KR20150129726A - 연조직 회복 및 재생을 위한 세포 재배치된 콜라겐 매트릭스 - Google Patents

연조직 회복 및 재생을 위한 세포 재배치된 콜라겐 매트릭스 Download PDF

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브렌트 앳킨슨
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Abstract

본 발명은 콜라겐 매트릭스 및 콜라겐 매트릭스에 부착된 중간엽 줄기세포를 포함하는 연조직 손상 치료용 조성물을 제공한다. 콜라겐 매트릭스 및 콜라겐 매트릭스에 부착된 중간엽 줄기세포를 포함하는 조성물의 제조 및 사용 방법이 또한 제공된다.

Description

연조직 회복 및 재생을 위한 세포 재배치된 콜라겐 매트릭스{CELL REPOPULATED COLLAGEN MATRIX FOR SOFT TISSUE REPAIR AND REGENERATION}
<관련 출원의 상호 참조>
본원은 2013년 3월 15일에 출원된 미국 가출원 61/790,412호의 우선권의 이익을 주장하며, 그 내용은 전체로서 본원에 참조문헌으로 포함된다.
<배경 기술>
피부, 근육, 결합 조직, 또는 혈관 조직과 같은 연조직의 손상은 흔히 있는 일이다. 일부 경우에서, 가벼운 연조직 손상은 임의의 외부 개입 없이 자가-회복 가능하지만, 종종 외과적 개입이 필요할 정도로 충분히 손상의 정도가 심하거나, 연조직의 자가-회복 능력이 제한된다. 연조직 손상을 회복하기 위한 수술은 손실 또는 결여 조직을 교체(예를 들어, 파열된 힘줄 또는 인대를 교체하는 이식편을 사용하여)하도록 의도된 생체적합성 물질의 이식 또는 적용을 일반적으로 수반한다. 그러나, 외과적 개입으로도, 손상된 연조직의 회복 또는 재건 과정은 느리거나 불완전할 수 있다.
줄기세포는 힘줄 및 인대와 같은 연조직의 손상의 상처 치유 및 회복을 촉진하는 데에 유용한 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, 문헌 [Yin et al., Expert Opin. Biol. Ther. 10:689-700 (2010); Hanson et al., Plast. Reconstr. Surg. 125:510-6 (2010)]; 및 문헌 [Cha and Falanga, Clin. Dermatol. 25:73-8 (2007)]을 참조하기 바란다. 줄기세포는 연조직 재건 촉진, 예를 들어 줄기세포-접종된 소장 점막하조직을 사용한 방광 복원 및 반월판 재건 촉진에 또한 사용되었다. 문헌 [Chung et al., J. Urol. 174:353-9 (2005); Tan et al., Tissue Eng. Part A 16:67-79 (2010)].
한 측면에서, 본 발명은 대상에서의 연조직 손상 치료용 조성물을 제공한다. 일부 실시태양에서, 조성물은 콜라겐 매트릭스 및 콜라겐 매트릭스에 부착된 중간엽 줄기세포를 포함하고, 중간엽 줄기세포는 콜라겐 매트릭스에 접종된 중간엽 줄기세포 및 비-중간엽 줄기세포를 포함하는 세포 현탁액을 형성하도록 처리된 조직으로부터 유래하고, 중간엽 줄기세포는 세포 현탁액의 형성 후 및 콜라겐 매트릭스로의 세포 현탁액의 접종 전에 체 외 배양되지 않는다.
일부 실시태양에서, 콜라겐 매트릭스는 피부, 진피, 힘줄, 인대, 근육, 양막, 반월판, 소장 점막하조직, 또는 방광이다. 일부 실시태양에서, 콜라겐 매트릭스는 탈세포화된 진피이다. 일부 실시태양에서, 콜라겐 매트릭스는 상피 층이 제거된 진피이다.
일부 실시태양에서, 콜라겐 매트릭스는 면역원성을 감소시키도록 처리된다. 일부 실시태양에서, 처리된 콜라겐 매트릭스는 대응하는 미처리된 동종 콜라겐 매트릭스에 비해 50 % 이상 적은 내인성 세포를 갖는다. 일부 실시태양에서, 처리된 콜라겐 매트릭스는 대응하는 미처리된 동종 콜라겐 매트릭스에 비해 50 % 이상 감소된 DNA 함량을 갖는다. 일부 실시태양에서, 처리된 콜라겐 매트릭스는 비-면역원성이다.
일부 실시태양에서, 처리된 콜라겐 매트릭스는 생리활성(bioactive) 사이토카인을 보유한다. 일부 실시태양에서, 생리활성 사이토카인은 IL-4, IL-6, IL-15, IL-16, IL-18, 및 IL-28로 이루어지는 군에서 선택된다. 일부 실시태양에서, 처리된 콜라겐 매트릭스는 생리활성 성장 인자를 보유한다. 일부 실시태양에서, 생리활성 성장 인자는 혈소판-유래 성장 인자 알파(PDGFa)이다.
일부 실시태양에서, 콜라겐 매트릭스는 인간, 돼지, 소, 또는 말이다.
일부 실시태양에서, 세포 현탁액을 형성하도록 처리된 조직은 지방 조직, 근육 조직, 출생 조직, 피부 조직, 뼈 조직, 또는 골수 조직에서 선택된다. 일부 실시태양에서, 세포 현탁액을 형성하도록 처리된 조직은 인간 조직이다.
일부 실시태양에서, 콜라겐 매트릭스 및 세포 현탁액을 형성하도록 처리된 조직은 동일한 종으로부터 온 것이다. 일부 실시태양에서, 콜라겐 매트릭스 및 세포 현탁액을 형성하도록 처리된 조직은 상이한 종으로부터 온 것이다. 일부 실시태양에서, 콜라겐 매트릭스 및 세포 현탁액을 형성하도록 처리된 조직은 동일한 공여자로부터 온 것이다. 일부 실시태양에서, 콜라겐 매트릭스 및 세포 현탁액을 형성하도록 처리된 조직은 상이한 시체 공여자로부터 온 것이다. 일부 실시태양에서, 공여자는 인간이다.
일부 실시태양에서, 콜라겐 매트릭스에 접종된 중간엽 줄기세포는 양성 MSC 마커 CD105, CD144, CD44, CD166, 또는 CD90 중 하나 이상을 발현한다. 일부 실시태양에서, 콜라겐 매트릭스에 접종된 중간엽 줄기세포는 음성 MSC 마커 CD34 및 CD116 중 하나 이상을 발현하지 않는다.
다른 측면에서, 본 발명은 대상에서의 연조직 손상 치료 방법을 제공한다. 일부 실시태양에서, 방법은 본원에서 기술한 조성물(예를 들어, 콜라겐 매트릭스 및 콜라겐 매트릭스에 부착된 중간엽 줄기세포를 포함하고, 중간엽 줄기세포가 콜라겐 매트릭스에 접종된 중간엽 줄기세포 및 비-중간엽 줄기세포를 포함하는 세포 현탁액을 형성하도록 처리된 조직으로부터 유래하고, 중간엽 줄기세포가 세포 현탁액의 형성 후 및 콜라겐 매트릭스로의 세포 현탁액의 접종 전에 체 외 배양되지 않는, 조성물)을 연조직 손상 부위에 접촉시키는 단계를 포함한다.
일부 실시태양에서, 연조직 손상은 힘줄 조직, 인대 조직, 반월판 조직, 근육 조직, 피부 조직, 방광 조직, 또는 진피 조직의 손상이다. 일부 실시태양에서, 연조직 손상은 수술 상처, 외상 상처, 만성 상처, 급성 상처, 깊은(deep channel) 상처, 출혈 부위, 또는 화상이다.
일부 실시태양에서, 조성물은 국소적으로 투여된다. 일부 실시태양에서, 조성물은 외과적 이식에 의해 투여된다.
일부 실시태양에서, 대상은 인간 대상이다. 일부 실시태양에서, 대상은 수의학적 대상이다. 일부 실시태양에서, 수의학적 대상은 말이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 연조직 손상 치료용 조성물의 제조 방법을 제공한다. 일부 실시태양에서, 방법은 다음을 포함한다:
(a) 중간엽 줄기세포 및 비-중간엽 줄기세포를 포함하는 세포 현탁액을 형성하도록 조직을 소화시키는 단계;
(b) 콜라겐 매트릭스로 세포 현탁액을 접종하는 단계;
(c) 중간엽 줄기세포를 콜라겐 매트릭스에 부착시키기 적합한 조건하에서 세포 현탁액이 접종된 콜라겐 매트릭스를 인큐베이션하는 단계; 및
(d) 비-부착 세포를 콜라겐 매트릭스에서 제거하는 단계.
일부 실시태양에서, (b) 단계 전에, 방법은 면역원성을 감소시키도록 콜라겐 매트릭스를 처리하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시태양에서, 면역원성을 감소시키도록 콜라겐 매트릭스를 처리하는 단계는 콜라겐 매트릭스에 탈세포화제를 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 실시태양에서, 면역원성을 감소시키도록 콜라겐 매트릭스를 처리하는 단계는 콜라겐 매트릭스를 탈세포화하지 않고 상피 층을 제거하는 단계를 포함한다. 일부 실시태양에서, 처리된 콜라겐 매트릭스는 대응하는 미처리된 동종 콜라겐 매트릭스에 비해 50 % 이상 적은 내인성 세포를 갖는다. 일부 실시태양에서, 처리된 콜라겐 매트릭스는 대응하는 미처리된 동종 콜라겐 매트릭스에 비해 50 % 이상 감소된 DNA 함량을 갖는다. 일부 실시태양에서, 처리된 콜라겐 매트릭스는 비-면역원성이다.
일부 실시태양에서, 방법은 탈세포화제를 제거하기 위한 세척 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시태양에서, 세척 단계는 탈세포화 후 및 콜라겐 매트릭스로의 세포 현탁액의 접종 전에 수행된다.
일부 실시태양에서, 콜라겐 매트릭스는 피부, 진피, 힘줄, 인대, 근육, 양막, 반월판, 소장 점막하조직, 또는 방광이다.
일부 실시태양에서, 처리된 콜라겐 매트릭스는 생리활성 사이토카인을 보유한다. 일부 실시태양에서, 생리활성 사이토카인은 IL-4, IL-6, IL-15, IL-16, IL-18, 및 IL-28로 이루어지는 군에서 선택된다. 일부 실시태양에서, 처리된 콜라겐 매트릭스는 생리활성 성장 인자를 보유한다. 일부 실시태양에서, 생리활성 성장 인자는 혈소판-유래 성장 인자 알파(PDGFa)이다.
일부 실시태양에서, 콜라겐 매트릭스는 인간, 돼지, 소, 또는 말이다.
