日本エスエルシーから購入）の胎齢14.5日の胎仔から下顎臼歯歯胚組織を顕微鏡下で常法により摘出した。下顎臼歯歯胚組織をCa2+，Mg2+不含リン酸緩衝液（PBS(-)）で洗浄し、PBS(-)に最終濃度50U/mLのディスパーゼ(BD, Massachusetts, USA)を添加した酵素液で室温にて2分間処理した後、10%FBS（Invitrogen, Carlsbad, CA)を添加したDMEM（Sigma, St. Louis, MO)で3回洗浄した。さらにDNase I溶液 (Takara, Shiga, Japan)を最終濃度70U/mLになるよう添加し、歯胚組織を分散させ、25G注射針 (Terumo, Tokyo, Japan)を用いて外科的に歯胚上皮組織と歯胚間葉組織を分離した。
歯胚上皮組織は、PBS(-)で3回洗浄し、PBS(-)に最終濃度100U/mLのCollagenase I（Worthington, Lakewood, NJ）を溶解した酵素液で37℃にて30分間の処理を2回繰り返した。遠心分離によって沈殿回収した細胞を、さらにPBS(-)に最終濃度0.25%のTrypsin (Sigma)を溶解した酵素液で37℃、10分間処理した。10%FBS（Invitrogen）添加DMEM（Sigma）で、細胞を3回洗浄した後、細胞に最終濃度70U/mLのDNase I（Takara）溶液を添加して、ピペッティングによりばらばらに分離された歯胚上皮系細胞の懸濁液を得た。
一方、歯胚間葉組織は、PBS(-)で3回洗浄し、PBS(-)に最終濃度100U/mLのコラーゲナーゼI（Worthington）を溶解した酵素液で37℃にて20分間の処理を行った。さらに、0.25%のトリプシン（Sigma）と100U/mLのコラーゲナーゼI（Worthington）を含むPBS(-)で10分間処理した。70U/mLのDNase I（Takara）を添加して、ピペッティングによりばらばらに分離された歯胚間葉系細胞の懸濁液を得た。
歯の形成を行うために歯胚の再構築を行った。実験モデルとしてマウスを用いた。
C57BL/6Nマウス（日本エスエルシーから購入）の胎齢14.5日の胎仔から下顎臼歯歯胚組織を顕微鏡下で常法により摘出した。下顎臼歯歯胚組織をCa2+，Mg2+不含リン酸緩衝液（PBS(-)）で洗浄し、PBS(-)に最終濃度50U/mLのディスパーゼ(BD, Massachusetts, USA)を添加した酵素液で室温にて2分間処理した後、10%FBS（Invitrogen, Carlsbad, CA)を添加したDMEM（Sigma, St. Louis, MO)で3回洗浄した。さらにDNase I溶液 (Takara, Shiga, Japan)を最終濃度70U/mLになるよう添加し、歯胚組織を分散させ、25G注射針 (Terumo, Tokyo, Japan)を用いて外科的に歯胚上皮組織と歯胚間葉組織を分離した。
歯胚上皮組織は、PBS(-)で3回洗浄し、PBS(-)に最終濃度100U/mLのCollagenase I（Worthington, Lakewood, NJ）を溶解した酵素液で37℃にて30分間の処理を2回繰り返した。遠心分離によって沈殿回収した細胞を、さらにPBS(-)に最終濃度0.25%のTrypsin (Sigma)を溶解した酵素液で37℃、10分間処理した。10%FBS（Invitrogen）添加DMEM（Sigma）で、細胞を3回洗浄した後、細胞に最終濃度70U/mLのDNase I（Takara）溶液を添加して、ピペッティングによりばらばらに分離された歯胚上皮系細胞の懸濁液を得た。
一方、歯胚間葉組織は、PBS(-)で3回洗浄し、PBS(-)に最終濃度100U/mLのコラーゲナーゼI（Worthington）を溶解した酵素液で37℃にて20分間の処理を行った。さらに、0.25%のトリプシン（Sigma）と100U/mLのコラーゲナーゼI（Worthington）を含むPBS(-)で10分間処理した。70U/mLのDNase I（Takara）を添加して、ピペッティングによりばらばらに分離された歯胚間葉系細胞の懸濁液を得た。
（２）再構成歯胚の作製
