CN103255101A - 一种成釉细胞的分离培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种成釉细胞的分离培养方法，具体地说，是涉及一种采用体视显微镜下分离牙胚组织和酶消化法分选相结合分离培养高纯度成釉细胞的方法。该方法的步骤为：体视显微镜下分离小鼠牙胚后，采用单克隆法原代培养成釉细胞，用更换培养液类型、差别消化法进行纯化，在倒置显微镜下观察细胞形态及生长状况，用免疫荧光法检测细胞表达釉原蛋白、成釉蛋白和细胞角蛋白14的情况。原代培养的成釉细胞生长良好，纯化后间充质细胞明显减少，上皮细胞呈片状生长，表达角蛋白，釉原蛋白以及成釉蛋白。体外培养的人成釉上皮细胞在较长时间内可保持其特性。建立人牙源性上皮细胞的体外培养方法，为牙齿组织工程研究提供可靠的种子细胞来源。

Description

一种成釉细胞的分离培养方法

技术领域

本发明涉及一种成釉细胞的分离培养方法，具体地说，是涉及一种采用体视显微镜下分离牙胚组织和酶消化法分选相结合分离培养高纯度成釉细胞的方法。

 

技术背景

    釉质，是矿化程度最高的牙体组织，是由羟基磷灰石构成，大约96%的矿物质和剩余4%的有机物和水组成。釉质的基本组成单位是秞柱。而秞柱的编织结构加强了强度和抗折裂的能力。然而，这仍然不能避免牙釉质因为龋病和外伤导致损伤。牙釉质是由发育牙胚成釉器中上皮来源的成釉细胞形成的，牙釉质覆盖着牙本质牙髓复合体。上皮向成釉细胞的分化是由上皮和间充质之间的相互作用调控的。牙釉质和粘膜之间的区别在于牙釉质没有任何上皮反应，因为形成釉质的上皮—成釉细胞—在牙齿萌出的时候已经丧失了。这也就意味着在牙齿萌出后牙釉质既不能替换也不能修复。

    为了替代缺失的牙釉质，牙医已经将能够模仿釉质的硬度的人工合成材料用于临床，但是人工合成材料并不是最理想的治疗方案。所以建立一种形成天然釉质新方法可以为修复釉质缺失提供一种重要的方法。

    近年来，用于牙再生的组织工程学致力于利用各种方法再生牙齿的结构。而这也给再生天然牙釉质提供了新的思路：组织工程学技术同样可以用于牙釉质再生。组织工程包括具有特定发育表型的组织特异性干细胞的体外培养。这些细胞都在特异性的培养环境下生长而且能够移植到体内从而形成新的组织或者器官。牙源性上皮因为在体外难以生长而使得科学家难以研究其特性。到目前为止，长时间培养成釉细胞的同时保持原代表型仍是十分困难的。于是，国内外学者着手进行牙源性上皮细胞终末期细胞（成釉细胞）的体外分离培养研究。目前已有多种方法可以用于成釉细胞的体外分离培养，但这些方法仍然存在着两大问题。其一，成釉细胞的生长容易因有间充质细胞的污染受到干扰，因为间充质细胞具有高增殖能力。其次是牙源性上皮的体外增殖仍然是存在问题，因为成釉在很短的时期后有终末分化的趋势。也就是体外培养的成釉细胞要维持其原代表型依旧存在一定困难。kukita等采用消化法在无血清条件下培养出大鼠成釉细胞，这些细胞表达釉原蛋白，但增殖较慢，其中混杂较多间充质细胞，仅传至第2代即失去成釉细胞的形态和特征。事实上，可以维持原代表型的猪成釉细胞的原代培养系统之前有过报道，但是这个方法涉及到了利用转化基因simian virus40对成釉细胞的转化和永生化。上述均方法繁琐且耗费高昂。

