MX2015000460A

MX2015000460A - Productos de cartilago alterados.

Info

Publication number: MX2015000460A
Application number: MX2015000460A
Authority: MX
Inventors: Dana Sue Yoo; Jin-Qiang Kuang; Jaime Paden; Scott A Maxson; Alla Danilkovitch; Erasmo Lopez; Samson Tom
Original assignee: Osiris Therapeutics Inc
Priority date: 2012-07-11
Filing date: 2013-07-11
Publication date: 2015-07-06
Also published as: BR112015000670A2; AU2013290064A1; SG11201500189PA; CA2878802A1; US20140017283A1; US11406735B2; JP2015523153A; EP2872071A4; EP2872071A1; US20150140057A1; CA2878921A1; JP2015523154A; US20140017292A1; EP2874571A4; WO2014011890A1; US20220184277A1; EP2872189A4; SG11201500181UA; CA2878808A1; AU2013290152B2

Abstract

La presente invención proporciona productos de cartílago alterado, métodos para fabricar productos de cartílago alterado y métodos para tratar a un sujeto, el cual comprende administrar un producto de cartílago; los productos de cartílago se fabrican por medio de un método que comprende alterar una matriz de colágeno, por ejemplo, para producir un producto de cartílago flexible; opcionalmente, los productos de cartílago comprenden condorcitos viables, factores bioactivos tales como factores condrogénicos y una matriz de tipo II; opcionalmente, los productos de cartílago son no inmunogénicos.

Description

PRODUCTOS DE CARTÍLAGO ALTERADOS REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS La presente solicitud reivindica la prioridad de: Solicitud provisional estadounidense n.° 61/670,434, con el título "Disrupted Cartilage Products", presentada el 11 de julio de 2011 y con el n.° de expediente 25533US01 en la oficina de McAndrews, Held and Malloy; Solicitud provisional estadounidense n.° 61/670,424, con el título "Porated Cartilage Products", presentada el 11 de julio de 2011 y con el n.° de expediente 25532US01 en la oficina de McAndrews, Held and Malloy; y Solicitud provisional estadounidense n.° 61/670,444, con el título "Methods of Manufacturing Cartilage Products," presentada el 11 de julio de 2011 con el n.° de expediente 25534US01 en la oficina de McAndrews, Held and Malloy; cuyos contenidos se incorporan en la presente en su totalidad mediante esta referencia.

Esta solicitud se presenta conjuntamente con solicitudes estadounidense y PCT con el título "Methods of Manufacturing Cartilage Products", con los n.° de expedientes 25534US02 y 25534WO01 en la oficina de McAndrews, Held and Malloy, respectivamente; solicitudes PCT y estadounidense con el título "Porated Cartilage Products" con los n.° de expediente 25532US02 y 25532WO01 en la oficina de McAndrews, Held and Malloy, respectivamente y solicitud estadounidense con el título "Disrupted Cartilage Products" con el n.° de expediente 25533US02 en la oficina de McAndrews, Held and Malloy, que se incorporan en la presente en su totalidad mediante esta referencia.

CAMPO TÉCNICO La presente invención se refiere a productos de cartílago útiles en productos terapéuticos y métodos para producir y usar tales productos terapéuticos.

ANTECEDENTESDELAINVENCIÓN La lesión del cartílago articular sigue siendo uno de los principales problemas sin solución en la ortopedia. Más de 500,000 pacientes por año en Estados Unidos se someten a procedimientos quirúrgicos para reparar el daño del cartílago. Sin embargo, muchas de estas cirugías proporcionan resultados subóptimos.

El cartílago articular consiste principalmente en una escasa población de condrocitos distribuida a través de una matriz extracelular formada por proteogllcanos en una fibrilla de colágeno de tipo II. Los colágenos le proporcionan al tejido su forma y resistencia a la tensión y la Interacción de los proteoglicanos con agua le proporciona al tejido su resistencia a la compresión, elasticidad y durabilidad. El cartílago hialino proporciona una superficie con baja fricción sobre las partes óseas de la articulación. Si el revestimiento se desgasta o daña resultando en lesiones, el movimiento de las articulaciones puede ser doloroso o restringirse gravemente. Mientras que el hueso dañado típicamente se puede regenerar de forma exitosa, la regeneración del cartílago hialino es bastante limitada.

Los tratamientos quirúrgicos actuales incluyen microfractura, desbridamiento, injerto osteocondral e implante de condrocito autólogo (ACI). El objetivo de estos tratamientos es reparar y regenerar el cartílago hialino natural (colágeno tipo II).

La microfractura implica la remoción de cartílago articular dañado seguido de daño físico al hueso subcondral subyacente a la médula ósea expuesta y crea sangrado. Pese a que el coágulo sanguíneo introduce citocinas inflamatorias, factores de crecimiento y MSC para corregir el defecto, el proceso no logra producir cartílago articular y en vez de esto estimula la producción de tejido cicatrizal de fibrocartílago hecho de colágeno tipo I. El fibrocartílago tiene un pobre desempeño biomecánico en el largo plazo, provoca un crecimiento óseo anormal y aumenta el riesgo de osteoartritis.

Otras estrategias que no han sido suficientes incluyen implante de condrocito autólogo (ACI), desbridamiento e injerto osteocondral.

Gomes et ál. (US 2004/0230303) describe un implante con una base ósea subcondral y una tapa de cartílago articular que contiene agujeros perforados a través de la tapa de cartílago y base para permitir la migración celular. El implante se puede digerir con hialuronidasa (tipo IV-s, 3 mg/mL) y tripsina (0.25% en amortiguador monodibásico 3 mi) durante 18 horas a 37 °C. Gomes et ál. no enseñan un implante de cartílago flexible, un implante de cartílago que contiene condrocitos naturales viables ni un implante de cartílago no inmunogénico.

Chen et ál. (US 2009/0024229) describe un injerto de cartílago que se desvitaliza (se hace acelular) y luego se recelulariza. El injerto se puede microperforar para facilitar la recelularización. El injerto se puede desvitalizar usando enzimas para modificar los aspectos moleculares del cartílago tales como condroitinasa para retirar el proteoglicano y una endonucleasa recombinante, por ejemplo BENZONASE.RTM. (Merk, Inc.). Chen et ál. no enseñan un implante de cartílago flexible, un implante de cartílago que contiene condrocitos naturales viables ni un implante de cartílago no inmunogénico.

Steinwachs et ál. (US 2008/0269895) describe implantes de cartílago con varios rasgos. El implante se puede cultivar in vitro desde condrocitos o puede ser un explante de cartílago. Entre varios rasgos, el Implante puede tener canales con un diámetro de 0.5 mm a 2 mm. Entre otros defectos, Stelnwachs et ál. no enseñan un implante de cartílago digerido ni un Implante de cartílago no ¡nmunogénlco.

Bardos et ál. ("Osteochondral Integration of Multiply Inclsed Puré Cartilage Allograft: Repair Method of Focal Chondral Defects ¡n a PorcineModel"; Am J SportsMed 2009 37: 50S) describe una muestra de cartílago de cerdo que comprende Incisiones paralelas. Bardos et ál. no enseña sobre una muestra de cartílago con corte en espiral ni una muestra de cartílago no inmunogénica.

Bravenboer et ál. ("Improved cartilage Integration and interfaclal strength alter enzymatlc treatment ¡n a cartilage transplantatlon model"; Arthritis Res Ther 2004, 6) describe cartílago articular bovino tratado con hialuronldasa seguido de colagenasa. Entre otros defectos, Bravenboer et ál. no enseñan una muestra de cartílago alterada mecánicamente ni una muestra de cartílago no Inmunogénica.

Bos et ál. ("Speclflc Enzymatic Treatment of Bovine and Human Articular Cartilage"; Arthritis & Rheumatism tomo 46, n.° 4, abril 2002, pp 976-985) describe muestras de cartílago tratadas con colagenasa VII. Bos et ál. no enseña sobre una muestra de cartílago alterada mecánicamente ni una muestra de cartílago no inmunogénica.

Lo que se necesita en la téenica es un producto de cartílago flexible que se pueda administrar fácilmente, por ejemplo, a través de una cánula artroscóplca y contornearse a un sitio de cartílago lesionado y que proporcione una matriz de colágeno tipo II que contiene condrocitos viables y factores condrogénicos para la regeneración de cartílago con cicatrización mínima.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención proporciona productos de cartílago, métodos para fabricar los productos de cartílago y métodos para usar los productos de cartílago. Un producto de cartílago de acuerdo con la presente Invención comprende una matriz de colágeno alterada. La matriz de colágeno comprende alteraciones mecánicas (por ejemplo, la matriz de colágeno se corta en espiral), alteraciones enzlmátlcas (por ejemplo, la matriz de colágeno se trata con colagenasa) o tanto alteraciones mecánicas como alteraciones enzimáticas.

La matriz de colágeno de ejemplos de productos de cartílago de la presente invención tiene uno o más (por ejemplo, cada uno) de los siguientes rasgos técnicos: • deriva de cartílago hialino o comprende colágeno II • comprende células viables que son opcionalmente naturales a la matriz de colágeno; • comprende factores bioactivos • presenta mayor flexibilidad que el cartílago articular natural y • se criopreserva o formula en un medio de criopreservación y es sustancialmente no inmunogénica.

En una modalidad, la matriz de colágeno comprende colágeno tipo II (o "colágeno II"). Opcionalmente, una mayoría del colágeno en la matriz de colágeno es colágeno II, tal como una matriz de colágeno proporcionada por cartílago hialino (por ejemplo, cartílago articular). Opcionalmente, el producto de cartílago está desprovisto de hueso subcondral, cartílago calcificado o tanto hueso subcondral como cartílago calcificado. Opcionalmente, la matriz de colágeno comprende una o más capas de cartílago que se seleccionan de: una capa radial, una capa de transición y una capa tangencial.

En una modalidad, el producto de cartílago comprende células viables. Opcionalmente, las células viables son condrocitos. Opcionalmente, las células viables son naturales a la matriz de colágeno. Opcionalmente, las células viables se distribuyen a través de la matriz de colágeno en un gradiente. Opcionalmente, los poros se alinean con el gradiente.

En una modalidad, el producto de cartílago comprende factores bioactivos tales como factores condrogénicos. Opcionalmente, los factores condrogénicos se seleccionan del grupo que consiste en TGF-bI, TGF- 2, TGF-p3, BMP-2, BMP-7, bFGF, e IGF-1. Opcionalmente, el cartílago comprende colágeno II, hialuronano y agrecano.

En una modalidad, las alteraciones son alteraciones enzimáticas y los fragmentos de proteína ECM (por ejemplo, colágeno) son sustancialmente más cortos que los del cartílago articular natural. De manera adicional o alternativa, una cantidad sustancial de la proteína ECM en la matriz de colágeno se fragmenta respecto de la del cartílago articular natural. Opcionalmente, los fragmentos de proteína ECM se producen por alteración enzimática ("digestión") de un cartílago natural, por ejemplo, digestión tal como tratamiento con colagenasa (por ejemplo, tipo II).

En una modalidad, las alteraciones mecánicas son del tipo con remoción de tejido. Opcionalmente, las alteraciones mecánicas del tipo con remoción de tejido se seleccionan de: cortes en espiral, ranuras, ranuras cruzadas, poros y cortes de núcleo que forman aros.

En una modalidad, las alteraciones mecánicas son del tipo sin remoción de tejido. Opcionalmente, las alteraciones mecánicas del tipo sin remoción de tejido se seleccionan de: estrías, cortes en espiral, líneas cruzadas y perforaciones.

En una modalidad, las alteraciones mecánicas alteran (es decir, se extienden a través de) todo el espesor de la muestra de cartílago. De manera alternativa, las alteraciones mecánicas alteran menos que la totalidad del espesor de la muestra de cartílago.

En una modalidad, el producto de cartílago es sustanclalmente no inmunogénico. Opcionalmente, el producto de cartílago no comprende una cantidad sustancial de macrófagos.

En una modalidad, la matriz de colágeno tiene un espesor de alrededor de 0.5 a alrededor de 2.0 mm. Opcionalmente, el espesor es de alrededor de 1 a alrededor de 2 mm. Opcionalmente, el espesor es de alrededor de 1 a alrededor de 1.5 mm.

En una modalidad, la matriz de colágeno alterada es más flexible que el cartílago articular no modificado de espesor similar.