次に、上記で調製された歯胚上皮系細胞及び歯胚間葉系細胞を用いて、歯胚再構築を行った。シリコングリースを塗布した1.5 mLマイクロチューブ (Eppendorf, Hamburg, Germany）に、10%FBS（Invitrogen) 添加DMEM（Sigma）で懸濁した歯胚上皮系細胞、あるいは歯胚間葉系細胞を入れ、600×gで3分間の遠心分離により細胞を沈殿として回収した。遠心後の培養液の上清をできる限り除去し、再度600×gで3分間の遠心操作を行い、実体顕微鏡で観察しながら細胞の沈殿周囲に残存する培養液をGELoader Tip 0.5-20μL（eppendorf）を用いて完全に除去した。
シリコングリースを塗布したペトリディッシュにCellmatrix type I-A (Nitta gelatin, Osaka, Japan) を30μL滴下して支持担体としてのコラーゲンゲルドロップを作製した。この溶液に、歯胚間葉系細胞の遠心後の沈殿を、ハミルトンシリンジ(7105KH PT-3, HAMILTON, Reno, NV)を用いて、定量的に配置して、円柱状の細胞集合体としての細胞凝集塊を作製した。次いで、先に作製した歯胚間葉系細胞の円柱状の細胞凝集塊と軸方向が平行になるように、且つ、お互いの側面が密着するように、歯胚間葉系細胞と等量の歯胚上皮系細胞を同様の方法により配置して細胞凝集塊とし、再構成歯胚を作製した。
その後、37℃にて20分間静置することでコラーゲンゲルドロップを固化させ、2つの細胞凝集塊の結合をより強固にした。固形化した再構成歯胚は、10%FBS（Invitrogen) 添加DMEM（Sigma）にセルカルチャーインサート（ポアサイズが0.4ミクロンのPETメンブレン；BD）が接するようにセットした培養容器のセルカルチャーインサートの膜上に移して、セルカルチャーインサート上での常法により37℃、95%RH、5%CO2にて器官培養を行った。
次に、上記で調製された歯胚上皮系細胞及び歯胚間葉系細胞を用いて、歯胚再構築を行った。シリコングリースを塗布した1.5 mLマイクロチューブ (Eppendorf, Hamburg, Germany）に、10%FBS（Invitrogen) 添加DMEM（Sigma）で懸濁した歯胚上皮系細胞、あるいは歯胚間葉系細胞を入れ、600×gで3分間の遠心分離により細胞を沈殿として回収した。遠心後の培養液の上清をできる限り除去し、再度600×gで3分間の遠心操作を行い、実体顕微鏡で観察しながら細胞の沈殿周囲に残存する培養液をGELoader Tip 0.5-20μL（eppendorf）を用いて完全に除去した。
シリコングリースを塗布したペトリディッシュにCellmatrix type I-A (Nitta gelatin, Osaka, Japan) を30μL滴下して支持担体としてのコラーゲンゲルドロップを作製した。この溶液に、歯胚間葉系細胞の遠心後の沈殿を、ハミルトンシリンジ(7105KH PT-3, HAMILTON, Reno, NV)を用いて、定量的に配置して、円柱状の細胞集合体としての細胞凝集塊を作製した。次いで、先に作製した歯胚間葉系細胞の円柱状の細胞凝集塊と軸方向が平行になるように、且つ、お互いの側面が密着するように、歯胚間葉系細胞と等量の歯胚上皮系細胞を同様の方法により配置して細胞凝集塊とし、再構成歯胚を作製した。
その後、37℃にて20分間静置することでコラーゲンゲルドロップを固化させ、2つの細胞凝集塊の結合をより強固にした。固形化した再構成歯胚は、10%FBS（Invitrogen) 添加DMEM（Sigma）にセルカルチャーインサート（ポアサイズが0.4ミクロンのPETメンブレン；BD）が接するようにセットした培養容器のセルカルチャーインサートの膜上に移して、セルカルチャーインサート上での常法により37℃、95%RH、5%CO2にて器官培養を行った。
（３）器官培養による再生歯胚の大きさの解析
上皮系細胞と間葉系細胞のそれぞれの円柱状の細胞凝集塊が、それぞれ450μm以下、450μmから900μm、900μmから1500μmの長さで密接している3グループの再構成歯胚を作製して、器官培養により再生歯胚を形成させた（図１）。細胞凝集塊同士が密接している長さの測定は位相差顕微鏡で行った。
再生歯胚の歯冠領域の幅を解析するために、図２の矢印の頭で挟まれた将来歯冠になる歯冠領域の幅を、器官培養7日目の再生歯胚において位相差顕微鏡を用いて測定した。測定部位は、図１の7日目の写真にも矢頭で示している。
