KR20150048115A - 손상 연골 제품 - Google Patents

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KR20150048115A
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cartilage
collagen
cells
cartilage product
collagen matrix
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KR1020157003680A
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다나 수 유
진-창 광
제이미 페이든
스콧 에이. 맥슨
알라 다닐코비치
에라스모 로페즈
삼손 톰
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오시리스 쎄라퓨틱스, 인크.
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Abstract

본 발명은 손상 연골 제품, 손상 연골 제품의 제조 방법, 손상 연골 제품의 이용 방법 및 연골 제품을 대상체에 투여하는 것을 포함하는 치료 방법을 제공한다. 상기 연골 제품은 가요성 연골 제품을 제조하기 위해 손상된 콜라겐 기질을 포함하는 방법에 의해 제조된다. 임의로, 상기 연골 제품은 생존 연골세포, 연골발생 인자와 같은 생물활성 인자, 및 II형 콜라겐 기질을 포함한다. 임의로, 상기 연골 제품은 비면역원성이다.

Description

손상 연골 제품{DISRUPTED CARTILAGE PRODUCTS}
본 출원은 다음을 우선권으로 청구하며, 그 내용이 이들의 전문을 참조하여 본원에 포함된다:
McAndrews, Held and Malloy 사무소에서 서류 번호 25533US01로서 2011. 7. 11.에 출원한 "Disrupted Cartilage Products"를 표제로 하는 U.S. 가출원 번호 61/670,434; McAndrews, Held and Malloy 사무소에서 서류 번호 25532US01로서 2011. 7. 11.에 출원한 "Porated Cartilage Products"를 표제로 하는 U.S. 가출원 번호 61/670,424; 및 McAndrews, Held and Malloy 사무소에서 서류 번호 25534US01로서 2011. 7. 11.에 출원한 "Methods of Manufacturing Cartilage Products"를 표제로 하는 U.S. 가출원 번호 61/670,444.
본 출원은 McAndrews, Held and Malloy 사무소에서 각각 서류 번호 25534US02 및 25534WO01로서 "Methods of Manufacturing Cartilage Products"를 표제로 하는 U.S. 및 PCT 출원; McAndrews, Held and Malloy 사무소에서 각각 서류 번호 25532US02 및 25532WO01로서 "Porated Cartilage Products"를 표제로 하는 U.S. 및 PCT 출원; 및 McAndrews, Held and Malloy 사무소에서 서류 번호 25533US02로서 "Disrupted Cartilage Products"를 표제로 하는 U.S. 출원과 공동 출원되었으며, 이들의 전문이 참조로 본원에 포함된다.
본 발명은 치료제에 유용한 연골 제품 및 이러한 치료제를 제조하고 이용하는 방법에 관한 것이다.
관절 연골 부상은 정형외과에서 해결되고 있지 않은 주요 문제 중 하나이다. U.S.에서 년간 500,000명을 넘는 환자가 연골 손상을 보수하기 위한 외과적 시술을 받는다. 그러나 이러한 수술의 다수는 최적의 결과를 내지 못한다.
관절 연골은 주로 II형 콜라겐 원섬유 중 프로테오글리칸에 의해 형성되는 세포외 기질에 걸쳐 분포되는 희박한 연골세포 모집단으로 이루어진다. 콜라겐은 조직에 그 형태와 인장 강도를 제공하며, 프로테오글리칸과 물의 상호작용은 조직에 그 압축에 대한 강도, 탄성 및 내구성을 제공한다. 히알린 연골은 관절의 뼈 부분에 걸쳐 마찰이 적은 표면을 제공한다. 병소에서 피복이 마모되거나 손상되면, 관절 운동이 고통스러워지거나 심하게 제한될 수 있다. 손상된 뼈는 전형적으로 성공적으로 재생시킬 수 있지만, 히알린 연골 재생은 상당히 제한된다.
현재의 수술적 처치에는 미세골절, 죽은 조직 제거, 뼈연골 이식, 및 자가 연골세포 착상(ACI)이 포함된다. 이들 처치의 목적은 천연 히알린 연골(II형 콜라겐)을 보수하고 재생시키는 것이다.
미세골절에는 손상된 관절 연골의 제거에 이어 하부 연골아래 뼈를 노출된 골수까지 물리적으로 손상시키고 출혈을 일으키는 것이 관여된다. 혈괴가 결손부를 채우기 위해 염증성 시토카인, 성장 인자 및 MSCs를 도입시키지만, 이 절차는 관절 연골을 생성하지는 못하고, 대신 I형 콜라겐으로 제조되는 섬유연골 흉터 조직의 생성을 자극한다. 섬유연골은 불량한 장기 생체역학 성능을 가지며, 비정상적 뼈 성장을 일으키고, 골관절염의 위험성을 증가시킨다.
실패한 다른 전략에는 자가 연골세포 착상(ACI), 죽은 조직 제거, 및 뼈연골 이식이 포함된다.
Gomes 등(US 2004/0230303)은 세포 이동을 허용하기 위해 연골 캡과 바닥에 걸쳐 드릴을 뚫은 구멍을 포함하는 연골아래 뼈 바닥 및 관절 연골 캡을 갖는 임플란트를 기재한다. 상기 임플란트는 37℃에서 18시간 동안 히알루로니다아제(IV-s형, 3mg/mL) 및 트립신(단일이염기성 완충액 3ml 중 0.25%)로 소화될 수 있다. Gomes 등은 가요성 연골 임플란트, 생존 천연 연골세포를 함유하는 연골 임플란트, 또는 비면역원성 연골 임플란트를 교시하지 않는다.
Chen 등(US 2009/0024229)은 실활(무세포화) 후 재세포화된 연골 그라프트를 기재한다. 상기 그라프트는 재세포화를 촉진하기 위해 미세천공될 수 있다. 상기 그라프트는 연골의 분자적 측면을 개질하기 위한 효소, 예컨대 프로테오글리칸을 제거하기 위한 콘드로이티나아제 및 재조합 엔도뉴클레아제, 예를 들어 BENZONASE.RTM. (Merk, Inc.)을 이용해서 실활될 수 있다. Chen 등은 가요성 연골 임플란트 또는 생존 천연 연골세포를 함유하는 연골 임플란트 또는 비면역원성 연골 임플란트를 교시하지 않는다.
Steinwachs 등(US 2008/0269895)은 다양한 특징을 갖는 연골 임플란트를 기재한다. 상기 임플란트는 연골세포로부터 시험관내 성장될 수도 있고, 또는 연골 추출물일 수도 있다. 다양한 특징 중, 상기 임플란트는 지름 0.5mm 내지 2mm의 채널을 가질 수 있다. 다른 단점 중에서도 Steinwachs 등은 소화된 연골 임플란트 또는 비면역원성 연골 임플란트를 교시하지 않는다.
Bardos 등("Osteochondral Integration of Multiply Incised Pure Cartilage Allograft: Repair Method of Focal Chondral Defects in a Porcine Model"; Am J Sports Med 2009 37: 50S)은 평행 절개를 포함하는 돼지 연골 표본을 기재한다. Bardos 등은 나선 커팅된 연골 표본 또는 비면역원성 연골 표본을 교시하지 않는다.
Bravenboer 등("Improved cartilage integration and interfacial strength after enzymatic treatment in a cartilage transplantation model"; Arthritis Res Ther 2004, 6)은 히알루로니다아제에 이어 콜라게나아제로 처리된 소 관절 연골을 기재한다. 다른 단점 중에서도 Bravenboer 등은 기계적으로 손상된 연골 표본 또는 비면역원성 연골 표본을 교시하지 않는다.
Bos 등("Specific Enzymatic Treatment of Bovine and Human Articular Cartilage"; Arthritis & Rheumatism Vol. 46, No. 4, 2002년 4월, 976-985페이지)은 콜라게나아제 VII로 처리된 연골 표본을 기재한다. Bos 등은 기계적으로 손상된 연골 표본 또는 비면역원성 연골 표본을 교시하지 않는다.
당분야에 필요한 것은, 예를 들어 관절경 캐뉼라를 통해 쉽게 투여되고 부상을 입은 연골 부위에 맞춰질 수 있고, 흉터를 최소화하면서 연골 재생을 위한 생존 연골세포 및 연골발생 인자를 함유하는 II형 콜라겐 기질을 제공하는 가요성 연골 제품이다.
본 발명은 연골 제품, 연골 제품의 제조 방법, 및 연골 제품의 이용 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 연골 제품은 손상된 콜라겐 기질을 포함한다. 콜라겐 기질은 기계적 손상(예로, 콜라겐 기질이 나선 커팅됨), 효소적 손상(예로, 콜라겐 기질이 콜라게나아제-처리됨), 또는 기계적 손상과 효소적 손상을 모두 포함한다.
본 발명의 예시적인 연골 제품의 콜라겐 기질은 하기 기술적 특징 중 하나 이상(예로, 각각)을 갖는다:
- 히알린 연골에서 유래되거나 콜라겐 II를 포함함
- 선택적으로 콜라겐 기질으로부터 유래한 생존 세포를 포함함;
- 생물활성 인자를 포함함
- 천연 관절 연골보다 더 큰 가요성을 나타냄; 및
- 동결보존 매질 중에 동결보존되거나 제형화되며, 실질적으로 비면역원성임.
하나의 구현예에서, 콜라겐 기질은 II형 콜라겐(또는 "콜라겐 II")을 포함한다. 선택적으로, 콜라겐 기질 중 콜라겐의 대부분은 콜라겐 II, 예컨대 히알린 연골(예로, 관절 연골)에 의해 제공되는 콜라겐 기질이다. 선택적으로, 연골 제품에는 연골아래 뼈, 석회화된 연골, 또는 연골아래 뼈와 석회화된 연골이 모두 없다. 선택적으로, 콜라겐 기질은 방사층, 이행층 및 접면층에서 선택되는 하나 이상의 연골층을 포함한다.
하나의 구현예에서, 연골 제품은 생존 세포를 포함한다. 선택적으로, 생존 세포는 연골세포이다. 선택적으로, 생존 세포는 콜라겐 기질로부터 유래된다. 선택적으로, 생존 세포는 콜라겐 기질에 걸쳐 구배로 분포되어 있다. 선택적으로, 개구는 구배를 갖고 정렬된다.
하나의 구현예에서, 연골 제품은 생물활성 인자, 예컨대 연골발생 인자를 포함한다. 선택적으로, 연골발생 인자는 TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, BMP-2, BMP-7, bFGF, 및 IGF-1로 이루어진 군에서 선택된다. 선택적으로, 연골은 콜라겐 II, 히알루로난, 및 아그레칸을 포함한다.
하나의 구현예에서, 손상은 효소적 손상이며, ECM 단백질(예로, 콜라겐) 단편은 천연 관절 연골에서보다 실질적으로 더 짧다. 부가적으로 또는 대안적으로, 콜라겐 기질 중 상당량의 ECM 단백질은 천연 관절 연골에 비해 단편화되어 있다. 선택적으로, ECM 단백질 단편은 천연 연골의 효소적 손상("소화"), 예로 콜라게나아제(예로 II형) 처리와 같은 소화에 의해 생성된다.
하나의 구현예에서, 기계적 손상은 조직 제거 유형이다. 선택적으로, 조직 제거 유형의 기계적 손상은 나선형 커팅, 홈, 교차 홈, 개구 및 후프-형성 코어 커팅에서 선택된다.
하나의 구현예에서, 기계적 손상은 조직 비제거 유형이다. 선택적으로, 조직 비제거 유형의 기계적 손상은 새김줄, 나선형 커팅, 교차 새김줄 및 피어싱에서 선택된다.
하나의 구현예에서, 기계적 손상은 연골 표본의 전체 두께를 손상시킨다(즉, 이를 통해 연장된다). 대안적으로, 기계적 손상은 연골 표본의 전체 두께보다 적게 손상시킨다.
하나의 구현예에서, 연골 제품은 실질적으로 비면역원성이다. 선택적으로, 연골 제품은 상당량의 대식세포를 포함하지 않는다.
하나의 구현예에서, 콜라겐 기질은 약 0.5 내지 약 2.0mm의 두께를 갖는다. 선택적으로, 두께는 약 1 내지 약 2mm이다. 선택적으로, 두께는 약 1 내지 약 1.5mm이다.
하나의 구현예에서, 손상 콜라겐 기질은 유사한 두께의 비개질 관절 연골보다 더 가요성이다.
본 발명은 또한 연골 표본의 제공 및 기계적 손상, 효소적 손상, 또는 기계적 손상과 효소적 손상 모두에 의한 연골 표본의 손상; 및 연골 표본의 부분적 소화를 포함하는 연골 제품의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 예시적인 제조 방법은 하기 기술적 특징 중 하나 이상(예로, 각각)을 갖는다:
- 효소적 손상("부분적 소화")이 상당량의 생존 세포를 보유하는 방식으로 수행됨;
- 연골 표본의 가요성을 증가시키는 정도까지 연골 표본이 기계적으로 손상됨;
- 연골 표본이 히알린 연골을 포함함; 및
- 연골 표본이, 예로 손상 단계 이후 동결보존됨.
하나의 구현예에서, 부분적 소화 단계는, 예를 들어 세포 보존량까지로 소화를 제한하여 상당량의 생존 세포를 보유하는 방식으로 수행된다. 선택적으로, 상기 부분적 소화 단계는 콜라겐 소화를 포함한다. 선택적으로, 상기 부분적 소화 단계는 효소적 소화, 예로 콜라게나아제(예로, II형 콜라게나아제)와 같은 프로티나아제로의 소화를 포함한다.
하나의 구현예에서, 연골 표본은 연골 표본의 가요성을 증가시키는 정도까지 기계적으로 손상된다. 선택적으로, 연골 표본의 전체 두께를 손상시키는(즉, 이를 통해 연장되는) 기계적 손상이 제공된다. 선택적으로, 연골 표본의 전체 두께를 손상시키지 않는 기계적 손상이 제공된다.
하나의 구현예에서, 연골 표본은 히알린 연골을 포함한다. 선택적으로, 연골 표본은 관절 연골 표본이다. 선택적으로, 연골 표본은 연골아래 뼈, 석회화된 연골, 또는 둘 다에서 단리된다.
하나의 구현예에서, 연골 표본은 손상 단계 이후 동결보존된다. 선택적으로, 동결보존 단계는 생존 세포를 보존하는 방식의 동결보존을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 연골 제품은 소화되지 않는다. 다른 구현예에서, 본 발명의 연골 제품은 효소적(예로, 콜라게나아제, 프로나아제, 프로티나아제 K 등의 처리), 생화학적(예로 파파인), 열적(예로 증가된 열), 화학적(케라틴 설페이트, 토실리실클로로메탄), 기계적(천공), 당업자에게 공지된 임의의 다른 소화 수단 및 상기 중 임의의 둘 이상의 조합을 포함하는 소화 수단에 의해 부분적으로 소화된다.
도 1은 본 발명의 제품이 제조될 수 있는 무릎 관절을 도시한다.
도 2는 본 발명의 관절 연골 및 인접 뼈의 층을 도시한다.
도 3은 본 발명의 동결보존 연골 제품 중 생존 연골세포를 도시한다.
도 4는 본 발명의 동결보존 연골 제품 중 생존 연골세포를 도시한다.
도 5는 본 발명의 동결보존 연골 제품 중 생존 연골세포를 도시한다.
도 6은 본 발명의 동결보존 연골 제품 중 생존 연골세포를 도시한다.
도 7은 본 발명의 동결보존 연골 제품 중 생존 연골세포를 도시한다.
도 8은 본 발명의 동결보존 연골 제품 중 생존 연골세포를 도시한다.
도 9는 본 발명의 연골 제품의 비면역원성을 도시한다.
도 10은 본 발명의 연골 제품으로부터의 연골발생 인자의 지속 방출을 도시한다.
도 11은 본 발명의 천공 연골 제품으로부터의 연골발생 인자의 더 많은 방출을 도시한다.
도 12는 본 발명의 소화 연골 제품으로부터의 연골발생 인자의 더 많은 방출을 도시한다.
도 13은 본 발명의 동결보존 연골 제품으로부터의 연골발생 인자의 더 많은 방출을 도시한다.
도 14는 세포 생존에 대한 요오드 처리 효과를 도시한다.
도 15는 본 발명의 연골 제품을 도시한다. 도 15a는 연골 제품의 기준 표본에 대해 본원에서 이용되는 명칭을 도시한다. 도 15b는 표면적 계산에 이용되는 지름, 두께 계산에 이용되는 높이, 및 층 또는 구배의 선택적 배향을 예시한다.