일부 실시태양에서, 세포 현탁액을 형성하도록 소화된 조직은 지방 조직, 근육 조직, 출생 조직, 피부 조직, 뼈 조직, 또는 골수 조직에서 선택된다. 일부 실시태양에서, 세포 현탁액을 형성하도록 소화된 조직은 인간 조직이다.
일부 실시태양에서, 콜라겐 매트릭스 및 세포 현탁액을 형성하도록 소화된 조직은 동일한 종으로부터 온 것이다. 일부 실시태양에서, 콜라겐 매트릭스 및 세포 현탁액을 형성하도록 소화된 조직은 상이한 종으로부터 온 것이다. 일부 실시태양에서, 콜라겐 매트릭스 및 세포 현탁액을 형성하도록 소화된 조직은 동일한 공여자로부터 온 것이다. 일부 실시태양에서, 콜라겐 매트릭스 및 세포 현탁액을 형성하도록 소화된 조직은 상이한 시체 공여자로부터 온 것이다. 일부 실시태양에서, 공여자는 인간이다.
정의
본원에서 사용되는 용어 "연조직"은 몸의 구조체와 장기를 연결, 지지, 또는 둘러싸고, 뼈가 아닌 조직을 나타낸다. 연조직의 예는 힘줄 조직, 인대 조직, 반월판 조직, 근육 조직, 피부 조직, 방광 조직, 및 진피 조직을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 용어 "콜라겐 매트릭스"는 세포 성장 및 증식을 위한 구조적 지지를 제공하는 콜라겐 섬유(예를 들어, 제I형 콜라겐)를 포함하는 생체적합성 골격을 나타낸다. 일부 실시태양에서, 콜라겐 매트릭스는 대상(예를 들어, 인간 또는 인간이 아닌 동물)으로부터 채취된 생물학적 조직이다. 콜라겐 출처의 예는 피부, 진피, 힘줄, 인대, 근육, 양막, 반월판, 소장 점막하조직, 또는 방광을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일부 실시태양에서, 콜라겐 매트릭스는 해부학적 연조직 출처(예를 들어, 피부, 진피, 힘줄, 또는 인대)로부터 오고 뼈 또는 관절 연골로부터 오지 않는다. 일부 실시태양에서, 콜라겐 매트릭스는 제II형 콜라겐보다 제I형 콜라겐을 주로 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "중간엽 줄기세포"는 골아세포, 연골세포, 및 지방세포를 포함한 다양한 세포 유형으로 분화할 수 있는 다분화능 줄기세포(즉, 하위 집합의 세포 유형으로 분화할 수 있는 능력이 있는 세포)를 나타낸다. 중간엽 줄기세포는 골수 조직, 지방 조직, 근육 조직, 출생 조직(예를 들어, 양막, 양수, 또는 탯줄 조직), 피부 조직, 뼈 조직, 및 치아 조직을 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 조직으로부터 얻어질 수 있다.
용어 "면역원성을 감소" 또는 "감소된 면역원성"은 대상에서의 면역원성 거부반응을 자극할 가능성이 감소된 것을 나타낸다. 일부 실시태양에서, 본원에서 기술한 콜라겐 매트릭스는 대응하는 처리되지 않은 동종 콜라겐 매트릭스에 비해 그 면역원성을 감소시키도록 처리된다(즉, 처리된 콜라겐 매트릭스가 이식되거나 국소적으로 적용되는 대상 내에서 면역원성 거부반응을 자극할 가능성을 감소). 콜라겐 매트릭스에 대해 사용하는 용어 "비-면역원성"은 대상 내에서 감지 가능한 면역원성 반응을 발생시키는 콜라겐 매트릭스를 나타낸다.
콜라겐 매트릭스에 대해 사용하는 용어 "탈세포화된" 및 "무세포"는 실질적으로 모든 내인성 세포가 매트릭스로부터 제거된 콜라겐 매트릭스를 나타낸다. 일부 실시태양에서, 탈세포화된 또는 무세포 콜라겐 매트릭스는 내인성 세포가 제거되지 않은(예를 들어, 탈세포화 처리되지 않은) 대응하는 동종 콜라겐 매트릭스에 비해 적어도 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 그 이상의 내인성 세포가 제거된(예를 들어, 탈세포화 처리에 의해) 매트릭스이다. 탈세포화는 미처리된 콜라겐 매트릭스에 비해 처리된 콜라겐 매트릭스의 DNA 함량 퍼센트의 감소를 측정하거나 조직학적 염색에 의한 것을 포함하나 이에 제한되지 않는 해당 기술 분야에서 공지된 임의의 방법에 따라 정량화될 수 있다. 일부 실시태양에서, 탈세포화된 또는 무세포 콜라겐 매트릭스는 미처리된 콜라겐 매트릭스에 비해 적어도 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % 또는 그 이상 감소된 DNA 함량을 갖는다.
용어 "대상"은 인간 또는 예를 들어, 다른 영장류, 설치류, 개, 고양이, 말, 양, 소, 돼지 등을 포함한 다른 인간이 아닌 동물을 나타낸다.
용어 "치료하다", "치료하는", 및 "치료"는 용어가 적용되는 질환 또는 병태, 또는 이러한 질환 또는 병태의 하나 이상의 증상의 시작을 연기하거나, 진행을 지연 또는 역전시키거나, 완화 또는 방지하는 것을 나타낸다.
도 1. 도립 현미경으로 본 최초(A), 헹굼(B), 및 최종(C) 웰의 육안 관찰.
도 2. 그룹 C 위 최초(A) 및 아래 최초(B) 웰은 판에 부착된 일부 생 세포를 나타냈다.
도 3. 전면성장(confluence)에 다다랐을 때 세포만 있는 대조 웰은 연장된, 건강해 보이는 세포를 나타냈다.
도 4. 접종된 샘플으로부터 회수 가능한 세포 집단. (A) 그룹 C 위 접종된 세포, 분리됨. (B) 미접종된 대조물, 피부로부터 분리된 세포 없음.
도 5. 지방 조직으로부터 기질 혈관 분획을 단리하는 방법인 지방 흡입, 육류 분쇄기 + 헹굼, 및 육류 분쇄기 헹굼 없음 사이의 평균 총 세포 및 생 세포 수 및 다양한 CD 마커에 대해 양성인 세포 수의 비교.
I. 서설
소장 점막하조직과 같은 콜라겐 매트릭스-함유 조직 제품은 손상 부위의 회복 또는 재건을 촉진시키기 위해 연조직 손상 부위에 적용될 수 있다. 콜라겐 매트릭스-함유 조직 제품에 줄기세포를 접종하는 것이 비-줄기세포 접종된 콜라겐 매트릭스 조직 제품에 비해 빠른 회복 또는 재건을 촉진하는 것으로 종래에 확인되었다. 이러한 결과는 콜라겐 매트릭스에 줄기세포를 접종하는 것이 연조직 회복 또는 재생의 속도 및/또는 질을 높일 수 있다는 것을 시사한다.
그러나, 앞에서 기술한 줄기세포-접종된 콜라겐 매트릭스는 콜라겐 매트릭스로의 줄기세포 접종 전에 체 외(예를 들어, 플라스틱 접시 위에서) 성장되거나 증식된 줄기세포를 사용했다. 조직 배양 플라스틱에의 부착 및 증식 시 세포 집단이 변화하기 때문에, 콜라겐 매트릭스로의 줄기세포 접종 전에 줄기세포를 체 외 배양하는 것은 접종된 줄기세포에 원치않는 표현형 변화를 가져올 수 있다.
따라서, 일부 실시태양에서 본 발명은 콜라겐 매트릭스 및 콜라겐 매트릭스에 부착된 중간엽 줄기세포를 포함하고, 중간엽 줄기세포가 콜라겐 매트릭스에 접종된 중간엽 줄기세포 및 비-중간엽 줄기세포를 포함하는 세포 현탁액을 형성하도록 처리된(즉, 소화된) 조직으로부터 유래하고, 중간엽 줄기세포가 콜라겐 매트릭스로의 세포 현탁액의 접종 전에 체 외(예를 들어, 플라스틱 접시 위에서) 배양되지 않는, 연조직 손상 치료용 조성물을 제공한다. 본 발명은 콜라겐 매트릭스 및 콜라겐 매트릭스에 부착된 중간엽 줄기세포를 포함하는 상기 조성물의 제조 방법 및 콜라겐 매트릭스 및 콜라겐 매트릭스에 부착된 중간엽 줄기세포를 포함하는 상기 조성물을 사용한 연조직 손상이 있는 대상의 치료 방법을 또한 제공한다.
본 발명은 또한 중간엽 줄기세포를 포함하는 세포 현탁액의 단리를 위한 조직 준비 방법에 관한 것이다. 시체 인간 조직은 조직 제품 가공 처리 및 의료 장비 생산에 사용되기 위해 동의한 공여자로부터 정식으로 회수된다. 일부 경우에서, 시체 조직은 치료제 및 방법에 포함될 수 있는 선조세포 또는 줄기세포와 같은 특정 세포 집단을 포함할 수 있다. 이러한 조직으로부터 선조세포 또는 줄기세포를 얻는 방법은 기술되어 있다. 예를 들어, 본원에 참조문헌으로 포함된 시(Shi)의 PCT 공개 WO 2010/059565는, 시체 조직으로부터 지방 유래 줄기세포를 단리하는 기술을 개시한다.
일부 실시태양에서, 본 발명은 선조세포 및 줄기세포 집단을 단리하기 전에 다양한 연조직 및 섬유 조직을 사전-처리하는 시스템 및 방법을 포함한다. 예를 들어, 이러한 준비 기술은 선조세포 또는 줄기세포의 단리 전에, 또는 이러한 세포를 포함하는 분획의 단리 전에 시체 조직에서 수행될 수 있다. 일부 경우에서, 준비 기술은 기질 혈관 분획(SVF), 선조세포 집단, 줄기세포 집단 등의 단리 전에 지방 조직에서 수행될 수 있다. 이러한 단리된 세포 집단 또는 분획은 치료적 처치 및 제품에 사용될 수 있다.
II. 연조직 손상 치료용 조성물
한 측면에서, 본 발명은 콜라겐 매트릭스 및 콜라겐 매트릭스에 부착된 중간엽 줄기세포를 포함하는 연조직 손상 치료용 조성물을 제공한다. 일부 실시태양에서, 중간엽 줄기세포는 콜라겐 매트릭스에 접종된 중간엽 줄기 세포 및 비-중간엽 줄기 세포를 포함하는 세포 현탁액을 형성하도록 처리(즉, 소화)되고 중간엽 줄기세포를 콜라겐 매트릭스에 부착시키기 적합한 조건하에서 인큐베이션된 조직으로부터 유래한다.