发明内容

本发明的发明目的在于：针对上述存在的问题，提供一种操作简易且较为经济的牙釉质细胞体外培养的方法。

本发明采用的技术方案是这样的：

一种人成釉细胞的分离培养方法，具体包括如下步骤：

（1）分离获取牙胚组织，用单克隆法原代培养获得牙源性细胞；

（2）将牙源性细胞用无血清培养基选择性培养；

（3）用差别消化法进行传代培养，得到成釉细胞；

（4）任选将获得的成釉细胞继续用无血清培养基培养。

    上述的成釉细胞的分离培养方法中,步骤（1）所述单克隆法包括用胶原酶I型和分散酶的混合液以及胰蛋白酶对牙胚组织进行消化的步骤；具体步骤优选用3mg/ml的胶原酶I型和3mg/ml的分散酶的混合液，在37℃的条件下消化1.5h，以及采用0.05%的胰蛋白酶，在37℃时消化5min；步骤（1）优选的操作为：在常规无菌条件下体视显微镜下机械分离牙胚组织，经漂洗、剪碎、离心收集后，在牙胚组织中加入与20倍体积3mg/ml的Ⅰ型胶原酶和3mg/ml的分散酶的混合液在37℃消化1.5h，期间适当震荡使其充分消化，再加入与混合液等体积的培养基中和离心收集细胞，之后用0.05%胰蛋白酶在37℃时消化5min，加入与胰酶等体积培养基进行中和，离心后获得的细胞即为牙源性细胞。

    步骤（2）中所述无血清培养基为含有1% （占培养基总体积1%）青链霉素混合液、0.05mMCa²⁺的KGM-2培养基；用于接种牙源性细胞的培养皿为真空-气体血浆处理的表面化学特性一致的培养皿；优选当步骤（2）中获得的牙源性细胞在培养皿底部的生长密度达70-90%时，进行步骤（3）的传代培养；所述生长密度达70-90%是指细胞长到占培养皿底部面积的70-90%。

    步骤（3）中传代培养为贴壁培养；步骤（3）中传代培养时使用的差别消化法包括用0.25%的胰蛋白酶，在37℃下消化2min，用等量培养基中和，弃去上清液，用PBS溶液清洗2遍，细胞刮刀收集培养皿上余留细胞即得到成釉细胞。

    细胞刮刀收集培养皿上残余细胞（成釉细胞），接种培养皿。将细胞进行免疫荧光染色，并且待细胞生长密度大70-90%时，收集细胞，提取mRNA进行PCR检测。

    如前所述任意一项的成釉细胞的分离纯化培养的方法所分离培养的成釉细胞，用于牙釉质再生或是其他牙组织工程。

    目前现有技术中成釉细胞的传代培养多有增殖缓慢且容易出现终末分化，针对这两个问题，我们进行了广泛的研究。结果发现，将无血清培养基选择性培养上皮和差别消化法相结合，可以尽可能去除成釉细胞中混杂的间充质细胞，由此可以获得高纯度的成釉细胞，同时使用真空-气体血浆处理的表面化学特性一致的培养皿保证细胞的贴壁及增殖速度。本发明检测了成釉细胞的培养，并从形态学，免疫细胞化学和mRNA等水平证实了所获得的细胞即为成釉细胞。

    本发明采用无血清培养基选择性培养和差别消化法相结合的方法富集到了高纯度的成釉细胞群，与现有技术相比，本发明具有以下优点和积极效果：

    1、本发明采用了无血清培养基选择性培养和差别消化法相结合的方法富集到能够表达成釉蛋白，釉原蛋白以及细胞角蛋白14的成釉细胞群。而纯化前混杂的间充质细胞是不表达这些蛋白的。

2、本发明培养所采用的无血清培养基为加入1%青链霉素混合液和0.05mMCa²⁺的KGM-2培养基，该培养基即含有培养成釉细胞所需的少量的牛垂体提取物BPE (bovine pitutary extract)、人表皮生长因子、胰岛素（人重组蛋白）、氢羟肾上腺皮质素、GA-1000 (gentamicin, amphotericin-B)、肾上腺素、铁传递蛋白。同时无血清培养基又能抑制间充质细胞。无需另外准备滋养层细胞或是包被培养皿。

