CN111197027A - 分离牙胚单细胞的方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及单细胞的分离方法，具体涉及一种对牙胚组织单细胞分离的方法。该方法包括依次利用胶原酶、胰蛋白酶和DNA水解酶对牙胚组织进行消化处理，获得牙胚单细胞。本发明所提供的分离单细胞的方法，操作简单，耗时短；对细胞伤害小，细胞能够最大程度维持原始特性；得到的单细胞悬液无黏连，符合单细胞测序要求。
Description
技术领域
本发明涉及细胞生物学领域，具体的，本发明涉及单细胞的分离方法，更具体的，本发明涉及适用于单细胞转录组测序的牙胚组织单细胞分离方法。
背景技术
众所周知，因龋病、牙周病、创伤和肿瘤等疾病因素，人类倍受牙齿缺失的困扰。牙齿缺失造成咀嚼、发音等生理和心理功能障碍。据统计，在50岁以前，美国平均每人缺失牙达到8个，65岁前牙齿缺失率达35％，而中国这一比率为40％，即全国约有5亿人患有不同程度的牙齿缺失。传统的牙齿修复方法完全不能恢复患者牙齿的基本生理功能，即使近年来在临床逐渐普及的种植牙，因其价格昂贵、流程复杂，适应症有限，难以解决全部的缺失牙问题。因此，越来越多的学者将牙组织再生，甚至全牙器官再生作为解决牙齿缺失这一问题的最终目标。
在牙组织工程中，除了支架材料和生物活性因子外，种子细胞的选择是牙组织工程中最重要的组成部分。牙齿的发育是上皮-间充质相互作用的结果，牙齿间充质细胞形成了除釉质外的牙齿大部分组织，包括牙髓-牙本质复合体、牙骨质、牙周膜和牙周支持组织。因此构成牙齿间充质细胞的种子细胞成为研究的热点和难点。而借助于单细胞转录组来研究上皮-间充质相互作用的分子机理，更加完善我们对牙齿发育过程及相关调控机制的认识，促进牙组织工程和牙再生医学的进一步发展。
单细胞分离技术是实现单细胞水平研究的基础，目前单细胞分离的方法包括单细胞显微操作法、显微切割、连续稀释法、酶消化法及流式分选等。但是，何种方法较为适合牙胚组织单细胞转录组测序的研究，还需要进一步进行研究。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种分离牙胚单细胞的方法，利用该方法分离牙胚单细胞，操作简单、耗时短，而且对细胞的伤害小，细胞能够最大程度维持原始特性。
具体而言，本发明提供了如下实验方案：
根据本发明的一方面，本发明提供了一种分离牙胚单细胞的方法，包括：依次利用胶原酶、胰蛋白酶和DNA水解酶对牙胚组织进行消化处理，获得牙胚单细胞。本发明提供了一种将牙胚单细胞分离的一种方法。主要分为三个步骤，首先为胶原酶消化处理，胶原酶能在生理PH和温度条件下特异性地水解天然胶原蛋白的三维螺旋结构，而不损伤其它蛋白质和组织。然后利用胰蛋白酶进行消化处理，胰蛋白酶能够把多肽链中赖氨酸和精氨酸残基中的羧基侧切断从而起到消化作用，而由于在胰蛋白酶消化过程中发生DNA外溢导致细胞之间黏连严重，为确保后续实验中细胞呈现不黏连的单细胞状态，因此需要在胰蛋白酶消化之后进行DNA水解酶消化处理。由此可以将牙胚组织消化为单细胞状态。
根据本发明的实施例，以上所述的分离牙胚单细胞的方法可以进一步包括如下技术方案：
在本发明的一些实施例中，胶原酶为Ⅰ型胶原酶。I型胶原酶仅对细胞间质有消化作用而对上皮细胞和间充质细胞均无损伤作用，因此不会损伤其他蛋白质和组织。
在本发明的一些实施例中，所述DNA水解酶为脱氧核糖核酸酶I(DNase I)。经过胰蛋白酶消化后的牙胚组织，会出现细胞DNA外溢所导致的细胞黏连，利用DNase I能够分离这些细胞黏连，使得获得的单细胞能够满足单细胞测序的要求。
在本发明的一些实施例中，所述方法包括：利用胶原酶对牙胚组织进行第一消化处理，除去胶原酶，加入第一培养液清清洗，获得第一消化产物；利用胰蛋白酶对所述第一消化产物进行第二消化处理，加入第二培养液终止，获得第二消化产物；利用DNA水解酶对所述第二消化产物进行第三消化处理，加入终止液终止，获得牙胚单细胞。