La invención también proporciona un método para hacer un producto de cartílago que comprende proporcionar una muestra de cartílago y alterar la muestra de cartílago por alteración mecánica, alteración enzimática o tanto alteración mecánica como alteración enzimática y digerir parcialmente la muestra de cartílago.

Los ejemplos de métodos de fabricación de la presente invención tienen uno o más (por ejemplo, cada uno) de los siguientes rasgos téenicos: • la alteración enzimática ("digestión parcial") se realiza en una forma que retiene una cantidad sustancial de células viables; • la muestra de cartílago se altera mecánicamente hasta un grado que aumenta la flexibilidad de la muestra de cartílago; • la muestra de cartílago comprende cartílago hialino y • la muestra de cartílago se criopreserva, por ejemplo después del paso de alteración.

En una modalidad, el paso de digestión parcial se realiza en una forma que retiene una cantidad sustancial de células viables, por ejemplo, limitando la digestión a una cantidad que prescinde de células. Opcionaimente, dicho paso de digestión parcial comprende digerir colágeno. Opcionalmente, dicho paso de digestión parcial comprende digestión enzimática, por ejemplo, digestión con una proteinasa tal como colagenasa (por ejemplo, colagenasa Tipo II).

En una modalidad, la muestra de cartílago se altera mecánicamente hasta un grado que aumenta la flexibilidad de la muestra de cartílago. Opcionalmente, se proporcionan alteraciones mecánicas que alteran (es decir, se extienden a través de) la totalidad del espesor de la muestra de cartílago. Opcionalmente, se proporcionan alteraciones mecánicas que no alteran la totalidad del espesor de la muestra de cartílago.

En una modalidad, la muestra de cartílago comprende cartílago hialino. Opcionalmente, la muestra de cartílago es una muestra de cartílago articular. Opcionalmente, la muestra de cartílago se aísla del hueso subcondral, cartílago calcificado o ambos.

En una modalidad, la muestra de cartílago se criopreserva después del paso de alteración. Opcionalmente, el paso de criopreservación comprende criopreservar en una forma que prescinde de las células viables.

En algunas modalidades, los productos de cartílago de la presente invención no se digieren. En otras modalidades, los productos de cartílago de la presente invención se digieren parcialmente por medios digestivos que incluyen medios enzimáticos (por ejemplo tratamiento con colegenasa, pronasa, proteinasa K, etc.), bioquímicos (por ejemplo papaína), térmicos (por ejemplo mayor calor), químicos (sulfato de queratina, tosilisilclorometano), mecánicos (perforados), cualquier otro medio de digestión conocido por los expertos en la téenica, y combinaciones de cualesquiera dos o más de lo siguiente.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS La Figura 1 ilustra una articulación de rodilla a partir de la cual se puede realizar un producto de la presente invención.

La Figura 2 ilustra capas de cartílago articular y hueso adyacente de la presente invención.

Las Figuras 3A y 3B ilustran condrocitos viables en productos de cartílago criopreservados de la presente invención.

Las Figuras 4A a 4C ilustran condrocitos viables en productos de cartílago criopreservados de la presente invención.

Las Figuras 5A y 5B ilustran condrocitos viables en productos de cartílago criopreservados de la presente invención.

Las Figuras 6A y 6B ilustran condrocitos viables en productos de cartílago criopreservados de la presente invención.

Las Figuras 7A y 7B ilustran condrocitos viables en productos de cartílago criopreservados de la presente invención.

Las Figuras 8A a 8C ilustran condrocitos viables en productos de cartílago criopreservados de la presente invención.

La Figura 9 ilustra la no inmunogenicidad de productos de cartílago de la presente invención.

Las Figuras 10A y 10B ¡lustran la liberación sostenida de factores condrogénicos de productos de cartílago de la presente invención.

La Figura 11 ilustra una mayor liberación de factores condrogénicos de productos de cartílago porosos de la presente invención.

La Figura 12 ilustra una mayor liberación de factores condrogénicos de productos de cartílago digeridos de la presente invención.

La Figura 13 ilustra una mayor liberación de factores condrogénicos de productos de cartílago criopreservados de la presente invención.

Las Figuras 14A a 14D ilustran el efecto del tratamiento con yodo sobre la viabilidad celular.

Las Figuras 15A y 15B ilustran un producto de cartílago de la presente invención. La Figura 15A ilustra los nombres usados en la presente para hacer referencia a superficies del producto de cartílago. La Figura 15B ilustra el diámetro usado para el cálculo de área de superficie, la altura usada para el cálculo de espesor y la orientación opcional de capas o gradiente.

Las Figuras 16A y 16B ilustran productos de cartílago de la presente invención que comprenden una matriz de colágeno y hueso.

Las Figuras 17A a 17C ilustran productos de cartílago de la presente invención que se sometieron a alteración mecánica del tipo sin remoción de tejido. Figura 17A: estriación paralela; Figura 17B: estriación no alineada; Figura 17C: corte en espiral.

Las Figuras 18A a 18D ilustran productos de cartílago de la presente invención que se sometieron a alteración mecánica del tipo con remoción de tejido. Figura 18A: ranuras rectangulares, Figura 18B: ranuras con corte en V (que se van estrechando hacia adentro); Figura 18C: ranuras con corte en V (que se van estrechando hacia afuera); Figura 18D: ranuras que se cruzan.

Las Figuras 19A y 19B ilustran productos de cartílago de la presente invención que se sometieron a alteración mecánica del tipo formación de aro. Figura 19A: Aro simple; Figura 19B: múltiples aros.

Las Figuras 20A y 20B ilustran un producto de cartílago de la presente invención que se sometió a alteración mecánica del tipo con remoción de tejido, corte en espiral. Figura 20A: Vista en perspectiva; Figura 20B: vista superior.

Las Figuras 21A y 21B ilustran un producto de cartílago de la presente Invención que se sometió a alteración mecánica del tipo con remoción de tejido, corte en espiral modificado. Figura 21A: Vista en perspectiva; Figura 21B: vista superior.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Tal como se usa en la presente, las siguientes definiciones y abreviaturas son aplicables: "BTB" significa injerto de hueso-tendón-hueso obtenido de la articulación de la rodilla y que comprende la rótula, el tendón rotuliano y el bloque de hueso tibial unido.

"Producto de cartílago", a menos que el contexto requiera otra cosa, significa un producto de cartílago de la presente Invención.

"Alteración" se refiere a tratar una matriz de colágeno en una forma que proporciona interrupciones en la matriz. En una modalidad, la alteración comprende alteración enzimática ("alteración parcial"). En otra modalidad, la alteración comprende alteración mecánica. En otra modalidad, la alteración comprende alteración mecánica y digestión parcial.

"DMEM" significa medio Eagle modificado por Dulbecco.

"D-PBS" significa solución salina amortiguada con fosfato de Dulbecco.

"ECM" significa matriz extracelular, por ejemplo, la matriz de cartílago.

"Ejemplo" (o "p. ej." o "por ejemplo") significa un ejemplo no taxativo.

"Alteración mecánica" significa proporcionar interrupciones específicas en la matriz de colágeno por tratamiento mecánico. Las interrupciones específicas pueden proporcionarse por una téenica con remoción de tejido (por ejemplo, como se ilustra en las Figuras 18A a 18D a las Figuras 21A y 21B) o por técnica sin remoción de tejido (por ejemplo, como se ilustra en las Figuras 17A a 17C). En una modalidad, las interrupciones específicas se proporcionan en todo el espesor de la matriz de colágeno (por ejemplo, como se ilustra en la Figura 17B, Figura 17C y Figuras 19A y 19B a Figuras 21A y 21B). En otra modalidad, las interrupciones específicas se proporcionan a través de menos de todo el espesor de la matriz de colágeno (por ejemplo, como se ilustra en la Figura 17A y Figuras 18A a 18D). En una modalidad, una matriz de colágeno alterada mecánicamente no comprende un disco de cartílago circular que comprende un núcleo retirado (por ejemplo, como se ilustra en la Figura 19A) si el núcleo retirado tiene un área de superficie menor que 15% en comparación con el disco de cartílago antes de dicha remoción de núcleo.

"Natural" en el contexto de, por ejemplo, "ECM natural" o "cartílago natural", se refiere a propiedades que presenta el ECM o cartílago en su estado natural en el donante.

"Digestión parcial" (o "digestiones limitadas") se refiere a digestión enzimática donde uno o más sitios digeribles no se digieren. En una modalidad, la digestión parcial es una digestión que prescinde de células tal que la digestión adicional de otro modo reduce la viabilidad celular. En una modalidad, la digestión se puede monitorear por cualquier método, por ejemplo, midiendo la liberación de productos de digestión de una muestra de cartílago o por el efecto de la digestión sobre las propiedades físicas. En una modalidad, una matriz de colágeno parcialmente digerida (por ejemplo, muestra de cartílago articular) está sustancialmente intacta respecto de una matriz de colágeno no digerida, por ejemplo, la matriz de colágeno digerida retiene su forma a través de la digestión.

"QC" significa control de calidad.

"Cantidad sustancial" cuando se usa respecto de células terapéuticas (por ejemplo, condrocitos) y factores bioactivos terapéuticos (por ejemplo, factores condrogénicos) en un producto de cartílago significa una cantidad que proporciona un efecto terapéutico medible in vivo cuando se administra el producto de cartílago, por ejemplo, de acuerdo con los métodos de tratamiento de la presente.

El término "desprovisto de" una sustancia como se usa respecto a la presente teenología incluye productos que están "sustancialmente libres de" o "sustancialmente desprovistos de" tal sustancia e incluyen productos que tienen menos que 5% de la sustancia, más preferentemente menos que 2%, más preferentemente menos que 1%, más preferentemente menos que 0.5%, incluyendo 0% de tal sustancia. Por ejemplo, en algunas modalidades de la presente invención, desprovisto de hueso subcondral, cartílago calcificado o tanto hueso subcondral como cartílago calcificado, cuando se usan respecto de la presente tecnología incluyen productos de cartílago que están sustancialmente libres de hueso subcondral, cartílago calcificado o ambos, y productos de cartílago que están sustancialmente desprovistos de hueso subcondral, cartílago calcificado o ambos y productos que contienen menos que 5%, menos que 2%, menos que 1%, menos que 0.5% o 0% de hueso subcondral, cartílago calcificado o ambos.

Productos de cartílago La presente invención proporciona un producto de cartílago que comprende una matriz de colágeno con múltiples poros en su interior. Opcionalmente, ¡a matriz de colágeno comprende fragmentos de proteína ECM, por ejemplo, la matriz de colágeno es cartílago hialino digerido.

En algunas modalidades, el producto de cartílago comprende una matriz con uno o más poros en su interior.

Sorprendentemente, los ejemplos de productos de cartílago de la presente invención soportan la regeneración de cartílago articular normal saludable proporcionando colágeno tipo II y proteoglicanos, factores bioactivos y condrocitos viables.

En una modalidad, el producto de cartílago es flexible. Un ejemplo de producto de cartílago flexible se puede enrollar en una cánula artroscópica, se puede doblar considerablemente sin romperse y puede contornearse en sitios objetivo irregulares en un sujeto. Sorprendentemente, se ha descubierto que un producto de cartílago flexible con células y factores viables se puede producir configurando de manera apropiada a) el espesor de la matriz de colágeno; b) grado de alteración mecánica y c) grado de digestión.

En una modalidad, el producto de cartílago comprende células viables tales como condrocitos. Opcionalmente, las células viables son condrocitos naturales. Opcionalmente, las células viables se distribuyen a través de la matriz de colágeno en un gradiente. Opcionalmente, la matriz de colágeno comprende alteraciones mecánicas que se extienden al menos parcialmente a través del gradiente (por ejemplo, poros siempre que estén sustancialmente alineados con el gradiente o perpendiculares a la superficie superior, como se ilustra en las Figuras 15A y 15B).

En una modalidad, la matriz de colágeno es alterada enzimáticamente y los fragmentos de proteína ECM (por ejemplo, colágeno) son sustancialmente más cortos que los del cartílago articular natural. De manera adicional o alternativa, una cantidad sustancial de la proteína ECM en la matriz de colágeno se fragmenta respecto de la del cartílago articular natural. Opcionalmente, los fragmentos de proteína ECM se producen por digestión parcial de un cartílago natural, por ejemplo, digestión enzimática tal como tratamiento con colagenasa (por ejemplo, tipo II).

En una modalidad, el producto de cartílago se formula para criopreservación, por ejemplo, comprende un medio de criopreservación. Opcionalmente, el producto de cartílago se criopreserva.