3、本发明使用BD FALCON BD Primaria??细胞培养皿，该培养皿真空-气体血浆处理的表面化学特性一致，从而保证了成釉细胞的贴壁及增殖速度。

4、本发明同时使用差别消化法去除成釉细胞中混杂的间充质细胞很大程度上提高了成釉细胞的纯度，所述的差别消化法为使用0.25%的胰酶消化贴壁细胞2min后，用与胰酶等体积培养基中和，弃去上清液及消化下的牙乳头细胞，用PBS溶液清洗2遍，细胞刮刀收集培养皿上余留细胞即得到成釉细胞。PBS溶液的摩尔浓度为0.01M，其pH值为 7.2-7.4。

本发明找到了一种可行、高效获得成釉细胞的方法，为在体外获取大量成釉潜能的成釉细胞运用于牙釉质再生甚至牙组织工程提供了新的方法。

附图说明

图1成釉细胞原代倒置显微镜图 第三天 单克隆 （x200）

图2成釉细胞原代倒置显微镜图 一周 片状生长（x200）

图3成釉细胞原代倒置显微镜图 两周 片状生长至80%（x200）

图4成釉细胞 釉原蛋白 免疫荧光染色（x200）

图5成釉细胞 成釉蛋白 免疫荧光染色（x200）

图6成釉细胞 细胞角化蛋白14 免疫荧光染色（x200）

本发明实施例中所提到的牙胚组织来源于胚鼠，本发明实施例中所用主要材料、

试剂与设备如下：

胚鼠；

KGM-2培养基（Lonza，美国）；

胰蛋白酶- 乙二胺四乙酸（EDTA ）(Gibco，美国）；

I 型胶原酶(COLLAGENASE TYPE I)（Gibco，美国）

分散酶I(DispaseI) (Roche, 美国)

amelogenin抗体,ameloblast抗体,CK14 (santa cruz，美国)

Gradient PCR Thermal Cycle ( Eppendorf, Germany)；BIORAD电泳仪（Bio-Rad, USA）

RNeasy Mini kit（QIAGEN Sciences, USA）

PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa，宝生物工程(大连)有限公司）

恒温水浴箱(Heto-Hoten，丹麦) ；

微量移液器(Gilson 公司，法国) ；

BD FALCON BD Primaria??细胞培养皿（BD，美国）

电子天平(Strtorius，美国)

超纯水机UNIQUE-R30（Millipore，美国）；

CO2 培养箱(Thermo，德国)，

台式离心机 SORVALLR LEGEND RM（Thermo，德国），

Thermo KS12 超净工作台（Thermo，德国），

Thermo -86℃ HERA freeze, (Thermo，德国) ；

OLYMPUS CKX41倒置显微镜（Olympus，日本），

OLYMPUS SZ61 体视显微镜（Olympus，日本）。

实施例1：

从胎鼠颌骨组织中分离获取牙胚组织使用单克隆法进行培养：在常规无菌条件下体视显微镜下机械分离牙胚，经漂洗、剪碎、离心收集后，在牙胚组织中加入与20倍体积3mg/ml的Ⅰ型胶原酶和3mg/ml分散酶的混合液在37℃消化1.5h，期间适当震荡充分消化，加入与混合液等体积培养基中和离心收集细胞，之后用0.05%胰蛋白酶37℃消化5min，加入与胰酶等体积培养基中和，离心后获得细胞即为牙源性细胞。

将获得的牙源性细胞接种于真空-气体血浆处理的表面化学特性一致的培养皿进行贴壁培养。牙源性细胞的培养采用含有1% 体积比青链霉素混合液、0.05mMCa²⁺的KGM-2培养基。培养基中加入了培养成釉细胞所需的少量的牛垂体提取物BPE (bovine pitutary extract)、人表皮生长因子、胰岛素（人重组蛋白）、氢羟肾上腺皮质素、GA-1000 (gentamicin, amphotericin-B)、肾上腺素、铁传递蛋白。培养条件为37℃、5%（v/v）CO₂。