在本发明的一些实施例中，所述胶原酶的作用浓度为50～100U/mL，作用时间为15～30分钟，作用温度为37摄氏度。在37摄氏度下，利用50～100U/mL的胶原酶作用15～30分钟，可以获得较佳的处理效果。
在本发明的一些实施例中，所述胰蛋白酶的作用浓度为质量百分比0.05～0.25％，作用时间为2～5分钟，作用温度为37摄氏度。胰蛋白酶作用较强烈，为避免过长的消化时间对细胞带来的损伤，本发明中将根据细胞群体的大小及状态将胰蛋白酶的消化时间控制在2-5分钟，作用浓度为0.05～0.25％，可以获得合适的细胞形态。
在本发明的一些实施例中，所述DNA水解酶的作用浓度为10～30U/mL，作用时间为5～10分钟，作用温度为37摄氏度。由此可以获得较佳的处理效果，去除细胞DNA外溢所导致的细胞黏连。
在本发明的一些实施例中，所述第一培养液为DMEM/F12培养液。
在本发明的一些实施例中，所述第二培养液为含有血清的培养液。可以利用培养液中的血清终止胰蛋白酶的消化作用。例如可以利用MEF培养基来终止胰蛋白酶的消化作用，从而用于后续的处理。
在本发明的一些实施例中，所述终止液为EDTA。
在本发明的一些实施例中，所述牙胚组织为处于胚胎期的生物体的牙胚组织。利用处于胚胎期的生物体的牙胚组织获得的单细胞可以作为种子细胞，能够实现牙组织的再生和修复。
在本发明的一些实施例中，所述生物体选自大鼠、小鼠、豚鼠、人的任意一种。以小鼠胚胎发育为例，小鼠胚胎发育第10天牙齿的发生发育开始启动，第18天小鼠临产，因此可以选择胚胎期第10～18天范围内的小鼠的牙胚。对于其他生物体，可以根据相应物种的具体的发育阶段决定牙胚组织的选取时间。
根据本发明的第二方面，本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒用于分离牙胚单细胞，所述试剂盒包括胶原酶、胰蛋白酶和DNA水解酶。
在本发明的一些实施例中，所述试剂盒中胶原酶为I型胶原酶。
在本发明的一些实施例中，所述DNA水解酶为DNase I。
在本发明的一些实施例中，所述试剂盒进一步包括：DMEM/F12培养液、含有血清的培养液或者EDTA中的至少一种。
根据本发明的第三方面，本发明提供了一种构建测序文库的方法，包括：按照本发明第一方面所述的方法获取牙胚单细胞；对所述牙胚单细胞建库，获得牙胚单细胞测序文库。
根据本发明的第四方面，本发明提供了一种对牙胚组织进行测序的方法，包括：对所述牙胚组织按照本发明第一方面所述的方法处理，获得牙胚单细胞；对所述牙胚单细胞建库，获得牙胚单细胞测序文库；利用单细胞测序平台对所述牙胚单细胞测序文库测序，以便获得测序结果。
在本发明的一些实施例中，以上对牙胚组织进行测序的方法中，所述单细胞测序平台选自Illumina单细胞测序平台、BD Rhapsody单细胞分析平台、10×Genonics单细胞测序平台中的一种。
本发明所取得的有益效果为：本发明所提供的分离牙胚单细胞的方法，相较以往通过将组织进行物理分离，来获得单细胞的消化方法而言，省去了牙胚上皮组织与间充质组织消化分离的步骤和人为分离上皮组织和间充质组织的步骤，为整个消化流程节约了消化时间，同时降低了人为操作的难度；其次，本发明所述的消化方法，偏重采用对细胞伤害较小的消化酶种类进行消化，或使用温和消化酶加入的方法减少作用剧烈消化酶的作用时间，以保证在整个消化过程中，酶对细胞的伤害降至最低，最大程度上保留细胞原始特性；最后，本发明所述的消化方法，能够将组织完全消化成单细胞状态，无黏连现象，为后续实验例如单细胞测序，提供了良好的基础。
附图说明
图1显示本发明的一个实施例中E14.5小鼠切牙、磨牙牙胚的组织分离和单细胞分离过程的示意图。
图2显示本发明的一个实施例中E14.5小鼠磨牙牙胚单细胞分离后，重聚、移植后牙齿的体视镜下牙齿的放大图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