도 16은 콜라겐 기질 및 뼈를 포함하는 본 발명의 연골 제품을 도시한다.
도 17은 조직 비제거 유형의 기계적 손상을 거친 본 발명의 연골 제품을 도시한다. A) 평행 새김줄; B) 비정렬 새김줄; C) 나선형 커팅.
도 18은 조직 제거 유형의 기계적 손상을 거친 본 발명의 연골 제품을 도시한다. A) 직사각형 홈, B) V-커팅 홈(안쪽으로 테이퍼링됨); C) V-커팅 홈(바깥쪽으로 테이퍼링됨); D) 교차 홈.
도 19는 후핑 유형의 기계적 손상을 거친 본 발명의 연골 제품을 도시한다. A) 단일 후프; B) 복수의 후프.
도 20은 나선형 커팅, 조직 제거 유형의 기계적 손상을 거친 본 발명의 연골 제품을 도시한다. A) 투시도; B) 상면도.
도 21은 개질된 나선형 커팅, 조직 제거 유형의 기계적 손상을 거친 본 발명의 연골 제품을 도시한다. A) 사시도; B)　평면도.
본원에서 이용되는 것에는 하기 정의 및 약어가 적용된다:
"BTB"는 무릎 관절에서 수득되고, 무릎뼈, 무릎뼈 힘줄 및 부착된 정강뼈 블록을 포함하는 뼈-힘줄-뼈 그라프트를 의미한다.
"연골 제품"은 문맥 상 달리 요구되지 않는 한, 본 발명의 연골 제품을 의미한다.
"손상"은 기질에 불연속성을 제공하는 방식의 콜라겐 기질 처리를 의미한다. 하나의 구현예에서, 손상은 효소적 손상("부분적 손상")을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 손상은 기계적 손상을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 손상은 기계적 손상 및 부분적 소화를 포함한다.
"DMEM"은 Dulbecco 개질 Eagle 배지를 의미한다.
"D-PBS"는 Dulbecco 인산염 완충 식염수를 의미한다.
"ECM"은 세포외 기질, 예를 들어 연골의 기질을 의미한다.
"예시적인"(또는 "예로" 또는 "예로서")은 비제한적 예를 의미한다.
"기계적 손상"은 기계적 처리에 의한 콜라겐 기질 중 개별 불연속성의 제공을 의미한다. 개별 불연속성은 조직 제거 기법(예로, 도 18 내지 도 21에 도시된 바와 같이) 또는 비-조직-제거 기법(예로, 도 17에 도시된 바와 같이)에 의해 제공될 수 있다. 하나의 구현예에서, 개별 불연속성은 콜라겐 기질의 전체 두께에 걸쳐 제공된다(예로, 도 17b, 도 17c, 및 도 19 내지 도 21에 걸쳐 도시된 바와 같음). 또 다른 구현예에서, 개별 불연속성은 콜라겐 기질의 전체 두께보다 적게 제공된다(예로, 도 17a 및 도 18에 도시된 바와 같음). 하나의 구현예에서, 기계적으로 손상된 콜라겐 기질은 제거된 코어가 상기 코어 제거 이전의 연골판에 비해 15% 미만의 표면적을 갖는 경우, 제거된 코어를 포함하는 원형 연골판을 포함하지 않는다(예로, 도 19a에 도시된 바와 같이).
예를 들어 "천연 ECM" 또는 "천연 연골"의 맥락에서의 "천연"은 공여자에서 그 천연 상태로 ECM 또는 연골이 나타내는 특성을 나타낸다.
"부분적 소화"(또는 "제한된 소화")는 하나 이상의 소화가능 부위가 소화되지 않고 남아 있는 효소적 소화를 의미한다. 하나의 구현예에서, 부분적 소화는 추가 소화가 다른 경우에 세포 생존을 감소시키는 세포-보존적 소화이다. 하나의 구현예에서, 소화는 임의 방법, 예로 연골 표본에서 소화 산물의 방출 측정에 의해 또는 물리적 특성에 대한 소화의 효과에 의해 모니터링될 수 있다. 하나의 구현예에서, 부분적으로 소화된 콜라겐 기질(예로, 관절 연골 표본)은 소화되지 않은 콜라겐 기질에 비해 실질적으로 온전하다, 예를 들어 소화된 콜라겐 기질은 소화에 걸쳐 그 형태를 유지한다.
"QC"는 품질 제어를 의미한다
연골 제품에서 치료 세포(예로, 연골세포) 및 치료 생물활성 인자(예로, 연골원 인자)에 대해 이용되는 경우 "상당량"은 연골 제품이 투여되는 경우, 예로 본 발명의 치료 방법에 따라 생체내 측정가능한 치료 효과를 제공하는 양을 의미한다.
본 발명의 기술에 대해 이용되는 물질이 "없는"이라는 용어에는 이러한 물질이 "실질적으로 부재하거나" 또는 "실질적으로 없는" 제품이 포함되며, 이러한 물질 0%를 포함하여 5% 미만의 물질, 보다 바람직하게는 2% 미만, 보다 바람직하게는 1% 미만, 보다 바람직하게는 0.5% 미만을 갖는 제품이 포함된다. 예를 들어, 본 발명의 일부 구현예에서, 본 기술에 대해 이용되는 경우 연골아래 뼈, 석회화된 연골, 또는 연골아래 뼈와 석회화된 연골이 모두 없는 것에는 실질적으로 연골아래 뼈, 석회화된 연골 또는 둘 다가 부재한 연골 제품, 실질적으로 연골아래 뼈, 석회화된 연골 또는 둘 다가 없는 연골 제품, 및 5% 미만, 2% 미만, 1% 미만, 0.5% 미만 또는 0%의 연골아래 뼈, 석회화된 연골 또는 둘 다를 함유하는 제품이 포함된다.
연골 제품
본 발명은 내부에 복수의 개구를 갖는 콜라겐 기질을 포함하는 연골 제품을 제공한다. 선택적으로, 콜라겐 기질은 ECM 단백질 단편을 포함한다, 예로 콜라겐 기질은 소화된 히알린 연골이다.
일부 구현예에서, 연골 제품은 내부에 하나 이상의 개구를 갖는 기질을 포함한다.
놀랍게도, 본 발명의 예시적인 연골 제품은 II형 콜라겐 및 프로테오글리칸, 생물활성 인자 및 생존 연골세포의 제공에 의해 건강한 정상 관절 연골의 재생을 지지한다.
하나의 구현예에서, 연골 제품은 가요성이다. 예시적인 가요성 연골 제품은 관절경 캐뉼라 내로 롤링할 수 있고, 파단 없이 널리 굽힐 수 있고, 대상체에서 불규칙한 표적 부위로 맞출 수 있다. 놀랍게도, 생존 세포 및 인자를 포함하는 가요성 연골 제품은 a) 콜라겐 기질의 두께; b) 기계적 손상의 정도; 및 c) 소화 정도를 적절히 구성함으로써 제조될 수 있음이 발견되었다.
하나의 구현예에서, 연골 제품은 연골세포와 같은 생존 세포를 포함한다. 선택적으로, 생존 세포는 천연 연골세포이다. 선택적으로, 생존 세포는 콜라겐 기질에 걸쳐 구배로 분포되어 있다. 선택적으로, 콜라겐 기질은 적어도 부분적으로 구배를 통해 연장되는 기계적 손상을 포함한다(예로, 도 15에 도시된 바와 같이, 위 표면에 대해 수직이거나 실질적으로 구배를 가지며 정렬된 개구가 제공됨).
하나의 구현예에서, 콜라겐 기질은 효소적으로 손상되며, ECM 단백질(예로, 콜라겐) 단편은 천연 관절 연골에 비해 실질적으로 더 짧다. 부가적으로 또는 대안적으로, 콜라겐 기질 중 상당량의 ECM 단백질은 천연 관절 연골에 비해 단편화되어 있다. 선택적으로, ECM 단백질 단편은 천연 연골의 부분적 소화, 예로 콜라게나아제(예로 II형) 처리와 같은 효소적 소화에 의해 제조된다.
하나의 구현예에서, 연골 제품은 동결보존을 위해 제형화된다, 예로 동결보존 매질을 포함한다. 선택적으로, 연골 제품은 동결보존된다.
본 발명의 하나의 구현예를 예시하기 위해, 예시적인 연골 제품은 콜라겐 기질로서 기계적 손상(예로 나선형 커팅)을 갖는 히알린(예로 관절) 연골층(예로 판)을 포함하며, 연골층은 콜라게나아제와 같은 콜라겐 소화 효소를 이용한 부분적 소화에 의해 생성되는 콜라겐 단편 및 생존 천연 연골세포를 포함한다. 연골층은 그 구조적 온전성을 보유하면서 가요성이다. 연골 제품에는 연골아래 뼈 및 석회화된 연골이 없으며, 생존 천연 연골세포 구배가 분포되는 방사층, 이행층 및 접면층을 포함한다. 선택적으로, 연골 제품은 동결보존을 위해 제형화된다.
콜라겐 기질
본 발명의 연골 제품은 콜라겐 기질을 포함한다. 콜라겐 기질은 콜라겐 원섬유 및 생물활성 인자를 포함하는 임의의 세포외 기질일 수 있다. 콜라겐 기질은 임의 원천에서 수득될 수 있고 임의 크기 및 형태일 수 있다. 선택적으로, 콜라겐 기질은 가요성이다(예로, 이것은 관절경 캐뉼라를 통해 롤링하거나 접고 투여할 수 있는 정도이다).
하나의 구현예에서, 콜라겐 기질은 대상체로부터 단리되거나('천연 콜라겐 기질') 또는 시험관내 성장된다.
하나의 구현예에서, 콜라겐 원섬유는 II형 콜라겐을 포함한다. 선택적으로, 콜라겐 기질은 관절 연골과 같은 히알린 연골이다. 선택적으로, 관절 연골은 관절융기 연골, 넙다리뼈 관절융기 연골, 정강뼈 고평부 연골, 넙다리뼈 머리 연골, 위팔뼈 머리 연골, 목말뼈 연골, 또는 절구 연골이다. 선택적으로, 관절 연골은 방사층, 이행층 및 접면층에서 선택되는 하나 이상의 연골층을 포함한다.
하나의 구현예에서, 콜라겐 기질은 단편화된 ECM 단백질을 포함한다. 단편화된 ECM 단백질은 선택적으로 천연 콜라겐 기질의 부분적 소화에 의해 제조된다. 선택적으로, 콜라겐 기질은 부분적으로 콜라겐 분해 효소와 같은 프로티나아제로 부분 소화된다. 유용한 콜라겐-분해 효소에는 비제한적으로, 예를 들어 콜라게나아제(예로, I-IV형, 박테리아 콜라게나아제), 다른 엔도펩티다아제(예로, 트립신, 파파인, 펩신) 및 엑소펩티다아제(예로 카르복시펩티다아제)가 포함된다.
하나의 구현예에서, 콜라겐 기질에는 연골아래 뼈, 석회화된 연골, 또는 둘 다가 없다. 존재하는 경우, 연골아래 뼈 및 석회화된 연골은 다른 경우 콜라겐 기질의 가요성을 저해할 수 있다. 대안적 구현예에서, 연골 제품은 뼈, 예로 도 16a에 도시된 바와 같은 뼈의 감소된 면적의 플러그(plug)(콜라겐 기질 대비) 또는 도 16b에 도시된 바와 같은 뼈의 덮개를 포함한다.
하나의 구현예에서, 콜라겐 기질은 관절 연골에서 유래되며, 방사층, 이행층 및 접면층에서 선택되는 하나 이상의 연골층을 포함한다. 도 2에 도시된 바와 같이, 천연 관절 연골의 천연 연골세포는 방사층에서 세로줄의 연골세포로부터 접면층에서 평탄화 세포까지의 구배로 이들 층에 걸쳐 분포되어 있다. 접면('표면')층의 콜라겐 원섬유는 표면과 평행하게 이어진다. 방사층의 콜라겐 원섬유는 전형적으로 관절 표면을 향해(예로, 수직으로) 배향된다. 이행층의 콜라겐 섬유는 전형적으로 방사층 및 접면층에 비해 덜 밀집되어 있고, 관절 표면에 대해 비스듬하게 또는 보다 무작위화된 방식으로 배열된다.
하나의 구현예에서, 콜라겐 기질은 약 3mm 미만의 두께(또는 도 15에 도시된 바와 같은 '높이')를 갖는다. 선택적으로, 콜라겐 기질은 약 0.2mm 내지 약 2mm 또는 약 1mm 내지 약 1.5mm의 두께를 갖는다. 두께는, 예를 들어 도 15a에 도시된 바와 같이 콜라겐 기질층에 수직으로(예로, 접면층 표면에서 방사층 표면까지의 거리로) 측정될 수 있다. 놀랍게도, 감소된 두께 및 맞춤화된 기계적 손상의 콜라겐 기질은 생존 세포 및 인자의 기질을 제공하는 그 능력을 보유하면서 관절경에 의해 투여되고 부상을 입은 조직 부위에 쉽게 맞춰질 수 있는 가요성 연골 제품을 제공할 수 있다.
하나의 구현예에서, 콜라겐 기질은 약 0.5cm2 내지 약 5cm2의 면적을 갖는 표면적(예로, 위 표면 또는 아래 표면, 예컨대 각각 접면층 또는 방사층의 표면)을 갖는다. 선택적으로, 콜라겐 기질은 약 3mm 미만 또는 약 2mm 미만(예로, 1mm 내지 약 1.5mm)의 두께로 구분되는 위 표면 및 아래 표면을 갖는다.
하나의 구현예에서, 콜라겐 기질은 둥근형(예로 타원형 또는 원형), 직사각형 또는 사각형으로 제공된다. 둥근 콜라겐 기질을 포함하는 연골 제품의 하나의 예가 도 15에 도시된다. 선택적으로, 콜라겐 기질의 폭(본원에서 형태와 무관하게 '지름'으로 불림)은, 예로 도 15에 도시된 바와 같이 높이(본원에서 '두께'로 불림)보다 크다.
하나의 구현예에서, 콜라겐 기질은 판이다, 즉, 콜라겐 기질 표면(예로 위 또는 아래 표면)의 지름(또는 폭)은, 예로 도 15에 도시된 바와 같은 콜라겐 기질의 두께(또는 외측 표면의 높이)보다 크다. 선택적으로, 개구는 위 표면, 아래 표면 또는 둘 다에 제공된다.
하나의 구현예에서, 비개질 콜라겐 기질(예로, 단리된 관절 연골 표본)에 비해, 콜라겐 기질은 증강된 가요성(예로 감소된 전단 계수)을 갖지만 연골의 기계적 특성을 보유한다. 이러한 특성(예로, 압축 강도, 영률)의 예는 MANSOUR("Biomechanics of Cartilage" Ch 5; 인터넷 URL: http://ww.cartilagehealth.com/images/artcartbiomech.pdf로부터 얻을 수 있음)에 기재되어 있다.
하나의 구현예에서, 콜라겐 기질은 가요성이며(예로 파단 없이 접힐 수 있는 정도임) 약 0.1MPa, 0.2MPa, 0.3MPa, 또는 0.4MPa 중 적어도 임의의 영률을 포함한다.
기계적 손상
하나의 구현예에서, 본 발명의 연골 제품은 기계적 손상을 포함한다. 기계적 손상은 콜라겐 기질에서의 임의의 개별 불연속성일 수 있다.
하나의 구현예에서, 개별 불연속성은 조직 제거 유형이다(예로, 도 18 내지 도 21에 도시된 바와 같음). 조직 제거 유형의 유용한 기계적 손상에는 나선형 커팅, 홈, 교차 홈, 방사 커팅, 개구 및 후프 형성 코어 커팅(예로, 단일 또는 다중 후프 형성 커팅)이 포함된다. 또 다른 구현예에서, 개별 불연속성은 조직 비제거 유형이다(예로, 도 17에 도시된 바와 같음). 조직 비제거 유형의 유용한 기계적 손상에는 새김줄(예로 도 17a에서), 나선형 커팅, 교차 새김줄, 방사 새김줄(예로, 도 17b에서), 및 피어싱(예로 박층, 실린더형, 뿔형 물체가 부여된 복수의 피어싱)이 포함된다.
하나의 구현예에서, 개별 불연속성은 콜라겐 기질의 전체 두께에 걸쳐 제공된다(예로, 도 17b, 도 17c, 및 도 19 내지 도 21에 걸쳐 도시된 바와 같음). 또 다른 구현예에서, 개별 불연속성은 콜라겐 기질의 전체 두께보다 적게 제공된다(예로, 도 17a 및 도 18에 도시된 바와 같음).