일부 실시태양에서, 중간엽 줄기세포는 세포 현탁액의 형성 후 및 콜라겐 매트릭스로의 세포 현탁액의 접종 전에 체 외 배양되지 않는다. 일부 실시태양에서, 콜라겐 매트릭스는 콜라겐 매트릭스의 안쪽 면 또는 표면에 비해 콜라겐 매트릭스의 바깥(표피)쪽 면 또는 표면에 부착된 더 많은 세포를 포함한다.
콜라겐 매트릭스
본 발명에서의 사용을 위한 콜라겐 매트릭스는 임의의 콜라겐성 조직으로부터 올 수 있다. 일부 실시태양에서, 콜라겐 매트릭스는 피부, 진피, 힘줄, 인대, 근육, 양막, 반월판, 소장 점막하조직, 또는 방광이다. 일부 실시태양에서, 콜라겐 매트릭스는 관절 연골 또는 뼈가 아니다. 일부 실시태양에서, 콜라겐 매트릭스는 제II형 콜라겐보다 제I형 콜라겐을 주로 포함한다.
일부 실시태양에서, 콜라겐 매트릭스는 대상, 예를 들어, 인간, 소, 양, 돼지, 또는 말 대상으로부터 채취된다. 일부 실시태양에서, 콜라겐 매트릭스는 조작된 콜라겐 매트릭스, 예를 들어, 하나 이상의 정제된 유형의 콜라겐으로부터 조작되고, 콜라겐 매트릭스에서 흔히 발견되는 다른 성분, 예를 들어, 글리코사미노글리칸을 임의적으로 추가로 포함하는 매트릭스이다. 조작된 콜라겐 매트릭스는 해당 기술분야에서 공지되어 있고 쉽게 상업적으로 입수 가능하다.
일부 실시태양에서, 세포 현탁액이 접종된 콜라겐 매트릭스는 유동성 연조직 매트릭스이다. 예를 들어, 콜라겐 매트릭스는 연조직 물질 부분을 얻고, 연조직 물질 부분을 저온분획화하여 저온분획화된 조직을 해동할 때 유동성 연조직 매트릭스 조성물을 제공하도록 함으로써 제조할 수 있다. 이러한 유동성 매트릭스 물질을 포함하는 예시적인 조성물 및 방법은 미국 특허 출원 13/712,295호에 기술되어 있고, 그 내용은 본원에 참조문헌으로 포함된다.
일부 실시태양에서, 콜라겐 매트릭스는 콜라겐 매트릭스가 이식되거나 적용되는 대상에 동종일 수 있다. 비-제한적 예로, 일부 실시태양에서, 콜라겐 매트릭스가 인간이고 대상이 인간이거나, 콜라겐 매트릭스가 말이고 대상이 말이다. 일부 실시태양에서, 콜라겐 매트릭스는 콜라겐 매트릭스가 이식되거나 적용되는 대상에 이종일 수 있다. 비-제한적 예로, 일부 실시태양에서, 콜라겐 매트릭스는 돼지 또는 소이고 대상은 인간이다. 일부 실시태양에서, 콜라겐 매트릭스는 시체 공여자로부터 온 것이다.
일부 실시태양에서, 콜라겐 매트릭스는 낮은 면역원성을 갖거나 비-면역원성이다. 일부 실시태양에서, 콜라겐 매트릭스는 대응하는 처리되지 않은 동종 콜라겐 매트릭스에 비해 매트릭스의 면역원성을 감소시키도록 처리된다. 통상적으로, 면역원성을 감소시키기 위해 콜라겐 매트릭스는 세포막, 핵산, 지질, 및 세포질 성분을 제거하고, 콜라겐, 및 엘라스틴, 글리코사미노글리칸, 및 프로테오글리칸과 같이 매트릭스와 통상적으로 관련되는 다른 성분을 포함하는 매트릭스가 온전히 남도록 처리된다. 일부 실시태양에서, 처리된 콜라겐 매트릭스의 면역원성은 미처리된 대응하는 동종 콜라겐 매트릭스(예를 들어, 처리된 진피 대 미처리된 진피)에 비해 50 % 이상, 60 % 이상, 70 % 이상, 80 % 이상, 90 % 이상, 또는 그 이상 감소된다. 콜라겐 매트릭스의 탈세포화(예를 들어, 계면활성제 및 단백질분해효소 또는 핵산분해효소로의 처리에 의해) 또는 콜라겐 매트릭스의 세포 붕괴(예를 들어, 저온보관, 냉동/해동 반복, 또는 방사선 처리에 의해)를 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 수많은 처리가 콜라겐 매트릭스의 면역원성을 감소시키기 위해 사용될 수 있다. 콜라겐 매트릭스의 탈세포화 또는 세포 붕괴 방법은, 예를 들어, 미국 특허 7,914,779호; 미국 특허 7,595,377호; 미국 특허 7,338,757호; 및 미국 공개 2005/0186286호에 기술되어 있고, 그 각각의 내용은 전체로서 본원에 참조문헌으로 포함된다.
면역원성의 감소는, 대응하는 미처리된 동종 콜라겐 매트릭스에 비해 처리된 콜라겐 매트릭스 내의 내인성 세포의 수의 감소를 측정하거나 처리된 콜라겐 매트릭스 내의 DNA 함량의 감소를 측정함으로써 해당 기술 분야에서 공지된 방법에 따라 정량화될 수 있다. 한 비-제한적 방법에서, 면역원성의 감소는 처리-후 콜라겐 매트릭스의 DNA 함량을 측정함으로써 정량화된다. 간단히 말해서, 처리된 콜라겐 매트릭스는 형광 핵산 염색(예를 들어, 피코그린(PicoGreen)®(인비트로겐(Invitrogen)) 또는 훽스트(Hoechst) 33258 염료)으로 염색되고, 이어서 형광의 양이 형광계로 측정되고 또한 형광 핵산 염색된 대응하는 미처리된 동종 콜라겐 매트릭스에서 관찰되는 형광의 양과 비교된다. 다른 비-제한적 방법에서, 면역원성의 감소는 헤마톡실린 및 에오신 및 임의적으로 DAPI를 사용하여 처리-후 콜라겐 매트릭스를 조직학적 염색하고 처리된 콜라겐 매트릭스에서 관찰되는 세포의 수를 조직학적 염색되지 않은 대응하는 미처리된 동종 콜라겐 매트릭스에서 관찰되는 세포의 수와 비교함으로써 정량화된다.
일부 실시태양에서, 처리된 콜라겐 매트릭스는 대응하는 미처리된 동종 콜라겐 매트릭스에 비해 50 % 이상, 60 % 이상, 70 % 이상, 80 % 이상, 또는 90 % 이상 적은 내인성 세포를 갖는다. 일부 실시태양에서, 처리된 콜라겐 매트릭스는 대응하는 미처리된 동종 콜라겐 매트릭스에 비해 50 % 이상, 60 % 이상, 70 % 이상, 80 % 이상, 또는 90 % 이상 감소된 DNA 함량을 갖는다.
일부 실시태양에서, 콜라겐 매트릭스는 콜라겐 매트릭스에 내인성인 생리활성 사이토카인 및/또는 생리활성 성장 인자를 보유한다. 이들 생리활성 사이토카인 및/또는 성장 인자는, 예를 들어 연조직 손상 부위에 세포를 보충하거나, 세포외 매트릭스 생성을 촉진하거나, 또는 회복 과정을 조절함으로써 연조직 회복 또는 재생을 개선하거나 가속화할 수 있다. 일부 실시태양에서, 콜라겐 매트릭스는 인터류킨(예를 들어, IL-1, IL-4, IL-6, IL-8, IL-15, IL-16, IL-18, 및 IL-28), 종양 괴사 인자 알파(TNFα), 및 단핵세포 화학주성인자 단백질-1(MCP-1)에서 선택되는 하나 이상의 생리활성 사이토카인을 보유한다. 일부 실시태양에서, 콜라겐 매트릭스는 피부이고 하나 이상의 생리활성 사이토카인은 IL-4, IL-6, IL-15, IL-16, IL-18, 및 IL-28에서 선택된다. 일부 실시태양에서, 콜라겐 매트릭스는 피부이고 하나 이상의 생리활성 사이토카인은 IL-15 및 IL-16에서 선택된다. 일부 실시태양에서, 콜라겐 매트릭스는 혈소판-유래 성장 인자 알파(PDGFa), 매트릭스 메탈로프로테이나제(MMP), 형질전환 성장 인자 베타(TGFβ), 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 및 표피 성장 인자(EGF)에서 선택되는 하나 이상의 생리활성 성장 인자를 보유한다. 일부 실시태양에서, 콜라겐 매트릭스는 피부이고 하나 이상의 생리활성 성장 인자는 PDGFa이다.
콜라겐 매트릭스에 의한 사이토카인 및/또는 성장 인자의 보유, 및 콜라겐 매트릭스에 의해 보유되는 사이토카인 및/또는 성장 인자의 마커 프로파일은, 해당 기술 분야에서 공지된 방법에 따라, 예를 들어 면역분석법에 의해 확인될 수 있다. 다양한 면역분석법 기술이 사이토카인 및/또는 성장 인자의 존재 또는 양을 알아내기 위해 사용될 수 있다. 용어 면역분석법은 제한 없이, 효소 증폭 면역분석법 기술(EMIT), 효소-결합 면역흡착 분석법(ELISA), 항원 포촉 ELISA, 샌드위치 ELISA, IgM 항체 포촉 ELISA(MAC ELISA), 및 미세입자 효소 면역분석법(MEIA)과 같은 효소 면역분석법(EIA); 모세관 전기영동 면역분석법(CEIA); 방사면역측정법(RIA); 면역방사계 측정법(IRMA); 형광 편광 면역분석법(FPIA); 및 화학발광 분석법(CL)을 포함한 기술을 포함한다. 원하는 경우, 이러한 면역분석법은 자동화될 수 있다. 면역분석법은 또한 레이저 유도 형광과 함께 사용될 수 있다(예를 들어, 문헌 [Schmalzing and Nashabeh, Electrophoresis, 18:2184-2193 (1997); Bao, J. Chromatogr. B. Biomed. Sci., 699:463-480 (1997)] 참조). 유동-주입 리포솜 면역분석법 및 리포솜 면역센서와 같은 리포솜 면역분석법 또한 본 발명에서의 사용에 적합하다(예를 들어, 문헌 [Rongen et al., J. Immunol. Methods, 204:105-133 (1997)] 참조). 또한, 단백질/항체 복합체가 형성되면 마커 농도의 함수로 피크 속도 신호로 변환되는 산란 광을 증가시키는 비탁분석법이 본 발명에서의 사용에 적합하다. 비탁분석법 측정기는 베크만 쿨터(Beckman Coulter)(캘리포니아주 브레아; 키트 #449430)로부터 상업적으로 입수가능하고 베링 네플로미터 분석기(Behring Nephelometer Analyzer)를 사용하여 수행할 수 있다(문헌 [Fink et al., J. Clin. Chem. Clin. Biol. Chem., 27:261-276 (1989)]).