測定結果を図３に示す。接触長さが450μm以下のものは歯冠領域の幅が366±103.1μm、450μmから900μmのものは584.0±103.3μm、900μmから1500μmのものは934.9±239.8μmであった。これより、再構成歯胚の形成時の上皮系細胞集合体と間葉系細胞集合体の接触長さが長いほど、歯冠領域の幅が大きい再生歯胚が形成されることが示された。
また、図４は、接触長さと歯冠領域の幅の測定値の散布図であり、図中の直線は最小二乗法により線形近似したものである。直線を表す式は、y = 0.7114x + 133.95であった。
上皮系細胞と間葉系細胞のそれぞれの円柱状の細胞凝集塊が、それぞれ450μm以下、450μmから900μm、900μmから1500μmの長さで密接している3グループの再構成歯胚を作製して、器官培養により再生歯胚を形成させた（図１）。細胞凝集塊同士が密接している長さの測定は位相差顕微鏡で行った。
再生歯胚の歯冠領域の幅を解析するために、図２の矢印の頭で挟まれた将来歯冠になる歯冠領域の幅を、器官培養7日目の再生歯胚において位相差顕微鏡を用いて測定した。測定部位は、図１の7日目の写真にも矢頭で示している。
測定結果を図３に示す。接触長さが450μm以下のものは歯冠領域の幅が366±103.1μm、450μmから900μmのものは584.0±103.3μm、900μmから1500μmのものは934.9±239.8μmであった。これより、再構成歯胚の形成時の上皮系細胞集合体と間葉系細胞集合体の接触長さが長いほど、歯冠領域の幅が大きい再生歯胚が形成されることが示された。
また、図４は、接触長さと歯冠領域の幅の測定値の散布図であり、図中の直線は最小二乗法により線形近似したものである。直線を表す式は、y = 0.7114x + 133.95であった。
（４）腎皮膜下移植による再生歯の大きさの解析
深麻酔下において8週齢C57BL/6マウスの、腎臓の上に位置する背中の毛を剃毛し、皮膚と腹膜を約1 cmほど切開してリングピンセット (Natsume, Tokyo, Japan)を用いて腎臓を引き出した。腎皮膜を剃刀 (Feather, Tokyo, Japan)を用いて 2〜3 mmほど切開して、腎臓と腎皮膜の間に実施例（２）で示した接触長さの異なる3グループの再構成歯胚をコラーゲンゲルごと押し込み、腎臓を中に戻し、筋層と皮膚をそれぞれ縫合した。
腎皮膜下移植後21日目に再生歯を摘出した。摘出した再生歯を図６に示す。図６の矢印の頭で挟まれた部分を歯冠の幅として実体顕微鏡を用いて測定した。
測定結果を表１に示す。
表中Ｄで表わされる百分率の平均値は13.03、標準偏差は10.00であった。
また、上記測定結果を接触長さが450μm以下、450μmから900μm、900μmから1500μmのものに分類した場合に、得られた歯の歯冠の幅を図７に示す。接触長さが450μm以下のものは歯冠の幅が497±118.0μmであり、450μmから900μmのものは727.0±271.4μm、900μmから1500μmのものは1073.9±186.0μmであった。これより、再構成歯胚の形成時に上皮系細胞集合体と間葉系細胞集合体が密着した長さが長いほど、歯冠の幅が大きい再生歯が形成されることが明らかになった。
また、図８は、接触長さと歯冠の幅の測定値の散布図であり、図中の直線は最小二乗法により線形近似したものである。直線を表す式は、y = 0.7257x + 272.15であった。
深麻酔下において8週齢C57BL/6マウスの、腎臓の上に位置する背中の毛を剃毛し、皮膚と腹膜を約1 cmほど切開してリングピンセット (Natsume, Tokyo, Japan)を用いて腎臓を引き出した。腎皮膜を剃刀 (Feather, Tokyo, Japan)を用いて 2〜3 mmほど切開して、腎臓と腎皮膜の間に実施例（２）で示した接触長さの異なる3グループの再構成歯胚をコラーゲンゲルごと押し込み、腎臓を中に戻し、筋層と皮膚をそれぞれ縫合した。
腎皮膜下移植後21日目に再生歯を摘出した。摘出した再生歯を図６に示す。図６の矢印の頭で挟まれた部分を歯冠の幅として実体顕微鏡を用いて測定した。
測定結果を表１に示す。