하나의 구현예에서, 기계적 손상은 부분적 기계적 손상이다, 즉 콜라겐 기질은 비개질 콜라겐 개질에 비해 실질적으로 그 형태를 보유한다(예로 도 15 내지 도 21에 도시된 바와 같음). 또 다른 구현예에서, 기계적 손상은 완전한 손상이다(예로, 콜라겐 기질이, 예로 복수의 고형 절편, 점성 형태 또는 무정형 형태로 분쇄된다).
나선형 커팅
하나의 구현예에서, 본 발명의 연골 제품은 나선형 커팅 콜라겐 기질을 포함한다. 나선형 커팅은 콜라겐 기질을 둘러싸거나 다른 방식으로 일주하며 완전한 1회전을 초과하여 포함하는 임의의 연속성 커팅일 수 있다. 선택적으로, 나선형 커팅은, 예로 도 17, 도 20 및 도 21에 도시된 바와 같이 콜라겐 기질의 전체 두께를 통해 연장된다
하나의 구현예에서, 나선형 커팅은, 예로 도 17에 도시된 바와 같이 조직 비제거 유형으로 제공된다. 또 다른 구현예에서, 나선형 커팅은, 예로 도 20 및 21에 도시된 바와 같이 조직 제거 유형으로 제공된다. 선택적으로, 조직 비제거 유형의 나선형 커팅 콜라겐 기질은 콜라겐 기질에 대해 실질적으로 더 작은 면적인(예로 90% 이하) 공극(예로, 환자에서 제거된 연골 결손부)에 맞도록 구성될 수 있다(예로, 지름 2cm의 나선형 커팅 콜라겐 기질판은 이것이 지름 약 1.8cm로 압착 및 수축될 수 있도록 구성된다).
하나의 구현예에서, 나선형 커팅은 적어도 2회전, 적어도 3회전, 적어도 4회전, 또는 적어도 5회전을 포함한다. 예를 들어, 도 17, 도 20 및 도 21은 3회전을 갖는 나선형 커팅을 포함하는 콜라겐 기질을 도시한다.
하나의 구현예에서, 나선형 커팅은 비분기형(예로, 도 20에 도시된 바와 같음) 또는 분기형(예로, 도 21에 도시된 바와 같음)이다.
개구
하나의 구현예에서, 본 발명의 연골 제품은 복수의 개구를 갖는 콜라겐 기질을 포함한다. 복수의 개구는 연골의 가요성을 증가시키고 세포와 인자가 이동할 수 있는 복수의 통로를 제공하는 임의의 방식으로 구성될 수 있다.
개구는 콜라겐 기질의 임의의 표면을 통해 제공될 수 있고, 콜라겐 기질을 통해 부분적으로(강에서와 같이) 또는 전체적으로(채널에서와 같이) 연장될 수 있다. 예를 들어, 도 15에 도시된 바와 같이, 개구는 위 표면, 아래 표면, 또는 둘 다를 통해 제공될 수 있다.
본 발명에 따르면, 콜라겐 기질의 개구는 하기 기술적 특징 중 하나 이상을 제공한다:
- 가요성 연골 제품;
- 고정이 우수한 연골 제품; 및
- 중간엽 줄기 세포(MSCs) 및 연골세포의 이동을 촉진하는 연골 제품
하나의 구현예에서, 복수의 개구가 구성되어 콜라겐 기질에 가요성을 부여한다. 개구의 밀도 및 크기를 변화시킴으로써, 당업자는 본 발명에 따른 가요성 콜라겐 기질을 제조할 수 있다. 선택적으로, 복수의 개구는 약 0.25mm 내지 약 1.5mm, 예컨대 약 0.5mm 내지 약 1.5mm(예로, 약 1mm)의 지름을 갖는다. 선택적으로, 콜라겐 기질은 cm2 당 약 10 내지 약 500개 개구, 예컨대 cm2 당 약 10 내지 약 100개 개구 또는 cm2 당 약 10 내지 약 60개 개구(예로, cm2 당 약 36개 개구)의 개구 밀도를 포함한다. 선택적으로, 콜라겐 기질은 상기 표면의 전체 면적 대비 약 3% 내지 약 90%(예로, 약 5% 내지 약 50% 또는 약 10% 내지 약 50%)의 전체 개구 면적을 갖는 위 또는 아래 표면을 포함한다. 예를 들어, 약 1mm의 지름을 갖는 개구를 cm2 당 36개 개구로 갖는 콜라겐 기질은 표면의 전체 면적 대비 약 28%의 개구 면적을 갖는다.
복수의 개구는 선택적으로 개선된 고정을 부여한다. 개구는 콜라겐 기질의 표면적을 증가시키고 더 우수한 접착을 제공할 수 있다, 예를 들어 접착제(예로, 원섬유 글루, 예컨대 Tisseel)의 적용 시 고정을 촉진하거나 연골 제품이 선택적으로 투여되는 대상체에서 표적 부위 내로의 더 우수한 도입을 허용할 수 있다.
복수의 개구는 선택적으로 MSCs 및 연골세포(예로, 콜라겐 기질 밖으로 이동하는 콜라겐 기질에 내인성인 공여자 세포 및 콜라겐 기질 내로 이동하는 임플란트 수신자의 세포)의 이동을 촉진한다.
하나의 구현예에서, 개구는 채널 또는 강이다. 채널은 콜라겐 기질의 두 면을 통해(예로, 위 표면 및 아래 표면을 통해) 연장되는 임의의 개구이다. 강은 콜라겐 기질의 두 면을 통해 연장되지 않는 임의의 개구이다. 선택적으로, 개구는 어레이로, 예로 2차원 어레이로 배열된다. 선택적으로, 콜라겐 기질은 하나 이상의 세포층 또는 ECM층(예로, 방사층, 접면층, 또는 이행층)을 포함하며 개구는 층(들)에 실질적으로 수직으로(즉 90°± 45°) 또는 층(들)에 비스듬히 연장되거나, 콜라겐 기질은 세포 구배를 포함하고 개구는, 예로 도 15에 도시된 바와 같이 구배를 가지고 정렬되거나 실질적으로 평행하다(즉 0°± 45°).
하나의 구현예에서, 콜라겐 기질은 약 0.3mm 내지 약 2mm, 약 0.5mm 내지 약 1.5mm, 약 0.8mm 내지 약 1.2mm, 또는 1mm에서 선택되는 지름을 갖는 복수의 개구를 포함한다.
하나의 구현예에서, 콜라겐 기질은 복수의 개구를 포함하며, 표면적의 약 3% 내지 약 90%(예로, 약 3% 내지 약 50% 또는 약 5% 내지 약 50% 또는 약 3% 내지 약 30% 또는 약 5% 내지 약 50%)가 천공된다. 예를 들어, 1mm 지름을 갖는 실린더형 개구를 cm2 당 36개 개구의 개구 밀도로 포함하는 콜라겐 기질은 콜라겐 기질의 전체 표면적 cm2 당 약 28mm2 의 천공 표면적을[(0.5mm 개구 반지름)x(ττ)x(36 pores/cm2)], 즉, 28%의 천공 표면적을 포함할 것이다.
하나의 구현예에서, 개구 크기는 콜라겐 기질의 두께 또는 개구 길이의 약 50% 내지 약 150%이다.
개구는 임의 방식, 예를 들어 드릴 또는 조직 펀치를 이용한 콜라겐 기질의 기계적 제거로 제조될 수 있다.
단편화 ECM
본 발명에 따르면, 효소적 손상("부분적 소화")이 연골 제품에 선택적으로 제공되어 단편화 ECM 단백질을 제공한다.
하나의 구현예에서, 단편화 ECM 단백질은 콜라겐(예로, II형) 단편 또는 프로테오글리칸 단편이다. 선택적으로, 콜라겐 기질은 관절 연골이다.
단편화 ECM 단백질은 임의의 방식으로 제조될 수 있다. 단편화 ECM 단백질은 선택적으로 천연 콜라겐 기질(즉, 대상체에서 단리됨)의 부분적 소화에 의해 제조된다. 선택적으로, 콜라겐 기질은 소화 효소(예로, 프로티나아제), 예컨대 콜라겐 분해 효소(예로 콜라게나아제) 또는 프로테오글리칸 분해 효소(예로 히알루니다아제)로 부분적으로 소화된다.
본 발명에 따르면, 콜라겐 기질의 부분적 소화는 하기 기술적 특징 중 하나 이상을 제공한다:
- 세포성 인자 및 생존 세포를 방출하고 이동을 허용하는 느슨한 ECM.
- 생존 천연 세포를 보유하는 천연 ECM
- 세포 및 ECM 간 생리적 상호작용의 보존
- 파편이 없는 청정 연골 제품
- 실질적으로 천연 연골의 충전 밀도를 보유하는 ECM 원섬유를 포함하는 연골 제품
- 더 큰 가요성을 갖는 연골 제품
- 대식세포를 제거하고 면역원성을 감소시킴
단편화 ECM은 세포성 인자 및 생존 세포를 방출하고 이동을 허용하는 느슨한 콜라겐 기질을 제공한다. 예를 들어, 세포성(예로, 연골발생) 인자는 대상체에 투여 시 주변 미세 환경으로 스며나올 수 있다. 본원에서 제공되는 교시로, 당업자는 이제 이러한 기술적 특징을 제공하기 위해 소화를 맞춤화할 수 있다.
하나의 구현예에서, ECM의 단편화는 상당량의 생존 천연 세포를 보유하는 양으로 제한된다. 단편화 시, 콜라겐 기질은 연골 제품의 선택적 투여 이전에 그 세포 모집단을 조기에 방출할 수 있다. 본원에서 제공되는 교시로, 당업자는 이제 이러한 기술적 특징을 제공하기 위해 소화를 맞춤화할 수 있다.
하나의 구현예에서, ECM은 세포 및 ECM간 정상 상호작용을 보존하는 방식으로 단편화된다. 예를 들어, ECM 및/또는 내부의 세포성 인자는 연골세포를 활성화한다, 즉 G0 상에서 G1 상으로의 전이를 유도하며, 또한 MSCs가 침윤하고 연골세포로 분화하는 것을 유도한다. 이론에 구애받지 않고, 본 발명자들은 이러한 기능이 치료 유효성을 증강시키는 것으로 믿는다.
하나의 구현예에서, ECM은 생물활성 인자 및 ECM 간 정상 상호작용을 보존하는 방식으로 단편화된다. 예를 들어, 생물활성 인자는 소화전 수준에 비해 약 50% 초과 또는 약 70% 초과 수준으로 보유된다.
하나의 구현예에서, ECM은 파편이 없이 연골 표본을 청정화하는 방식으로 단편화된다. 이러한 미시적 및/또는 거시적 파편(예로 ECM 단편)은 연골 표본 천공 시 더 많은 양이 존재하며, 본 기술의 연골 표본에 파편이 제거되지 않은 경우, 대상체에 투여 시 통증 및 다른 유해 반응을 유발할 수 있다.
하나의 구현예에서, ECM의 단편화는 실질적으로 천연 연골의 충전 밀도를 보유하는 단편화 ECM 원섬유를 제공하는 양으로 제한된다. 이러한 기술적 특징은 천연 연골의 기계적 특성을 갖는 연골 제품을 제공한다.
하나의 구현예에서, ECM의 단편화는 임의의(예로 각각의) 하기 기술적 특징을 갖는 콜라겐 기질을 제공하는 양으로 제한된다: 시각적으로 온전함, 가요성임(예로, 관절경에 맞도록 롤링하거나 파단 없이 접거나 굽힐 수 있는 정도임), 생존 천연 세포를 보유함, 비분해 생체인자(예로, 성장 인자)를 보유함, 및 생체인자(예로, 성장 인자) 수준을 증가시킴.
하나의 구현예에서, 연골 제품은 단편화 ECM이 없는 동일한 콜라겐 기질에 비해 단편화 ECM을 가지며 더 큰 가요성을 나타낸다. 선택적으로, 연골 제품은 연골 제품의 지름(또는 폭)의 50% 이하인 지름을 갖는 캐뉼라 내로 삽입될 수 있을 정도로 가요성이다. 예를 들어, 지름 2cm의 판 형태인 연골 제품은 이것이 관절경의 캐뉼라(약 1cm 미만의 지름을 갖는 캐뉼라) 내로 롤링할 수 있을 정도로 가요성일 수 있다.
생존 연골세포
하나의 구현예에서, 본 발명의 연골 제품은 생존 연골세포를 포함한다. 선택적으로, 연골 제품은 천연 연골 제품이며(즉 콜라겐 기질이 대상체에서 단리됨) 생존 연골세포가 천연이다, 즉 콜라겐 기질에 대해 천연이다. 생존은 임의 수단에 의해, 예로 생체 염색, 위상차 현미경 등의 이용을 통해 나타낼 수 있다.
하나의 구현예에서, 콜라겐 기질은 관절 연골에서 유래되며 관절 연골에 대해 천연인(또는 내인성인) 생존 연골세포를 포함한다. 천연 연골세포는 방사층, 이행층 및 접면층에서 선택되는 관절 연골의 하나 이상의(예로 전체) 층에 걸쳐 분포되어 있다. 본 발명은 대안적으로 외인성 또는 비천연(즉 첨가된) 연골세포를 갖는 콜라겐 기질을 고려한다. 하나의 구현예에서, 콜라겐 기질은 그 표면에 생존 연골세포를 포함한다. 선택적으로, 콜라겐 기질의 표면에서 적어도 70%의 연골세포는 생존이다. 일부 구현예에서, 연골 제품은 적어도 약 50%의 생존 세포, 대안적으로 적어도 60%의 생존 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 연골 제품은 적어도 약 70%의 생존 세포, 대안적으로 약 75%의 생존 세포, 대안적으로 약 80%의 생존 세포를 포함한다.
표면 생존 세포 백분율은, 예를 들어 현미경 기법에 의해 정량될 수 있다.
하나의 구현예에서, 일부 연골세포는 G0 상이다. 이론에 구애받지 않고, 본 발명자들은 ECM 또는 ECM 인자가 연골세포를 활성화하는 것으로 믿는다. 상기 활성화는 G0 상에서 G1 상으로의 전이로 관찰될 수 있다.
연골세포는 연골발생 및 연골 보수를 촉진하는 인자를 발현하는 것에 부가하여 연골 기질 항상성의 유지에 중요한 것으로 여겨진다. 이론에 구애받지 않고, 본 발명자들은 천연 관절 연골의 세포 및 구조 조직의 보존에 의해 더 우수한 치료 제품이 수득된다고 믿는다.
이론에 구애받지 않고, 본 발명자들은 본 발명의 연골 제품의 콜라겐 기질이 연골세포의 생존을 보존하고 이들의 생체외(수신자 대상체에서를 포함) 수명을 연장하는 것으로 믿는다. 또한, 수신자 대상체에 투여 시 콜라겐 기질은 수신자의 MSCs가 콜라겐 기질(연골 제품의)을 침윤하고 연골세포로 분화하는 것을 유도하여 연골 제품을 연골세포로 보충할 수 있다고 여겨진다.
실시예 10에 상세히 나타낸 바와 같이, 본 발명의 연골 제품은 부분적 소화 및 동결보존 이후에도 상당량의 생존 연골세포를 함유할 수 있다. 상당량의 생존 연골세포는 존재하는 경우, 연골 제품의 치료 유효성을 증강시키는 양이다.
생물활성 인자
하나의 구현예에서, 본 발명의 연골 제품은 생물활성 인자를 포함한다. 선택적으로, 생물활성 인자는 연골발생 인자를 포함한다. 선택적으로, 연골발생 인자에는 하나 이상의(예로 각각의) TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, BMP-2, BMP-7, bFGF, 및 IGF-1이 포함된다.
선택적으로, 연골은 II형 콜라겐, 히알루로난, 및 아그레칸을 포함하는 세포외 기질을 포함한다.
선택적으로, 연골은 전사 인자, 예로 Sox5, Sox6, 및 Sox9를 포함한다.
하나의 구현예에서, 연골 제품은 TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, BMP-2, BMP-7, bFGF, IGF-1, II형 콜라겐, 히알루로난, 아그레칸, Sox5, Sox6, 및 Sox9를 포함한다.
하나의 구현예에서, 콜라겐 기질은 천연 콜라겐 기질이며 생물활성 인자는 콜라겐 기질에 대해 천연이다.