Para ilustrar una modalidad de la invención, un ejemplo de producto de cartílago comprende, como la matriz de colágeno, una capa (por ejemplo, disco) de cartílago hialino (por ejemplo, articular) que tiene alteraciones mecánicas (por ejemplo, corte en espiral), donde la capa de cartílago comprende condrocitos naturales viables y fragmentos de colágeno producidos por digestión parcial con una enzima digestiva de colágeno tal como una colagenasa. La capa de cartílago es flexible a la vez que retiene su integridad estructural. El producto de cartílago está desprovisto de hueso subcondral y cartílago calcificado y comprende una capa radial, una capa de transición y una capa tangencial a través de la cual se distribuye un gradiente de los condrocitos naturales viables. Opcionalmente, el producto de cartílago se formula para criopreservación.

Matriz de colágeno Un producto de cartílago de la presente invención comprende una matriz de colágeno. La matriz de colágeno puede ser cualquier matriz extracelular que comprende fibrillas de colágeno y factores bioactivos. La matriz de colágeno se puede obtener de cualquier fuente y puede tener cualquier tamaño y forma. Opcionalmente, la matriz de colágeno es flexible (por ejemplo, de modo que se puede enrollar o plegar y administrarse mediante cánula artroscópica).

En una modalidad, la matriz de colágeno se aísla de un sujeto ('matriz de colágeno natural') o se cultiva in vitro.

En una modalidad, las fibrillas de colágeno comprenden colágeno tipo II. Opcionalmente, la matriz de colágeno es cartílago hialino tal como cartílago articular. Opcionalmente, el cartílago articular es cartílago condilar, cartílago condilar de fémur, cartílago de meseta tibial, cartílago de cabeza de fémur, cartílago de cabeza humeral, cartílago de astrágalo o cartílago de acetábulo. Opcionalmente, el cartílago articular comprende una o más capas de cartílago que se seleccionan de: una capa radial, una capa de transición y una capa tangencial.

En una modalidad, la matriz de colágeno comprende proteínas ECM fragmentadas. Las proteínas ECM fragmentadas se producen opcionalmente por digestión parcial de una matriz de colágeno natural. Opcionalmente, la matriz de colágeno se digiere parcialmente con una proteinasa tal como una enzima degradadora de colágeno. Las enzimas degradadoras de colágeno útiles incluyen, de modo no taxativo, por ejemplo, colagenasa (por ejemplo, colagenasa bacteriana de Tipos I - IV), otras endopeptidasas (por ejemplo, tripsina, papaína, pepsina) y exopeptidasas (por ejemplo, carboxipeptidasa).

En una modalidad, la matriz de colágeno está desprovista de hueso subcondral, cartílago calcificado o ambos. En caso de estar presente, el hueso subcondral y el cartílago calcificado pueden de otro modo inhibir la flexibilidad de la matriz de colágeno. En una modalidad alternativa, el producto de cartílago comprende hueso, por ejemplo, un tapón de hueso de área reducida (respecto de la matriz de colágeno) como se ilustra en la Figura 16A o una cáscara de hueso como se ilustra en la Figura 16B.

En una modalidad, la matriz de colágeno deriva de cartílago articular y comprende una o más capas de cartílago que se seleccionan de: una capa radial, una capa de transición y una capa tangencial. Como se ilustra en la Figura 2, los condrocitos naturales de un cartílago articular natural se distribuyen a través de estas capas en un gradiente desde filas verticales de condrocitos en la capa radial a células aplanadas en la capa tangencial. Las fibrillas de colágeno de la capa tangencial ('superficial') son paralelas a la superficie. Las fibrillas de colágeno en la capa radial están típicamente orientadas hacia (por ejemplo, perpendiculares a) la superficie articular. Las fibras de colágeno en la capa de transición típicamente están menos apretadas que las de las capas radial y tangencial y dispuestas de forma oblicua o de forma más aleatoria respecto de la superficie articular.

En una modalidad, la matriz de colágeno tiene un espesor (o "altura" como se ilustra en las Figuras 15A y 15B) menor que alrededor de 3 mm. Opcionalmente, la matriz de colágeno tiene un espesor de alrededor de 0.2 mm a alrededor de 2 mm o alrededor de 1 mm a alrededor de 1.5 mm. El espesor se puede medir, por ejemplo, perpendicular a las capas de la matriz de colágeno (por ejemplo, distancia desde la superficie de una capa tangencial a la superficie de una capa radial) como se ilustra en la Figura 15A. Sorprendentemente, las matrices de colágeno de espesor reducido y alteración mecánica adaptada pueden proporcionar un producto de cartílago flexible que se puede administrar por artroscopía y se puede contornear fácilmente a un sitio de tejido lesionado a la vez que retiene su capacidad de proporcionar una matriz de factores y células viables.

En una modalidad, la matriz de colágeno tiene un área de superficie (por ejemplo, superficie superior o inferior, tal como la superficie de una capa tangencial o una capa radial, respectivamente) con un área de alrededor de 0.5 cm2 a alrededor de 5 cm2. Opcionalmente, la matriz de colágeno tiene una superficie superior y una superficie inferior separadas por un espesor menor que alrededor de 3 mm o menos que alrededor de 2 mm (por ejemplo, 1 mm a alrededor de 1.5 mm).

En una modalidad, la matriz de colágeno se proporciona en una forma redonda (por ejemplo, ovalada o circular), una forma rectangular o una forma cuadrada. Un ejemplo de producto de cartílago que comprende una matriz de colágeno redonda se ilustra en las Figuras 15A y 15B. Opcionalmente, el ancho (denominado en la presente "diámetro" independientemente de la forma) de una matriz de colágeno es mayor que la altura (denominada en la presente "espesor"), por ejemplo, como se ilustra en las Figuras 15A y 15B.

En una modalidad, la matriz de colágeno es un disco, es decir el diámetro (o ancho) de la superficie de matriz de colágeno (por ejemplo, superficie superior o inferior) es mayor que el espesor (o altura de la superficie lateral) de la matriz de colágeno, por ejemplo, como se ilustra en las Figuras 15A y 15B. Opcionalmente, los poros se proporcionan en la superficie superior, la superficie inferior o ambas.

En una modalidad, respecto de una matriz de colágeno no modificada (por ejemplo, muestra de cartílago articular aislada) la matriz de colágeno tiene flexibilidad mejorada (por ejemplo, módulo de cizallamiento reducido) pero retiene las propiedades mecánicas del cartílago. Ejemplos de tales propiedades (por ejemplo, tensión de compresión, módulo de Young) se describen en ("Biomechanics of Cartilage" Cap. 5; Obtenido de Internet URL: http:bww.cartilaaehealth.com/imaaes/artcartbiomech.pdf) En una modalidad, la matriz de colágeno es flexible (por ejemplo, tal que se puede plegar sin romperse) y comprende un módulo de Young de al menos alrededor de cualquiera de: 0.1 MPa, 0.2 MPa, 0.3 MPa, o 0.4 MPa.

Alteraciones mecánicas En una modalidad, un producto de cartílago de la presente invención comprende alteraciones mecánicas. Las alteraciones mecánicas pueden ser cualesquiera interrupciones específicas en la matriz de colágeno.

En una modalidad, las interrupciones específicas son del tipo con remoción de tejido (por ejemplo, como se ilustra en las Figuras 18A a 18D a las Figuras 21A y 21B). Las alteraciones mecánicas útiles del tipo con remoción de tejido incluyen: cortes en espiral, ranuras, ranuras cruzadas, cortes radiales, poros y cortes de núcleo que forman aros (por ejemplo, cortes que forman uno o múltiples aros). En otra modalidad, las interrupciones específicas son del tipo sin remoción de tejido (por ejemplo, como se ilustra en las Figuras 17A a 17C). Las alteraciones mecánicas útiles del tipo sin remoción de tejido incluyen: estrías (por ejemplo, como en la Figura 17A), cortes en espiral, estrías cruzadas, estrías radiales (por ejemplo, como en la Figura 17B) y perforaciones (por ejemplo, múltiples perforaciones realizadas con un objeto fino, cilindrico y puntiagudo).

En una modalidad, las interrupciones específicas se proporcionan en todo el espesor de la matriz de colágeno (por ejemplo, como se ilustra en la Figura 17B, Figura 17C y Figuras 19A y 19B a Figuras 21A y 21B). En otra modalidad, las interrupciones específicas se proporcionan a través de menos de todo el espesor de la matriz de colágeno (por ejemplo, como se ilustra en la Figura 17A y Figuras 18A a 18D).

En una modalidad, las alteraciones mecánicas son alteraciones mecánicas parciales, es decir, la matriz de colágeno retiene sustancialmente su forma respecto de la de la matriz de colágeno no modificada (por ejemplo, como se ilustra en las Figuras 15A y 15B a las Figuras 21A y 21B). En otra modalidad, las alteraciones mecánicas son alteraciones completas (por ejemplo, la matriz de colágeno se pica, por ejemplo, en múltiples piezas sólidas, en forma viscosa o en forma amorfa).

Corte en espiral En una modalidad, un producto de cartílago de la presente invención comprende una matriz de colágeno de corte en espiral. El corte en espiral puede ser cualquier corte continuo que encierre o de otro modo circunnavegue la matriz de colágeno y comprenda más que una vuelta completa. Opcionalmente, el corte en espiral se extiende en todo el espesor de la matriz de colágeno, por ejemplo, como se ilustra en las Figuras 17A a 17C, Figuras 20A y 20B y Figuras 21A y 21B.

En una modalidad, el corte en espiral se proporciona del tipo sin remoción de tejido, por ejemplo, como se ilustra en las Figuras 17A a 17C. En otra modalidad, el corte en espiral es del tipo con remoción de tejido, por ejemplo, como se ilustra en las Figuras 20A y 20B y Figuras 21A y 21B. Opcionalmente, las matrices de colágeno de corte en espiral del tipo sin remoción de tejido se pueden construir para ajustarse en un hueco (por ejemplo, defecto de cartílago retirado de un paciente) que tiene un área sustancialmente menor (por ejemplo, 90% o menos) respecto de la matriz de colágeno (por ejemplo, un disco de matriz de colágeno de corte en espiral con un diámetro de 2 cm se configura de modo que se pueda apretar y oprimir hasta un diámetro de alrededor de 1.8 cm).

En una modalidad, el corte en espiral comprende al menos dos vueltas, al menos tres vueltas, al menos cuatro vueltas o al menos cinco vueltas. Por ejemplo, las Figuras 17A a 17C, Figuras 20A y 20B y Figuras 21A y 21B ilustran matrices de colágeno que comprenden un corte en espiral con tres vueltas.

En una modalidad, el corte en espiral es del tipo sin ramificaciones (por ejemplo, como se ¡lustra en las Figuras 20A y 20B) o del tipo con ramificación (por ejemplo, como se ilustra en las Figuras 21A y 21B).

Poros En una modalidad, un producto de cartílago de la presente invención comprende una matriz de colágeno con múltiples poros. Los múltiples poros se pueden configurar de cualquier forma que aumente la flexibilidad del cartílago y proporcione múltiples pasajes a través de los cuales puedan migrar las células y los factores.

Los poros se pueden proporcionar a través de cualquier superficie de la matriz de colágeno y se pueden extender parcialmente (como en una cavidad) o completamente (como en un canal) a través de la matriz de colágeno. Por ejemplo, como se ilustra en las Figuras 15A y 15B, los poros se pueden proporcionar a través de una superficie superior, una superficie Inferior o ambas.

De acuerdo con la presente invención, los poros en la matriz de colágeno proporcionan uno o más de los siguientes rasgos téenicos: • un producto de cartílago flexible; • un producto de cartílago que tiene fijación superior y • un producto de cartílago que facilita la migración de células madre mesenquimales(MSC) y condorcitos.