牙齿由牙胚发育而来，牙胚又经过复杂的发生、发育、分化，组织形成和萌出等过程。在牙齿发育的初始阶段，口腔黏膜上皮条索可诱导牙齿发生，首先该上皮诱导腮弓中的间充质形成牙间充质，而后两者相互作用，形成由上皮细胞和外胚间充质细胞共同形成的牙胚组织。利用胚胎时期的牙胚组织分离获得单细胞，将这些细胞作为种子细胞，应用于牙组织工程中，从而可以实现牙组织的再生和修复，从而从根本上解决牙齿问题。
本发明的发明人在研究过程中发现：对牙胚组织通过利用胶原酶、胰蛋白酶以及DNA水解酶依次进行处理，能够使得牙胚组织快速分离为单细胞。而且对于细胞的伤害极低，不破坏细胞的性能，尤其是使得所获得的单细胞能够适合大规模牙胚组织单细胞转录组测序的研究。利用胶原酶、胰蛋白酶以及DNA水解酶依次处理获得单细胞，可以省去传统上需要对组织进行物理分离，才能获得单细胞的人为操作。在至少一种优选实施方式中，DNA水解酶为脱氧核糖核酸酶Ⅰ。
如本文所用，术语“单细胞分离”或者“分离单细胞”是指将细胞群体分离为单独存在的细胞个体的过程。在本文中，指将胚胎时期的牙胚组织或者牙胚组织相关区域分离为单独存在的细胞个体的过程。
胶原酶的化学名为胶原蛋白水解酶(Collagenase)，它能在生理PH和温度条件下特异性地水解天然胶原蛋白的三维螺旋结构，而不损伤其它蛋白质和组织。胶原酶是从溶组织梭状细胞芽孢杆菌提取制备的，主要水解结缔组织中胶原蛋白成分。当拟消化的组织较硬，内含较多结缔组织或胶原成分时，可采用胶原酶解离细胞法。胶原酶仅对细胞间质有消化作用而对上皮细胞影响不大。适于消化分离纤维性组织、上皮及癌组织，可使上皮细胞与胶原成分分离而不受损害。胶原酶分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型以及肝细胞专用胶原酶。根据本发明的实施例，所述胶原酶为Ⅰ型胶原酶，作用浓度为75units/mL，反应温度为37℃。
胰蛋白酶(简称胰酶)是广泛应用的消化剂。是一种胰脏制品,对蛋白质有水解作用，主要作用于赖氨酸或精氨酸相连接的肽键，使细胞间质中的蛋白质水解而使细胞分散开，胰蛋白酶作用较强，容易造成平滑肌细胞损坏。在至少一种实施方式中，所使用到的胰蛋白酶为含有EDTA的质量百分浓度为0.25％的胰蛋白酶。质量百分浓度按照通常理解，即溶质的质量占全部溶液的质量的百分比。在至少一种实施方式中，质量百分浓度为0.25％的胰蛋白酶即将溶质胰蛋白酶溶于DPBS中，其中胰蛋白酶全部溶液的质量百分比为0.25％。在至少一些实施例中，含有EDTA的质量百分浓度为0.25％的胰蛋白酶中，EDTA的质量百分浓度为0.02％。
脱氧核糖核酸酶Ⅰ是最有代表性的核酸内切酶。最早是由M.Kunitz从胰脏中分离出结晶的，也称为脱氧核糖核酸酶或DNaseⅠ。能够分离单链和双链DNA，产生具有5′-磷酸末端的分解物。在原代组织分离的过程中能够对胰蛋白酶消化造成细胞DNA外溢导致的细胞黏连起到分离作用。在至少一种实施方式中，所使用的DNA水解酶为DNase I，作用浓度为20units/mL，反应温度为37℃。
利用本发明提供的方法可以制备得到单细胞，该单细胞满足对于单细胞测序的要求。所获得的单细胞可以满足现有单细胞测序平台的要求。例如可以选择测序平台10xChromium Single Cell Gene Expression Solution平台。该平台是10×genomic公司推出的，可通过快速高效的单细胞标记、测序和分析，获得单细胞水平的数字化基因表达谱。而且，周期快速，细胞捕获效率高。该平台可以利用微流控技术进行单个细胞分选，将带有条形码和引物的凝胶珠和单个细胞包裹在油滴中，在每个油滴中，凝胶珠溶解，细胞裂解释放mRNA，通过逆转录产生用于测序的带条形码的cDNA；液体油层破坏后，cDNA后续进行文库构建，使用Illumina测序平台对文库进行测序检测，即可一次性获得大量单细胞的基因表达数据。BD Rhapsody系统也是基于微流控芯片技术。细胞悬液经注入孔注入，自然沉降到反应孔中，随后，磁珠同样由注入孔注入，即可在单个反应孔中捕获其中的细胞。磁珠上的序列结构可以捕获到游离mRNA的poly A尾。