실시예 16에 상세히 나타낸 바와 같이, 본 발명의 연골 제품은 부분적 소화 및 동결보존 이후에도 생물활성 인자(예로, 연골발생 인자)를 함유할 수 있다. 부가적으로 또는 대안적으로, 본 발명의 연골 제품은 생체내 또는 시험관내 배양되는 경우 생물활성 인자를 방출할 수 있다. 연골 제품에서 주어진 인자의 양은 조직 용해액 분석에 의해, 예로 실시예 16에 상세히 나타낸 바와 같이 결정될 수 있다. 연골 제품에서 방출되는 인자의 양은 배양 분석에 의해, 예로 실시예 16에 상세히 나타낸 바와 같이 결정될 수 있다. 예를 들어, 실시예 16 및 표 4에 상세히 나타낸 바와 같이, 본 발명의 연골 제품은 하기 기술적 특징 중 하나 이상(예로 각각)을 가질 수 있다:
a. TGF-β1을 적어도 약 11pg/cm2, 예를 들어 약 11 내지 약 628pg/cm2의 양으로 포함함.
b. TGF-β3을 적어도 약 4pg/cm2, 예를 들어 약 4 내지 약 112pg/cm2의 양으로 포함함.
c. BMP-7을 적어도 약 3pg/cm2, 예를 들어 약 3 내지 약 23pg/cm2의 양으로 포함함.
d. bFGF를 적어도 약 169pg/cm2, 예를 들어 약 169 내지 약 365pg/cm2의 양으로 포함함.
e. IGF-1을 적어도 약 111pg/cm2, 예를 들어 약 111 내지 약 779pg/cm2의 양으로 포함함.
f. 배양 시, 연골 제품이 TGF-β1을 적어도 약 2617pg/cm2, 예를 들어 약 2617 내지 약 17818pg/cm2의 양으로 방출함.
g. 배양 시, 연골 제품이 TGF-β2를 적어도 약 133pg/cm2, 예를 들어 약 133 내지 약 623pg/cm2의 양으로 방출함.
h. 배양 시, 연골 제품이 IGF-1을 적어도 약 14pg/cm2, 예를 들어 약 14 내지 약 2842pg/cm2의 양으로 방출함.
이론에 구애받지 않고, 본 발명자들은 연골 제품에 의해 촉진되는 바와 같이, 효율적인 연골 보수에 중요한 것이 세포외 기질 생성을 매개하고 연골발생을 생체내 촉진하는 성장 인자, 연골발생 인자 및 다른 생물활성 인자인 것으로 믿는다. 예를 들어, TGF-β1-3은 연골발생 분화를 촉진하고 콜라겐 발현을 조절한다; BMP-2 및 BMP-7은 MSCs의 연골발생을 유도하고 연골세포에 의한 ECM 생성을 촉진한다; bFGF는 연골세포의 증식을 자극한다; IGF-1은 ECM 합성을 유도한다; 그리고 ECM(콜라겐, 히알루로난, 및 아그레칸)은 연골발생의 기계적 조절을 매개한다.
제형
본 발명에 따르면, 연골 제품은 선택적으로 동결보존 매질과 함께 제형화된다.
하나의 구현예에서, 동결보존 매질은 하나 이상의 세포 투과 동결보존제, 하나 이상의 비세포 투과 동결보존제 또는 이들의 조합을 포함한다.
선택적으로, 동결보존 매질은 비제한적으로 예를 들어 DMSO, 글리세롤, 글리콜, 프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜 또는 이들의 조합에서 선택되는 하나 이상의 세포 투과 동결보존제를 포함한다.
선택적으로, 동결보존 매질은 비제한적으로 예를 들어 폴리비닐피롤리돈, 히드록시에틸 전분, 다당류, 단당류, 당 알코올, 알기네이트, 트레할로오스, 라피노오스, 덱스트란, 또는 이들의 조합에서 선택되는 하나 이상의 비세포 투과 동결보존제를 포함한다.
유용한 동결보존제의 다른 예는 "Cryopreservation" (BioFiles Volume 5 Number 4-Sigma-Aldrich® 데이터시트)에 기재되어 있다.
하나의 구현예에서, 동결보존 매질은 세포 투과 동결보존제를 포함하며, 세포 투과 동결보존제의 대부분은 DMSO이다. 선택적으로, 동결보존 매질은 상당량의 글리세롤을 포함하지 않는다.
하나의 구현예에서, 동결보존 매질은, 예로 약 1부피% 내지 약 50부피%의 DMSO(예로, 약 10부피%)의 양으로 DMSO를 포함한다.
하나의 구현예에서, 동결보존 매질은 알부민(예로, HSA 또는 BSA), 전해질 용액(예로 Plasma-Lyte, PBS 또는 식염수), 또는 이들의 조합과 같은 추가 성분을 포함한다.
하나의 구현예에서, 동결보존 매질은 1중량% 내지 약 20중량%의 알부민(예로 HSA) 및 약 1부피% 내지 약 50부피%의 동결보존제(예로 약 10부피%), 예컨대 DMSO를 포함한다.
비면역원성
하나의 구현예에서, 연골 제품은 실질적으로 비면역원성이다.
본 발명의 연골 제품은 면역원성을 감소시키는 하나 이상의 기술적 특징을 갖는다. 이러한 기술적 특징의 예에는 하기가 포함된다:
- 비격리 세포의 부재
- 면역격리된 MSC 세포의 존재 및 저수준의 순환 면역원성 세포(예로, 대식세포) 및 TNF-α.
- 동결보존에 의한 선택적 사멸
본원에서 교시된 바와 같이, 본 발명의 특정 구현예는 콜라겐 기질로부터 유래한 연골세포와 같은 생존 세포를 갖는 콜라겐 기질을 포함한다. 본 발명은 또한 기질에 부가된 연골세포와 같은 비천연 세포를 갖는 연골 제품을 고려한다. 외인성(및 내인성) 연골세포는 면역원성의 잠재적 원천이지만, 본 발명의 연골 제품은 놀랍게도 면역원성이 낮거나 없다. 이론에 구애받지 않고, 본 발명자들은 콜라겐 기질에 임베딩된 연골세포(특히 천연 연골세포)가 연골세포가 투여되는 대상체에서 주변 환경으로부터 보다 효과적으로 격리되어 면역원성을 감소시키는 것으로 믿는다.
하나의 구현예에서, 연골 제품은 감소된 수준의 순환 면역원성 세포 및 TNF-α를 갖는다. 선택적으로, 이러한 연골 제품은 실질적으로 지질다당질(LPS)에 대한 반응이 없다. 이러한 연골 제품은, 예를 들어 세척/헹굼, 소화, 동결보존 또는 이들의 임의 조합의 제조 단계를 수행하여 제공될 수 있다.
제조
연골 제품은 임의 방식으로 제조될 수 있다. 하나의 구현예에서, 본 발명은 연골 표본을 제공하고 연골 표본을 손상시키는 것을 포함하는 연골 제품의 제작("제조") 방법을 제공한다. 연골 표본의 손상 단계는 기계적 손상, 효소적 손상("부분적 소화"), 또는 기계적 손상과 부분적 소화를 모두 포함한다.
하나의 구현예에서, 방법은 연골 표본 연골아래 뼈, 석회화된 연골, 또는 연골아래 뼈와 석회화된 연골 모두에서의 제거를 포함한다.
하나의 구현예에서, 방법은 상기 천공 및 부분적 소화 단계 이후 연골 표본의 동결보존을 포함한다. 선택적으로, 동결보존 단계는 생존 세포를 보존하는 방식의 동결보존을 포함한다.
하나의 구현예에서, 부분적 소화 단계는 상당량의 생존 세포를 보유하는 방식으로 수행된다.
하나의 구현예에서, 연골 표본은 연골 표본의 가요성을 증가시키는 정도까지 기계적으로 손상된다.
하나의 구현예에서, 연골 표본의 가공은 상당량의 열을 생성하지 않는 방식으로 수행된다. 선택적으로, 연골 조직의 커팅은 저속 톱 또는 드릴 및/또는 조직 펀치의 이용을 포함한다.
하나의 구현예에서, 공정은 연골 표본의 냉각을(예로 연속적으로 또는 주기적으로) 포함한다.
연골 표본
연골 표본은 임의 원천에서 수득될 수 있으며, 임의 형태, 두께 및 표면적으로 제공될 수 있다. 선택적으로, 원천은 대상체, 예컨대 인간 대상체이다. 선택적으로, 원천은 시체이다.
하나의 구현예에서, 연골 표본은 II형 콜라겐을 포함하는 임의의 연골 표본이다. 선택적으로, 연골 표본은 히알린 연골, 섬유연골, 및 탄성 연골에서 선택된다.
하나의 구현예에서, 연골 표본은 히알린 연골을 포함한다. 선택적으로, 연골 표본은 관절 연골 표본이다(예로 공여자 뼈에서 수득됨). 선택적으로, 연골 표본은 연골아래 뼈 및/또는 석회화된 연골에서 단리된다(즉, 분리된다). 연골은 뼈연골 플러그(plug)의 형태로 연골 표본을 제거(예로 조직 펀치를 이용)한 후 연골아래 뼈에서 분리될 수 있거나 연골은 공여자 뼈에 존재하는 동안 연골아래 뼈에서 직접 분리될 수 있다(예로 공여자 뼈에서 연골 슬라이스를 잘라냄). 다른 유용한 히알린 연골에는 코 연골, 기관 연골, 및 후두 연골이 포함된다
하나의 구현예에서, 연골 표본은 관절 연골이다. 관절 연골은 임의의 공여자 뼈에서 수득될 수 있다. 선택적으로, 연골 표본은 긴 뼈, 예컨대 넙다리뼈, 정강뼈, 종아리뼈, 위팔뼈, 자뼈, 노뼈, 또는 짧은 뼈, 예컨대 손 또는 발의 뼈(예로, 목말뼈), 납작뼈, 예컨대 골반 뼈(예로, 절구), 불규칙형 뼈, 예컨대 척추 및 종자 뼈에서 수득된다. 관절 연골은 임의 뼈의 관절융기에서 수득될 수 있다. 선택적으로, 연골 표본은 플러그(plug)(예로, 1cm 또는 2cm 플러그)로 수득된다. 선택적으로, 연골 표본은 연골아래 뼈 및/또는 석회화된 연골에서 제거된다.
하나의 구현예에서, 연골 표본은 섬유연골을 포함한다. 선택적으로, 연골 표본은 두덩 결합, 섬유 테, 추간판, 반달연골 및 턱 관절에서 선택되는 원천에서 수득된다.
하나의 구현예에서, 연골 표본은 탄성 연골을 포함한다. 선택적으로, 연골 표본은 귀, 후두, 후두개에서 선택되는 원천에서 수득된다.
하나의 구현예에서, 연골 표본은 포유류, 유제류, Sus 속 개체, 돼지, 영장류, 고등 영장류, 또는 인간에서 수득된다.
하나의 구현예에서, 연골 표본은 두께에 대해 스크리닝된다. 선택적으로, 두께는 0.2mm 내지 약 2.0mm, 예컨대 약 1mm 내지 약 1.5mm이다. 예를 들어, 최소 두께보다 얇은 연골 표본은 폐기될 수 있는 반면 최대 두께보다 두꺼운 연골 표본은 크기를 낮추도록 손질된다. 놀랍게도 연골 표본의 두께를 감소시키고 연골 표본을 천공함으로써, 생존 세포 및 생물활성 인자의 기질을 제공하는 능력을 보유하면서 부상을 입은 조직 부위에 쉽게 맞춰지는 가요성 연골 제품이 수득된다.
하나의 구현예에서, 콜라겐 표본은 약 0.5cm2 내지 약 5cm2의 면적을 갖는 표면(예로 상부("위") 또는 하부("아래") 표면)을 갖는다. 선택적으로, 콜라겐 표본은 약 2mm 미만(예로 1mm 내지 약 1.5mm)의 두께로 분리되는 상부 표면 및 하부 표면을 갖는다.
하나의 구현예에서, 콜라겐 표본은 둥근형(예로 타원형 또는 원형), 직사각형 또는 사각형으로 제공된다.
하나의 구현예에서, 연골 표본의 수득은, 예로 냉각 용매, 저온실, 저온 플레이트를 이용하는 표본의 냉각을 포함한다. 하나의 구현예에서, 표본의 수득은, 예로 저속 톱을 이용하여 상당량의 열을 생성하지 않는 단리를 포함한다. 일부 구현예에서, 냉각은 빙수조의 이용을 포함한다.
기계적 손상
본 발명의 연골 제품의 제조 방법은 선택적으로 연골 표본의 기계적 손상 단계를 포함한다. 기계적 손상 단계는 콜라겐 기질에 개별 불연속성을 부여하는 임의 방식으로 수행될 수 있다.
기계적 손상의 유용한 방법에는 커팅(예로, 조직 제거 없는 새김줄 또는 조직 제거를 포함하는 커팅), 홈 형성, 천공, 피어싱, 및 분쇄가 포함된다.
하나의 구현예에서, 기계적 손상은 조직 제거를 포함한다(예로, 도 18 내지 도 21에 도시된 제품). 조직 제거 유형의 유용한 기계적 손상에는 나선형 커팅, 홈, 교차 홈, 개구 및 후프 형성 코어 커팅이 포함된다. 또 다른 구현예에서, 기계적 손상은 상당량의 조직 제거가 없는 불연속성의 제공(예로 도 17에 도시된 바와 같음)을 포함한다. 조직 비제거 유형의 유용한 기계적 손상에는 새김줄, 나선형 커팅, 교차 새김줄 및 피어싱이 포함된다.
하나의 구현예에서, 기계적 손상은 콜라겐 기질의 전체 두께에 걸쳐 개별 불연속성을 제공하는 방식으로 수행된다(예로, 도 17b, 도 17c 및 도 19 내지 도 21에 도시된 바와 같음). 또 다른 구현예에서, 기계적 손상은 콜라겐 기질의 전체 두께보다 적게 개별 불연속성을 제공하는 방식으로 수행된다(예로, 도 17a 및 도 18에 도시된 바와 같음).
하나의 구현예에서, 기계적 손상은 부분적 기계적 손상이다, 즉 콜라겐 기질은 비개질 콜라겐 개질에 비해 실질적으로 그 형태를 보유한다(예로 도 15 내지 도 21에 도시된 바와 같음). 또 다른 구현예에서, 기계적 손상은 완전한 손상이다(예로, 콜라겐 기질이, 예로 복수의 고형 절편, 점성 형태 또는 무정형 형태로 분쇄된다).
천공
본 발명의 연골 제품의 생산 방법("제조 방법")은 선택적으로 연골 표본의 천공 단계를 포함한다. 천공은 연골의 가요성을 증가시키고 세포 및 인자가 이동할 수 있는 복수의 통로를 제공하는 임의 방식으로 수행될 수 있다.
하나의 구현예에서, 연골은 레이저 천공 또는 기계적 천공을 이용하여 천공된다.
하나의 구현예에서, 연골은 기계적 천공을 이용하여 천공된다. 선택적으로, 기계적 천공은 드릴링, 펀칭, 수압 천공(예로 고압 유체 드릴링) 또는 이들의 조합에 의해 제공된다. 선택적으로, 연골은 단일 펀치 또는 다중 펀치 장치를 이용해서 천공된다.
하나의 구현예에서, 연골 표본은 연골 표본의 가요성을 증가시키는 정도까지 천공된다. 선택적으로, 연골 표본은 약 0.25mm 내지 약 2mm(예로 약 0.25mm 내지 약 1.5mm 또는 약 0.5mm 내지 약 1.5mm) 지름을 갖는 개구를 제공하도록 천공된다. 선택적으로, 연골 표본은 cm2 당 약 10 내지 약 400개 개구, 예컨대 cm2 당 약 10 내지 약 100개 개구 또는 cm2 당 약 20 내지 약 60개 개구(예로, cm2 당 약 36개 개구)를 제공하도록 천공된다. 선택적으로, 연골 표본은 연골층을 포함하며, 개구는 연골층의 대부분(예로, 전체)에 걸쳐 통과한다.
하나의 구현예에서, 연골 표본은 연골 표본의 표면적 cm2 당 약 10mm2 내지 약 50mm2의 천공 표면적의 정도까지 천공된다. 예를 들어, 1mm 지름을 갖는 실린더형 개구를 cm2 당 36개 개구의 개구 밀도로 포함하는 콜라겐 기질은 cm2 당 약 28mm2의 천공 표면적을 포함할 것이다[(0.5mm 개구 반지름) (x) (π)(36개 개구/cm2)].
하나의 구현예에서, 연골 표본의 천공은, 예로 냉각 용매 및/또는 저온실 또는 저온 플레이트를 이용한 표본의 냉각을(예로 연속적으로 또는 주기적으로) 포함한다. 하나의 구현예에서, 연골 표본의 천공은, 예로 저속 드릴 또는 조직 펀치를 이용해서 상당량의 열을 생성하지 않는 연골 표본의 천공을 포함한다.