En una modalidad, los múltiples poros se configuran para otorgar flexibilidad a la matriz de colágeno. Al variar la densidad y tamaño de los poros, un experto en la técnica puede producir una matriz de colágeno flexible de acuerdo con la presente invención. Opcionalmente, los múltiples poros tienen un diámetro de alrededor de 0.25 mm a alrededor de 1.5 mm tal como alrededor de 0.5 mm a alrededor de 1.5 mm (por ejemplo, alrededor de 1 mm). Opcionalmente, la matriz de colágeno comprende una densidad de poro de alrededor de 10 a alrededor de 500 poros por cm2tal como alrededor de 10 a alrededor de 100 poros por cm2 o alrededor de 10 a alrededor de 60 poros por cm2 (por ejemplo, alrededor de 36 poros por cm2). Opcionalmente, la matriz de colágeno comprende una superficie superior o inferior con un área de poro total de alrededor de 3% a alrededor de 90% (por ejemplo, alrededor de 5% a alrededor de 50% o alrededor de 10% a alrededor de 50%) respecto del área total de dicha superficie. Por ejemplo, una matriz de colágeno con poros con un diámetro de alrededor de 1 mm a 36 poros por cm2 tiene un área de poro de alrededor de 28% respecto de la del área total de la superficie.

Los múltiples poros opcionalmente otorgan fijación mejorada. Los poros pueden aumentar el área de superficie de la matriz de colágeno y proporcionar mejor adhesión, por ejemplo, facilitando la fijación tras la aplicación de un adhesivo (por ejemplo, goma de fibrina tal como Tisseel) o permitiendo una mayor integración en el sitio diana de un sujeto al que opcionalmente se le administra el producto de cartílago.

Lo múltiples poros opcionalmente facilitan la migración de MSC y condrocitos (por ejemplo, células endógenas del donante a la matriz de colágeno que migran fuera de la matriz de colágeno y las células del receptor del implante que migran a la matriz de colágeno).

En una modalidad, los poros son canales o cavidades. Un canal es cualquier poro que se extiende a través de dos caras (por ejemplo, a través de una superficie superior y una superficie inferior) de la matriz de colágeno. Una cavidad es cualquier poro que no se extiende a través de dos caras de la matriz de colágeno. Opcionalmente, los poros se disponen en un arreglo, por ejemplo, un arreglo bidimensional. Opcionalmente, la matriz de colágeno comprende una o más capas de ECM o celulares (por ejemplo, capas radial, tangencial o de transición) y los poros se extienden sustancialmente en perpendicular (es decir, 90° ± 45°) a una o más capas o diagonalmente a una o más capas, o la matriz de colágeno comprende un gradiente de células y los poros están alineados o están sustancialmente paralelos (es decir, 0°± 45°) con el gradiente, por ejemplo, como se ilustra en las Figuras 15A y 15B.

En una modalidad, la matriz de colágeno comprende múltiples poros con un diámetro que se selecciona de: alrededor de 0.3 mm a alrededor de 2 mm, alrededor de 0.5 mm a alrededor de 1.5 mm, alrededor de 0.8 mm a alrededor de 1.2 mm o alrededor de 1 mm.

En una modalidad, la matriz de colágeno comprende múltiples poros, donde alrededor de 3% a alrededor de 90% del área de superficie es porosa (por ejemplo, alrededor de 3% a alrededor de 50% o alrededor de 5% a alrededor de 50% o alrededor de 3% a alrededor de 30% o alrededor dé 5% a alrededor de 50%). Por ejemplo, una matriz de colágeno que comprende poros cilindricos con 1 mm de diámetro a una densidad de poro de 36 poros por cm2 comprendería alrededor de 28 mm2de área de superficie porosa por cm2 de área de superficie total de la matriz de colágeno [(0.5 mm de radio de poro)x(n)x(36 poros/cm2)], es decir, 28% de área de superficie porosa.

En una modalidad, el tamaño del poro es de alrededor de 50% a alrededor de 150% del espesor de la matriz de colágeno o longitud del poro.

Los poros se pueden producir de cualquier forma, por ejemplo, remoción mecánica de la matriz de colágeno usando un taladro o bisturí circular.

ECM fragmentado De acuerdo con la presente invención, la alteración enzimática ("digestión parcial") se proporciona opcionalmente en un producto de cartílago para proporcionar proteínas de ECM fragmentadas.

En una modalidad, las proteínas ECM fragmentadas son fragmentos de colágeno (por ejemplo, tipo II) o fragmentos de proteoglicano. Opcionalmente, la matriz de colágeno es cartílago articular.

Las proteínas ECM fragmentadas se pueden producir de cualquier manera. Las proteínas ECM fragmentadas se producen opcionalmente por digestión parcial de una matriz de colágeno natural (es decir, aisladas de un sujeto). Opcionalmente, la matriz de colágeno se digiere parcialmente con una enzima de digestión (por ejemplo, proteinasa) tal como, por ejemplo, una enzima degradadora de colágeno (por ejemplo, colagenasa) o una enzima degradadora de proteoglicano (por ejemplo, hialuranidasa).

De acuerdo con la presente invención, la digestión parcial de una matriz de colágeno proporciona uno o más de los siguientes rasgos téenicos: • una ECM floja que libera y permite la migración de factores celulares y células viables. • una ECM natural que retiene células naturales viables • preservación de interacciones fisiológicas entre las células y la ECM • un producto de cartílago limpio desprovisto de restos • un producto de cartílago que comprende fibrillas de ECM que retienen sustanclalmente la densidad de empaquetamiento de cartílago natural • un producto de cartílago con mayor flexibilidad • retira macrófagos y reduce la inmunogenicidad Una ECM fragmentada proporciona una matriz de colágeno floja y permite la migración de factores celulares y células viables. Por ejemplo, los factores celulares (por ejemplo, condrogénicos) pueden lixiviarse en el microambiente circundante tras la administración a un sujeto. Con las enseñanzas provistas en la presente, un experto en la técnica puede ahora adaptar la digestión para proporcionar tal rasgo técnico.

En una modalidad, la fragmentación de ECM se limita a una cantidad que retiene una cantidad sustancial de células naturales viables. Tras una fragmentación adicional, la matriz de colágeno puede liberar prematuramente su población de células antes de la administración opcional del producto de cartílago. Con las enseñanzas provistas en la presente, un experto en la técnica puede ahora adaptar la digestión para proporcionar tal rasgo técnico.

En una modalidad, la ECM se fragmenta de manera de preservar las interacciones normales entre las células y la ECM. Por ejemplo, la ECM y/o factores celulares allí activan los condrocitos, es decir, inducen un cambio de la fase G0 a la fase Gl, y también inducen a que las MSC se infiltren y diferencien en condrocitos. Sin limitarse a la teoría, los inventores creen que estas funciones potencian la eficacia terapéutica.

En una modalidad, la ECM se fragmenta de manera de preservar las interacciones normales entre los factores bioactivos y la ECM. Por ejemplo, los factores bloactivos se retienen a niveles mayores que alrededor de 50% o mayores que alrededor de 70% en comparación con los niveles anteriores a la digestión.

En una modalidad, la ECM se fragmenta de manera que limpia la muestra de cartílago de restos. Los restos microscópicos y/o macroscópicos (por ejemplo fragmento ECM) están presentes en cantidades incluso mayores tras la poración de una muestra de cartílago, y pueden activar el dolor y otras respuestas adversas al administrarse a un sujeto si la muestra de cartílago de la presente teenología no está limpia de restos.

En una modalidad, la fragmentación de ECM se limita a una cantidad que provee fibrillas de ECM fragmentadas que retienen sustancialmente la densidad de empaquetamiento del cartílago natural. Este rasgo técnico proporciona un producto de cartílago que tiene propiedades mecánicas de cartílago natural.

En una modalidad, la fragmentación de la ECM se limita a una cantidad que proporciona una matriz de colágeno que tiene cualquiera (por ejemplo, cada uno) de los siguientes rasgos técnicos: es visualmente intacta, es flexible (por ejemplo, tal que se pueda plegar o doblar sin romperse o enrollarse para entrar en un artroscopio), retiene células naturales viables, retiene biofactores no degradados (por ejemplo, factores de crecimiento) y aumenta el nivel de biofactores (por ejemplo, factores de crecimiento).

En una modalidad, el producto de cartílago presenta mayor flexibilidad con la ECM fragmentada en comparación con la de la misma matriz de colágeno sin ECM fragmentada. Opcionalmente, el producto de cartílago es flexible de manera que se pueda insertar en una cánula con un diámetro no mayor que 50% del diámetro (o ancho) del producto de cartílago. Por ejemplo, el producto de cartílago en forma de un disco con un diámetro de 2 cm puede ser lo suficientemente flexible para que se pueda enrollar en una cánula de un artroscopio (por ejemplo, una cánula con un diámetro menor que alrededor de 1 cm).

Condrocitos viables En una modalidad, un producto de cartílago de la presente invención comprende condrocitos viables. Opcionalmente, el producto de cartílago es un producto de cartílago natural (es decir, la matriz de colágeno se aísla de un sujeto) y los condrocitos viables son naturales, es decir, naturales a la matriz de colágeno. La viabilidad se puede demostrar por cualquier medio, por ejemplo, a través del uso de tinciones vitales, microscopía de contraste de fase, etc.

En una modalidad, la matriz de colágeno deriva de cartílago articular y comprende condrocitos viables que son naturales (o endógenos) al cartílago articular. Los condrocitos naturales se distribuyen a través de una o más (por ejemplo, todas las) capas de cartílago articular que se seleccionan de: una capa radial, una capa de transición y una capa tangencial. La invención alternativamente contempla matrices de colágeno con condrocitos exógenos o no naturales (es decir, agregados). En una modalidad, la matriz de colágeno comprende condrocitos viables en su superficie. Opcionalmente, al menos 70% de los condrocitos en la superficie de la matriz de colágeno son viables. En algunas modalidades, el producto de cartílago comprende al menos alrededor de 50% de células viables, de manera alternativa al menos 60% de células viables. En algunas modalidades, el producto de cartílago comprende al menos alrededor de 70% de células viables, de manera alternativa alrededor de 75% de células viables, de manera alternativa alrededor de 80% de células viables.

El porcentaje de células viables de superficie se puede cuantificar, por ejemplo, por téenicas microscópicas.

En una modalidad, una porción de los condrocitos están en la fase G0. Sin pretender limitarse por la teoría, los inventores creen que la ECM o los factores de ECM activan condrocitos. Esta activación se puede observar como un cambio a la fase Gide G0.

Se cree que los condrocitos son importantes para mantener la homeostasis de matriz de cartílago además de expresar factores que promueven la condrogénesis y la reparación de cartílagos. Sin pretender limitarse por la teoría, los inventores creen que se obtiene un producto terapéutico superior por conservación de la organización celular y estructural del cartílago articular natural.

Sin pretender limitarse por la teoría, los inventores creen que la matriz de colágeno de los productos de cartílago de la presente invención conservan la viabilidad de condrocitos y extienden su período de vida ex-vivo (incluyendo en el sujeto receptor). Además, se cree que, tras la administración a un sujeto receptor, la matriz de colágeno puede inducir a las MSC del receptor a que se infiltren en la matriz de colágeno (del producto de cartílago) y se diferencia en condrocitos, rellenando así el producto de cartílago con condrocitos.

Como se detalla en el Ejemplo 10, los productos de cartílago de la presente invención pueden contener una cantidad sustancial de condrocitos viables, incluso después de la digestión parcial y crlopreservación. Una cantidad sustancial de condrocitos viables es una cantidad que, cuando está presente, mejora la eficacia terapéutica de un producto de cartílago.

Factores bioactivos En una modalidad, un producto de cartílago de la presente invención comprende factores bioactivos. Opcionalmente, los factores bioactivos comprenden factores condrogénicos. Opcionalmente, los factores condrogénicos incluyen uno o más (por ejemplo, cada uno de) TGF-bI, TGF-p2, TGF- 3, BMP-2, BMP-7, bFGF, e IGF-1.

Opcionalmente, el cartílago comprende una matriz extracelular que comprende colágeno tipo II, hialuronano y agrecano.

Opcionalmente, el cartílago comprende factores de transcripción, por ejemplo, Sox5, Sox6 y Sox9.

En una modalidad, el producto de cartílago comprende TGF-bI, TGF- 2, TGF-p3, BMP-2, BMP-7, bFGF, IGF-1, colágeno tipo II, hialuronano, agrecano, Sox5, Sox6, y Sox9.

En una modalidad, la matriz de colágeno es una matriz de colágeno natural y los factores bioactivos son naturales a la matriz de colágeno.