Single-Cell SequencingSolution借助Bio-Rad的Droplet Digital液滴分离技术，可以对单个细胞进行隔离和编制条形码，完成单细胞的捕获、扩增、表达谱建库，然后在Illumina NextSeq 500仪器进行下游测序，从而获得单个细胞表达谱数据。此外还有Fluidigm公司推出的C1单细胞自动制备系统，借助于微流体技术可以实现单细胞测序。Wafergen公司开发的ICELL8Single-CellSystem单细胞分选平台，借助于微流控芯片技术，实现单细胞测序。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例中所用到的原料、试剂及其厂家如下：
ICR小鼠购自于：北京维通利华实验动物技术有限公司，
DPBS缓冲液购自于Gibco，货号：C14190500BT，
I型胶原酶购自于Gibco，货号：C0130，
胰蛋白酶购自于Gibco，货号：25200-056，
DNase I购自于Roche，货号：04716728001，
DMEM/F12培养液购自于Gibco，货号：C11330500BT，
高糖DMEM培养液(DMEM/HG培养液)购自于Hyclone，货号：SH30022.01，
非必须氨基酸(non-essential amino acids，NEAA)、谷氨酸混合物(Gluta Max)均购自于Gibco公司，胎牛血清购自于Natocor，货号为SFBE。
实施例1
以14.5天小鼠胚胎为例，对本发明的具体实施过程进行详细说明。
ICR(Institute of Cancer Research)成年小鼠购自于北京维通利华实验动物技术有限公司，购买后饲养于中国科学院广州生物医药与健康研究院动物实验中心SPF级实验动物区，由实验人员自行合笼检栓计算孕期。然后选用孕14.5天小鼠，安乐死后在无菌条件下取出胚胎，将子宫壁、羊膜、胎盘逐一分离，同时淘汰个体差异较大的胚胎(整个过程在DPBS缓冲液中操作，DPBS缓冲液预冷，操作中尽量在冰上进行，防止细胞凋亡)。待分离出单个小鼠胚胎后，将盛装有小鼠胚胎的解剖皿转移至解剖镜下，以1mL注射针为操作工具切下胎鼠下颌，继而切取下颌切牙牙胚及磨牙牙胚。切取牙胚组织时应尽量保留牙胚区域，去除多余组织。
牙胚组织分离完成后，将切牙牙胚和磨牙牙胚分别收集至无菌的EP管中，200g、4℃离心5min，离心后吸去多余DPBS缓冲液。分别按照如下步骤进行消化处理：
第一步消化：每管加入5005LⅠ型胶原酶(胶原酶的作用浓度为75units/mL)，37℃消化20min，消化完成后可见组织呈现较软状态，吸去消化液用DMEM/F12培养液清洗一遍，200g、4℃离心5min；离心后吸去DMEM/F12培养液；
第二步消化：每管加入500 5L质量百分浓度为0.25％的胰蛋白酶，37℃消化4min(胰蛋白酶消化时间根据组织大小及细胞间结合紧密程度进行适当调整，详见表1)，消化后用200 5L枪头吹打，吹打至肉眼无明显组织状态后立刻加入与胰蛋白酶等体积的MEF培养基含有血清的培养液进行终止，200g、4℃离心5min，离心后吸去消化液；
其中MEF培养基的配方为：高糖DMEM培养液+10％的FBS+1％的NEAA+1％的GlutaMax。
第三步消化：每管加入5005L DNase I(DNaseI的作用浓度为20units/mL)，37℃消化5min，打散细胞间的黏连，消化完成后轻吹，加入200 5L 0.5mM EDTA终止消化，200g、4℃离心5min，完成三步消化，消化步骤完成后，用含有0.04％BSA的DPBS缓冲液清洗细胞一遍，过405m细胞筛，保证细胞悬液中的细胞均为单细胞状态。