항원 포촉 ELISA는 사이토카인 및/또는 성장 인자의 존재 또는 양을 측정하는 데에 유용할 수 있다. 예를 들어, 항원 포촉 ELISA에서, 관심 있는 분석물에 대한 항체는 고체 상에 결합되고 분석물이 항체에 결합되도록 샘플이 첨가된다. 비결합 단백질이 세척에 의해 제거된 후, 결합된 분석물의 양은, 예를 들어, 방사면역측정법을 사용하여 정량화될 수 있다(예를 들어, 문헌 [Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1988)] 참고). 샌드위치 ELISA가 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, 2-항체 샌드위치 분석기에서, 제1 항체는 고체 지지체에 결합되고, 관심 있는 분석물은 제1 항체에 결합된다. 분석물의 양은 분석물에 결합하는 제2 항체의 양을 측정함으로써 정량화된다. 항체는, 자기 또는 크로마토그래피 매트릭스 입자, 분석기 판의 표면(예를 들어, 미량정량판 웰), 고체 기판 물질 또는 막 조각(예를 들어, 플라스틱, 나이론, 종이), 등과 같은 다양한 고체 지지체에 고정화될 수 있다. 분석 스트립은 고체 지지체 상에 분석기 내의 항체 또는 복수의 항체들을 어레이로 코팅함으로써 제조할 수 있다. 이 스트립은 이어서 시험 샘플에 담가 지고 착색된 점과 같은 측정가능한 신호를 생성하도록 세척 및 감지를 통해 빠르게 처리될 수 있다.
중간엽 줄기세포
콜라겐 매트릭스에 부착되는 중간엽 줄기세포("MSC")는 지방 조직, 근육 조직, 출생 조직(예를 들어, 양막 또는 양수), 피부 조직, 뼈 조직, 또는 골수 조직을 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 수많은 상이한 조직으로부터 유래할 수 있다. 조직은 인간 대상 또는 비-인간 대상(예를 들어, 소, 돼지, 또는 말 대상)으로부터 채취될 수 있다. 일부 실시태양에서, 조직은 인간 시체 공여자로부터 채취된다. 일부 실시태양에서, 조직은 연조직 손상이 치료되는 대상으로부터 채취된다. 일부 실시태양에서, 조직은 콜라겐 매트릭스에 동종일 수 있다. 비-제한적 예로, 일부 실시태양에서, 조직이 인간이고 콜라겐 매트릭스가 인간이거나, 조직이 말이고 콜라겐 매트릭스가 말이다. 일부 실시태양에서, 조직은 콜라겐 매트릭스에 이종일 수 있다. 비-제한적 예로, 일부 실시태양에서, 조직은 인간이고 콜라겐 매트릭스는 돼지 또는 소이다. 일부 실시태양에서, 조직 및 콜라겐 매트릭스는 동일한 공여자로부터 채취된다(예를 들어, 동일한 인간 공여자, 예를 들어, 동일한 시체 공여자). 일부 실시태양에서, 조직 및 콜라겐 매트릭스는 동종이지만 상이한 공여자로부터 채취된다(예를 들어, 상이한 인간 공여자, 예를 들어, 상이한 시체 공여자).
일부 실시태양에서, 콜라겐 매트릭스에 접종되거나 부착되는 중간엽 줄기세포는 하나 이상의 마커의 존재 또는 부재에 기초하여 확인 또는 특성화될 수 있다. 일부 실시태양에서, 중간엽 줄기세포는 특정 마커 프로파일을 가진 것으로 확인된다.
일부 실시태양에서, 중간엽 줄기세포는 하나, 둘, 셋, 넷, 또는 그 이상의 세포 분화("CD") 마커의 존재 또는 부재에 기초하여 특성화된다. 일부 실시태양에서, CD 마커는 CD34, CD45, CD73, CD90, CD105, CD116, CD144, 및 CD166에서 선택된다. 중간엽 줄기세포 마커는, 예를 들어, 문헌 [Lin et al., Histol. Histopathol. 28:1109-1116 (2013)], 및 문헌 [Halfon et al., Stem Cells Dev. 20:53-66 (2011)]에 기술되어 있다.
본원에서 사용되는 "양성" 중간엽 줄기세포 마커는 중간엽 줄기세포에 특이한 세포 표면의 마커(예를 들어, 표면 항원, 단백질, 또는 수용체)이다. 일부 실시태양에서, 양성 중간엽 줄기세포 마커는 CD105, CD144, CD44, CD166, 또는 CD90이다. 일부 실시태양에서, 콜라겐 매트릭스에 접종된 MSC 세포의 5 % 이상, 10 % 이상, 15 % 이상, 20 % 이상, 25 % 이상, 30 % 이상, 35 % 이상, 40 % 이상, 45 % 이상, 50 % 이상, 55 % 이상, 60 % 이상, 65 % 이상, 70 % 이상, 75 % 이상, 또는 그 이상이 CD 마커 CD105, CD144, CD44, CD166, 또는 CD90 중의 하나 이상에 대해 양성이다.
본원에서 사용되는 "음성" 중간엽 줄기세포 마커는 중간엽 줄기세포에 의해 뚜렷하게 발현되지 않는 세포 표면의 마커(예를 들어, 표면 항원, 단백질, 또는 수용체)이다. 일부 실시태양에서, 음성 중간엽 줄기세포 마커는 CD34 또는 CD116이다. 일부 실시태양에서, 콜라겐 매트릭스에 접종된 MSC 세포의 25 % 이상, 30 % 이상, 35 % 이상, 40 % 이상, 45 % 이상, 50 % 이상, 55 % 이상, 60 % 이상, 65 % 이상, 70 % 이상, 75 % 이상, 또는 그 이상이 CD 마커 CD34 및 CD116 중 하나 이상에 대해 음성이다. 일부 실시태양에서, 중간엽 줄기세포는 양성 MSC 마커 CD105, CD144, CD44, CD166, 또는 CD90 중 하나 이상을 발현하는 것으로 확인되고 음성 MSC 마커 CD34 및 CD116 중 하나 이상을 발현하지 않는 것으로 추가로 확인된다.
중간엽 줄기세포 상의 관심 있는 마커의 존재 및/또는 양은 해당 기술 분야에서 공지된 임의의 핵산 또는 단백질 발현 방법에 따라 확인할 수 있다. 핵산은 노던 분석, 역전사효소 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR), 마이크로어레이, 서열 분석, 또는 마커 코딩 서열 부분에 상보적인 핵산 서열의 혼성에 기초한 임의의 다른 방법(예를 들어, 슬롯 블롯 혼성)과 같은 일반적인 기술을 사용하여 감지할 수 있다. 단백질은 통상적인 항체-기반 기술, 예를 들어, ELISA, 웨스턴 블로팅, 유동 세포분석법, 면역형광법, 및 면역조직화학과 같은 면역분석법을 사용하여 검출될 수 있다. 일부 실시태양에서, 관심 있는 마커의 존재 및/또는 양은 위에서 기술한 면역분석법(예를 들어, ELISA)에 의해 확인된다.
III. 연조직 손상 치료용 조성물의 제조 방법
다른 측면에서, 본 발명은 연조직 손상 치료용 조성물의 제조 방법을 제공한다. 일부 실시태양에서, 방법은 다음을 포함한다:
(a) 중간엽 줄기세포 및 비-중간엽 줄기세포를 포함하는 세포 현탁액을 형성하도록 조직을 소화시키는 단계;
(b) 콜라겐 매트릭스로 세포 현탁액을 접종하는 단계;
(c) 중간엽 줄기세포를 콜라겐 매트릭스에 부착시키기 적합한 조건하에서 세포 현탁액이 접종된 콜라겐 매트릭스를 인큐베이션하는 단계; 및
(d) 비-부착 세포를 콜라겐 매트릭스에서 제거하는 단계.
일부 실시태양에서, (b) 단계 전에, 방법은 콜라겐 매트릭스의 면역원성을 감소시키도록 콜라겐 매트릭스를 처리하는 단계를 추가로 포함한다.
세포 현탁액의 준비
콜라겐 매트릭스로의 접종을 위한 중간엽 줄기세포 및 비-중간엽 줄기세포를 포함하는 세포 현탁액은 다양한 유형의 조직으로부터 유래할 수 있다. 일부 실시태양에서, 세포 현탁액을 형성하도록 소화되는 조직은 지방 조직, 근육 조직, 출생 조직(예를 들어, 양막 또는 양수), 피부 조직, 뼈 조직, 또는 골수 조직에서 선택된다. 일부 실시태양에서, 조직은 인간 대상 또는 비-인간 대상(예를 들어, 소, 돼지, 또는 말 대상)으로부터 채취된다. 일부 실시태양에서, 조직은 인간 시체 공여자로부터 채취된다. 일부 실시태양에서, 조직은 연조직 손상이 치료되는 대상으로부터 채취된다.
조직으로부터 세포 현탁액을 형성하고 골격으로 세포 현탁액을 접종하는 방법은 지방 조직에 대해 이전에 기술되었다. US 2010/0124776 및 US 출원 12/965,335호를 참조하기 바라며, 그 각각의 내용은 전체로서 본원에 참조문헌으로 포함된다. 조직은 중간엽 줄기세포 및 원치않는 세포를 포함하는 세포 현탁액을 형성하도록 효소에 의해 소화된다. 일부 실시태양에서, 조직은 콜라게나아제 용액(예를 들어, 콜라게나아제 I)로 소화된다. 임의적으로, 조직은 조직이 육안 관찰에 의해 매끄럽게 보일 때까지 적절한 시간 동안(예를 들어, 30 분, 45 분, 60 분, 또는 그 이상) 연속적인 교반 하에서(예를 들어, 약 75 rpm에서) 콜라게나아제 용액으로 소화된다.
임의적으로, 조직은 소화 전 또는 도중에 세척될 수 있다. 일부 실시태양에서, 조직은 적어도 조직과 실질적으로 동일한 용액(예를 들어, 인산-완충 식염수(PBS) 또는 성장 배지)으로 세척된다. 일부 실시태양에서, 조직은 항생제(예를 들어, 1 % 페니실린 및 스트렙토마이신) 및/또는 항진균제를 포함하는 용액으로 세척된다. 일부 실시태양에서, 조직은 임의적으로 조직을 교반하기 위해 진탕하면서 약 37 ℃에서 세척된다. 세척은 맑은 하층 용액이 얻어질 때까지 조직을 세척하고, 이어서 상청액 조직을 흡입해내고, 이어서 신선한 용액으로 세척하는 반복되는 단계를 포함할 수 있다.