Como se detalla en el Ejemplo 16, los productos de cartílago de la presente invención pueden contener factores bioactivos (por ejemplo, factores condrogénicos), incluso después de la digestión parcial y criopreservación. De manera adicional o alternativa, los productos de cartílago de la presente invención puede liberar factores bioactivos cuando se cultivan in vivo o in vitro. La cantidad de un factor dado en un producto de cartílago se puede determinar por un ensayo de lisado de tejido, por ejemplo, como se detalla en el Ejemplo 16. La cantidad de factor liberado de un producto de cartílago se puede determinar por un ensayo de cultivo, por ejemplo, como se detalla en el Ejemplo 16. Por ejemplo, como se detalla en el Ejemplo 16 y la Tabla 4, un producto de cartílago de la presente invención puede tener uno o más (por ejemplo, cada uno) de los siguientes rasgos téenicos: a. comprende TGF-bI en una cantidad de al menos alrededor de 11 mg/cm2, por ejemplo, alrededor de 11 a alrededor de 628 pg/cm2. b. comprende TGF^3 en una cantidad de al menos alrededor de 4 pg/cm2, por ejemplo, alrededor de 4 a alrededor de 112 pg/cm2. c. comprende BMP-7 en una cantidad de al menos alrededor de 3 pg/cm2, por ejemplo, alrededor de 3 a alrededor de 23 pg/cm2. d. comprendebbFGF en una cantidad de al menos alrededor de 169 pg/cm2, por ejemplo, alrededor de 169 a alrededor de 365 pg/cm2. e. comprende IGF-1 en una cantidad de al menos alrededor de 111 pg/cm2, por ejemplo, alrededor de Ill a alrededor de 779 pg/cm2. f. cuando se cultiva, el producto de cartílago libera TGF-bI en una cantidad de al menos alrededor de 2617 pg/cm2, por ejemplo, alrededor de 2617 a alrededor de 17818 pg/cm2. g. cuando se cultiva, el producto de cartílago libera TGF^2 en una cantidad de al menos alrededor de 133 pg/cm2, por ejemplo, alrededor de 133 a alrededor de 623 pg/cm2. h. cuando se cultiva, el producto de cartílago libera IGF-1 en una cantidad de al menos alrededor de 14 pg/cm2, por ejemplo, alrededor de 14 a alrededor de 2842 pg/cm2.

Sin pretender limitarse por la teoría, los inventores creen que son importantes para la reparación de cartílago eficaz, como se facilitan por productos de cartílago, son los factores de crecimiento, factores condrogénicos y otros factores bioactivos que median la producción de matriz extracelular y promueven la condrogénesis/n vivo. Por ejemplo, TGF-b 1-3 promueve la diferenciación condrogénica y regulan la expresión de colágeno; BMP-2 y BMP-7 inducen la condrogénesis de MSC y estimulan la producción de ECM por condrocitos; bFGF estimula la proliferación de condrocitos; IGF-1 induce la síntesis de ECM y ECM (colágeno, hialuronano y agregano) media la regulación mecánica de la condrogénesis.

Formulación De acuerdo con la presente invención, el producto de cartílago se formula opcionalmente con un medio de criopreservación.

En una modalidad, el medio de criopreservación comprende uno o más criopreservantes que permean células, uno o más criopreservantes que no permean células, o una combinación de estas.

Opcionalmente, el medio de criopreservación comprende uno o más criopreservantes que permean células que se seleccionan, de modo no taxativo, de DMSO, un glicerol, un glicol, un propilengilcol, un etilenglicol o una combinación de estos.

Opcionalmente, el medio de criopreservación comprende uno o más criopreservantes que no permean células que se seleccionan, de modo no taxativo, por ejemplo de polivinilpirrolidona, un almidón de hidroxietilo, un polisacárido, un monosacárido, un alcohol de azúcar, un alginato, una trehalosa, una rafinosa, un dextrano, o una combinación de estos.

Otros ejemplos de criopreservantes útiles se describen en "Cryopreservation" (hoja de datos BioFiles Tomo 5 Número 4-Sigma-Aldrich®).

En una modalidad, el medio de criopreservación comprende un criopreservante que permea células, donde la mayoría del criopreservante que permea células es DMSO. Opcionalmente, el medio de criopreservación no comprende una cantidad sustancial de glicerol.

En una modalidad, el medio de criopreservación comprende DMSO, por ejemplo, en una cantidad de alrededor de 1% a alrededor de 50% de DMSO por volumen (por ejemplo alrededor de 10%).

En una modalidad, el medio de criopreservación comprende componentes adicionales tales como albúmina (por ejemplo HSA o BSA), una solución de electrolitos (por ejemplo Plasma-Lyte, PBS o solución salina), o una combinación de estos.

En una modalidad, el medio de criopreservación comprende 1% a alrededor de 20% de albúmina (por ejemplo, HSA) en peso y alrededor de 1% a alrededor de 50% de criopreservante en volumen (por ejemplo alrededor de 10%) tal como DMSO.

No inmunoaenicidad En una modalidad, el producto de cartílago es sustanclalmente no ¡nmunogénico.

Los productos de cartílago de la presente invención tienen uno o más rasgos téenicos que reducen la inmunogenicidad. Ejemplos de tales rasgos técnicos incluyen: • ausencia de células no secuestradas • presencia de células MSC inmunoprivilegiadas y bajos niveles de células inmunogénicas en circulación (por ejemplo, macrófagos) y TNF-a.

• Destrucción selectiva por criopreservación Como se enseña en la presente, determinadas modalidades de la presente invención comprenden una matriz de colágeno que tiene células viables tales como condrocitos que son naturales a la matriz de colágeno. La invención también contempla productos de cartílago que tienen células no naturales tales como condrocitos agregados a la matriz. Si bien los condrocitos exógenos (y endógenos) son una posible fuente de inmunogenicidad, los productos de cartílago de la presente invención sorprendentemente presentan una inmunogenicidad baja o nula. Sin pretender limitarse por la teoría, los inventores creen que los condrocitos (especialmente los condrocitos naturales), que se incrustan en la matriz de colágeno, se secuestran de manera más eficaz del ambiente circundante en un sujeto al cual se le administra el producto de cartílago, reduciendo así la inmunogenicidad.

En una modalidad, el producto de cartílago tiene niveles agotados de células inmunogénicas en circulación y TNF-a. Opcionalmente, tal producto de cartílago sustancialmente no tiene una respuesta al lipopolisacárido (LPS). Tal producto de cartílago se puede proporcionar, por ejemplo, realizando pasos de fabricación de lavado/enjuague, digestión, criopreservación o cualquier combinación de estos.

Fabricación Un producto de cartílago se puede producir de cualquier manera. En una modalidad, la invención proporciona un método para hacer ("fabricar") un producto de cartílago que comprende proporcionar una muestra de cartílago y alterar la muestra de cartílago. El paso de alterar la muestra de cartílago comprende alteración mecánica, alteración enzimática ("digestión parcial") o tanto alteración mecánica como digestión parcial.

En una modalidad, el método comprende retirar hueso subcondral, cartílago calcificado o tanto hueso subcondral como cartílago calcificado de la muestra de cartílago.

En una modalidad, el método comprende criopreservar la muestra de cartílago luego de dichos pasos de poración y digestión parcial. Opcionalmente, el paso de criopreservación comprende criopreservar en una forma que prescinde de las células viables.

En una modalidad, el paso de digestión parcial se lleva a cabo de manera que retiene una cantidad sustancial de células viables.

En una modalidad, la muestra de cartílago se altera mecánicamente hasta un grado que aumenta la flexibilidad de la muestra de cartílago.

En una modalidad, el procesamiento de la muestra de cartílago se realiza de manera que no genere una cantidad sustancial de calor. Opcionalmente, cortar el tejido de cartílago comprende el uso de una sierra o taladro de baja velocidad y/o un bisturí circular.

En una modalidad, el proceso comprende enfriar (por ejemplo, continua o periódicamente) la muestra de cartílago.

Muestra de cartílago La muestra de cartílago se puede obtener de cualquier fuente y se puede proporcionar en cualquier forma, espesor y área de superficie. Opcionalmente, la fuente es un sujeto tal como un sujeto humano. Opcionalmente, la fuente es un cadáver.

En una modalidad, la muestra de cartílago es cualquier muestra de cartílago que comprende colágeno tipo II. Opcionalmente, la muestra de cartílago se selecciona de: cartílago hialino, fibrocartílago y un cartílago elástico.

En una modalidad, la muestra de cartílago comprende cartílago hialino. Opcionalmente, la muestra de cartílago es una muestra de cartílago articular (por ejemplo, obtenida de un hueso de donante). Opcionalmente, la muestra de cartílago se aísla (es decir, separa) de hueso subcondral y/o cartílago calcificado. El cartílago se puede separar del hueso subcondral luego de retirar una muestra de cartílago en forma de un tapón ostecondral (por ejemplo, usando un bisturí circular) o el cartílago se puede separar directamente del hueso subcondral mientras está presente en el hueso del donante (por ejemplo, cortando el cartílago del hueso del donante). Otros cartílagos hialinos útiles incluyen cartílago nasal, cartílago de tráquea y cartílago de laringe.

En una modalidad, la muestra de cartílago es cartílago articular. El cartílago articular se puede obtener de cualquier hueso de donante. Opcionalmente, la muestra de cartílago se obtiene de huesos largos tales como fémur, tibia, fíbula, húmero, cubito, radio o huesos cortos tales como los huesos de las manos o pies (por ejemplo, astrágalo), huesos planos tales como huesos pélvicos (por ejemplo, acetábulo), huesos irregulares tales como huesos vertebrados y sesamoideo. El cartílago articular se puede obtener del cóndilo de cualquier hueso. Opcionalmente, la muestra de cartílago se obtiene como un tapón (por ejemplo, tapón de 1 cm o 2 cm). Opcionalmente, la muestra de cartílago se retira del hueso subcondral y/o cartílago calcificado.

En una modalidad, la muestra de cartílago comprende fibrocartílago. Opcionalmente, la muestra de cartílago se obtiene de una fuente que se selecciona de: sínfisis del pubis, disco intervertebral, menisco y articulación temporomandibular.

En una modalidad, la muestra de cartílago comprende cartílago elástico. Opcionalmente, la muestra de cartílago se obtiene de una fuente que se selecciona de orejas, laringe y epiglotis.

En una modalidad, la muestra de cartílago se obtiene de un mamífero, un ungulado, un organismo del género Sus, un cerdo, un primate, un primate mayor o un ser humano.

En una modalidad, la muestra de cartílago se analiza para determinar su espesor. Opcionalmente, el espesor es de 0.2 mm a alrededor de 2.0 mm tal como alrededor de 1 mm a alrededor de 1.5 mm. Por ejemplo, las muestras de cartílago que son más finas que el espesor mínimo se pueden descartar mientras que las muestras de cartílago que son más gruesas que el espesor máximo se recortan hasta alcanzar su tamaño. Sorprendentemente, al reducir el espesor de la muestra de cartílago y porar la muestra de cartílago, se obtiene un producto de cartílago flexible que se contornea fácilmente a un sitio de tejido lesionado mientras que se retiene la capacidad de proporcionar una matriz de células viables y factores bioactivos.

En una modalidad, la muestra de colágeno tiene una superficie (por ejemplo, superficie de más arriba ("superior") o de más abajo ("inferior") con un área de alrededor de 0.5 cm2 a alrededor de 5 cm2. Opcionalmente, la muestra de colágeno tiene una superficie superior y una superficie inferior separadas por un espesor menor que alrededor de 2 mm (por ejemplo, 1 mm a alrededor de 1.5 mm).

En una modalidad, la matriz de colágeno se proporciona en una forma redonda (por ejemplo, ovalada o circular), una forma rectangular o una forma cuadrada.

En una modalidad, obtener la muestra de cartílago comprende enfriar la muestra, por ejemplo, usar un solvente enfriado, una habitación fría, una placa fría. En una modalidad, obtener la muestra comprende aislar sin generar una cantidad sustancial de calor, por ejemplo, usando una sierra de baja velocidad. En algunas modalidades, enfriar comprende el uso de un baño de agua helada.

Alteración mecánica Un método para producir un producto de cartílago de la presente Invención opcionalmente comprende un paso de alterar mecánicamente la muestra de cartílago. El paso de alteración mecánica se puede realizar de cualquier manera que transmita interrupciones específicas en la matriz de colágeno.

Los métodos útiles de alteración mecánica incluyen: cortar (por ejemplo, estriar sin retirar tejido o cortar con remoción de tejido), ranurar, porar, perforar y picar.