소화
본 발명의 연골 제품은 선택적으로, 예로 프로티나아제 또는 프로테오글리칸 소화 효소와 같은 소화 효소를 이용하여 연골 표본을 부분 소화하여 제조된다.
본 발명의 제조 방법에 따르면, 부분적 소화 단계는 연골 표본의 ECM을 개질하며, 하기 기술적 특징 중 하나 이상을 제공하는 방식으로 수행될 수 있다:
- 세포성 인자 및 생존 세포를 방출하고 이동을 허용하는 느슨한 ECM.
- 생존 천연 세포를 보유하는 천연 ECM
- 세포 및 ECM 간 생리적 상호작용의 보존
- 파편이 없는 청정 연골 제품
- 실질적으로 천연 연골의 충전 밀도를 보유하는 ECM 원섬유를 포함하는 연골 제품
- 더 큰 가요성을 갖는 연골 제품
- 대식세포를 제거하고 면역원성을 감소시킴
하나의 구현예에서, 부분적 소화 단계는, 예로 콜라겐 내에 펩티드 결합을 절단하여 ECM을 느슨하게 하는 방식으로 수행된다. 느슨한 ECM은 세포성 인자 및 생존 세포를 방출하고 이동을 허용한다. 예를 들어, 생물-(예로, 연골발생) 인자는 대상체에 투여 시 주변 미세 환경으로 스며나올 수 있다. 본원에서 제공되는 교시로, 당업자는 이제 이러한 기술적 특징을 제공하기 위해 소화를 맞춤화할 수 있다.
하나의 구현예에서, 부분적 소화 단계는, 예를 들어 세포 보존량으로 소화를 제한하여 상당량의 생존 천연 세포를 보유하는 방식으로 수행된다. 본원에서 제공되는 교시로, 당업자는 이제 이러한 기술적 특징을 제공하기 위해 소화를 맞춤화할 수 있다.
하나의 구현예에서, 부분적 소화 단계는 세포 및 ECM 간 정상 상호작용을 보존하는 방식으로 수행된다. 예를 들어, ECM 및/또는 내부의 세포성 인자는 연골세포를 활성화한다, 즉 G0 상에서 G1 상으로의 전이를 유도하며, 또한 MSCs가 침윤하고 연골세포로 분화하는 것을 유도한다. 이론에 구애받지 않고, 본 발명자들은 이러한 기능이 치료 유효성을 증강시키는 것으로 믿는다.
하나의 구현예에서, 부분적 소화 단계는 연골 표본의 파편을 제거하는 방식으로 수행된다. 이러한 미시적 및/또는 거시적 파편(예로 ECM 단편)은 연골 표본 천공 시 더 많은 양이 존재하며, 본 기술의 연골 표본에서 파편이 제거되지 않은 경우, 대상체에 투여 시 통증 및 다른 유해 반응을 유발할 수 있다.
하나의 구현예에서, 부분적 소화 단계는 실질적으로 천연 연골의 충전 밀도를 보유하는 단편화 ECM 원섬유를 제공하는 방식으로 수행된다. 예를 들어, 부분적 소화는 연골 표본의 구조적 온전성을 파괴하지 않는 양으로 제한될 수 있다. 이러한 기술적 특징은, 예를 들어 장기 지속, 체중 지지 연골 그라프트를 제공하기 위해 천연 연골의 기계적 특성을 갖는 연골 제품을 제공한다.
하나의 구현예에서, 부분적 소화 단계는 연골 제품에 가요성을 부여하는 방식으로 수행된다.
하나의 구현예에서, 연골 표본은 콜라겐 소화 효소(예로 콜라게나아제 또는 카텝신) 또는 프로테오글리칸 소화 효소(예로 히알루로니다아제, 아그레카나아제, 또는 파파인)를 이용하여 소화된다. 선택적으로, 연골 표본은 세포-기질 상호작용을 보유하는 방식으로 소화된다. 예를 들어, 트립신 소화는 전형적으로 다른 경우 트립신의 작용을 저해하는 마그네슘 및 칼슘을 격리시키는 EDTA와 같은 킬레이터로 수행된다. 이러한 킬레이터는 기질에서 세포를 해리시킬 수 있다. 실제로 트립신 자체는 세포가 부착하거나 결합하는 기질 단백질을 절단할 수 있다. 따라서, 본 발명의 하나의 구현예는 연골세포와 같은 천연 세포를 보유하는 방식으로 연골 표본을 부분적으로 소화시킬 수 있는 비해리성 소화의 이용을 고려한다.
하나의 구현예에서, 부분적 소화 단계는 연골 표본(예로, 관절 연골)에서의 콜라겐 II의 소화를 포함한다. II형 콜라겐 기질의 부분적 소화에 유용한 소화 효소에는 콜라게나아제(예로 II형, 임의의 콜라게나아제 I - Ⅳ, 및 박테리아 콜라게나아제), 다른 엔도펩티다아제(예로 트립신, 파파인, 펩신) 및 엑소펩티다아제(예로 카르복시펩티다아제)가 포함된다..
하나의 구현예에서, 부분적 소화는 비효소적 소화, 예를 들어 증기 기반, 산 기반 또는 발효 기반 소화를 포함한다. 선택적으로, 비효소적 소화는 기계적 소화, 예로 부분적 분쇄 또는 발효 기반 소화이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 연골 제품은 소화되지 않는다. 다른 구현예에서, 본 발명의 연골 제품은 효소적(예로, 콜라게나아제, 프로나아제, 프로티나아제 K 등의 처리), 생화학적(예로 파파인), 열적(예로 증가된 열), 화학적(케라틴 설페이트, 토실리실클로로메탄), 기계적(천공), 당업자에게 공지된 임의의 다른 소화 수단, 및 상기의 임의의 둘 이상의 조합을 포함하는 소화 수단에 의해 부분적으로 소화된다.
동결보존
본 발명의 연골 제품은 신선하게 이용될 수도 있고 일정 시기 동안 보존될 수도 있다. 선택적으로, 연골 제품은 냉동-해동 사이클을 거친다, 즉 동결보존된 후 해동된다.
하나의 구현예에서, 연골 제품은 동결보존된다. 연골 제품은 동결보존 매질 중 냉동 온도(예로 -80℃±5℃)에서 인큐베이션에 의해 동결보존될 수 있다.
하나의 구현예에서, 동결보존은 제어되는 냉동 방법을 포함할 수 있다, 즉 연골 제품은 실온 및 -80℃의 하나 이상의 중간 온도에서 유지된다. 동결보존은, 예를 들어 연골 제품을 4℃에서 30분 내지 24hrs(예로 약 30 내지 약 90분) 동안 인큐베이션한 뒤, 연골 제품을 약 -20℃ 내지 약 -40℃(예로 약 -30℃)에서 약 20분 내지 약 12hrs(예로 약 20 내지 약 60분) 동안 인큐베이션하고, 이어서 예를 들어 약 4℃/분 내지 약 -80℃/분의 속도로 온도를 감소시켜 사용 전까지 -80℃에서 인큐베이션하는 것을 포함할 수 있다. 대안적으로, 연골 제품은 -80℃에서 신속 냉동되거나 액체 질소 중에 급속 냉동될 수 있다.
이어서 연골 제품은 사용을 위해 해동될 수 있다. 선택적으로, 연골 제품은 냉동-해동 사이클 이후 세포 생존이 놀랍게도 잘 보유되는 방식으로 동결보존된다.
하나의 구현예에서, 동결보존은 하나 이상의 세포 투과 동결보존제, 하나 이상의 비세포 투과 동결보존제 또는 이들의 조합을 포함하는 동결보존 매질 중의 보관을 포함한다. 선택적으로, 동결보존 매질은 DMSO, 글리세롤, 글리콜, 프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜 또는 이들의 조합에서 선택되는 하나 이상의 세포 투과 동결보존제를 포함한다. 선택적으로, 동결보존 매질은 폴리비닐피롤리돈, 히드록시에틸 전분, 다당류, 단당류, 당 알코올, 알기네이트, 트레할로오스, 라피노오스, 덱스트란 또는 이들의 조합에서 선택되는 하나 이상의 비세포 투과 동결보존제를 포함한다. 유용한 동결보존제의 다른 예는 "Cryopreservation" (BioFiles Volume 5 Number 4-Sigma-Aldrich® 데이터시트)에 기재되어 있다.
하나의 구현예에서, 동결보존 매질은 세포 투과 동결보존제를 포함하며, 세포 투과 동결보존제의 대부분은 DMSO이다.
하나의 구현예에서, 동결보존 매질은 DMSO를, 예로 약 1부피% 내지 약 50부피%의 DMSO를 포함한다(예로 약 10부피%).
하나의 구현예에서, 동결보존 매질은 알부민(예로 HSA 또는 BSA), 전해질 용액(예로 Plasma-Lyte), 또는 이들의 조합과 같은 추가적 성분을 포함한다.
하나의 구현예에서, 동결보존 매질은 1중량% 내지 약 20중량%의 알부민 및 약 1부피% 내지 약 50부피%의 동결보존제(예로, 약 10부피%)를 포함한다. 선택적으로, 동결보존제는 DMSO를 포함한다(예로, 다량으로).
항균 처리
본 발명의 연골 제품은 선택적으로 오염 미생물 위험성(bioburden)을 감소시키기 위해 하나 이상의 항균 용액으로 처리된다. 선택적으로, 연골 제품은 항생제로 처리된다(예로 그 중에 인큐베이션된다). 선택적으로, 연골 제품은 포비돈-요오드로 처리된다(예로 닦여진다).
일부 구현예에서, 연골 제품은 항생제로 처리되며, 항생제는 겐타마이신 설페이트(Abraxis Pharmaceutical Products, Schaumburg, IL), 반코마이신 HCl(Hospira Inc., Lake Forest, IL), 및/또는 암포테리신 B(Sigma Aldrich, St. Louis MO)이다.
선택적으로, 연골 제품은 살진균 용액으로 처리된다.
세포, 생존 및 연골발생 인자의 스크리닝
하나의 구현예에서, 연골 제품은 연골세포, 세포 생존 및 하나 이상의 구조적 또는 기능적 성분, 예컨대 생물활성 인자 및 다른 ECM 성분(예로, 연골발생 인자)에 대해 스크리닝된다.
본 발명자들의 식견을 통해, 특정 성분이 치료 유효성과 연관됨을 발견하였다.
하나의 구현예에서, 스크리닝되는 성분에는 표 4에 기재된 하나 이상의 생물활성 인자, 생존 연골세포의 존재, 또는 이들의 조합이 포함된다.
기타
하나의 구현예에서, 본 발명의 연골 제품의 제조 방법은 하나 이상의 용액을 이용한 연골 제품의 처리를 포함한다. 선택적으로, 하나 이상의 용액의 pH는 5-10 범위이다. 선택적으로, 처리 용액은 식염수, PBS, Plasmalyte 및 물 중 하나 이상을 포함한다.
이용 방법
하나의 구현예에서, 본 발명의 연골 제품은 대상체에서 부상을 입은 조직의 치료에 이용된다. 부상을 입은 조직은 임의의 부상을 입은 조직일 수 있다. 예를 들어 본 발명의 연골 제품을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 치료 방법이 제공될 수 있다.
하나의 구현예에서, 부상을 입은 조직은 연골이다. 선택적으로, 부상을 입은 조직은 관절 연골이다. 선택적으로, 상기 방법은 부상을 입은 연골의 제거 및 부상을 입은 연골이 제거되는 부위로의 연골 제품의 투여를 포함한다. 그선택적으로, 제거 단계는 부상을 입은 조직을 포함하는 플러그의 제거를 포함하며, 연골 제품은 플러그를 제거하여 남은 공극에 맞도록 커팅되거나 형상화된다(또는 둘 다이다) (예로, 2cm 지름의 플러그가 제거되고 상기 플러그 형태의 2cm 지름의 연골 제품으로 대체된다).
하나의 구현예에서, 부상을 입은 조직은 관절 연골이고 상기 방법은, 예로 손상된 관절 연골의 제거에 이어 노출된 골수까지 하부 연골아래 뼈를 물리적으로 손상시키고 출혈을 생성하는, 부상을 입은 조직 부위의 미세골절을 추가로 포함한다. 선택적으로, 연골 제품은 미세골절 이후 연골아래 뼈 상에 놓인다.
미세골절은 혈액 응괴를 형성하여 염증성 시토카인, 성장 인자 및 MSCs를 도입하여 치유를 자극할 수 있는 기법이다. 미세골절만으로는 I형 콜라겐을 포함하는 섬유연골의 형성을 야기하며, 불량한 생체역학 성능과 골관절염을 일으키는 비정상적인 뼈 성장을 갖는다. 놀랍게도 본 발명자들의 식견을 통해, 본 발명의 연골 제품이 생존 연골세포를 포함하는 II형 콜라겐 기질을 제공하여 미세골절에 의해 도입된 MSCs의 연골발생을 촉진함으로써 이러한 결함을 극복하는 것이 발견되었다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 연골 제품은 관절경으로 투여된다. 놀랍게도 본 발명의 가요성 연골 제품은 관절경으로 쉽게 투여될 수 있고(즉, 관절경 캐뉼라를 통해 투여될 수 있는 정도로 가요성임) 투여 부위에 맞춰, 예로 연골 표면에 맞춰 채택될 수 있다.
하나의 구현예에서, 연골 제품은 투여 부위에 고정된다. 선택적으로, 연골 제품은 접착제(예로 원섬유 글루)에 의해 또는 기계적 장치(예로 생체재흡수성 핀과 같은 핀)에 의해 고정된다.
놀랍게도, 본 발명자들의 식견을 통해, 본 발명의 연골 제품은 더 우수한 치유를 제공하며, 더 큰 크기의 부상을 치료하기 위해 이용될 수 있다.
놀랍게도, 본 발명자들의 식견을 통해, 연골 제품은 표적 부위에서 연골 내로 효율적으로 도입되는 천연의 기계적 및 기능적 특성을 갖는 콜라겐 기질을 제공한다. 이론에 구애받지 않고, 본원에서 교시되는 연골 제품의 더 우수한 치유능은 부분적으로 공여자 기질(연골 제품), 공여자 세포, 수신자(치료받는 대상체) 세포 및 수신자 기질 간의 복잡한 상호작용에 기인하는 것으로 여겨진다. 이는 전형적으로 단지 완화성인 자가 연골세포 착상과 같은 이전 치료법에 비해 훨씬 더 우수하다.
실시예
실시예 1 넙다리 관절융기 및 정강뼈 고평부의 단리.
도 1에 도시된 바와 같이, 인간 무릎 관절을 수득하였다.
연골과 요오드를 접촉시키지 않고 무릎 관절의 외표면을 요오드(10% 포비돈-요오드 용액, Purdue, "Betadine")로 세정하였다. 연골 표면을 손상시키지 않고 무릎 관절을 박리하여 넙다리뼈, 정강뼈 및 종아리뼈를 분리하였다. 연조직(지방, 근육, 근막, 인대 및 힘줄)을 제거하여 정강뼈 고평부 및 넙다리 관절융기 상의 관절 연골 표면을 노출시켰다.
관절 연골(정강뼈 고평부 및 넙다리뼈 관절융기)을 함유하는 부분을 저온 플레이트 상의 냉각 식염수(0.9% 나트륨 클로라이드 관류 용액, USP) 중에 두어 냉각하였다.
실시예 2 연골 플러그의 단리
넙다리뼈 관절융기 및 정강뼈 고평부를 실시예 1에 상세히 나타낸 바와 같이 수득하였다. 약 1cm 또는 약 2cm의 지름을 갖는 뼈연골 플러그를 넙다리뼈 관절융기 및 정강뼈 고평부에서 수득하였다. 플러그의 단리 동안, 관절융기 및 정강뼈 고평부를 촉촉하게 유지하고, 냉각 식염수 중에 주기적으로 침지하거나 냉각 식염수를 적신 와이프로 닦아내어 냉각하였다. 이어서 단리된 플러그를 냉각 식염수에 두어 냉각하였다.
손상된 연골의 임의 영역을 배제하면서 조직 펀치를 이용해서 뼈연골 플러그를 수득하였다. 구체적으로, 지름 1cm 또는 2cm의 조직 펀치를 이용하여 관절 표본에서 하부 뼈와 연골의 전체 플러그를 제거하였다.
실시예 3 연골아래 뼈 및 석회화된 연골에서 연골 표본의 단리.
뼈연골 플러그를 실시예 2에 상세히 나타낸 바와 같이 수득하였다. 연골아래 뼈 및 석회화된 연골을 뼈연골 플러그에서 제거하여 연골판 형태로 연골 표본을 제공하였다. 상기 절차 동안, 연골을 주기적으로 냉각 식염수로 냉각하여 과열을 방지하였다.