また、上記測定結果を接触長さが450μm以下、450μmから900μm、900μmから1500μmのものに分類した場合に、得られた歯の歯冠の幅を図７に示す。接触長さが450μm以下のものは歯冠の幅が497±118.0μmであり、450μmから900μmのものは727.0±271.4μm、900μmから1500μmのものは1073.9±186.0μmであった。これより、再構成歯胚の形成時に上皮系細胞集合体と間葉系細胞集合体が密着した長さが長いほど、歯冠の幅が大きい再生歯が形成されることが明らかになった。
また、図８は、接触長さと歯冠の幅の測定値の散布図であり、図中の直線は最小二乗法により線形近似したものである。直線を表す式は、y = 0.7257x + 272.15であった。
（５）マイクロCTによる再生歯の歯尖の数の解析
実験動物用3DマイクロX線CT（RIGAKU,Tokyo,Japan）を用いて、電圧90.0 kv,電流150.0 A,10μm/Pixelにて、（４）に示す方法で発生させた再生歯を撮影した。結果を図９に示す。
次いで、i-View (RIGAKU,Tokyo,Japan)を用いて画像を解析し、再生歯の三次元画像を取得して、再生歯の歯尖の数を計測した。再構成歯胚の作製時における上皮系細胞と間葉系細胞の細胞凝集塊の接触長さと、腎皮膜下で発生した再生歯の歯尖の数をプロットして相関係数を算定すると、再構成時の接触長さと再生歯の歯尖の数の間には、強い相関関係があることが明らかとなった（R2=0.658）（図１０）。この結果より、再構成時の上皮系細胞と間葉系細胞が接触長さが長いほど、歯尖の数が多い再生歯が形成されることが確認された。
実験動物用3DマイクロX線CT（RIGAKU,Tokyo,Japan）を用いて、電圧90.0 kv,電流150.0 A,10μm/Pixelにて、（４）に示す方法で発生させた再生歯を撮影した。結果を図９に示す。
次いで、i-View (RIGAKU,Tokyo,Japan)を用いて画像を解析し、再生歯の三次元画像を取得して、再生歯の歯尖の数を計測した。再構成歯胚の作製時における上皮系細胞と間葉系細胞の細胞凝集塊の接触長さと、腎皮膜下で発生した再生歯の歯尖の数をプロットして相関係数を算定すると、再構成時の接触長さと再生歯の歯尖の数の間には、強い相関関係があることが明らかとなった（R2=0.658）（図１０）。この結果より、再構成時の上皮系細胞と間葉系細胞が接触長さが長いほど、歯尖の数が多い再生歯が形成されることが確認された。
（６）細胞集合体の接触長さを一定範囲として細胞数を変化させた再構成歯胚の解析
細胞凝集塊同士の接触長さを300-500μmの範囲内とした。実施例（２）で用いた内径が0.330 mmのハミルトンシリンジ (7105KH PT-3, HAMILTON, Reno, NV)にて容積約0.05μlの細胞懸濁液を用いた細胞凝集体を作製し、内径が0.203 mmのハミルトンシリンジ (7002KH PT-3, Hamilton)にて容積約0.02μlの細胞懸濁液を用いた細胞凝集体を作製することによって、細胞凝集塊に用いる細胞数を変化させた再構成歯胚を作製した。この再構成歯胚から形成される再生歯胚、および再生歯の形態を、実施例（３）、（４）、（５）に示した方法によって解析した。
再生歯胚の歯冠領域の幅を図１１に、再生歯の歯冠の幅を図１２に、再生歯における歯尖の数を図１３に示す。接触長さを一定範囲内として細胞数を変化させても再生歯胚および再生歯の形態に有意な変化は認められなかった。
細胞凝集塊同士の接触長さを300-500μmの範囲内とした。実施例（２）で用いた内径が0.330 mmのハミルトンシリンジ (7105KH PT-3, HAMILTON, Reno, NV)にて容積約0.05μlの細胞懸濁液を用いた細胞凝集体を作製し、内径が0.203 mmのハミルトンシリンジ (7002KH PT-3, Hamilton)にて容積約0.02μlの細胞懸濁液を用いた細胞凝集体を作製することによって、細胞凝集塊に用いる細胞数を変化させた再構成歯胚を作製した。この再構成歯胚から形成される再生歯胚、および再生歯の形態を、実施例（３）、（４）、（５）に示した方法によって解析した。