En una modalidad, la alteración mecánica comprende retirar tejido (por ejemplo, productos ilustrados en las Figuras 18A a 18D a las Figuras 21A y 21B). Las alteraciones mecánicas útiles del tipo con remoción de tejido incluyen: cortes en espiral, ranuras, ranuras cruzadas, poros y cortes de núcleo que forman aros. En otra modalidad, la alteración mecánica comprende proporcionar interrupciones sin retirar una cantidad sustancial de tejido (por ejemplo, como se ilustra en las Figuras 17A a 17C). Las alteraciones mecánicas útiles del tipo sin remoción de tejido se seleccionan de: estrías, corte en espiral, líneas cruzadas y perforaciones.

En una modalidad, la alteración mecánica se realiza de manera que proporcione interrupciones específicas en todo el espesor de la matriz de colágeno (por ejemplo, como se ilustra en la Figura 17B, Figura 17C y Figuras 19A y 19B a Figuras 21A y 21B). En otra modalidad, la alteración mecánica se realiza de manera que proporcione interrupciones específicas en menos que todo el espesor de la matriz de colágeno (por ejemplo, como se ilustra en la Figura 17A y Figuras 18A a 18D).

Poración Un método para producir un producto de cartílago de la presente Invención ("método de fabricación") opcionalmente comprende un paso de porar una muestra de cartílago. La poración se puede llevar a cabo de cualquier forma que aumente la flexibilidad del cartílago y proporcione múltiples pasajes a través de los cuales puedan migrar las células y los factores.

En una modalidad, el cartílago se pora usando poración láser o poración mecánica.

En una modalidad, el cartílago se pora usando poración mecánica. Opcionalmente, la poración mecánica se proporciona mediante perforación, punción, poración hidráulica (por ejemplo, perforación de fluido a alta presión) o combinación de estos. Opcionalmente, el cartílago se pora usando un dispositivo de punción única o múltiples punciones.

En una modalidad, la muestra de cartílago se pora hasta un grado que aumenta la flexibilidad de la muestra de cartílago. Opcionalmente, la muestra de cartílago se pora para proporcionar poros con un diámetro de alrededor de 0.25 mm a alrededor de 2 mm (por ejemplo, 0.25 mm a alrededor de 1.5 mm o alrededor de 0.5 mm a alrededor de 1.5 mm) de diámetro. Opcionalmente, la matriz de cartílago se pora para proporcionar alrededor de 10 a alrededor de 400 poros por cm2 tal como alrededor de 10 a alrededor de 100 poros por cm2 o alrededor de 20 a alrededor de 60 poros por cm2 (por ejemplo, alrededor de 36 poros por cm2). Opcionalmente, la muestra de cartílago comprende una capa de cartílago y los poros pasan a través de la mayoría (por ejemplo, la totalidad) de la capa de cartílago.

En una modalidad, la muestra de cartílago se pora hasta un grado de alrededor de 10 mm2 a alrededor de 50 mm2 de área de superficie porosa por cm2 de área de superficie de la muestra de cartílago. Por ejemplo, una matriz de colágeno que comprende poros cilindricos con 1 mm de diámetro a una densidad de poro de 36 poros por cm2 comprendería alrededor de 28 mm2de área de superficie porosa por cm2 [(0.5 mm de radio de poro) (x)(íT (36 poros/ cm2)].

En una modalidad, porar la muestra de cartílago comprende enfriar (por ejemplo, continua o periódicamente) la muestra, por ejemplo, usando un solvente enfriado y/o una habitación fría o una placa fría. En una modalidad, porar la muestra de cartílago comprende porar la muestra de cartílago sin generar una cantidad sustancial de calor, por ejemplo, usando un taladro de baja velocidad o un bisturí circular.

Digestión Un producto de cartílago de la invención se produce opcionalmente digiriendo parcialmente una muestra de cartílago, por ejemplo, usando una enzima digestiva tal como una enzima digestiva de proteoglicano o proteinasa.

De acuerdo con los métodos de fabricación de la presente invención, un paso de la digestión parcial modifica la ECM de la muestra de cartílago y puede realizarse de manera que provea uno o más de los siguientes rasgos téenicos: • una ECM floja que libera y permite la migración de factores celulares y células viables. • una ECM natural que retiene células naturales viables • preservación de interacciones fisiológicas entre las células y la ECM • un producto de cartílago limpio desprovisto de restos • un producto de cartílago que comprende fibrillas de ECM que retienen sustancialmente la densidad de empaquetamiento de cartílago natural • un producto de cartílago con mayor flexibilidad • retira macrófagos y reduce la inmunogenicidad.

En una modalidad, el paso de digestión parcial se lleva a cabo de manera que afloja la ECM, por ejemplo, escindiendo los enlaces peptídicos en el colágeno. Una ECM floja libera y permite la migración de factores celulares y células viables. Por ejemplo, los bio-factores (por ejemplo, condrogénicos) pueden lixiviarse en el micro ambiente circundante tras la administración a un sujeto. Con las enseñanzas provistas en la presente, un experto en la técnica puede ahora adaptar la digestión para proporcionar tal rasgo téenico.

En una modalidad, el paso de digestión parcial se lleva a cabo de manera que retiene una cantidad sustancial de células naturales viables, por ejemplo, limitando la digestión a una cantidad que prescinde de células. Con las enseñanzas provistas en la presente, un experto en la técnica puede ahora adaptar la digestión para proporcionar tal rasgo técnico.

En una modalidad, el paso de digestión parcial se lleva a cabo de manera que preserva las interacciones normales entre las células y la ECM. Por ejemplo, la ECM y/o factores celulares allí activan los condrocitos, es decir, inducen un cambio de la fase GO a la fase Gl, y también inducen a que las MSC se infiltren y diferencien en condrocitos. Sin limitarse a la teoría, los inventores creen que estas funciones potencian la eficacia terapéutica.

En una modalidad, el paso de digestión parcial se lleva a cabo de manera que limpia la muestra de cartílago de restos. Estos restos microscópicos y/o macroscópicos (por ejemplo fragmento ECM) están presentes en cantidades incluso mayores tras la poración de una muestra de cartílago, y pueden activar el dolor y otras respuestas adversas al administrarse a un sujeto si el producto de cartílago de la presente tecnología no está limpio de restos.

En una modalidad, el paso de digestión parcial se lleva a cabo de manera que provee fibrillas de ECM fragmentadas que retienen sustancialmente la densidad de empaquetamiento del cartílago natural. Por ejemplo, la digestión parcial puede limitarse a una cantidad que no destruye la integridad estructural de la muestra de cartílago. Tal rasgo técnico provee un producto de cartílago que tiene propiedades mecánicas de cartílago natural, por ejemplo, para proporcionar un injerto de cartílago que soporte peso y duradero.

En una modalidad, el paso de digestión parcial se lleva a cabo de manera que imparte flexibilidad al producto de cartílago.

En una modalidad, la muestra de cartílago se digiere usando una enzima digestiva de colágeno (por ejemplo, colagenasa o catepsina) o una enzima digestiva de proteoglicáno (por ejemplo hialuronidasa, agrecanasa o papaína). Opcionalmente, la muestra de cartílago se digiere de manera que retiene la interacción de la matriz celular. Por ejemplo, la digestión de tripsina se realiza típicamente con un quelante tal como EDTA para secuestrar magnesio y calcio, que de otro modo inhibe la acción de tripsina. Tales quelantes pueden disociar las células de la matriz. De hecho, la tripsina misma puede cortar las proteínas de matriz a las cuales las células se adhieren o unen. Por lo tanto, una modalidad de la invención contempla el uso de digestiones no disociativas que pueden digerir parcialmente una muestra de cartílago de manera que retiene células naturales tales como condrocitos.

En una modalidad, el paso de digestión parcial comprende digerir colágeno II en una muestra de cartílago (por ejemplo cartílago articular). Las enzimas de digestión que son útiles en la digestión parcial de matrices de colágeno tipo II incluyen: colagenasa (por ejemplo Tipo II, cualquiera de colagenasa I - IV, y colagenasa bacteriana), otras endopeptidasas (por ejemplo tripsina, papaína, pepsina), y exopeptidasas (por ejemplo carboxipeptidasa).

En una modalidad, la digestión parcial comprende digestión no enzimática, por ejemplo, digestión basada en vapor, basada en ácidos o basada en fenestración. Opcionalmente, la digestión no enzimática es digestión mecánica, por ejemplo picado parcial o digestión basada en fenestración.

En algunas modalidades, los productos de cartílago de la presente Invención no se digieren. En otras modalidades, los productos de cartílago de la presente invención se digieren parcialmente por medios digestivos que incluyen medios enzimáticos (por ejemplo tratamiento con colagenasa, pronasa, proteinasa K, etc.), bioquímicos (por ejemplo papaína), térmicos (por ejemplo mayor calor), químicos (sulfato de queratina, tosilisilclorometano), mecánicos (perforados), cualquier otro medio de digestión conocido por los expertos en la téenica, y combinaciones de cualesquiera dos o más de lo que antecede.

Criopreservación Un producto de cartílago de la presente invención puede usarse fresco o puede preservarse durante un período de tiempo. Opcionalmente, el producto de cartílago se somete a un ciclo de congelado-descongelado, es decir se criopreserva y luego se descongela.

En una modalidad, un producto de cartílago está criopreservado. Un producto de cartílago puede criopreservarse por Incubación a temperaturas de congelado (por ejemplo a -80°C ± 5°C) en un medio de criopreservación.

En una modalidad, la criopreservación puede comprender un método controlado de congelado, es decir donde el producto de cartílago se mantiene a una o más temperaturas intermedias de temperatura ambiente y -80°C. La criopreservación puede comprender, por ejemplo, incubar el producto de cartílago a 4°C durante 30 min a 24 hr (por ejemplo alrededor de 30 a alrededor de 90 min), luego incubar el producto de cartílago a alrededor de -20°C a alrededor de -40°C (por ejemplo alrededor de -30°C) durante alrededor de 20 min a alrededor de 12hr (por ejemplo alrededor de 20 a alrededor de 60 min) y luego incubar a -80°C hasta su uso por ejemplo, reduciendo la temperatura a una velocidad de alrededor de 4°C/min a alrededor de -80°C /min. De manera alternativa, el producto de cartílago puede congelarse rápidamente a -80°C o congelarse instantáneamente en nitrógeno líquido.

El producto de cartílago puede luego descongelarse para su uso. Opcionalmente, el producto de cartílago se criopreserva de manera tal que la viabilidad celular se retiene sorprendentemente bien luego de un ciclo de congelado-descongelado.

En una modalidad, la criopreservación comprende el almacenamiento en un medio de criopreservación que comprende uno o más criopreservantes que permean células, uno o más criopreservantes que no permean células, o una combinación de estos. Opcionalmente, el medio de criopreservación comprende uno o más criopreservantes que permean células que se seleccionan de DMSO, un glicerol, un glicol, un propilengilcol, un etilenglicol o una combinación de estos. Opcionalmente, el medio de criopreservación comprende uno o más criopreservantes que no permean células que se seleccionan de polivinilpirrolidona, un almidón de hidroxietilo, un polisacárido, un monosacárido, un alcohol de azúcar, un alginato, una trehalosa, una rafinosa, un dextrano, o una combinación de estos. Otros ejemplos de criopreservantes útiles se describen en "Cryopreservation" (hoja de datos BioFiles Tomo 5 Número 4-S¡gma-Aldr¡ch®).

En una modalidad, el medio de criopreservación comprende un criopreservante que permea células, donde la mayoría del criopreservante que permea células es DMSO.

En una modalidad, el medio de criopreservación comprende DMSO, por ejemplo alrededor de 1% a alrededor de 50% de DMSO por volumen (por ejemplo alrededor de 10%).

En una modalidad, el medio de criopreservación comprende componentes adicionales tales como albúmina (por ejemplo HSA o BSA), una solución de electrolitos (por ejemplo Plasma-Lyte), o una combinación de estos.

En una modalidad, el medio de criopreservación comprende 1% a alrededor de 20% de albúmina en peso y alrededor de 1% a alrededor de 50% de criopreservante en volumen (por ejemplo alrededor de 10%). Opcionalmente, el criopreservante comprende DMSO (por ejemplo en una cantidad mayoritaria).

Tratamiento antiséptico Un producto de cartílago de la presente invención se trata opcionalmente con una o más soluciones antisépticas para reducir la biocarga. Opcionalmente, el producto de cartílago se trata con (por ejemplo se incuba en) un antibiótico. Opcionalmente, el producto de cartílago se trata con (por ejemplo se limpia) con povidona-yodo.