注意事项：
1.消化过程中由于多次离心操作，将会导致细胞损失，为降低细胞的损失比例，可在具体消化步骤中将所使用到的EP管、枪头等均改换为低黏附款；
2.为防止胰蛋白酶中的EDTA对DNA水解酶造成的影响，应尽量吸干离心后的消化液，同时小心操作，防止细胞丢失；
3.由于胰蛋白酶消化作用较为剧烈，消化时间为多次摸索后确定的最佳消化时间，忌吹打不开后补消化，如此将导致大量DNA外溢，影响后续实验步骤。
表1本发明实施例中各天数牙胚组织的消化详细流程信息
其中，表1中示出了各天数牙胚组织的消化处理的详细流程信息。其中E12.5，E13.5，E14.5，E16.5分别代表12.5天的小鼠胚胎，13.5天的小鼠胚胎，14.5天的小鼠胚胎，16.5天的小鼠胚胎。表1中M是molar的缩写，代表磨牙，M1代表第一磨牙，M2代表第二磨牙；I是incisor的首字母缩写，代表切牙。其中每胎中总细胞的数量代表利用如上第一步消化、第二步消化和第三步消化处理每一胎孕鼠，所获得的总细胞的数量。而括号中“12胚胎＝12下颌＝24磨牙&切牙”代表的含义为：假设每胎孕鼠能够提供12只胎鼠，由于每只胎鼠下颌在左右两侧共有两个磨牙牙胚和两个切牙牙胚，这样每胎孕鼠一共可以提供24个切牙牙胚和24个磨牙牙胚。因此，每胎中总细胞的数量也相当于12个胚胎，或者12个下颌，或者24个磨牙牙胚和24个切牙牙胚中的总细胞的数量。
图1中示出了E14.5小鼠切牙、磨牙牙胚的组织分离和单细胞分离过程的示意图。图1中，取E14.5小鼠磨牙，然后分别获得磨牙牙胚和切牙牙胚，分别按照如上过程进行消化处理，获得单细胞。图1示出的单细胞为呈现在血细胞计数板上的单细胞，是利用小鼠磨牙牙胚组织所获得的单细胞，其中血细胞计数板上示出的正方形的边长为250μm。
从图1可以看出，利用小鼠磨牙牙胚组织所获得的单细胞的直径大小在12～18μm范围。对小鼠切牙分别进行相同的处理，所获得的单细胞的大小也在12～18μm之间。同样地，对E12.5，E13.5以及E16.5小鼠胚胎进行处理，所获得的单细胞的大小均在12～18μm范围。而且将所获得的单细胞悬液过40μm细胞筛前后，无较大差别，说明牙胚组织进行消化后基本均呈现单细胞状态。而且利用计数板计数时也呈现单细胞状态。
总之，无论对切牙的牙胚组织还是磨牙的牙胚组织，均能得到单细胞悬液，且单细胞悬液过40μm前后细胞技术无较大差别，说明组织消化后多呈现单细胞状态，且计数时在计数板上呈现单细胞状态。
为了研究牙胚组织分离获得牙胚单细胞的方法，参照上述实验过程，我们只利用胰蛋白酶进行消化处理牙胚组织，结果发现，只利用胰蛋白酶消化时，组织吹散较为困难，细胞机械力损伤较为严重，表现为细胞死亡和细胞撕裂。根据台盼蓝染色的特点，活细胞无法被染成蓝色，而死细胞能够被台盼蓝透过，呈现蓝色状态，而完整的细胞个体呈现较规则的圆形形态。利用胰蛋白酶消化处理，在细胞计数时视野内可见较多蓝色或者非圆形的碎片。且吹散后离心，细胞呈现黏连状态严重。
同时，参照上述实验过程，仅利用胰蛋白酶和DNA水解酶消化的方法来处理牙胚组织(即省去胶原酶处理的过程，依次采用胰蛋白酶和DNA水解酶处理牙胚组织)。结果发现：虽然细胞计数时死细胞数量与细胞碎片数量明显减少，选用胰蛋白酶和DNA水解酶处理牙胚组织时，需要的消化时间较长，而且虽然相对于仅利用胰蛋白酶处理能够避免细胞之间的黏连情况，无法保证获取单细胞状态，仍存在消化后组织吹散较为困难的问题。后期通过40μm滤网后，虽然可以保证单细胞状态，但是过滤前后细胞损失量大，而且由于细胞黏连程度高，在反复的离心操作过程中细胞的损失量大。这种处理方式，对于原代组织来说，很可能会导致某些关键细胞的丢失。