再生歯胚の歯冠領域の幅を図１１に、再生歯の歯冠の幅を図１２に、再生歯における歯尖の数を図１３に示す。接触長さを一定範囲内として細胞数を変化させても再生歯胚および再生歯の形態に有意な変化は認められなかった。
Claims (15)
- 一方向に所望の長さを有する歯を製造する方法であって、
支持担体の内部に、間葉系細胞と上皮系細胞のいずれか一方でそれぞれ構成された第１の細胞集合体と第２の細胞集合体を密着させて配置する工程と、
前記第１及び第２の細胞集合体を前記支持担体の内部で培養する工程と、を含み、
前記第１の細胞集合体と前記第２の細胞集合体の所定の一方向の接触長さを調節することによって歯の大きさを調節する方法であって、
前記第１の細胞集合体と前記第２の細胞集合体との前記接触長さは、前記所望の長さの約±２５％以内の範囲である、方法。 - 一方向に所望の長さを有する歯を製造する方法であって、
支持担体の内部に、間葉系細胞と上皮系細胞のいずれか一方でそれぞれ構成された第１の細胞集合体と第２の細胞集合体を密着させて配置した構成体を、前記第１の細胞集合体と前記第２の細胞集合体の所定の一方向の接触長さを変更して複数種類作製する工程と、
前記複数種類の構成体を前記支持担体の内部でそれぞれ培養する工程と、
前工程で製造された歯の前記一方向の長さを測定し、該長さと前記接触長さとの相関関係を求める工程と、
前記相関関係に基づいて、一方向に所望の長さを有する歯を得るために必要な前記第１及び第２の細胞集合体の接触長さを算出する工程と、
支持担体の内部に、間葉系細胞と上皮系細胞のいずれか一方でそれぞれ構成された第１の細胞集合体と第２の細胞集合体を、前工程で算出された接触長さを有するように密着させて配置する工程と、
前記第１及び第２の細胞集合体を前記支持担体の内部で培養する工程と、を含む方法。 - 一方向に所望の長さを有する歯を製造する方法であって、
支持担体の内部に、間葉系細胞と上皮系細胞のいずれか一方でそれぞれ構成された略柱状の第１の細胞集合体と第２の細胞集合体を、各柱の軸方向が平行になるように密着させて配置した構成体を、前記第１の細胞集合体と前記第２の細胞集合体の軸方向の接触長さを変更して複数種類作製する工程と、
前記複数種類の構成体を前記支持担体の内部でそれぞれ培養する工程と、
前工程で製造された歯の前記一方向の長さを測定し、該長さと前記接触長さとの相関関係を求める工程と、
前記相関関係に基づいて、一方向に所望の長さを有する歯を得るために必要な前記第１及び第２の細胞集合体の接触長さを算出する工程と、
支持担体の内部に、間葉系細胞と上皮系細胞のいずれか一方でそれぞれ構成された略柱状の第１の細胞集合体と第２の細胞集合体を、軸方向の接触長さが前工程で算出された長さとなるように、かつ、各柱の軸方向が平行になるように密着させて配置する工程と、
前記第１及び第２の細胞集合体を前記支持担体の内部で培養する工程と、を含む方法。 - 近遠心方向及び／又は頬舌方向に所望の長さを有する臼歯を製造する方法であって、
支持担体の内部に、間葉系細胞と上皮系細胞のいずれか一方でそれぞれ構成された略柱状の第１の細胞集合体と第２の細胞集合体を、各柱の軸方向が平行になるように密着させて配置した構成体を、前記第１の細胞集合体と前記第２の細胞集合体の軸方向及び／又は軸と垂直方向の接触長さを変更して複数種類作製する工程と、
前記複数種類の構成体を前記支持担体の内部でそれぞれ培養する工程と、
前工程で製造された臼歯の近遠心方向及び／又は頬舌方向の長さを測定し、前記軸方向の接触長さと臼歯の近遠心方向の長さ、及び／又は、前記軸と垂直方向の接触長さと臼歯の頬舌方向の長さの相関関係を求める工程と、
前記相関関係に基づいて近遠心方向及び／又は頬舌方向に所望の長さを有する臼歯を得るために必要な前記第１の細胞集合体と第２の細胞集合体の軸方向及び／又は軸と垂直方向の接触長さを算出する工程と、
支持担体の内部に、間葉系細胞と上皮系細胞のいずれか一方でそれぞれ構成された略柱状の第１の細胞集合体と第２の細胞集合体を、軸方向及び／又は軸と垂直方向の接触長さが前工程で算出された長さとなるように、かつ、各柱の軸方向が平行となるように密着させて配置する工程と、
前記第１及び第２の細胞集合体を前記支持担体の内部で培養する工程と、を含む方法。 - 一方向に所望の長さを有する歯を製造する方法であって、