En algunas modalidades, el producto de cartílago se trata con un antibiótico, donde el antibiótico es sulfato de gentamicina (AbraxisPharmaceuticalProducts, Schaumburg, IL), vancomicinaHCI (Hospira Inc., Lake Forest, IL), y/o anfotericina B (Sigma Aldrich, St. Louis MO).

Opcionalmente, el producto de cartílago se trata con una solución fungicida.

Tamizaie de células, viabilidad v factores condroaénicos En una modalidad, un producto de cartílago se tamiza para determinar condrocitos, viabilidad celular y uno o más componentes estructurales o funcionales tales como factores bioactivos y otros componentes de ECM (por ejemplo factores condrogénicos).

A través de la intuición de los inventores, se descubrió que determinados componentes se correlacionan con la eficacia terapéutica.

En una modalidad, los componentes tamizados incluyen uno o más de los factores bioactivos enumerados en la Tabla 4, la presencia de condrocitos viables o una combinación de estos.

Varios En una modalidad, un método de fabricación de un producto de cartílago de la presente invención comprende tratar el producto de cartílago con una o más soluciones. Opcionalmente, el pH de una o más soluciones varía de 5-10. Opcionalmente, las soluciones de tratamiento comprenden uno o más de: solución salina, PBS, Plasmalyte y agua.

Métodos de uso En una modalidad, un producto de cartílago de la presente invención se usa para tratar un tejido lesionado en un sujeto. El tejido lesionado puede ser cualquier tejido lesionado. Puede proporcionarse un método de tratamiento, por ejemplo, administrándole a un sujeto que lo necesita, un producto de cartílago de la presente invención.

En una modalidad, el tejido lesionado es cartílago. Opcionalmente, el tejido lesionado es cartílago articular. Opcionalmente, el método comprende retirar el cartílago lesionado y administrar el producto de cartílago al sitio donde se retiró el cartílago lesionado. Opcionalmente, el paso de retirar comprende retirar un tapón que comprende el tejido lesionado y el producto de cartílago se corta o moldea (o ambos) para adaptarlo al hueco dejado al retirar el tapón (por ejemplo el tapón de 2 cm de diámetro se retira y se remplaza con un producto de cartílago de 2 cm de diámetro de la forma de tal tapón).

En una modalidad, el tejido lesionado es cartílago articular y el método comprende además microfracturar el sitio del tejido lesionado, por ejemplo retirar cartílago articular lesionado seguido de daño físico al hueso subcondral subyacente a la médula ósea expuesta y crear sangrado. Opcionalmente, el producto de cartílago se coloca en el hueso subcondral luego de la microfracturación.

La microfracturación es una téenica que puede estimular la curación formando un coágulo de sangre, introduciendo así citocinas inflamatorias, factores de crecimiento y MSC. La microfracturación sola provoca la formación de fibrocartílago que comprende colágeno tipo I y tiene escaso rendimiento bioquímico y crecimiento óseo anormal que provoca osteoartritis. Sorprendentemente, a través de la intuición de los inventores, se descubrió que los presentes productos de cartílago superan estas deficiencias proporcionando una matriz de colágeno tipo II con condrocitos viables para promover la condrogénesis de las MSC introducidas por la microfracturaclón.

En una modalidad, un producto de cartílago de la presente invención se administra artroscópicamente. Sorprendentemente, un producto de cartílago flexible de la invención puede fácilmente administrarse artroscópicamente (es decir, es flexible de modo que puede administrarse a través de una cánula para atroscopía) y se adapta a los contornos en el sitio de administración, por ejemplo, contornos de superficies condrales.

En una modalidad, un producto de cartílago se fija en el sitio de administración. Opcionalmente, el producto de cartílago se fija con un adhesivo (por ejemplo pegamento de fibrina) o por un dispositivo mecánico (por ejemplo un clavo tal como un clavo biorreabsorbible).

Sorprendentemente, a través de la intuición de los inventores, los productos de cartílago de la presente invención proporcionan una mayor curación y pueden usarse para tratar lesiones de mayor tamaño.

Sorprendentemente, a través de la intuición de los inventores, los productos de cartílago proporcionan una matriz de colágeno con propiedades naturales mecánicas y funcionales que está integrada de forma eficaz al cartílago en el sitio diana. Sin limitarse a la teoría, se cree que la capacidad de curación superior de los productos de cartílago descrita en la presente se debe, en parte, a interacciones complejas entre la matriz del donante (producto de cartílago), células del donante, células del destinatario (sujeto tratado), y matriz del destinatario. Esto es bastante superior a terapias anteriores tales como implante de condrocitos autólogos que son típicamente solo paliativos.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Aislamiento de cóndilos femorales v meseta tibial Se obtuvo una articulación de rodilla humana, como se describe en la Figura 1.

Las superficies externas de la articulación de rodilla se limpiaron con yodo (10% solución de povidona-yodo, Purdue, "Betadine") sin poner en contacto el cartílago con el yodo. La articulación de rodilla se diseccionó para separar el fémur, tibia y fíbula sin dañar las superficies de cartílago. El tejido blando (adiposo, músculo, fascia, ligamentos y tendones) se retiraron para exponer las superficies de cartílago articular en la meseta tibial y cóndilos femorales.

Las porciones que contienen el cartílago articular (meseta tibial y los cóndilos del fémur) se congelaron colocándolos en solución salina helada (0.9% solución de irrigación de cloruro de sodio, USP) en una placa fría.

EJEMPLO 2 Aislamiento de tapones de cartílago Se obtuvieron cóndilos femorales y meseta tibial como se detalla en el Ejemplo 1. Los tapones osteocondrales que tienen diámetros de alrededor de lcm o alrededor de 2cm se obtuvieron de los cóndilos femorales y meseta tibial. Durante el aislamiento de los tapones, los cóndilos y meseta tibial se mantuvieron humedecidos y congelados por inmersión periódica en solución salina helada o se limpiaron con una toallita empapada en solución salina helada. Los tapones aislados se congelaron luego colocándolos en solución salina helada.

Los tapones osteocondrales se obtuvieron usando un bisturí circular mientras se evita cualquier área de cartílago dañado. Específicamente, se usaron bisturíes circulares con diámetros de 1 cm o 2 cm para retirar tapones enteros de cartílago y hueso subyacente de la superficie articular.

EJEMPLO 3 Aislamiento de una muestra de cartílago del hueso subcondral v cartílago calcificado Se obtuvieron tapones osteocondrales como se detalla en el Ejemplo 2. El hueso subcondral y cartílago calcificado se retiró de los tapones osteocondrales para proporcionar muestras de cartílago en forma de discos de cartílago. Durante este proceso, el cartílago se congeló periódicamente con solución salina helada para evitar el sobrecalentamiento.

Específicamente, cada tapón osteocondral se mantuvo seguro y la capa de hueso subcondral se cortó (se retiró) usando una sierra sagital con una hoja de ángulo de inclinación de la capa de cartílago. Una vez retirado el hueso subcondral, cualquier resto óseo y de cartílago calcificado se raspó de la parte inferior de los discos de cartílago. Para evitar el sobrecalentamiento, el tejido se sumergió frecuentemente en solución salina helada a lo largo del proceso de corte y raspado. Este proceso se repitió para cada uno de los discos de cartílago.

EJEMPLO 4 Dimensionamiento de muestras de cartílago Se obtuvieron muestras de cartílago aisladas en forma de discos de cartílago como se detalla en el Ejemplo 3, y luego se dimensionaron para aumentar su flexibilidad. El espesor de las muestras de cartílago se midió usando un medidor de espesor de disco o calibre. Los discos con espesor mayor a alrededor de 1.5 mm se recortaron hasta alrededor de 1.5 mm. Los discos con espesor menor a alrededor de 1 mm se descartaron.

EJEMPLO 5 Poración de una muestra de cartílago Se obtuvieron y dimensionaron muestras de cartílago (discos de cartílago) como se detalla en el Ejemplo 4 y luego se poraron para proporcionar una capa de cartílago (disco) con poros de alrededor de lmm de diámetro con una densidad de poro de alrededor de 36 poros/cm2 como se describe en las Figuras 15A y 15B.

Específicamente, se colocó un patrón de poro (una malla perforada de acero inoxidable) sobre la muestra de cartílago y se usó un sacabocados de biopsia de 1 mm para perforar los poros (agujeros) de cartílago en el patrón. La muestra de cartílago porado se congeló luego por inmersión en solución salina helada.

EJEMPLO 6 Digestión parcial de una muestra de cartílago Se obtuvieron muestras de cartílago (discos de cartílago) como se detalla en el Ejemplo 5 y luego se digirieron con colagenasa tipo II.

Específicamente, la colagenasa se formuló en DMEM (200 unidades/ml de colagenasa tipo II, Sigma). Las muestras de cartílago porado se incubaron en la suspensión de colagenasa durante 30 ± 2 minutos a 37°C ± 2°C. La solución de colagenasa se retiró y los discos se enjuagaron con solución salina helada.

EJEMPLO 7 Tratamiento con antibiótico de un producto de cartílago Se obtuvieron muestras de cartílago (discos de cartílago) como se detalla en el Ejemplo 7 y luego se incubó solución antibiótica que contenía sulfato de gentamicina (50 mg/mL; AbraxisPharmaceuticalProducts, Schaumburg, IL), vancomicinaHCI (50 pg/mL; Hospira Inc., Lake Forest, IL), y anfotericina B (2.5 pg/mL; Sigma Aldrich, St. Louis, MO) en DMEM a 37°C ± 2°C durante 18 hr a 48 hr. Luego de la incubación, la solución antibiótica se retiró y los discos se enjuagaron en solución salina helada.

EJEMPLO 8 Cr100reservación Se obtuvieron productos de cartílago como se detalla en el Ejemplo 8 y se criopreservaron en una solución de criopreservación.

La solución de criopreservación contenía 10% de dimetilsulfóxido (DMSO) (Bioniche Teo. Inverin Co) y 5% de albúmina en suero humano (HSA; Baxter) en PlasmaLyte-A (Baxter Healthcare Corp.).

Para cada producto de cartílago, se rellenó un vial con alrededor de 7 mi de la solución de criopreservación y un producto de cartílago se transfirió al vial usando fórceps. El producto de cartílago se limpió para retirar cualquier líquido residual (por ejemplo solución salina) antes de colocarlo en solución de criopreservación. Se colocó un tapón en el vial que contenía la solución de criopreservación y el producto de cartílago.

El vial se cerró luego de tapar, prensar y embolsar el vial, y luego se criopreservó a alrededor de -80°C colocando el vial en un congelador automático.

El congelador se programó para reducir la temperatura de forma gradual y en pasos usando el siguiente programa de temperaturas: Paso 1 reducir la temperatura hasta 4°C a 4.0°C/m Paso 2 mantener la temperatura durante 60m a 4°C Paso 3 reducir la temperatura hasta -30°C a 1.0°C/m Paso 4 mantener la temperatura a -30°C Mantener durante 30m Paso 5 reducir la temperatura hasta -80°C a 4.0°C/m Paso 6 mantener la temperatura a -80°C EJEMPLO 9 Producto de cartílago Los productos de cartílago se produjeron aislando, porando, digiriendo y criopreservando una muestra de cartílago usando el método detallado en el Ejemplo 1 hasta el Ejemplo 8. Los productos de cartílago tienen una organización estructural natural y promueven la reparación adecuada del cartílago articular. Sorprendentemente, los productos de cartílago terapéuticamente activos tienen los siguientes rasgos téenicos: • contienen condrocitos naturales viables que tienen la capacidad de condrogénesis • contienen factores bioactivos • no son inmunogénicos • proveen una matriz de reparación flexible que tiene una organización estructural natural EJEMPLO 10 Condrocitos viables luego de la criopreservación usando varios métodos de congelado Los productos de cartílago del Ejemplo 9 se analizaron para determinar condrocitos viables luego de la criopreservación.

Se investigaron varios métodos de congelado para determinar su efecto en la viabilidad celular. Los productos de cartílago se formularon en un medio de criopreservación que comprende 10% de dimetilsulfóxido (DMSO) y 5% de albúmina en suero humano (HSA) en plasmalyte-A (cloruro de sodio, gluconato de sodio, acetato de sodio, cloruro de potasio y cloruro de magnesio).

En un primer conjunto de experimentos, se analizaron diferentes métodos de criopreservación para determinar el efecto sobre las células viables de preservación en el producto de cartílago.