구체적으로, 각각의 뼈연골 플러그를 단단히 잡고, 연골층에서 벤트 앵글 블레이드를 갖는 시상 톱을 이용하여 연골아래 뼈층을 커팅하였다(제거하였다). 연골아래 뼈를 제거하면, 임의의 잔여 뼈 및 석회화된 연골을 연골판 하부에서 깎아내었다. 과열을 방지하기 위해, 조직을 톱질 및 셰이빙 절차에 걸쳐 냉각 식염수에 자주 침지하였다. 상기 절차를 각각의 연골판에 대해 반복하였다.
실시예 4 연골 표본의 크기 조정
연골판 형태로 단리된 연골 표본을 실시예 3에 상세히 나타낸 바와 같이 수득한 뒤, 이들의 가요성을 증가시키기 위해 크기 조정하였다. 연골 표본의 두께를 캘리퍼 또는 판 두께 게이지를 이용하여 측정하였다. 약 1.5mm보다 두꺼운 판은 약 1.5mm로 줄여 다듬었다. 약 1mm보다 얇은 판은 버렸다.
실시예 5 연골 표본의 천공
연골 표본(연골판)을 실시예 4에 상세히 나타낸 바와 같이 수득하고 크기 조정한 뒤 천공하여, 도 15에 나타낸 바와 같이 약 1mm 지름의 개구를 약 36개 개구/cm2의 개구 밀도로 갖는 연골층(판)을 제공하였다.
구체적으로, 개구 패턴(천공 스테인리스 스틸 스크린)을 연골 표본에 걸쳐 배치하고 1mm 생검 펀치를 이용하여 패턴에 걸쳐 연골의 개구(구멍)를 펀칭해내었다. 이어서 천공 연골 표본을 냉각 식염수에 침지하여 냉각하였다.
실시예 6 연골 표본의 부분적 소화
연골 표본(연골판)을 실시예 5에 상세히 나타낸 바와 같이 수득한 뒤 II형 콜라게나아제로 소화시켰다.
구체적으로, 콜라게나아제를 DMEM 중에 제형화하였다(200units/ml의 II형 콜라게나아제, Sigma). 천공 연골 표본을 37℃±2℃에서 30±2분 동안 콜라게나아제 현탁액 중에 인큐베이션하였다. 콜라게나아제 용액을 제거하고 판을 냉각 식염수로 세척하였다.
실시예 7 연골 제품의 항생제 처리
연골 표본(연골판)을 실시예 7에 상세히 나타낸 바와 같이 수득한 뒤 37℃±2℃에서 18시간 내지 48시간 동안 DMEM 중 겐타마이신 설페이트(50㎍/mL; Abraxis Pharmaceutical Products, Schaumburg, IL), 반코마이신 HCl(50㎍/mL; Hospira Inc., Lake Forest, IL), 및 암포테리신 B(2.5㎍/mL; Sigma Aldrich, St. Louis, MO)를 함유하는 항생제 용액과 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 항생제 용액을 제거하고 판을 냉각 식염수 중에 헹구었다.
실시예 8 동결보존
연골 제품을 실시예 8에 상세히 나타낸 바와 같이 수득하고 동결보존 용액 중에 동결보존하였다.
동결보존 용액은 PlasmaLyte-A(Baxter Healthcare Corp.) 중에 10% 디메틸 설폭시드(DMSO) (Bioniche Teo. Inverin Co) 및 5% 인간 혈청 알부민(HSA; Baxter)을 함유하였다.
각각의 연골 제품에 있어서, 바이알을 약 7ml의 동결보존 용액으로 채우고 연골 제품을 핀셋을 이용하여 바이알 내로 옮겼다. 연골 제품을 닦아서 동결보존 용액에 배치하기 전에 임의의 잔여 액체(예로 식염수 용액)을 제거하였다. 동결보존 용액 및 연골 제품을 함유하는 바이알에 뚜껑을 배치하였다.
뚜껑을 닫은 뒤 바이알을 밀봉하고 권축하고 백에 넣은 뒤 바이알을 자동화 냉동기에 두어 약 -80℃에서 동결보존하였다.
냉동기는 하기 온도 프로그램을 이용하여 점차적인 단계식 방식으로 온도를 낮추도록 프로그래밍되었다:
단계 1 온도를 4.0℃/m로 4℃까지 감소시킴
단계 2 온도를 4℃에서 60m 동안 유지
단계 3 온도를 1.0℃/m로 -30℃까지 감소시킴
단계 4 온도를 -30℃에서 30m 동안 유지함
단계 5 온도를 4.0℃/m로 -80℃까지 감소시킴
단계 6 온도를 -80℃에서 유지함
실시예 9 연골 제품
연골 제품은 실시예 1 내지 실시예 8에 상세히 나타낸 방법을 이용하여 연골 표본을 단리하고, 천공하고, 소화시키고, 동결보존하여 제조되었다. 연골 제품은 천연 구조 조직을 가지며 적절한 관절 연골 보수를 촉진한다. 놀랍게도, 치료 활성 연골 제품은 하기와 같은 기술적 특징을 갖는다:
- 연골발생능을 갖는 생존 천연 연골세포를 함유함
- 생물활성 인자를 함유함
- 비면역원성임
- 천연 구조 조직을 갖는 가요성 보수 기질을 제공함
실시예 10 다양한 냉동 방법을 이용한 동결보존 이후의 생존 연골세포.
실시예 9의 연골 제품을 동결보존 이후 생존 연골세포에 대해 분석하였다.
다양한 냉동 방법을 조사하여 세포 생존에 대한 이들의 효과를 결정하였다. 연골 제품을 plasmalyte-A(나트륨 클로라이드, 나트륨 글루코네이트, 나트륨 아세테이트, 칼륨 클로라이드 및 마그네슘 클로라이드) 중 10% 디메틸 황산 옥시드(DMSO) 및 5% 인간 혈청 알부민(HSA)을 포함하는 동결보존 매질 중에 제형화하였다.
첫 번째 실험 세트에서는 상이한 동결보존 방법을 시험하여 연골 제품 내에서 생존 세포의 보존에 대한 효과를 결정하였다.
방법 1: 연골 제품을 4℃에서 유지하여 평형화(즉, 조직 내로의 동결용액의 침투)하기 위한 시간을 준 뒤 제품을 스티로폼 박스에 넣고 약 -0.5℃/분의 일정한 냉각 속도를 유도하는 -80℃ 냉동기에서 냉동하였다.
방법 2, 단계:
1. 온도를 단계식 방법으로 감소시킨다:
2. 온도를 4.0℃/m로 4℃까지 감소시킴
3. 평형화를 위해 온도를 4℃에서 60m 동안 유지함
4. 온도를 1.0℃/m로 -30℃까지 감소시킴
5. 온도를 -30℃에서 30m 동안 유지함
6. 온도를 4.0℃/m로 -80℃까지 감소시킴
7. 온도를 -80℃에서 유지함
생존 세포의 존재를 나타내기 위해, 연골 제품을 LIVE/DEAD® 생존/세포독성 키트(Molecular Probes Inc., Eugene, OR)를 이용하여 염색하여 세포 생존을 정성적으로 평가하였다. 염색은 제조업체의 프로토콜에 따라 수행하였다. 연골 제품의 얇은 부분(예로 대략 0.5cm x 0.5cm x 0.02cm)을 37℃ 수조에서 해동하고 분석에 이용하였다. 염색 조직의 평가는 형광 현미경을 이용하여 수행하였다. 짙고 균일한 녹색 형광은 살아있는 세포의 존재를 시사하며, 밝은 빨간색 형광은 죽은 세포의 존재를 시사하였다.
도 3에 도시된 바와 같이, 단계적 방법(방법 2; 도 3b)에 의해 동결보존된 연골 제품은 단회 평형화 단계 후 점차적 냉각을 포함하는 방법(방법 1; 도 3a)을 이용하여 동결보존된 연골 제품에 비해 증강된 수준의 생존 연골세포를 포함한다. 연골세포는 관절 연골 내에 존재하는 주요 세포 유형이며, 연골 기질 항상성 유지에 필수적이다. 또한, 연골세포는 연골발생 및 연골 보수를 촉진하는 인자를 발현한다. 연골을 동결보존하기 위해 문헌에 언급되었던 몇몇 시도가 해동 시 생존 세포 보존에 거의 성공하지 못했으므로 생존 연골세포가 동결보존 후 남아있는 것은 상당히 놀라운 것이다(예로 Acosta 등, 2007. Clin Orthop Relat Res; 460:234-9).
두 번째 세트의 실험에서 평형화 기간을 해동 연골 제품 중 생존 연골세포 수준에 대한 그 효과에 대해 시험하였다. 구체적으로, 세포 생존을 방법 2를 이용한 동결보존 후 평가하였고(도 4a) 4℃에서 1시간 평형화 단계에 대해 2시간 평형화 단계(도 4b) 또는 4시간 평형화 단계(도 4c)로 대체한 동결보존 방법과 비교하였다. 놀랍게도 도 4에 도시된 바와 같이, 1시간 평형화 단계는 2시간 및 4시간 평형화에 필적하는(또는 더 우수한) 세포 생존을 제공하였다.
실시예 11 다양한 동결보존 매질 중 동결보존 이후의 생존 연골세포
실시예 9의 연골 제품을 동결보존 이후 생존 연골세포에 대해 분석하였다. 다양한 동결보존 매질을 조사하여 세포 생존에 대한 이들의 효과를 결정하였다.
첫 번째 실험에서, 연골 제품을 plasmalyte A 중 5% HSA 중에 10% 또는 20% DMSO를 함유하는 동결보존 매질 중에 제형화하였다. 실시예 10에 상세히 기재된 방식으로 최종 연골 제품의 해동 연골 제품 상에 LIVE/DEAD® 염색을 수행하였다. 결과를 도 5에 도시한다. 10%(도 5a) 및 20% DMSO(도 5b) 간 세포 생존에는 정성적 차이가 없었다. 따라서, 해동 시 생존 연골세포를 갖는 제품을 제공하기 위해 연골 제품이 감소된 농도의 동결보존 매질 중에 제형화될 수 있다.
두 번째 실험에서, 연골 제품을 plasmalyte A 중 0% 또는 5% HSA 및 5% HSA 중에 10% DMSO를 함유하는 동결보존 매질 중에 제형화하였다. 실시예 10에 상세히 기재된 방식으로 최종 연골 제품의 해동 연골 제품 상에 LIVE/DEAD® 염색을 수행하였다. 결과를 도 6에 도시한다. 이 연구에서, 0%(도 6a) 및 5% HSA(도 6b) 간에는 세포 생존에 현저한 차이가 관찰되지 않았다. 그러나 동결보존 조직의 장기 안정성에 대한 HSA의 효과에 관한 본 발명자의 식견을 통해, HSA가 선택적으로 포함된다.
세 번째 실험에서, 연골 제품을 plasmalyte A 또는 일반 식염수 중 10% DMSO + 5% HSA를 함유하는 동결보존 매질 중에 제형화하였다. 실시예 10에 상세히 기재된 방식으로 최종 연골 제품의 해동 연골 제품 상에 LIVE/DEAD® 염색을 수행하였다. 결과를 도 7에 도시한다. 결과는 plasmalyte-A(도 7a) 및 일반 식염수(도 7b) 간에 세포 생존에 있어서 현저한 차이를 나타내지 않았다. 그러나 본 발명자의 식견을 통해, 동결 보관 동안 연골 제품의 장기 안정성에 있어 유익할 수 있는 염 및 미네랄(예로 나트륨 클로라이드, 나트륨 글루코네이트, 나트륨 아세테이트, 칼륨 클로라이드 및 마그네슘 클로라이드)을 함유하므로 plasmalyte-A는 선택적으로 포함된다. 본 발명의 연골 제품을 위해 유용한 동결 용액에는 plasmalyte-A 중 10% DMSO +5% HSA가 포함된다.
이들 결과는 본원에 교시된 연골 제품이 다양한 동결보존 매질 중에 제형화되는 경우 냉동/해동 사이클 이후 생존 연골세포를 함유함을 시사한다.
실시예 12 해동 이후 지속되는 세포 생존
실시예 9의 연골 제품을 동결보존 이후 생존 연골세포에 대해 분석하였다. 세포 생존을 연골 제품의 해동 이후 다양한 시점에 결정하였다.
연골 제품을 plasmalyte A 중 5% HSA 중에 10% DMSO를 함유하는 동결보존 매질 중에 제형화하였다. 동결보존 및 해동 후, 연골 제품을 최대 14일까지 DMEM + 1% HSA+ 항생제/항진균제 중에 배양하였다. 배양 0일(도 8a), 7일(도 8b) 및 14일(도 8c)에, 연골 제품을 실시예 10에 상세히 기재된 방식으로 LIVE/DEAD® 염색에 대해 평가하였다. 도 8에 도시된 바와 같이, 연골세포는 냉동/해동 사이클 이후 14일 배양 기간 동안 생존이었다. 따라서, 본 발명의 연골 제품은 치료 유효성에 기여하는 세포성 성분을 제공한다.
실시예 13 세포 생존의 정량적 평가
실시예 9의 연골 제품을 동결보존 이후 세포수 및 세포 생존에 대해 분석하였다.
동결보존 연골 제품을 해동하고, 얇은 섹션을 실시예 10에 상세히 나타낸 바와 같이 LIVE/DEAD® 염색으로 염색하였다. 생존 및 죽은 연골세포를 10X 확대 렌즈 하에 가시화하고, 0.38mm2 시야 내에서 각각 녹색 또는 빨간색 형광으로 나타나는 바에 따라 계수하였다. 3개의 무작위 섹션을 4명의 별도 공여자로부터 분석하였다. 표 1에 상세히 나타낸 바와 같이, 생존 세포의 평균 수는 64,989세포/cm2이고 세포 생존은 70.5%였다. 상기 데이터는 본 발명의 연골 제품이 70% 생존을 가질 수 있음을 시사한다.
표 1 - 세포 생존
살아있는 세포/ cm 2 죽은 세포/ cm 2 생존
공여자 50
섹션 1 46,579 8,421 85.0%
섹션 2 38,947 10,000 79.6%
평균 42,763 9,211 82.3%
공여자 53
섹션 1 95,789 13,421 87.7%
섹션 2 61,316 17,632 77.7%
섹션 3 67,895 53,158 56.1%
평균 75,000 28,070 72.8%
공여자 54
섹션 1 57,632 5,789 90.9%
섹션 2 66,316 11,081 85.7%
섹션 3 76,579 9,211 89.3%
평균 66,842 8,694 89.3%
공여자 55
섹션 1 83,158 82,368 50.2%
섹션 2 63,947 18,684 77.4%
섹션 3 78,947 87,895 47.3%
평균 75,351 62,982 54.5%
전체 평균 64,989 27,239 70.5%
실시예 14 가요성 연골 제품
하나의 구현예에서, 본 발명의 연골 제품은 관절경으로 투여될 수 있도록 하는 증강된 가요성을 나타낸다. 놀랍게도, 천공 및 선택적 소화에 의해 연골 제품이 관절경 캐뉼라를 통해 스레드되기에 충분히 가요성이 될 수 있다; 이는 보통 파단 없이는 굴곡력이 거의 없는 단단한 천연 관절 연골과는 대조적이다.
다양한 개구 크기 및 개구 밀도를 평가하여 관절경 검사에 이용하기 위한 가요성 및 능력에 대한 이들의 효과를 결정하였다. 실시예 4에 상세히 기재된 방법을 이용하여 연골 제품을 제조하고 천공 단독 또는 천공과 소화에 의해 추가 가공하였다. 0.6mm 및 0.9mm 지름 개구의 두 상이한 개구 크기를 시험하였다. 12, 25 및 50개 개구/cm2의 세 상이한 개구 밀도를 시험하였다. 또한, 30분 콜라게나아제 소화도 시험하여 연골 제품에 대한 소화의 효과를 평가하였다. 표 2에 상세히 나타낸 바와 같이 처리 조건(처리 A-L)의 다양한 조합을 평가하였다. 처리 A-L로 제조된 각각의 연골 제품은 본 발명의 예시적인 연골 제품이다.