当获得的牙源性细胞在培养皿底部的生长密度达80% 时，进行传代培养。传代是采用差别消化法，即待细胞生长密度达80%是，用0．25％胰蛋白酶37℃ 消化2 min后弃去消化液及其中先消化下的间充质细胞，PBS荡洗两次，用细胞刮刀收集培养皿中的剩余细胞即成釉细胞，再接种于培养皿中。

体外培养成釉细胞成釉潜能检测

RT-PCR检测成釉细胞特异性基因amelogenin、ameloblastin、Cytokeratin14的表达情况。收集P1的成釉细胞，按照Qiagen mRNA提取试剂盒抽提总RNA,接着按照TaKaRa逆转录试剂盒合成cDNA, 将得到的cDNA 模板-20℃贮存备用。根据待检测基因序列，采用Primer 5.0 引物设计软件设计引物：正向引物 (Forward primer )、反向引物 (Reverse primer)，以管家基因GAPDH作为内参。成釉细胞的特异性基因amelogenin、ameloblastin、Cytokeratin14都有所表达，证明成釉细胞分化培养成功。免疫荧光染色检测成釉细胞特异性蛋白成釉蛋白，釉原蛋白和细胞角蛋白14的表达情况。

成釉细胞细胞爬片用4%多聚甲醛固定。

3%羊血清，0.1%牛血清蛋白和0.1%Triton室温封闭1h。

PBS液漂洗，15min*3次,目标蛋白一抗4℃孵育过夜。

PBS液漂洗，15min*3次，二抗室温孵育1h。

PBS液漂洗，15min*3次，DAPI室温孵育5min。

PBS液漂洗，15min*3次, 封片，荧光显微镜观察。成釉细胞特异性蛋白成釉蛋白，釉原蛋白和细胞角蛋白14都有所表达，再一次证明成釉细胞分化培养成功。

    在本发明中，从形态学、免疫细胞化学和mRNA等方面证明了体外培养的成釉细胞仍然具有形成牙釉质的潜能。该方法建立了一种高效、快速、经济获得高纯度成釉细胞的新方法，为在体外获取大量的具有成釉潜能的种子细胞并应用于组织再生提供了新途径。 

Claims (7)

1.一种成釉细胞的分离培养方法，其特征在于包括如下步骤：

分离获取牙胚组织，用单克隆法原代培养获得牙源性细胞；

将牙源性细胞用无血清培养基选择性培养；

用差别消化法进行传代培养，得到成釉细胞；

任选将获得的成釉细胞继续用无血清培养基培养。

2.根据权利要求1所述的成釉细胞的分离培养方法，其特征在于：步骤（1）所述单克隆法包括用胶原酶I型和分散酶的混合液以及胰蛋白酶对牙胚组织进行消化的步骤。

3.根据权利要求1 所述的成釉细胞的分离培养方法，其特征在于：步骤（2）中所述无血清培养基为含有1% 青链霉素混合液、0.05mMCa²⁺的KGM-2培养基。

4.根据权利要求1 所述的成釉细胞的分离培养方法，其特征在于：步骤（2）培养牙源性细胞时用于接种的培养皿为真空-气体血浆处理的表面化学特性一致的培养皿。

5.根据权利要求1 所述的成釉细胞的分离培养方法，其特征在于：当步骤（2）中获得的牙源性细胞在培养皿底部的生长密度达70-90% 时，进行步骤（3）的传代培养。

6.根据权利要求2所述的成釉细胞的分离培养方法，其特征在于：步骤（3）中传代培养为贴壁培养。

7.根据权利要求1所述的成釉细胞的分离培养方法，其特征在于：步骤（3）中传代培养时使用的差别消化法包括用0.25%的胰蛋白酶，在37℃下消化2min，用等量培养基中和，弃去上清液，用PBS溶液清洗2遍，细胞刮刀收集培养皿上余留细胞即得到成釉细胞。

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