而采用胶原酶、胰蛋白酶和DNA水解酶联合消化处理，在细胞计数时很少有死细胞和细胞碎片出现。而且细胞黏连状态和细胞严重损失现象很少。由此，依次采用I型胶原酶、胰蛋白酶和DNA水解酶，能够将牙胚组织分离成单细胞，且获得的单细胞之间没有黏连。以胚龄14.5的小鼠磨牙为例，两个磨牙牙胚即可满足测序时的细胞数量要求。
然后将利用I型胶原酶、胰蛋白酶和DNA水解酶消化处理所获得的单细胞进行重聚、移植，观察所获得的细胞的成牙能力。其过程如下：
将按照一定数量细胞浆收集得到的单细胞悬液分为若干份，置于ep管中冷冻离心，使细胞聚集成团，随后扎破ep管壁，置于细胞培养箱中培养一定时间，使细胞重聚成小球。
小鼠完成麻醉后俯卧位，自背部开创，取出肾脏，在肾脏的适宜位点打开肾包膜，将收集得到的细胞小球置于肾包膜下，完成所有样品移植后，将肾脏放回腹腔，缝合肌肉皮肤，完成移植。
实验结果如图2所示，图2示出了E14.5小鼠磨牙牙胚单细胞分离后，重聚、移植后的成牙体视图。图2所显示的是将牙胚单细胞重聚获得重组牙胚，然后将重组牙胚移植三周后的成牙效果。其中图2中A为将10个重组牙胚移植到同一肾脏三周后的结果图，可见在肾脏中呈现有明显的矿化结构形成；B、C和D图所示为每一个重组牙胚所形成的牙齿图，可见每个重组牙胚都能够形成多个牙齿结果；E图为D图所示样品剖出后的牙齿，可见此样品在移植三周后能够形成8颗牙齿。根据图2所示结果，发现在移植三周后所有样品均形成矿化的牙齿组织，样品成牙效率为100％，单个样品的成牙数量为2～8颗。表明利用小鼠磨牙牙胚消化处理后所获得的单细胞，进行重聚和移植后，单细胞仍保有细胞原有的成牙能力。
实施例2
分别将实施例1利用胶原酶、胰蛋白酶和DNA水解酶联合消化处理所获得的单细胞利用10x Genonics单细胞测序平台进行测序。按照10x Genonics single cell 3’reagentkits v2说明书中描述对实施例所获得的单细胞建库和测序，所获得的测序信息如下表2所示：
表2分离后的单细胞用于单细胞测序时细胞的捕获效率信息
其中表2中活细胞浓度和目的细胞数代表在进行细胞捕获时的加样信息。其中活细胞浓度指的是：将组织消化为单细胞悬液后，利用台盼蓝染色法对细胞进行计数，由于台盼蓝不能透过活细胞细胞膜，因此计数的细胞数量为活细胞数量，活细胞浓度反应单位体积内活细胞的数量；目的细胞数是指：由于活细胞浓度已知，在单细胞样品上机捕获前，设置目的细胞数，所决定加入捕获芯片中的单细胞悬液体积。
文库浓度和文库体积指的是建库完成后的样品信息。其中文库浓度是指cDNA文库的浓度，是指由细胞的mRNA反转录后的涵盖全转录组总cDNA的浓度。文库体积是指根据文库浓度测序时所加入的样品体积。
有效细胞数是在完成测序后根据测序标记(barcode)所捕获到的能达到一定要求的有效基因信息的细胞数量，即根据测序结果所计算出的实际捕获到的单细胞数量。由于每个细胞在10x Genomics平台的测序方法中用到的微流板中，每个细胞都是单独标记的，每个细胞有自己的测序标记(barcode)；所以测序结果对每一个细胞的测序质量会进行一定的筛选。每个细胞都需要测到一定有效基因(测序程序中已经设置好的相应的要求)，才能最终被认定为有效细胞(即活细胞)。而有效细胞数越多，即有效细胞数与目的细胞数的比值越高，说明捕获效率越高。表2给出的信息说明，利用10×Genonics单细胞测序平台对于本发明所获得的单细胞测序，能够很容易捕获到目的细胞。
而且所获得的单细胞能够满足单细胞转录组测序对于样品的要求，如10×Genomics平台的样品浓度不低于1×103cells/μL、活细胞数在90％以上、细胞大小小于405m等。
在本发明的描述中，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (10)
1.一种分离牙胚单细胞的方法，其特征在于，包括：
依次利用胶原酶、胰蛋白酶和DNA水解酶对牙胚组织进行消化处理，获得牙胚单细胞；