구체적으로, 각각의 처리 조건 A-L을 해당 문자로 표시하고, 6명의 맹검 검사자에게 연골 제품의 가요성에 대한 등급을 1-5 척도로(1=가장 가요성이 높음 및 5=가장 가요성이 적고 가장 단단함) 평가하도록 요청하였다. 결과를 표 3에 도시한다. 결과는 개구 크기가 클수록(0.9mm 지름) 그리고 개구 빈도가 높을수록(50개 개구/cm2) 가요성이 더 높은 연골 제품을 산출함을 시사한다. 상기 실험에서, 콜라게나아제 처리는 가요성에 현저한 차이를 나타내지 않았다. 그러나 다른 실험에서(데이터는 나타내지 않음), 사용자들은 콜라게나아제 처리로 인해 훨씬 더 현저한 가요성 차이를 관찰하였다.
표 2 - 처리 조건
처리 설명
A 0.6mm 개구, 12개 개구/cm2
B 0.6mm 개구, 25개 개구/cm2
C 0.6mm 개구, 50개 개구/cm2
D 0.9mm 개구, 12개 개구/cm2
E 0.9mm 개구, 25개 개구/cm2
F 0.9mm 개구, 50개 개구/cm2
G 0.6mm 개구, 12개 개구/cm2+ 콜라게나아제 처리
H 0.6mm 개구, 25개 개구/cm2+ 콜라게나아제 처리
I 0.6mm 개구, 50개 개구/cm2+ 콜라게나아제 처리
J 0.9mm 개구, 12개 개구/cm2+ 콜라게나아제 처리
K 0.9mm 개구, 25개 개구/cm2+ 콜라게나아제 처리
L 0.9mm 개구, 50개 개구/cm2+ 콜라게나아제 처리
표 3 - 다양한 처리 조건 이후 연골 제품의 가요성
조건 평가 #1 평가 #2 평가 #3 평가 #4 평가 #5 평가 #6 평균
A 5 5 4 5 5 5 4.8
B 5 4 4 5 5 5 4.7
C 4 4 4 3 3 3 3.5
D 5 4 3 4 4 2 3.7
E 4 4 3 3 3 1 3.0
F 3 3 2 2 2 1 2.2
G 5 5 5 5 5 5 5.0
H 5 5 5 5 5 5 5.0
I 4 4 5 4 4 3 4.0
J 5 4 4 4 3 2 3.7
K 4 4 3 3 4 1 3.2
L 3 3 2 2 2 1 2.2
실시예 15 연골 제품의 비면역원성
실시예 9의 연골 제품을 면역원성에 대해 분석하였다. 구체적으로, 지질다당질(LPS)에 반응한 연골 제품에 의한 TNF-α분비를 이용하여 면역원성을 결정하였다. 본 발명의 동결보존 연골 제품의 TNF-α분비를 미가공(신선) 연골 제품에서와 비교하였다.
연골 제품(미가공 제품 대 동결보존 제품)의 절편(0.785cm2)을 조직 배양 배지 중에 두고 20-24hr 동안 박테리아 LPS(1㎍/mL, Sigma)에 노출시켰다. 24시간 후, 조직 배양 배지를 수집하고 제조업체의 프로토콜에 따라 TNF-α ELISA 키트(R&D Systems)를 이용하여 TNF-α존재에 대해 시험하였다. LPS 자극 시 고수준의 TNF-α를 분비하는 단핵구를 함유하는 것으로 알려져 있는 인간 hPBMCs를 분석에서 양성 대조군으로 이용하였다. LPS가 없는 hPBMCs 및 연골 제품도 분석에서 대조군으로 포함시켰다.
결과를 도 9에 도시한다. 비동결보존 연골 제품("미가공 제품")은 LPS에 반응하여 상당한 수준의 TNF-α를 제공한 반면, 동결보존 연골 제품("최종 제품")은 LPS에 반응하여 상당한 수준의 TNF-α를 제공하지 않아, 제조 공정에서 연골 표본의 면역원성이 제거됨을 시사하였다. 이론에 구애받지 않고, 본 발명자들은 생존이 있는 기능성 대식세포가 미가공 연골에서 면역원성의 원천인 것으로 믿는다.
놀랍게도, 이들 결과는 연골 제품이 선택적으로 대식세포를 결핍시켜 동종이형 임플란트의 면역원성을 감소시킬 수 있음을 시사한다.
실시예 16 연골 제품에서의 생물활성 인자
실시예 9의 연골 제품을 생물활성 인자의 존재에 대해 분석하였다. 구체적으로, 효소 연관 면역흡착 분석(ELISAs)을 이용하여 조직 추출물 및 연골 제품의 배양 상청액에 방출된 인자를 분석하였다.
조직 추출물 분석을 위해, 실시예 9의 동결보존 연골 제품을 37℃ 수조에서 해동하고 동결보존 매질에서 제거한 뒤 PBS로 헹구었다. 이어서 각 제품을 미분하고 액체 질소조에서 호모게나이즈 튜브 중에 급속 냉동하였다. 1개의 사전 냉각된 5mm 철 비드를 각 튜브에 첨가하고 1ml 호모게나이즈 매질 중에서 제조업체의 권장사항에 따라 Qiagen 조직 용해기를 이용하여 호모게나이즈하였다. 이어서 호모게나이즈액을 마이크로원심분리기를 이용하여 10분 동안 16000g에서 회전 침강시켰다. 상청액을 수집하고 단백질 발현에 대해 ELISA로 분석할 때까지 -80℃에서 보관하였다. 상청액 부피는 호모게나이즈 매질의 초기 부피(1ml)와 대략 동량이었다.
인자 방출 분석을 위해, 동결보존 연골 제품을 37℃ 수조에서 해동하고 동결보존 매질에서 제거한 뒤 PBS로 헹구었다. 각각의 연골 제품을 12웰 디쉬의 웰 상에 접종하고, 2ml의 성장 배지(DMEM +1% HSA+ 항생제/항진균제)를 첨가하고 최대 14일까지 37℃에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 조직 및 배양 배지를 15ml 코니칼 튜브로 옮기고 5분 동안 2000rpm에서 원심분리하였다. 배양 상청액을 수집하고 단백질 발현에 대해 ELISA로 분석하였다. 상청액 부피는 성장 배지의 초기 부피(2ml)와 대략 동량이었다.
표 4는 조직 추출물 및 인자 방출 분석에서 검출된 연골발생 인자의 예를 기재한다. 각각의 발현값은 연골 제품의 위 표면적(도 15에서 확인) 당 상청액 부피 당 양(pg/ml/cm2) 및 연골 제품의 위 표면적 당 인자의 양(pg/cm2)의 측면으로 제공된다.
표 4 - 연골발생 인자
인자 조직 용해액 중 발현 범위 배양 상청액에 방출되는 인자의 범위(조직 cm 2 당 조정)
( pg / cm 2 ) ( pg / ml )
TGF-β1 10.8-627.8 2616.6-17818
TGF-β2 TBD 133-623
TGF-β3 3.98-112.1 TBD
BMP-2 TBD TBD
BMP-7 3.33-23.3 TBD
bFGF 168.8-365 TBD
IGF-1 111-779 14-2842
ECM(II형 콜라겐, 히알루로난, 아그레칸) TBD TBD
이론에 구애받지 않고, 본 발명자들은 세포외 기질 생성을 매개하고 연골발생을 촉진하는 생물활성 인자(예로 성장 인자 단백질)이 본 기술의 연골 제품에 의해 촉진되는 효율적인 연골 보수에 중요하다고 믿는다.
놀랍게도, 이들 결과는 연골 제품이 관절 연골 보수에서 치료적 가치를 촉진하는 다양한 연골발생 인자를 포함함을 시사한다.
실시예 17 연골 제품으로부터 단백질의 지속 방출
본 발명의 연골 제품은 이들의 기능적 활성을 증강시키기 위해 세포 또는 조직에 의해 미세환경 내로 인자를 방출할 수 있다.
방출되는 양 또는 단백질을 측정하기 위해, 실시예 9의 연골 제품을 7-21일 동안 배양 배지 중에 배양하고 상청액을 수집하여 주요 단백질을 ELISA로 정량하였다. 결과를 도 10에 도시하며, 이는 연골 제품이 TGF-β1 및 TGF-bβ를 적어도 21일 동안 생성하고 상청액 내로 방출함을 시사한다. 이들 데이터는 연골 제품이 생존 연골세포의 존재 및 밀도 높은 ECM으로 인해 경시적으로 연골발생 성장 인자를 생성하고 수준을 지속하는 능력을 가짐을 제시한다.
실시예 18 천공 연골 제품으로부터의 인자 방출
단백질에 대한 천공 대 온전한 연골 제품의 효과를 조사하였다. 천공 파라미터를 개질한 것을 제외하고, 연골 제품을 실시예 9에 상세히 나타낸 바와 같이 생성하였다. 제품의 절반은 36-50개 개구/cm2로 천공한 반면, 나머지는 천공 없이 온전한 채로 두었다. TGF-β1의 양을 7일 동안 배양한 두 조건의 연골 제품의 상청액에서 ELISA로 측정하였다. 결과를 도 11에 도시하며, 이는 천공 연골 임플란트에서 방출된 TGF-β1의 양이 온전한 연골 제품에 비해 더 크다는 것을 시사한다. 이들 데이터는 제품 내의 천공이 제품의 가요성에 기여할 뿐만 아니라 천공이 연골발생 인자의 더 큰 방출을 지지함을 시사한다. 이론에 구애받지 않고, 본 발명자들은 증강된 방출이 개구에 의해 생성되는 증가된 표면적에 기인하는 것으로 추정한다.
실시예 19 소화 연골 제품에서의 인자 방출
단백질 방출에 대한 연골 제품의 소화 효과를 조사하였다. 소화 파라미터를 개질한 것을 제외하고, 연골 제품을 실시예 9에 상세히 나타낸 바와 같이 생성하였다. 제품의 절반은 동결보존 이전에 30분 콜라게나아제 소화를 거치지 않았다. 방출되는 TGF-β1의 양을 14일 동안 배양된 두 조건의 제품의 상청액에서 ELISA로 측정하였다. 결과를 도 12에 도시하며, 이는 콜라게나아제 소화 연골 제품에서 방출된 TGF-β1의 양이 비소화 연골 제품에서보다 크다는 것을 나타낸다. 이들 데이터는 콜라게나아제 소화가 제품의 가요성 및 청정도에 기여할 뿐만 아니라 소화가 미세환경에 대한 유익 단백질의 더 큰 방출을 지지함을 시사한다.
실시예 20 살아있는 세포를 함유하는 동결보존 연골 제품으로부터의 TGF -β인자 방출
단백질 방출에 대한 동결보존의 효과를 조사하였다. 연골 제품을 실시예 9에 상세히 나타낸 바와 같이 생성하였다(즉 동결보존). 다음으로, 일부 연골 제품은 제품 내의 모든 세포를 죽이기 위해("실활화") H2O 중에 추가적인 3회의 냉동 해동을 거쳤다. 최종 단계에, 모든 연골 제품을 해동하고, 21일 동안 성장 배지 중 별도의 웰에서 배양하였다.
배지 내로 자연 방출되는 TGF-β1의 양을 21일 동안 배양된 두 조건의 연골 제품의 상청액에서 ELISA로 측정하였다. 결과를 도 13에 도시하며, 이는 살아있는 세포를 함유하는 동결보존 연골 제품으로부터 방출된 인자(TGF-β1)의 양이 21일 배양 전반에 걸쳐 실활화 연골 제품에서보다 크다는 것을 나타낸다. 이들 데이터는 동결보존 연골 제품이 살아있는 세포가 없는 연골에 비해 미세환경에 대해 TGF-β1과 같은 유익한 인자를 생성하고 기여하는 것을 계속하는 생존 세포를 함유함을 시사한다.
실시예 21 연골 제품의 포비돈 -요오드 처리 이후 세포 생존
공여자 조직의 무균 가공을 최적화하기 위한 노력은 치료적 이용을 위해(그리고 예로, 조직 제품 안전성에 관한 식약청(FDA) 및 조직 은행 규제에 부합하기 위해서도) 중요하다. 공여자 조직에 의해 수반되는 도입 오염 미생물 위험성을 최소화하기 위해, 실시예 7에 상세히 나타낸 바와 같이 연골 제품을 동결보존 이전에 하룻밤 동안 항생제 인큐베이션으로 처리하였다. 연골 제품의 오염 미생물 위험성을 더 감소시키기 위해, 포비돈-요오드 처리를 시험하여 세포 생존 또는 단백질 발현에서의 임의 변화를 관찰하였다. 포비돈-요오드는 수술 표면을 세정하고 오염을 제거하기 위해 병원에서 널리 사용되는 강력한 항균제이다.
간략하게, 연골 제품을 실시예 9에 상세히 나타낸 바와 같이 제조하였으나, 하룻밤 동안 항생제 인큐베이션 이전에 연골 제품을 포비돈-요오드조에 1초 동안 침지시킨 뒤 즉시 식염수 중에 3회 세척하였다. 이어서 연골 제품으로 일반적인 항생제 인큐베이션 및 동결보존 절차를 따랐다. 포비돈-요오드 처리의 효과를 평가하기 위해, 세포 생존(LIVE/DEAD® 염색)을 실시예 10에 상세히 나타낸 바와 같이 분석하였다. 결과를 도 14에 도시한다. 세 농도의 포비돈-요오드를 10% 포비돈-요오드(도 14a), 5% 포비돈-요오드(도 14b), 1% 포비돈-요오드(도 14c)로, 그리고 대조군으로 0% 포비돈-요오드(도 14d)를 시험하였다. 해동 연골 제품의 LIVE/DEAD®염색은 포비돈-요오드의 농도가 증가할수록 대조군인 미처리 연골 제품에 비해 세포 생존이 또한 감소됨을 드러내었다.
실시예 22 연골 제품을 이용한 염소에서 연골 결손의 치료
하나의 구현예에서, 연골 제품의 유효성을 동물 모델, 예로 국소 연골 결손의 동물 모델에서 시험한다.
간략하게, 염소의 네발무릎 관절 내로 국소 연골 결손을 유도한 뒤 미세골절만으로 또는 연골 제품(실시예 9에서 제조된 바와 같은 것)과 함께 미세골절로 치료한다. 3, 6 및 12개월에 관절을 수집하고, 결손부 충전 부피뿐만 아니라 관절 연골 보수 조직의 형성을 시사하는 II형 콜라겐 염색에 대해 보수 조직을 분석한다. 또한, 연구 기간에 걸쳐 동물의 염증 또는 일반적인 불편함을 모니터링하여 염소를 제품의 안전성에 대해 평가할 수 있다.
본 기술의 연골 제품은 하기 비제한적 기준 중 적어도 하나 이상에 따라 연골 보수를 실질적으로 증가시킨다.
- 안전성
- 전체 형태
- 천연 주변 조직 대비 보수 조직의 품질
- 보수 조직의 도입
- 조직학적 평가
- 세포외 기질 염색
- 결손부 부피 충전
- 기계적 평가
- 보수 조직의 함입 시험
- O' Driscoll 등급 체계에 따른 보수 조직 평가
실시예 23 연골 제품 내에서 생존 세포의 연골발생
본 연구는 연골 제품 내의 생존 세포가 기능적이며, 적절한 연골 보수에 기여할 건강한 ECM을 만들어낼 잠재력을 가진다는 것을 나타낸다.
본 발명의 연골 제품에서 연골세포를 단리하고 증식시킨다. 연골세포의 연장된 시험관내 배양으로 일부 세포의 역분화가(예로 보다 원시적인 섬유아세포 계통으로) 일어난다. 다음으로 이들 세포를 분화 배지(예로 성장 인자 함유 배지) 중에 둔다. 경시적으로, 이들 세포는 시험관내 연골발생을 나타낸다.
실시예 24 연골 제품 내 연골세포의 유전자 발현
연골 제품을 실시예 9에 상세히 나타낸 바와 같이 생성한다(동결보존을 포함하는 것, 및 포함하지 않는 것을 제외하고). 연골 제품 내의 연골세포를 기능적으로 활성이 있는 연골세포를 자극하는 필수 유전자의 발현에 대해 검사한다. 하기의 상당한 발현 수준이 검출된다: II형 콜라겐, 아그레칸, SOX5, SOX6, 및 SOX9.
실시예 25 외인성 MSCs 에 대한 연골 제품 중 연골세포의 자극 효과.
단리된 중간엽 줄기 세포(예로 상이한 공여자 유래)를 본 발명의 연골 제품에서 단리된 연골세포와 공동 배양한다.
연골세포는 MSCs가 연골세포로 분화하는 것을 자극하며, 상기 모델에서 생성 연골발생을 자극한다. 이들 결과는 본 발명의 연골 제품의 치료 유효성이 부분적으로 수신자 MSC 세포에 대한 연골 제품의 연골세포 자극 효과에 기인한다는 것을 나타낸다.