조직의 소화에 이어 소화된 조직의 원심분리를 하면 흡입하여 상청액을 제거하면 중간엽 줄기세포 및 원치않는 세포를 포함하는 세포 펠릿이 남을 수 있는 세포 현탁액이 형성된다. 세포 펠릿을 용액(예를 들어, 항생제를 포함하는 성장 배지)에 재현탁하고 이어서 생성된 세포 현탁액을 접종 단계 전에 중간엽 줄기세포-함유 세포 현탁액을 추가적으로 배양하거나 증식시키는 임의의 중간 단계 없이 콜라겐 매트릭스에 접종한다.
일부 실시태양에서, 콜라겐 매트릭스에 세포 현탁액을 접종하기 전에 콜라겐-코팅된 기재에 연속 평판배양함으로써 세포 현탁액은 줄기세포가 강화될 수 있다. 한 비-제한적 예로, 근육 조직은 콜라겐 매트릭스에 접종하기 위한 강화된 세포 현탁액을 형성하기 위해 다음의 방법에 따라 준비될 수 있다. 채취된 근육 샘플을 다지고, 0.2 % 콜라게나아제로 37 ℃에서 소화시키고, 트립신 처리하고, 70 μm 필터를 통해 거르고, 15% 소 태아 혈청을 포함하는 F12 배지(깁코(Gibco), 영국 페이즐리)에서 37 ℃에서 콜라겐-코팅된 세포 배양 접시(35-mm 지름, 코닝(Corning), 뉴욕주 코닝)에서 배양한다. 적절한 시간(예를 들어, 한 시간) 후, 세포 배양 접시로부터 상청액을 제거하여 신선한 콜라겐-코팅된 세포 배양 접시에 재평판배양한다. 이 기간 내에 빠르게 부착하는 세포는 대부분 원치않는 세포(예를 들어, 섬유아세포)일 것이다. 30 %-40 %의 세포가 각 콜라겐-코팅된 세포 배양 접시에 부착되면, 상청액의 연속 재평판배양을 반복한다. 3-4 연속 재평판배양 후, 배양 배지는 작고 둥근 세포로 강화되고, 따라서 줄기세포-풍부 세포 현탁액을 형성한다.
콜라겐 매트릭스 접종
콜라겐 매트릭스로의 세포 현탁액의 접종을 위해, 콜라겐 매트릭스는 배양 접시, 예를 들어, 24-웰 배양 판에 놓이고 이어서 세포 현탁액이 콜라겐 매트릭스에 첨가될 수 있다. 세포 현탁액이 접종되는 콜라겐 매트릭스는 위에서 기술한 임의의 콜라겐 매트릭스일 수 있다. 일부 실시태양에서, 콜라겐 매트릭스는 피부, 진피, 힘줄, 인대, 근육, 양막, 반월판, 소장 점막하조직, 또는 방광이다. 일부 실시태양에서, 콜라겐 매트릭스는 관절 연골이 아니다. 콜라겐 매트릭스가 복수의 층을 포함하는 일부 실시태양에서, 하나 이상의 매트릭스 층에 세포 현탁액이 접종될 수 있다. 비-제한적 예로, 일부 실시태양에서 진피 매트릭스는 표피 대향 기저막 및 더 깊은 피하조직 표면의 두 층을 포함한다. 세포 현탁액은 표피 대향 기저막, 더 깊은 피하조직 표면, 또는 표피 대향 기저막 및 더 깊은 피하조직 표면 모두에 접종될 수 있다.
일부 실시태양에서, 콜라겐 매트릭스로의 세포 현탁액 접종 전에 콜라겐 매트릭스는 면역원성을 감소시키도록 처리된다. 일부 실시태양에서, 처리 후의 콜라겐 매트릭스의 면역원성은 미처리된 대응하는 동종 콜라겐 매트릭스에 비해 50 % 이상, 60 % 이상, 70 % 이상, 80 % 이상, 90 % 이상, 또는 그 이상 감소된다. 일부 실시태양에서, 처리된 콜라겐 매트릭스는 비-면역원성이다. 위에서 기술한 대로, 콜라겐 매트릭스의 탈세포화(예를 들어, 계면활성제 및 단백질분해효소 또는 핵산분해효소로의 처리에 의해) 또는 콜라겐 매트릭스의 세포 붕괴(예를 들어, 저온보관, 냉동/해동 반복, 또는 방사선 처리에 의해)를 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 수많은 처리가 콜라겐 매트릭스의 면역원성을 감소시키기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시태양에서, 콜라겐 매트릭스는 탈세포화제(예를 들어, 계면활성제 및 단백질분해효소 또는 계면활성제 및 핵산분해효소를 포함하는 용액)로 처리된다. 다른 적합한 탈세포화 방법은 문헌 [Crapo et al., Biomaterials 32:3233-43 (2011)]에 기술되어 있고, 그 내용은 본원에 참조문헌으로 포함된다.
콜라겐 매트릭스로의 세포 현탁액의 접종 후, 세포 현탁액-접종된 콜라겐 매트릭스는 중간엽 줄기세포를 매트릭스에 부착하기에 적합한 조건하에서 인큐베이션된다. 일부 실시태양에서, 세포 현탁액-접종된 콜라겐 매트릭스는 부착되도록 수 일 간(예를 들어, 약 24 시간, 약 36 시간, 약 48 시간, 약 60 시간, 또는 약 72 시간 이하) 인큐베이션된다. 일부 실시태양에서, 세포 현탁액-접종된 콜라겐 매트릭스는 약 37 ℃에서 CO2 인큐베이터에서 인큐베이션된다. 세포 현탁액-접종된 콜라겐 매트릭스는, 임의적으로 보충물 및/또는 항생제 및/또는 항진균제(예를 들어, 10 % 태아 소 혈청(FBS) 및 1 % 페니실린, 스트렙토마이신, 및 암포테리신 B(PSA)을 포함하는 DMEM/F12)을 포함하는 배양 배지(예를 들어, DMEM/F12)로 인큐베이션될 수 있다. 일부 실시태양에서, 콜라겐 매트릭스의 안쪽(피하조직) 측 또는 표면에 비해 콜라겐 매트릭스의 바깥쪽(표피) 측 또는 표면에 더 많은 수의 중간엽 줄기세포가 부착된다.
인큐베이션 단계 후, 비-부착 세포를 콜라겐 매트릭스에서 제거하도록 세포 현탁액-접종된 콜라겐 매트릭스는 세척된다(예를 들어, PBS 또는 배양 배지로). 일부 실시태양에서, 부착된 중간엽 줄기세포를 포함하는 콜라겐 매트릭스 저온보관 배지(예를 들어, 10 % DMSO, 90 % 혈청)에 넣고 -80 ℃에서 냉동상태로 보관한다.
세포 현탁액 단리를 위한 조직 준비
일부 실시태양에서, 본 발명은 효소 또는 다른 소화 기술 전에, 세포 현탁액(예를 들어, 지방 조직의 기질 혈관 분획(SVF)) 단리를 위해 조직을 효율적으로 준비하기 위해, 정해진 입자 크기로 기계적 분쇄에 의해 재현 가능하고 일관된 방식으로 선조세포 및 줄기세포 집단을 포함하는 대량 또는 대용량의 지방, 근육, 및 다른 연조직 및 섬유 조직을 조작하는 기술을 제공한다.
예시적인 방법은 대규모 사용에 적용될 수 있는 재현 가능하고 일관된 분쇄 방법을 사용하여 세포 현탁액을 단리하기 위해 선조세포 또는 줄기세포 집단, 또는 둘 다를 포함하는 대형 및 대량의 지방, 근육, 또는 다른 조직을 준비하는 것을 포함할 수 있다. 이 방식으로, 대형 및 대량의 조직은 이어지는 효소 또는 다른 소화 기술을 사용한 세포 현탁액의 단리를 위해 적합한 형태로 효율적으로 분해될 수 있다. 기계적 분쇄의 사용은 공학적 제어를 통해 일관성 및 재현성을 개선할 수 있다.
일부 경우에서, 실시태양은 대규모 효율 측면에서 세포 현탁액의 최적의 단리를 위한 시체 조직의 준비에 관한 것이다. 지방 또는 다른 조직 유형은 공여자 시체로부터 회수되고 처리 장치로 이동된다. 조직은 피 및 다른 잔해를 제거하기 위해 임의적으로 항생제 및/또는 항진균 용액을 포함하는 둘베코의 인산-완충 식염수(DPBS) 또는 다른 등장 시약으로 반복하여 세척된다. 이어서 조직은 그 최초의 큰 크기에서 작고, 일정한 입자로 분쇄된다. 감소된 입자 크기 및 증가된 표면적은 효소 또는 다른 기술에 의한 보다 효율적인 소화, 및 선조세포 및 줄기세포-함유 세포 현탁액의 개선된 수율을 가능하게 한다. 이어서 작은 입자는 DPBS와 같은 등장액으로 다시 세척될 수 있다.
일부 실시태양에서, 분쇄 전, 분쇄 후, 또는 둘 다 조직을 헹구는 것이 유용할 수 있다. 원하는 결과를 얻기 위해서 특정 헹굼 프로토콜이 선택될 수 있고, 임의의 조합으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 최종 세포 집단은 헹굼 횟수 및 조직이 분쇄되고 헹구어지는 순서에 영향받을 수 있다. 따라서, 본 발명의 실시태양은 분쇄 전에 헹굼, 분쇄 후에 헹굼, 및 분쇄 전 및 후에 헹굼을 수반하는 기술을 포함하고, 선택되는 기술은 원하는 세포 집단에 따라 달라질 수 있다.
본원에서 개시한 분쇄 프로토콜은 특정한 현재 공지된 기술과 비교할 때 개선된 결과를 제공할 수 있다. 예를 들어, 일부 공지된 기술은 최초에 채취된 형태의 지방 조직과 같은 대형 조직을 효소에 의해 소화시키는 것을 포함한다. 관련하여, 일부 공지된 기술은 예를 들어 회수된 지방 흡입물, 전체 조각, 또는 손으로 다진 입자를 사용한 단지 매우 소량(예를 들어 ~50 cc)의 세포 현탁액의 단리에 제한된다.
반면, 본 발명의 실시태양은 적시 및 일관된 방식으로 처리될 수 있는 대량의 조직을 사용한 대규모 생산 기술을 가능하게 한다. 이를 위해서, 대규모 생산을 위한 세포 현탁액 단리를 효율적으로 촉진하기 위해 채취된 조직을 더 작은 입자로 감소시키기 위해 기계적 분쇄기를 사용할 수 있다. 일부 측면에서, 이러한 입자 크기의 감소는 증가된 표면적을 제공하고 빠르고, 보다 효율적인 소화 및 세포 현탁액 단리를 가능하게 한다. 일부 실시태양에 따르면, 기계적 분쇄기가 채취된 조직을 균일한 크기 및 모양을 가진 입자로 처리하는데에 사용될 수 있다. 일부 실시태양에서, 작업자 파트에서의 임의의 주관성에 관계없이 균일한 크기 또는 모양 특성을 가진 조직 조각이 얻어질 수 있도록 공정은 자동화될 수 있다.