支持担体の内部に、間葉系細胞と上皮系細胞のいずれか一方でそれぞれ構成された略柱状の第１の細胞集合体と第２の細胞集合体を、各柱の軸方向が平行になるように密着させ、該第１及び第２の柱状細胞集合体の軸方向の接触長さが前記所望の長さの約±２５％となるように配置する工程と、
前記第１及び第２の細胞集合体を前記支持担体の内部で培養する工程と、を含む方法。 - 前記支持担体内部に前記第１及び第２の細胞集合体を配置する工程は、
前記支持担体内部に前記第１及び第２の細胞集合体を配置した構成体を複数作製する工程と、
前記第１及び第２の細胞集合体の軸方向の接触長さを測定する工程と、
前記測定した接触長さが、前記所望の長さの約±２５％である構成体を選択する工程と、を含む、請求項５に記載の方法。 - 単一の歯を製造する方法であって、
支持担体の内部に、間葉系細胞と上皮系細胞のいずれか一方でそれぞれ構成された第１の細胞集合体と第２の細胞集合体を密着させて配置する工程と、
前記第１及び第２の細胞集合体を前記支持担体の内部で培養する工程と、を含み、
前記第１の細胞集合体と前記第２の細胞集合体の最大接触長さを所定の値以下とする、方法であって、
前記第１の細胞集合体と前記第２の細胞集合体との前記接触長さは、前記単一の歯の所望の長さの約±２５％以内の範囲である、方法。 - 前記細胞集合体が、いずれも細胞凝集塊である、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
- 前記間葉系細胞及び前記上皮系細胞の少なくとも一方が歯胚由来である、請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。
- 非ヒト哺乳動物の口腔内の歯の欠損部の修復方法であって、
請求項１から９のいずれか１項に記載の方法で得られた歯を、前記欠損部に移植する工程を含む、方法。 - 請求項１から９のいずれか１項に記載の方法で得られた歯を、２個以上に分割することなくそのまま前記欠損部に移植する、請求項１０に記載の方法。
- 前記間葉系細胞及び前記上皮系細胞は、前記欠損部を有する個体由来である、請求項１０又は１１に記載の方法。
- 所定の条件下で、一方向に所望の長さを有する歯を製造する方法を設計する方法であって、
上記設計方法は、支持担体の内部に、間葉系細胞と上皮系細胞のいずれか一方でそれぞれ構成された第１の細胞集合体と第２の細胞集合体を、密着させて配置する場合に、所望の大きさの歯を製造するために必要な両細胞集合体の所定の一方向の接触長さを決定する方法を含み、
さらに、前記接触長さを決定する方法は、
支持担体の内部に、間葉系細胞と上皮系細胞のいずれか一方でそれぞれ構成された第１の細胞集合体と第２の細胞集合体を密着させて配置した構成体を、前記第１の細胞集合体と前記第２の細胞集合体の所定の一方向の接触長さを変更して複数種類作製する工程と、
前記複数種類の構成体を前記支持担体の内部でそれぞれ培養する工程と、
前工程で製造された歯の前記一方向の長さを測定し、前記接触長さと歯の一方向の長さとの相関関係を求める工程と、
前記相関関係に基づいて、前記一方向に所望の長さを有する歯を得るために必要な前記第１及び第２の細胞集合体の接触長さを算出する工程と、を含む方法。 - 所定の条件下で、単一の歯を製造する方法を設計する方法であって、
上記設計方法は、支持担体の内部に、間葉系細胞と上皮系細胞のいずれか一方でそれぞれ構成された第１の細胞集合体と第２の細胞集合体を、密着させて配置する場合に、単一の歯を製造するために必要な両細胞集合体の最大接触長さを決定する方法を含み、
さらに、前記最大接触長さを決定する方法は、
支持担体の内部に、間葉系細胞と上皮系細胞のいずれか一方でそれぞれ構成された第１の細胞集合体と第２の細胞集合体を密着させて配置した構成体を、前記第１の細胞集合体と前記第２の細胞集合体の最大接触長さを変更して複数種類作製する工程と、
前記複数種類の構成体を前記支持担体の内部でそれぞれ培養する工程と、
前工程で製造された歯の数を測定し、単一の歯を得るための前記第１及び第２の細胞集合体の最大接触長さを求める工程と、を含む方法。 - 前記間葉系細胞及び前記上皮系細胞の少なくとも一方が歯胚由来である、請求項１３又は１４に記載の方法。
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