任选地，所述胶原酶为Ⅰ型胶原酶；
任选地，所述DNA水解酶为DNase I。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括：
利用胶原酶对牙胚组织进行第一消化处理，除去胶原酶，加入第一培养液清清洗，获得第一消化产物；
利用胰蛋白酶对所述第一消化产物进行第二消化处理，加入第二培养液终止，获得第二消化产物；
利用DNA水解酶对所述第二消化产物进行第三消化处理，加入终止液终止，获得牙胚单细胞。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述胶原酶的作用浓度为50～100U/mL，作用时间为15～30分钟，作用温度为37摄氏度；
任选地，所述胰蛋白酶的作用浓度为质量百分浓度0.05～0.25％，作用时间为2～5分钟，作用温度为37摄氏度；
任选地，所述DNA水解酶的作用浓度为10～30U/mL，作用时间为5～10分钟，作用温度为37摄氏度。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述第一培养液为DMEM/F12培养液；
任选地，所述第二培养液为含有血清的培养液。
5.根据权利要求2～4中任一项所述的方法，其特征在于，所述终止液为EDTA。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的方法，其特征在于，所述牙胚组织为处于胚胎期的生物体的牙胚组织；
任选地，所述生物体选自大鼠、小鼠、豚鼠、人的任意一种。
7.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于分离牙胚单细胞，所述试剂盒包括：胶原酶、胰蛋白酶和DNA水解酶；
任选地，所述胶原酶为Ⅰ型胶原酶；
任选地，所述DNA水解酶为DNase I；
任选地，进一步包括：DMEM/F12培养液、含有血清的培养液或者EDTA中的至少一种。
8.一种构建测序文库的方法，其特征在于，包括：
按照权利要求1～6任一项所述的方法获取牙胚单细胞；
对所述牙胚单细胞建库，获得牙胚单细胞测序文库。
9.一种对牙胚组织进行测序的方法，其特征在于，包括：
对所述牙胚组织按照权利要求1～6中任一项所述的方法处理，获得牙胚单细胞；
对所述牙胚单细胞建库，获得牙胚单细胞测序文库；
利用单细胞测序平台对所述牙胚单细胞测序文库测序，以便获得测序结果。
10.根据权利要求9所述的对牙胚组织进行测序的方法，其特征在于，所述单细胞测序平台选自Illumina单细胞测序平台、BD Rhapsody单细胞分析平台、10×Genonics单细胞测序平台、Fludigm C1单细胞测序平台中的一种。
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| CN201811367582.1A CN111197027A (zh) | 2018-11-16 | 2018-11-16 | 分离牙胚单细胞的方法及应用 |
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Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
| CN112574941A (zh) * | 2020-12-29 | 2021-03-30 | 上海派森诺生物科技股份有限公司 | 一种组织单细胞悬液的制备方法 |
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- 2018-11-16 CN CN201811367582.1A patent/CN111197027A/zh active Pending
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