일부 실시태양에서, 일반적인 분쇄기가 대규모, 통제된 동작을 위해 입자 크기를 일관적으로 감소시키는 데에 사용된다. 예시적인 분쇄 장치의 부품은 사용의 편의성을 가능하게 하고 대규모 생산량을 견딜 수 있는 스테인리스 강과 같은 내구성 있고, 오토클레이빙 가능하고 불활성인 물질로 만들어 질 수 있다. 일부 경우에서, 분쇄 시스템은 수동으로 작동될 수 있다. 일부 경우에서, 분쇄 시스템은 전기로 작동될 수 있다. 분쇄 시스템으로 처리되는 조직 유형은 지방, 근육, 피부, 출생 조직 등과 같은 선조세포 및 줄기세포 집단을 포함하는 임의의 연조직을 포함할 수 있다. 다양한 분쇄기 속도 및 부속품이 각 특정한 조직 유형 또는 응용을 위해 바람직한 입자 크기로 조직을 분해하기 위해 사용될 수 있다.
본원에 개시한 조직 사전-처리 시스템 및 방법은 대량의 줄기세포 및 선조세포를 포함하는 조직 및 의료 장비의 대규모 생산에서의 사용에 적합하다. 이들 기술에 따라, 공여 세포 수율이 극대화될 수 있다. 일부 경우에서, 분쇄 접근법은 연/섬유 조직이 대량으로 공여자 시체로부터 회수되고 처리 장치에서 분쇄되어 줄기세포 또는 선조세포 집단을 포함하는 대량의 세포 현탁액을 만드는, 공정의 전단에서 사용될 수 있다. 일부 경우에서, 조직 채취 기술은 대형 및 대량으로 회수된 조직을 제공할 수 있다. 관련하여, 본원에 개시한 지방 처리 기술은 대규모 지방 회수의 주된 방법으로 사용될 수 있고, 임의적으로 지방 흡입이 추가될 수 있다.
IV. 치료 방법
또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에서 기술한 조성물(예를 들어, 콜라겐 매트릭스 및 콜라겐 매트릭스에 부착된 중간엽 줄기세포를 포함하는 조성물)을 사용한 대상에서의 연조직 손상 치료 방법을 제공한다. 일부 실시태양에서, 방법은 연조직 손상 부위에 본원에서 기술한 조성물을 접촉시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 조성물은 회복 또는 재생을 요하는 임의의 연조직 손상이 있는 대상을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 연조직 손상은, 예를 들어, 질환, 외상, 또는 정상적인 조직 성장 실패에서 기인할 수 있다. 본 발명의 방법에 따라 치료할 수 있는 연조직 손상의 예는 연조직(예를 들어, 힘줄, 인대, 반월판, 근육, 방광 또는 피부)의 파열 또는 찢김; 탈장; 피부 상처; 화상; 피부 궤양; 수술 상처; 혈관 질환(예를 들어, 말초 동맥 질환, 복부 대동맥류, 경동맥 질환, 및 정맥 질환; 혈관 손상; 부적절한 혈관 성장); 및 근육 질환(예를 들어, 선천성 근질환; 중증 근무력증; 염증성, 신경성, 및 근원성 근육 질환; 및 뒤쉔 근위축증, 베커 근위축증, 근긴장성 근위축증, 지대형 근위축증, 안면견갑상완 근위축증, 선천성 근위축증, 안구인두 근위축증, 원위 근위축증, 및 에머리-드레퓌스 근위축증과 같은 근위축증)을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일부 실시태양에서, 연조직 손상은 힘줄 조직, 인대 조직, 반월판 조직, 근육 조직, 피부 조직, 방광 조직, 또는 진피 조직의 손상이다. 일부 실시태양에서, 연조직 손상은 수술 상처, 외상 상처, 만성 상처, 급성 상처, 깊은 상처, 출혈 부위, 또는 화상이다.
일부 실시태양에서, 조성물은 치료되는 대상에 동종일 수 있다. 비-제한적 예로, 일부 실시태양에서, 콜라겐 매트릭스가 인간이고, 매트릭스에 부착된 중간엽 줄기세포가 인간이고, 대상이 인간이거나; 콜라겐 매트릭스가 말이고, 매트릭스에 부착된 중간엽 줄기세포가 말이고, 대상이 말이다. 일부 실시태양에서, 조성물은 치료되는 대상에 이종일 수 있다. 비-제한적 예로, 일부 실시태양에서, 콜라겐 매트릭스는 돼지 또는 소이고, 매트릭스에 부착된 중간엽 줄기세포는 인간이고, 대상은 인간이다.
일부 실시태양에서, 본원에서 기술하는 조성물은 위에서 기술한 연조직 손상이 있는 인간을 치료하기 위해 사용된다. 일부 실시태양에서, 본원에서 기술하는 조성물은 수의학적 용도에 사용된다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 본 발명의 조성물은 위에서 기술한 연조직 손상이 있는 비-인간 영장류, 생쥐, 쥐, 개, 고양이, 돼지, 양, 소 또는 말과 같은 인간이 아닌 동물에 사용된다. 일부 실시태양에서, 본원에서 기술하는 조성물은 찢어지거나 파열된 연조직(예를 들어, 인대)이 있는 말을 치료하기 위해 사용된다.
본 발명의 중간엽 줄기세포-접종된 콜라겐 매트릭스는 이식, 주사, 국소적 적용, 외과적 부착, 또는 다른 조직의 이식을 포함하나 이에 제한되지 않는, 해당 기술 분야에서 공지된 임의의 방법에 따라 대상의 신체에 적용되거나 도입될 수 있다. 일부 실시태양에서, 조성물은 국소적으로 투여된다. 일부 실시태양에서, 조성물은 외과적 이식에 의해 투여된다. 매트릭스는 조직 또는 장기의 모양 및/또는 크기에 맞춰 만들어질 수 있거나 투여 전에(예를 들어, 의사에 의해) 치료되는 연조직 손상의 크기에 맞춰 크기 조절될 수 있다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 중간엽 줄기세포-접종된 콜라겐 매트릭스는 다층이다.
V. 실시예
다음의 실시예는 청구된 발명을 제한하는 것이 아니라, 설명을 위해 제공된다.
실시예 1: 무세포 진피 매트릭스 상의 지방-유래 줄기세포의 부착 및 생존
배경
무세포 진피 매트릭스 샘플을 72 시간 동안 DPBS/10%PSA에서 탈세포화 및 세척했다. 샘플을 24 시간 동안 DPBS/4%PSA에 두고, 이어서 18 시간 동안 DPBS/1%PSA에 두었다. 사용될 일부 샘플을 DMEM-F12/10%FBS/1%PSA에 두었고 나머지 조직은 4 ℃에서 DPBS/4%PSA에 보관했다.
샘플 제조
먼저, 무세포 진피 매트릭스 샘플을 항생제 보관에서 제거했다. 이어서, 떠오르지 않으면서 웰 바닥 전체를 덮도록 원형 샘플을 24-웰 판(지름 = 15.6 mm)에 맞춰 잘랐다. 세 헹굼 그룹이 있었다: (a) DPBS 저장된 샘플, DPBS/1%PSA로 헹굼; (b) DPBS 저장된 샘플, DMEM-F12/20%FBS/1%PSA로 헹굼; 및 (c) 배지 저장된 샘플, DMEM-F12/20%FBS/1%PSA로 헹굼. 각 헹굼 그룹에 대해, 샘플을 50 ml의 DPBS/1%PSA 또는 DMEM-F12/20%FBS/1%PSA와 함께 125 ml 배기되는 삼각 플라스크에 넣고 100-125 RPM으로 60 분 동안 수평 진탕기에서 37 ℃에서 진탕했다. 각 헹굼 단계에서 시약을 교체하면서 세 번의 헹굼을 수행했다. 이어서 샘플을 플라스크에서 제거하고 접종까지(>10 분) 24-웰 판에서 DMEM-F12/10%FBS/1%PSA(모든 그룹)에 두었다. 판 배치는 아래의 표 1 및 표 2에 나타낸다.
Figure pct00001
Figure pct00002
접종
DPBS 세척 및 트리플 익스프레스 분리(사용된 세포: 113712(P1))에 의해 배양된 지방-유래 줄기세포(ASC)를 단리했다. 세포를 원심분리하고 계수기(Countess)로 세고 1.0x106 세포/ml로 희석했다. 모든 샘플 웰에서 배지를 흡입하고, 200,000 세포(200 μl)를 각 샘플 및 양성 대조 웰에 첨가했다. 모든 웰의 부피를 배양 배지(DMEM-F12/10%FBS/1%PSA)로 1.8 ml로 약간 높였다. 샘플을 42-48 시간 동안 37 ℃ CO2 인큐베이터에 두었다.
평가
샘플 평가를 위해, 먼저 배지를 37 ℃로 및 프레스토블루를 실온으로 가온했다. 샘플 판을 인큐베이터에서 제거하고, 이어서 1.8 l의 배지를 각 "헹굼" 및 "최종" 웰에 첨가했다. 집게로, 각 이식편을 "최초" 웰에서 제거하고 "헹굼" 웰에 8-10 회 담그고, 이어서 적절한 배향으로 "최종" 웰에 두었다. 판 1에만, 200 μl의 프레스토블루 시약을 각 샘플 및 대조 웰에 첨가했다. 이어서 샘플을 3 시간 동안 CO2 인큐베이터에서 인큐베이션했다. 인큐베이션 후, 접종된 샘플을 새로운 12-웰 판의 DPBS(-Ca/-Mg)로 옮기고 저 RPM의 진탕기에 두었다. 형광 측정을 위해 삼중 샘플을 검은색 96-웰 판(들)로 옮기고, 가장 많이 부착된 샘플(가장 밝은 측정값) 및 세포 없는 대조물을 트리플 익스프레스 분리 및 세포 계수에 사용했다. 이어서 판 1에서 본 가장 많이 부착된 샘플을 사용하여 H&E 조직학을 위해 판 2 샘플을 준비했다.