실시예 26 나선형 커팅 연골 제품
천공하는 대신 연골 표본 조직을 제거하며(도 20 또는 도 21에 도시된 바와 같이) 또는 조직 제거 없이(도 17c에 도시된 바와 같이) 나선형 커팅하는 것을 제외하고, 연골 제품을 실시예 9에 상세히 기재된 방법에 따라 제조한다. 부분적 소화 단계를 배제한 것을 제외하고 동일한 방법을 이용하여 추가적인 연골 제품을 제조한다.
나선형 커팅 연골 제품은 가요성이며, 환자에서 표적 부위에 맞춰질 수 있고 관절경을 통해 쉽게 투여될 수 있다.
나선형 커팅 연골 제품은 실시예 22에 상세히 나타낸 바와 같이 연골 결손 모델에서 유효성을 나타낸다.
일정 시기 이후, 임플란트된 나선형 커팅 연골 제품 및 주변 숙주 조직을 제거하고 분석하며, 적절한 마커를 이용하여 하기 중 하나 이상이 관찰된다:
a. 숙주 연골 내로의 도입
b. 숙주 세포의 침윤 및 II형 콜라겐이 풍부한 ECM;
c. 연골발생 인자와 같은 생물활성 인자의 상당한 발현
d. 상당한 수준의 연골세포
e. 상당한 발현 수준의 II형 콜라겐, 아그레칸, SOX5, SOX6, 및 SOX9.
나선형 커팅 연골 제품은 대상체(예로 연골 결손부) 치료 시 우수한 유효성을 나타낸다. 부분적으로 나선형 커팅으로 제공되는 증강된 가요성으로 인해, 쉽게 조작될 수 있고 표적 부위(예로, 연골 결손부의 제거 후 남아있는 공극)에 맞춰질 수 있는 연골 제품이 더 크게(예로 더 두껍게, 더 넓게 또는 더 많이) 제조될 수 있다. 부분적으로 구조 불연속성(나선형 커팅)으로 인해, 연골 제품이 생체내 팽창하거나 수축하여(예로 외측으로) 숙주 연골 내로의 증강된 도입을 제공할 수 있다.
실시예 27 기계적으로 손상된 연골 제품
천공하는 대신, 연골 표본을 정렬 커팅, 방사 커팅, 교차 커팅, 후프 형성 커팅 또는 다중 후프 형성 커팅을 이용하여 기계적으로 손상시키는 것을 제외하고, 연골 제품을 실시예 9에 상세히 기재된 방법에 따라 제조한다. 각 유형의 기계적 손상을 1회는 조직을 제거하고(예로, 도 18 및 도 19에 도시된 바와 같이) 및 1회는 조직 제거 없이(예로, 도 17에 도시된 바와 같이) 적어도 2회 상이한 연골 표본 상에 수행하였다. 부분적 소화 단계를 배제한 것을 제외하고 동일한 방법을 이용하여 추가적인 연골 제품을 제조한다.
기계적으로 손상된 연골 제품은 하기와 같은 더 우수한 특성을 가지며, 이는 부분 소화 제품에서 더욱 더 큰 정도로 존재한다.
기계적으로 손상된 연골 제품은 가요성이며, 환자에서 표적 부위에 맞춰질 수 있고 관절경을 통해 쉽게 투여될 수 있다.
기계적으로 손상된 연골 제품은 실시예 22에 상세히 나타낸 바와 같이 연골 결손부 모델에서 유효성을 나타낸다.
일정 시기 이후, 임플란트된 기계적으로 손상된 연골 제품 및 주변 숙주 조직을 제거하고 분석하며, 적절한 마커를 이용해서 하기 중 하나 이상이 관찰된다:
a. 숙주 연골 내로의 도입
b. 숙주 세포의 침윤 및 II형 콜라겐이 풍부한 ECM;
c. 연골발생 인자와 같은 생물활성 인자의 상당한 발현
d. 상당한 수준의 연골세포
e. 상당한 발현 수준의 II형 콜라겐, 아그레칸, SOX5, SOX6, 및 SOX9.
본원에서 제공되는 인용문들은 언급되는 요지에 대한 참조로 본원에 포함된다.
본 발명의 추가 구현예는 하기 단락에서 확인할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 기술은 손상된 콜라겐 기질을 포함하는 연골 제품을 제공한다.
일부 구현예에서, 연골 제품은 효소적 손상을 포함하는 콜라겐 기질을 함유한다.
일부 구현예에서, 콜라겐 기질은 콜라게나아제로 소화되며, 선택적으로 콜라겐 기질은 콜라게나아제 ll로 소화된다.
일부 구현예에서, 본 기술은 연골 제품을 제공하며, 콜라겐 기질은 기계적 손상을 포함한다. 일부 구현예에서, 기계적 손상은 부분적인 기계적 손상이며, 콜라겐 기질은 실질적으로 온전하다. 다른 구현예에서, 기계적 손상은 나선형 커팅, 홈, 새김줄, 개창 및 개구에서 선택된다. 추가 구현예에서, 기계적 손상은 전체적인 기계적 손상일 수 있고, 선택적으로 콜라겐 기질은 분쇄된다. 일부 구현예에서, 기계적 손상은 조직 제거 유형이다. 또 다른 구현예에서, 기계적 손상은 조직 비제거 유형이다.
다른 구현예에서, 연골 제품에는 기계적 손상을 포함하는 콜라겐 기질이 포함되며, 기계적 손상은 콜라겐 기질의 전체 두께에 걸쳐 연장된다. 다른 구현예에서, 기계적 손상은 나선형 커팅, 새김줄, 교차 새김줄, 방사 새김줄, 후프-커팅, 및 개구에서 선택된다.
다른 구현예에서, 연골 제품은 기계적 손상을 포함하는 콜라겐 기질을 함유하며, 기계적 손상은 콜라겐 기질의 전체 두께보다 적게 연장된다. 일부 구현예에서, 기계적 손상은 나선형 커팅, 새김줄, 교차-새김줄, 및 방사 새김줄에서 선택된다.
일부 구현예에서, 본 기술의 연골 제품에는 약 0.2mm 내지 약 2.0mm의 두께, 대안적으로 약 1mm 내지 약 1.5mm의 두께를 갖는 콜라겐 기질이 포함된다.
다른 구현예에서, 본 기술은 콜라겐 기질이 생존 세포를 함유하는 연골 제품을 제공하며, 선택적으로 생존 세포의 기원은 콜라겐 기질이다. 다른 구현예에서, 본 기술의 연골 제품에는 실활된 콜라겐 기질이 포함된다.
일부 구현예에서, 본 기술의 연골 제품은 뼈층을 추가로 포함하며, 선택적으로 뼈층의 기원은 콜라겐 기질이다. 일부 구현예에서, 뼈층은 콜라겐 기질보다 실질적으로 적은 표면적을 갖는다. 다른 구현예에서, 뼈층은 플러그, 쉘 플러그, 또는 쉘 층 또는 뼈이다.
일부 구현예에서, 본 기술의 연골 제품은 천연 인간 콜라겐 기질인 콜라겐 기질을 함유한다. 다른 구현예에서, 콜라겐 기질은 히알린 연골을 포함한다.
다른 구현예에서, 본 기술의 연골 제품은 히알린 연골을 포함한다. 일부 구현예에서, 히알린 연골은 관절 연골을 포함한다.
다른 구현예에서, 본 기술의 연골 제품은 콜라겐 기질을 함유하며, 콜라겐 기질은 약 500세포/mm2, 약 600세포/mm2, 약 700세포/mm2, 약 800세포/mm2, 약 1200세포/mm2, 약 1500세포/mm2, 및 약 5000세포/mm2 중 적어도 임의의 양으로 생존 연골세포를 포함하고, 선택적으로 생존 연골세포의 기원이 콜라겐 기질이다.
다른 구현예에서, 본 기술의 연골 제품은 콜라겐 기질을 함유하며, 콜라겐 기질은 접면층, 이행층, 및 방사층에서 선택되는 하나 이상의 층을 포함한다. 일부 구현예에서, 콜라겐 기질은 약 100세포/mm2, 약 200세포/mm2, 및 약 1000세포/mm2 중 적어도 임의를 포함하는 접면층을 포함하며, 선택적으로 생존 연골세포의 기원이 콜라겐 기질이다.
일부 구현예에서, 연골 제품은 약 100세포/mm2, 약 200세포/mm2, 및 약 400세포/mm2 중 적어도 임의를 포함하는 이행층을 포함하는 콜라겐 기질을 함유하며, 선택적으로 생존 연골세포의 기원이 콜라겐 기질이다.
다른 구현예에서, 연골 제품은 약 100세포/mm2 및 약 200세포/mm2 중 적어도 임의를 포함하는 방사층을 포함하는 콜라겐 기질을 함유하며, 선택적으로 생존 연골세포의 기원이 콜라겐 기질이다.
또 다른 구현예에서, 본 기술의 연골 제품은 콜라겐 기질을 함유하며, 콜라겐 기질은 가요성이고, 선택적으로 콜라겐 기질은 파단 없이 굽히거나 접을 수 있는 정도로 가요성을 갖는다. 일부 구현예에서, 연골 제품은 약 0.1MPa, 0.2MPa, 0.3MPa, 및 0.4MPa 중 적어도 임의의 영률(Young's modulus)을 갖는 콜라겐 기질을 함유한다.
다른 구현예는 본 기술의 연골 제품을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 치료 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 연골 제품은 관절경으로 투여된다. 또 다른 구현예에서, 투여는 연골 제품의 접음 또는 롤링을 포함한다. 다른 구현예에서, 투여 단계는 미세골절 시술과 함께 수행된다.
또 다른 구현예에서, 본 기술의 연골 제품에는 II형 콜라겐을 포함하는 콜라겐 기질이 포함된다. 일부 구현예에서, 연골 제품에는 히알린 연골을 포함하는 콜라겐 기질이 포함된다. 일부 구현예에서, 연골 제품에는 천연 콜라겐 기질인 콜라겐 기질이 포함되며, 선택적으로 콜라겐 기질은 인간 콜라겐 기질이다.
다른 구현예에서, 본 기술의 연골 제품에는 천연 콜라겐 기질인 콜라겐 기질이 포함되며, 선택적으로 콜라겐 기질은 인간 콜라겐 기질이다.
일부 구현예에서, 연골 제품은 첨가제를 추가로 포함한다.

Claims (40)

  1. 손상 콜라겐 기질을 포함하는 연골 제품.
  2. 제1항에 있어서, 상기 콜라겐 기질이 효소적 손상들을 포함하는 연골 제품.
  3. 제2항에 있어서, 상기 콜라겐 기질이 콜라게나아제로 소화되며, 임의로 상기 콜라겐 기질이 콜라게나아제 II로 소화되는 연골 제품.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 콜라겐 기질이 기계적 손상들을 포함하는 연골 제품.
  5. 제4항에 있어서, 상기 기계적 손상들이 부분적인 기계적 손상들이며, 상기 콜라겐 기질은 실질적으로 온전한 연골 제품.
  6. 제5항에 있어서, 상기 기계적 손상들이 나선형 커팅, 홈들, 새김줄들, 개창들, 및 개구들에서 선택되는 연골 제품.
  7. 제4항에 있어서, 상기 기계적 손상들은 전체적인 기계적 손상들이며, 임의로 상기 콜라겐 기질이 분쇄되는 연골 제품.
  8. 제4항에 있어서, 상기 기계적 손상들이 조직 제거 유형인 연골 제품.
  9. 제4항에 있어서, 상기 기계적 손상들이 조직 비제거 유형인 연골 제품.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 상기 기계적 손상들이 상기 콜라겐 기질의 전체 두께에 걸쳐 연장되는 연골 제품.
  11. 제10항에 있어서, 상기 기계적 손상들은 나선형 커팅, 새김줄들, 교차 새김줄들, 방사 새김줄들, 후프-커팅, 및 개구들에서 선택되는 연골 제품.
  12. 제8항 또는 제9항에 있어서, 상기 기계적 손상들이 상기 콜라겐 기질의 전체 두께보다 적게 연장되는 연골 제품.
  13. 제12항에 있어서, 상기 기계적 손상들이 나선형 커팅, 새김줄들, 교차-새김줄들, 및 방사 새김줄들에서 선택되는 연골 제품.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 콜라겐 기질이 약 0.2mm 내지 약 2.0mm의 두께를 갖는 연골 제품.
  15. 제14항에 있어서, 상기 콜라겐 기질이 약 1mm 내지 약 1.5mm의 두께를 갖는 연골 제품.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 콜라겐 기질이 생존 세포들을 함유하며, 임의로 상기 생존 세포들의 기원이 상기 콜라겐 기질인 연골 제품.
  17. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 콜라겐 기질이 탈세포화된 연골 제품.
  18. 제15항에 있어서, 뼈층을 추가로 포함하며, 임의로 상기 뼈층의 기원이 상기 콜라겐 기질인 연골 제품.
  19. 제18항에 있어서, 상기 뼈층이 상기 콜라겐 기질보다 실질적으로 작은 표면적을 갖는 연골 제품.
  20. 제19항에 있어서, 상기 뼈층이 플러그(plug), 쉘 플러그(shelled plug), 또는 쉘(shelled) 층 또는 뼈인 연골 제품.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 콜라겐 기질이 천연 인간 콜라겐 기질인 연골 제품.
  22. 제21항에 있어서, 상기 콜라겐 기질이 히알린 연골을 포함하는 연골 제품.
  23. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 콜라겐 기질이 히알린 연골을 포함하는 연골 제품.
  24. 제23항에 있어서, 상기 히알린 연골이 관절 연골을 포함하는 연골 제품.
  25. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 콜라겐 기질이 약 500 세포/mm2, 약 600 세포/mm2, 약 700 세포/mm2, 약 800 세포/mm2, 약 1200 세포/mm2, 약 1500 세포/mm2, 및 약 5000 세포/mm2 중 적어도 어느 하나의 양으로 생존 연골세포들을 포함하고, 임의로 상기 생존 연골세포들의 기원이 상기 콜라겐 기질인 연골 제품.
  26. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 콜라겐 기질이 접면층, 이행층, 및 방사층에서 선택되는 하나 이상의 층들을 포함하는 연골 제품.
  27. 제26항에 있어서, 상기 콜라겐 기질이 약 100 세포/mm2, 약 200 세포/mm2, 및 약 1000 세포/mm2 중 적어도 어느 하나를 포함하는 접면층을 포함하며, 임의로 상기 생존 연골세포들의 기원이 상기 콜라겐 기질인 연골 제품.
  28. 제26항에 있어서, 상기 콜라겐 기질이 약 100 세포/mm2, 약 200 세포/mm2, 및 약 400 세포/mm2 중 적어도 어느 하나를 포함하는 이행층을 포함하며, 임의로 상기 생존 연골세포들의 기원이 상기 콜라겐 기질인 연골 제품.
  29. 제26항에 있어서, 상기 콜라겐 기질이 약 100 세포/mm2 및 약 200 세포/mm2중 적어도 어느 하나를 포함하는 방사층을 포함하며, 임의로 상기 생존 연골세포들의 기원이 상기 콜라겐 기질인 연골 제품.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 콜라겐 기질이 가요성이고, 임의로 상기 콜라겐 기질이 파단 없이 굽히거나 접을 수 있을 정도로 가요성을 갖는 연골 제품.
  31. 제30항에 있어서, 상기 콜라겐 기질이 약 0.1MPa, 0.2MPa, 0.3MPa, 및 0.4MPa 중 적어도 어느 하나의 영률(Young's modulus)을 갖는 연골 제품.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항의 연골 제품을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 것을 포함하는 치료 방법.
  33. 제32항에 있어서, 상기 연골 제품이 관절경으로 투여되는 방법.
  34. 제32항에 있어서, 상기 투여가 상기 연골 제품의 접음 또는 롤링을 포함하는 방법.
  35. 제32항에 있어서, 상기 투여 단계가 미세골절 시술과 함께 수행되는 방법.
  36. 제25항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 콜라겐 기질이 II형 콜라겐을 포함하는 연골 제품.
  37. 제36항에 있어서, 상기 콜라겐 기질이 히알린 연골을 포함하는 연골 제품.
  38. 제37항에 있어서, 상기 콜라겐 기질이 천연 콜라겐 기질이고, 임의로 상기 콜라겐 기질이 인간 콜라겐 기질인 연골 제품.
  39. 제25항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 콜라겐 기질이 천연 콜라겐 기질이고, 임의로 상기 콜라겐 기질이 인간 콜라겐 기질인 연골 제품.
  40. 제1항 내지 제31항 및 제36항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 첨가제를 추가로 포함하는 연골 제품.
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