육안 관찰
도 1에 나타낸대로, 도립 현미경으로 각 최초, 헹굼, 및 최종 웰을 보았다(최종으로부터 샘플 제거). 그룹 A 및 그룹 B 웰은 위 및 아래 샘플에 대해 매우 유사했다. 어떤 웰에서도 생 세포가 보이지 않았다. 그룹 A의 경우, 현저한 양의 지성 잔류물이 있는 위 헹굼 웰을 제외하고 위 및 아래 샘플 웰 모두 동일한 일반적인 모습이었다. 그룹 A 최초 및 헹굼 웰은 적음 내지 중간 양의 죽은 세포 및 잔해가 있었다. 최종 웰은 약간 더 적은 죽은 세포 및 잔해가 있었다. 그룹 B 웰은 A 또는 B의 다른 웰에 비해 현저히 많은 양의 죽은 세포가 있는 아래 최초 웰을 제외하고 그룹 A와 유사했다.
그룹 C 헹굼 및 최종 웰은 모두 그룹 A 및 B와 유사해, 중간 양의 죽은 세포 및 잔해를 나타냈다. 그러나, 모든 샘플 그룹 중 그룹 C 최초 웰이 생 세포를 나타낸 유일한 웰이었다(도 2). 위 최초 웰에는 적은 양의 부유 죽은 세포가 중간에 있었고 주변부에 부착된 생 세포가 있었다. 이들 세포를 마찬가지로 동종편의 가장자리를 통해 붓고 인큐베이션 중에 플라스틱에 부착할 수 있었다. 그룹 C 아래 최초 웰에도 또한 가장자리에 생 세포가 있었다. 아래 최초 웰은 위 최초 웰보다 많은 세포를 볼 수 있었고, 이는 샘플이 판으로부터 부분적으로 부유해서 세포가 유동할 수 있었으므로 예측가능했다. 모든 그룹 C 최초 웰 또한 전체적으로 중간 양의 죽은 세포가 있었다. 전면성장에 다다랐을 때 세포만 있는 대조 웰은 연장된, 건강해 보이는 세포를 나타냈다(도 3).
프레스토블루 대사 분석기
프레스토블루 분석기로부터의 형광(표 3) 및 흡광(표 4) 측정을 사용하고, 세포만 있는 양성 대조물을 최대 가능 세포 활성으로 설정하여 대사 활성 퍼센트를 비교했다. 배지만 있는 배경을 각 샘플 웰 및 양성 대조물에서 뺐다. 각 샘플을 양성 대조물과 비교하고, 각 웰 위치에 대한 대사 활성 퍼센트를 기록했다. (그룹 C 아래 샘플은 웰 판으로부터 부분적으로 부유해서, 세포가 유동하고 플라스틱에 부착할 수 있었다.)
Figure pct00003
Figure pct00004
대사 활성에서 복수의 경향이 확인되었다. 피부의 위 표면은 프레스토블루를 사용한 보다 높은 대사 활성을 나타냈다. 세포는 아래보다 위에 보다 용이하게 부착될 수 있거나 아래보다 위 표면에서 48 시간 후에 보다 대사적으로 활성일 수 있다.
다른 경향은 DMEM-F12/FBS에 보관되고 헹궈진 샘플이 가장 높은 대사 활성을 보였고 아마도 가장 높은 접종 효율을 나타냈을 것이라는 점이다. 접종 직전에 모든 그룹을 배지에 짧게 담갔지만, 혈청-함유 배지에 대한 노출은 샘플의 수명에 대해 매우 상이했다. 그룹 C에 있는 것들은 접종 전에 배지에 보관했고 배지로 헹구었다. 그룹 A 및 B의 샘플은 DPBS에 보관했다. 그룹 A는 DPBS로 헹구었고 그룹 B는 배지로 헹구었다.
트리플 익스프레스 소화
프레스토블루 분석 후, 각 그룹으로부터의 샘플을 DPBS에서 세척하고 세포를 트리플 익스프레스를 사용하여 분리했다. 이어서 세포 집단을 원심분리하고 6-웰 판에 재평판배양했다. 모든 접종된 샘플에 현미경으로 봤을 때 회수 가능한 세포 집단이 있었다. 도 4A에 나타낸 대로 가장 높은 정도의 대사 활성을 나타낸 그룹 C 위 샘플이 현미경 하에서 가장 많은 수의 세포를 또한 나타냈다. 비접종된 샘플(도 4B)은 배출된 세포를 나타내지 않았다.
실시예 2: 세포 현탁액 형성을 위한 지방 조직 준비
배경
줄기세포 생성을 위한 지방은 지방 흡입 장비를 사용해서 지방 흡입물로 통상적으로 회수된다. 그러나 지방 흡입 방법은 뻔하고 통상적인 공여자로부터 1000 cc 이상의 지방을 얻기 힘들다. 따라서, 단일 공여자로부터 회수되는 조직의 양을 극대화하기 위해 손으로 얻은 지방 덩어리와 같은 상이한 회수 방법이 연구되었다. 단일 공여자로부터의 덩어리 지방 수율은 2 L이므로, 세포 수율도 2 배 증가했다. 이 연구에서는, 동일한 공여자로부터의 덩어리 지방 및 지방 흡입 기계를 사용하여 회수된 세포의 세포 수 및 세포 표현형을 비교했다.
단계 I: 조작 방법
덩어리 지방 내의 결합 조직의 섬유질 특성으로 인해 단순한 수동 조작이 불가능했다. 입자 크기를 효율적으로 및 일관적으로 감소시키기 위해 기계적 힘이 필요한 것으로 판단했다. 첫번째 목표는 효율적인 콜라게나아제 소화를 가능하게 하기 위해 대형 지방을 소형 입자로 분해하는 것이었다.
지방 덩어리는 두 공여자로부터 얻어졌고 콜라게나아제 소화를 위한 조직을 준비하기 위한 시도로 다양한 처리 도구 및 요리 장비를 사용하여 조작되었다. 사용된 처리 도구는 육류 분쇄기, 전기 뼈 분쇄기, 육류 연화제, 치즈 그레이터, 및 블렌더였다. 지방의 조작-후 및 소화-후 모습을 기록했다. 덩어리 조직을 그룹으로 나누고 각 조작 형태를 가했다. 입자 크기 감소에 성공한 것으로 보이는 것들은 이어서 콜라게나아제로 소화되고 세포는 단리되었다.
사용 용이성, 반복성, 조작된 지방의 물리적 외관 및 생성된 세포 수/활성에 기초해서 다음의 조작 방법이 성공적이었다: (1) 전통적인 입자 세트 또는 작은 입자 세트를 포함한 전기 뼈 분쇄기(EBG); 및 (2) TSM #10 육류 분쇄기, 3/8" 및 3/16" 공극 크기. 특히, 3/8" 공극 크기 육류 분쇄기는 지방 흡입물과 매우 유사한 외관을 보였다.
단계 II: 분쇄기 및 조직 세척 비교
3/8" 공극 판 또는 3/16" 공극 판을 사용한 육류 분쇄기와 비교하여 작은 입자 세트 또는 시제품 강력 입자 세트를 포함하는 EBG를 사용하여 추가적으로 지방 덩어리의 조작을 시험했다. 또한, 조직 헹굼 과정을 시험했다.
추가적인 세 공여자로부터의 지방 덩어리를 얻고 활성 세포 수를 최적화하고 지방 흡입물 특성을 최대한 재현하기 위해 다양한 분쇄기 및 부속품 및 헹굼 기술을 사용하여 처리했다. 공여자 3은 육류 분쇄기 판 부속품(3/8" 대 3/16") 및 작은 입자 세트를 포함하는 EBG를 비교하는 데에 사용했다. 최종 펠릿의 활성 세포 수 간의 최소의 차이를 발견했다. 공여자 4는 분쇄-전에만 헹궈지거나 분쇄-전 및 후에 헹궈진 샘플을 사용하여 3/8"판을 포함하는 육류 분쇄기와 강력 입자 세트를 포함하는 EBG를 비교하는 데에 사용했다. 공여자 5는 공여자 4와 동일한 프로토콜을 사용하여 검증 시험에 사용했다.
3/8" 분쇄 판이 사용의 편의성 및 지방 흡입물 입자 크기와의 생성물의 유사성 측면에서 바람직했다. 또한, 육류 분쇄기의 속도 및 일관성이 EBG에 비해 우수했지만, 모든 분쇄기가 비슷한 수의 활성 세포를 생성했다. 분쇄-전에만 헹구는 것과 분쇄-전 및 후에 헹구는 것의 비교와 관련해서는 결론을 얻을 수 없었다.
단계 III: 기질 혈관 분획 단리를 위한 지방 덩어리 대 지방 흡입물
이 연구의 목적은 동일한 공여자로부터의 덩어리 및 지방 흡입물 지방으로부터 세포 현탁액(기질 혈관 분획, 또는 SVF)을 단리하고 유동 세포분석법을 사용하여 얻어진 세포 집단의 특징을 확인하는 것이었다. 샘플은 다음의 방식으로 처리했다: (1) 지방 흡입; (2) 3/8" 육류 분쇄기 판 및 소화-전 헹굼(분쇄-전 및 분쇄-후)에 의한 지방 덩어리; 및 (3) 3/8" 육류 분쇄기 판 및 소화-전 헹굼 없음(분쇄-전만)에 의한 지방 덩어리. 추가적인 다섯 공여자로부터의 지방을 동일한 공여자로부터 지방 흡입 및 덩어리 모두로 회수했다. 지방 흡입 지방은 복부로부터 회수했고, 덩어리 지방은 복부 및 허벅지로부터 회수했다. 각 방법에 대해 200 cc 샘플을 동시에 처리했다. 수송 배지를 빼내고 이어서 콜라게나아제로의 소화 전에 분별 깔때기 내에서 세 번의 DPBS 헹굼을 포함하는 통상적인 프로토콜에 따라 지방 흡입물을 처리했다.
지방 덩어리는 콜라게나아제 소화 전에 두 단계를 거쳤고, 그 지점 이후 통상적인 프로토콜을 사용해 처리했다. 소화 전에, ~500 cc의 지방 덩어리를 동일한 부피의 DPBS에 담그고 총 6 회에 걸쳐 두 비커 사이에서 옮겨 따랐다. 이 헹굼을 총 세 번 헹굼으로 반복했다. 이어서 지방 덩어리를 육류 분쇄기 및 3/8" 판을 사용해 분쇄했다. 이어서 분쇄된 지방 덩어리를 두 200 cc 샘플로 나누었다. 한 샘플은 소화 전에 분별 깔때기에서 DPBS로 세 번 헹구었고 다른 샘플은 분쇄 후 바로 소화시켰다. 추가적인 헹굼을 사용하는 덩어리 방법은 지방 흡입 방법에 비해 처리 시간을 약간 증가시킬 수 있다. 그러나, 분쇄-후 헹굼 없이 처리하는 것은 지방 흡입에 비해 전체 처리 시간을 감소시킬 것이다.
세포 활성 및 양성 및 음성 중간엽 줄기세포 마커를 시험하기 위해 생성된 SVF 샘플을 다양한 세포 표면 마커(CD 73, 90, 105, 34, 45, 271 및 D&-Fib)에 대해 유동 세포분석법에 의해 분석했다.
Figure pct00005
표 5 및 도 5는 지방 흡입과 육류 분쇄기 덩어리 + 헹굼 사이 또는 지방 흡입과 육류 분쇄기 덩어리 헹굼 없음 사이에서 생 세포 및 총 세포 수의 현저한 차이가 없었다는 것을 나타낸다. 또한, 표면 마커는 현저히 다르지 않았다.
시험한 임의의 카테고리에 대해 지방 흡입과 각 육류 분쇄기 샘플 사이에 현저한 차이가 없었다. 평균은 대량의 총 생 세포 및 높은 평균의 CD73+ 및 CD90+가 육류 분쇄기 헹굼 없음 방법으로부터 얻어졌다는 것을 나타냈다. CD105+의 가장 높은 평균은 지방 흡입 방법으로부터 얻어졌다. CD34+ 세포는 지방 흡입과 육류 분쇄기 헹굼 없음 방법 사이에서 매우 유사했지만, CD45+는 육류 분쇄기 헹굼 없음 방법에서 가장 높았고 지방 흡입 방법에서 가장 낮았다. 육류 분쇄기 + 헹굼 샘플은 시험한 모든 카테고리에 대해 중간-범위 또는 가장 낮은 양을 나타냈다. 따라서 덩어리 지방 처리 방법으로 육류 분쇄기 헹굼 없음 방법을 선택했다.
결론
이 연구는 콜라게나아제 소화를 위해 덩어리 지방을 효율적으로 분해하는 방법을 증명한다. 이 데이터는 cc의 지방 조직 당 세포 수 및 세포 표현형이 지방 흡입 지방과 덩어리 지방 사이에 현저히 다르지 않았다는 것을 또한 시사한다. 지방 흡입의 경우, 공여자 당 지방 부피 수율은 1 L이고, 118,604의 SVF 수율/cc 지방 및 118 백만의 SVF 수율/공여자이다. 덩어리 처리의 경우, 공여자 당 지방 부피 수율은 2 L이고, 133,394의 SVF 수율/cc 지방 및 267 백만의 SVF 수율/공여자이다. 따라서, 덩어리 지방 회수가 공여자 당 얻을 수 있는 지방의 총 부피를 증가시켜 수율을 시키는 효율적인 수단이다.
본원에서 기술한 실시예 및 실시태양은 단지 설명의 목적을 위한 것이고 이를 기초로 한 다양한 수정 또는 변형이 당업자에게 제시되고 본원의 사상 및 범위 및 첨부된 청구항에 포함될 것으로 이해된다. 본원에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 모든 면에서 전체로서 본원에 참조문헌으로 포함된다.

Claims (51)

  1. 콜라겐 매트릭스, 및
    콜라겐 매트릭스에 부착된 중간엽 줄기세포를 포함하고,
    중간엽 줄기세포가, 콜라겐 매트릭스에 접종된 중간엽 줄기세포 및 비-중간엽 줄기세포를 포함하는 세포 현탁액을 형성하도록 처리된 조직으로부터 유래하고,
    중간엽 줄기세포가, 세포 현탁액의 형성 후 및 콜라겐 매트릭스로의 세포 현탁액의 접종 전에 체 외 배양되지 않는,
    대상에서의 연조직 손상 치료용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 콜라겐 매트릭스가 피부, 진피, 힘줄, 인대, 근육, 양막, 반월판, 소장 점막하조직, 또는 방광인, 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 콜라겐 매트릭스가 면역원성을 감소시키도록 처리되는, 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 처리된 콜라겐 매트릭스가 대응하는 미처리된 동종 콜라겐 매트릭스에 비해 50 % 이상 적은 내인성 세포를 갖는, 조성물.
  5. 제3항 또는 제4항에 있어서, 처리된 콜라겐 매트릭스가 대응하는 미처리된 동종 콜라겐 매트릭스에 비해 50 % 이상 감소된 DNA 함량을 갖는, 조성물.
  6. 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 처리된 콜라겐 매트릭스가 비-면역원성인, 조성물.
  7. 제3항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 처리된 콜라겐 매트릭스가 생리활성 사이토카인을 보유하는, 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 생리활성 사이토카인이 IL-4, IL-6, IL-15, IL-16, IL-18, 및 IL-28로 이루어지는 군에서 선택되는, 조성물.
  9. 제3항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 처리된 콜라겐 매트릭스가 생리활성 성장 인자를 보유하는, 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 생리활성(bioactive) 성장 인자가 혈소판-유래 성장 인자 알파(PDGFa)인, 조성물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 콜라겐 매트릭스가 탈세포화된 진피인, 조성물.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 콜라겐 매트릭스가 상피층이 제거된 진피인, 조성물.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 콜라겐 매트릭스가 인간, 돼지, 소, 또는 말인, 조성물.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 현탁액을 형성하도록 처리된 조직이 지방 조직, 근육 조직, 출생 조직, 피부 조직, 뼈 조직, 또는 골수 조직에서 선택되는, 조성물.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 현탁액을 형성하도록 처리된 조직이 인간 조직인, 조성물.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 콜라겐 매트릭스 및 세포 현탁액을 형성하도록 처리된 조직이 동일한 종으로부터 온 것인, 조성물.
  17. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 콜라겐 매트릭스 및 세포 현탁액을 형성하도록 처리된 조직이 상이한 종으로부터 온 것인, 조성물.
  18. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 콜라겐 매트릭스 및 세포 현탁액을 형성하도록 처리된 조직이 동일한 공여자로부터 온 것인, 조성물.
  19. 제18항에 있어서, 공여자가 인간인, 조성물.
  20. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 콜라겐 매트릭스 및 세포 현탁액을 형성하도록 처리된 조직이 상이한 공여자로부터 온 것인, 조성물.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 콜라겐 매트릭스에 접종된 중간엽 줄기세포가 하나 이상의 양성 중간엽 줄기세포 마커를 발현하는, 조성물.
  22. 제21항에 있어서, 콜라겐 매트릭스에 접종된 중간엽 줄기세포가 하나 이상의 음성 중간엽 줄기세포 마커를 발현하지 않는, 조성물.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 기재된 조성물을 연조직 손상 부위에 접촉시키는 단계를 포함하는, 대상에서의 연조직 손상 치료 방법.
  24. 제23항에 있어서, 연조직 손상이 힘줄 조직, 인대 조직, 반월판 조직, 근육 조직, 피부 조직, 방광 조직, 또는 진피 조직의 손상인, 방법.
  25. 제23항에 있어서, 연조직 손상이 수술 상처, 외상 상처, 만성 상처, 급성 상처, 깊은(deep channel) 상처, 출혈 부위, 또는 화상인, 방법.
  26. 제23항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 국소적으로 투여되는, 방법.
  27. 제23항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 외과적 이식에 의해 투여되는, 방법.
  28. 제23항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 대상이 인간 대상인, 방법.
  29. 제23항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 대상이 수의학적 대상인, 방법.
  30. 제29항에 있어서, 수의학적 대상이 말인, 방법.
  31. (a) 중간엽 줄기세포 및 비-중간엽 줄기세포를 포함하는 세포 현탁액을 형성하도록 조직을 소화시키는 단계;
    (b) 콜라겐 매트릭스로 세포 현탁액을 접종하는 단계;
    (c) 중간엽 줄기세포를 콜라겐 매트릭스에 부착시키기 적합한 조건하에서 세포 현탁액이 접종된 콜라겐 매트릭스를 인큐베이션하는 단계; 및
    (d) 비-부착 세포를 콜라겐 매트릭스에서 제거하는 단계를 포함하는, 연조직 손상 치료용 조성물의 제조 방법.
  32. 제31항에 있어서, 콜라겐 매트릭스가 피부, 진피, 힘줄, 인대, 근육, 양막, 반월판, 소장 점막하조직, 또는 방광인, 방법.
  33. 제31항 또는 제32항에 있어서, (b) 단계 전에, 면역원성을 감소시키도록 콜라겐 매트릭스를 처리하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  34. 제33항에 있어서, 면역원성을 감소시키도록 콜라겐 매트릭스를 처리하는 단계가 콜라겐 매트릭스에 탈세포화제를 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
  35. 제33항에 있어서, 면역원성을 감소시키도록 콜라겐 매트릭스를 처리하는 단계가 콜라겐 매트릭스를 탈세포화하지 않고 상피층을 제거하는 단계를 포함하는, 방법.
  36. 제33항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 처리된 콜라겐 매트릭스가 대응하는 미처리된 동종 콜라겐 매트릭스에 비해 50 % 이상 적은 내인성 세포를 갖는, 방법.
  37. 제33항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 처리된 콜라겐 매트릭스가 대응하는 미처리된 동종 콜라겐 매트릭스에 비해 50 % 이상 감소된 DNA 함량을 갖는, 방법.
  38. 제33항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 처리된 콜라겐 매트릭스가 비-면역원성인, 방법.
  39. 제33항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 처리된 콜라겐 매트릭스가 생리활성 사이토카인을 보유하는, 방법.
  40. 제39항에 있어서, 생리활성 사이토카인이 IL-4, IL-6, IL-15, IL-16, IL-18, 및 IL-28로 이루어지는 군에서 선택되는, 방법.
  41. 제33항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 처리된 콜라겐 매트릭스가 생리활성 성장 인자를 보유하는, 방법.
  42. 제41항에 있어서, 생리활성 성장 인자가 혈소판-유래 성장 인자 알파(PDGFa)인, 방법.
  43. 제31항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 콜라겐 매트릭스가 인간, 돼지, 소, 또는 말인, 방법.
  44. 제31항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 현탁액을 형성하도록 소화된 조직이 지방 조직, 근육 조직, 출생 조직, 피부 조직, 뼈 조직, 또는 골수 조직에서 선택되는, 방법.
  45. 제31항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 현탁액을 형성하도록 소화된 조직이 인간 조직인, 방법
  46. 제31항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 콜라겐 매트릭스 및 세포 현탁액을 형성하도록 소화된 조직이 동일한 종으로부터 온 것인, 방법.
  47. 제31항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 콜라겐 매트릭스 및 세포 현탁액을 형성하도록 소화된 조직이 상이한 종으로부터 온 것인, 방법.
  48. 제31항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 콜라겐 매트릭스 및 세포 현탁액을 형성하도록 소화된 조직이 동일한 공여자로부터 온 것인, 방법.
  49. 제48항에 있어서, 공여자가 인간 공여자인, 방법.
  50. 제31항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 콜라겐 매트릭스 및 기질 혈관 분획을 형성하도록 소화된 조직이 상이한 시체 공여자로부터 온 것인, 방법.
  51. 제34항에 있어서, 탈세포화제를 제거하기 위한 세척 단계를 추가로 포함하는, 방법.
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