Método 1: Mantener el producto de cartílago a 4°C para dar tiempo a equilibrio (es decir, penetración de criosolución en el tejido), seguido por colocar el producto en una caja de espuma de poliestireno y congelarlo en un congelador a -80 °C que provoca una tasa de congelado uniforme de alrededor de -0.5 °C /min.

Metodo 2. Paso: 1. Reducir la temperatura en pasos: 2. reducir la temperatura hasta 4°C a 4.0°C/m 3. mantener la temperatura durante 60m a 4°C para su equilibrio 4. reducir la temperatura hasta -30°C a 1.0°C/m 5. mantener la temperatura a -30°C Mantener durante 30m 6. reducir la temperatura hasta -80°C a 4.0°C/m 7. mantener la temperatura a -80°C Para demostrar la presencia de células viables, los productos de cartílago se tiñeron usando un kit de Viabilidad/Citotoxicidad LIVE/DEAD® (Molecular Probes Inc., Eugene, OR) para evaluar cualitativamente la viabilidad celular. La tinción se llevó a cabo según el protocolo del fabricante. Las porciones finas de productos de cartílago (por ejemplo aproximadamente 0.5 cm x 0.5 cm x 0.02 cm) se descongelaron en un baño de agua a 37 °C y se usaron para análisis. La evaluación de tejido teñido se realizó usando un microscopio de fluorescencia. Una fluorescencia verde intenso uniforme indicó la presencia de células vivas, y una fluorescencia roja brillante indicó la presencia de células muertas.

Como se describe en las Figuras 3A y 3B, los productos de cartílago criopreservados por el método en pasos (Método 2; Figura 3B) comprenden niveles potenciados de condrocitos viables con relación a productos de cartílago criopreservados usando un método que comprende un único paso de equilibrio seguido por congelado gradual (Método 1; Figura 3A). Los condrocitos son el tipo celular predominante presente en el cartílago articular y son integrales en el mantenimiento de la homeostasis de la matriz del cartílago. Adicionalmente, los condrocitos expresan factores que promueven la condrogénesis y la reparación del cartílago. Es bastante sorprendente que los condrocitos viables permanezcan luego de la criopreservación ya que en la bibliografía se han citado varios intentos por criopreservar el cartílago con poco éxito en la preservación de células viables una vez descongeladas (por ejemplo, Acosta etál, 2007. ClinOrthopRelat Res; 460:234-9).

En un segundo conjunto de experimentos, se evaluó la duración del equilibrio para determinar su efecto en el nivel de condrocitos viables en productos de cartílago descongelados. Específicamente, se accedió a la viabilidad celular luego de la criopreservación usando el método 2 (Figura 4A) y se comparó a métodos de criopreservación que sustituyeron un paso de equilibrio de 2 horas (Figura 4B) o paso de equilibrio de 4 horas (Figura 4C) por el paso de equilibrio de 1 hora a 4 °C. Sorprendentemente, como se describe en las Figuras 4A a 4C, un paso de equilibrio de 1 hora proporcionó viabilidad celular comparable (o mejor) a la de equilibrios de 2 horas y 4 horas.

EJEMPLO 11 Condrocitos viables luego de la criopreservación en varios medios de criopreservación Los productos de cartílago del Ejemplo 9 se analizaron para determinar condrocitos viables luego de la criopreservación. Se investigaron varios medios de criopreservación para determinar su efecto en la viabilidad celular.

En un primer experimento, los productos de cartílago se formularon en un medio de criopreservación que contenía ya sea 10% o 20% de DMSO en 5% de HSA en plasmalyte A. La tinción LIVE/DEAD® se realizó en productos de cartílago descongelados del producto de cartílago final del modo detallado en el Ejemplo 10. Los resultados se describen en las Figuras 5A y 5B. No hay diferencia cualitativa en la viabilidad celular entre 10% (Figura 5A) y 20% DMSO (Figura 5B). Por lo tanto, el producto de cartílago puede formularse en concentraciones reducidas de medio de criopreservación para proporcionar productos con condrocitos viables tras el descongelado.

En un segundo experimento, los productos de cartílago se formularon en un medio de criopreservación que contenía ya sea 0% o 5% de HSA y 10% de DMSO en 5% de HSA en plasmalyte A. La tinción LIVE/DEAD® se realizó en productos de cartílago descongelados del producto de cartílago final del modo detallado en el Ejemplo 10. Los resultados se describen en las Figuras 6A y 6B. En este estudio, no se observaron diferencias notables en la viabilidad celular entre 0% (Figura 6A) y 5% HSA (Figura 6B). Sin embargo, a través de la intuición de los inventores respecto del efecto de HSA sobre la estabilidad a largo plazo de tejidos criopreservados, la HSA está opcionalmente incluida.

En un tercer experimento, los productos de cartílago se formularon en un medio de criopreservación que contenía solución de 10% DMSO + 5% HSA ya sea en plasmalyte-A o solución salina normal. La tinción LIVE/DEAD® se realizó en productos de cartílago descongelados del producto de cartílago final de la manera detallada en el Ejemplo 10. Los resultados se describen en las Figuras 7A y 7B. Los resultados no demostraron una diferencia notable en la viabilidad celular entre plasmalyte-A (Figura 7A) y la solución salina normal (Figura 7B). Sin embargo, a través de la intuición de los inventores, el plasmalyte-A está opcionalmente incluido debido a que contiene sales y minerales (por ejemplo, cloruro de sodio, gluconato de sodio, acetato de sodio, cloruro de potasio y cloruro de magnesio) que pueden ser beneficiosos para la estabilidad a largo plazo del producto de cartílago durante el almacenamiento criogénico. Una criosolución útil para los productos de cartílago de la presente invención incluye 10% DMSO +5% HSA en plasmalyte-A.

Estos resultados indican que los productos de cartílago descritos en la presente contienen condrocitos viables luego de un ciclo de congelado/descongelado al formularse en varios medios de criopreservación.

EJEMPLO 12 Viabilidad sostenida de celulas luego del descongelado Los productos de cartílago del Ejemplo 9 se analizaron para determinar condrocitos viables luego de la crlopreservación. La viabilidad celular se determinó en varios puntos de tiempo luego de descongelar los productos de cartílago.

Los productos de cartílago se formularon en un medio de criopreservación que contenía ya sea 10% de DMSO en 5% de HSA en plasmalyte A. Luego de la criopreservación y descongelado, los productos de cartílago se cultivaron en DMEM + 1% HSA+ antibiótico/antimicótico durante hasta 14 días. A los 0 días (Figura 8A), 7 días (Figura 8B) y 14 días (Figura 8C) de cultivo, los productos de cartílago se evaluaron para determinar tinción LIVE/DEAD® del modo detallado en el Ejemplo 10. Como se describe en las Figuras 8A a 8C, los condrocitos fueron viables durante el período de cultivo de 14 días luego del ciclo de congelado/descongelado. Por lo tanto, los productos de cartílago de la presente invención proporcionan un componente celular que contribuye con la eficacia terapéutica.

EJEMPLO 13 Evaluación cuantitativa de la viabilidad celular Los productos de cartílago del Ejemplo 9 se analizaron para determinar la cantidad celular y viabilidad celular luego de la criopreservación.

Los productos de cartílago criopreservado se descongelaron y secciones finas se tiñeron con tinción LIVE/DEAD® como se detalla en el Ejemplo 10. Los condrocitos viables y muertos se visualizaron en un lente de magnificación 10X y se contaron como se indica por fluorescencia verde o roja, respectivamente, en un campo de 0.38 mm2. Se analizaron tres secciones aleatorias de cuatro donantes separados. Como se detalla en la Tabla 1, la cantidad promedio de células viables fue 64,989 células/cm2 con viabilidad celular de 70.5 %. Esto dato indica que los productos de cartílago de la presente invención pueden tener una viabilidad de 70%.

TABLA 1 Viabilidad celular EJEMPLO 14 Producto de cartílago flexible En una modalidad, los productos de cartílago de la presente Invención exhiben flexibilidad potenciada permitiéndoles ser administrados artroscópicamente. Sorprendentemente, por poración y digestión opcional, un producto de cartílago puede ser lo suficientemente flexible para enhebrarse a través de una cánula artroscópica; esto es contrario al cartílago articular natural que es normalmente duro con muy poca capacidad de flexionarse sin quebrarse.

Varios tamaños de poro y densidades de poro se evaluaron para determinar su efecto sobre la flexibilidad y capacidad de uso en artroscopía. Los productos de cartílago se produjeron usando el método detallado en el Ejemplo 4 y se procesaron además por poración solo o poración y digestiones. Se analizaron dos tamaños de poro diferentes, poros de 0.6 mm y 0.9 mm de diámetro. Se analizaron tres densidades de poro diferentes: 12, 25 y 50 poros/cm2. Además, también se analizó una digestión con colagenasa de 30 minutos para evaluar el efecto de la digestión sobre el producto de cartílago. Se evaluaron varias combinaciones de condiciones de tratamiento (tratamientos A-L), como se detalla en la Tabla 2. Cada uno de los productos de cartílago producidos por los tratamientos A-L es un ejemplo de producto de cartílago de la presente invención.

Específicamente, cada una de las condiciones de tratamiento A-L se etiquetó con una letra correspondiente y se les pidió a 6 evaluadores en ciego que calificaran la flexibilidad del producto de cartílago en una escala de 1-5 (l=más flexible y 5=más duro y menos flexible). Los resultados se describen en la Tabla 3. Los resultados indican que un tamaño de poro mayor (0.9 mm de diámetro) y mayor frecuencia de poro (50 poros/cm2) proporcionaron el producto de cartílago más flexible. En este experimento, el tratamiento con colagenasa no demostró una diferencia notable en la flexibilidad. Sin embargo, en otros experimentos (no se muestran los datos), los usuarios observaron cambio mucho más marcado en la flexibilidad debido al tratamiento con colagenasa.

TABLA 2 Condiciones de tratamiento TABLA 3 Flexibilidad de productos de cartílago luego de varias condiciones de tratamiento EJEMPLO 15 No inmunooenicidad de productos de cartílago Los productos de cartílago del Ejemplo 9 se analizaron para determinar la ¡nmunogenicidad. Específicamente, la secreción de TNF-a por productos de cartílago en respuesta al lipopolisacárido (LPS) se usó para determinar la ¡nmunogenicidad. La secreción de TNF-a de productos de cartílago criopreservados de la presente invención se comparó con la de productos de cartílago crudos (frescos).

Las piezas (0.785 cm2) de productos de cartílago (crudos vs. criopreservados) se colocaron en medio de cultivo tisular y se expusieron a LPS bacteriano (1 mg/mL, Sigma) durante 20-24 hr. Luego de 24 horas, el medio de cultivo tisular se recogió y analizó para determinar la presencia de TNF-a usando un kit TNF-a ELISA (R&D Systems) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las hPBMC humanas, conocidas por contener monocitos que secretan niveles elevados de TNF-a tras la estimulación con LPS, se usaron como control positivo en el ensayo. Las hPBMC y productos de cartílago sin LPS también se incluyeron como controles en el análisis.

Los resultados se describen en la Figura 9. Los productos de cartílago no criopreservados ("producto crudo") proporcionaron niveles sustanciales de TNF-a en respuesta a LPS mientras que los productos de cartílago criopreservados ("producto final") no proporcionaron niveles sustanciales de TNF-a en respuesta a LPS, indicando que el proceso de fabricación elimina la ¡nmunogenicidad de las muestras de cartílago. Sin limitarse a la teoría, los inventores creen que los macrófagos funcionales viables son la fuente de ¡nmunogenicidad en el cartílago no procesado.

Sorprendentemente, estos resultados indican que los productos de cartílago pueden agotarse selectivamente de macrófagos para reducir la inmunogenicidad de los implantes alogeneicos.

EJEMPLO 16 Factores bioactivos en productos de cartílago Los productos de cartílago del Ejemplo 9 se analizaron para determinar la presencia de factores bioactivos. Específicamente, los ensayos por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) se usaron para analizar extractos tisulares y factores liberados en los sobrenadantes cultivados de los productos de cartílago.

Para el ensayo de extracto tisular, los productos de cartílago criopreservados del Ejemplo 9 se descongelaron en un baño de agua a 37°C y se retiraron del medio de criopreservación seguido por enjuague por PBS. Cada producto se picó muy fino y se congeló Instantáneamente en un tubo de homogenización en un baño de nitrógeno líquido. Se agregó una perla de acero de 5mm pre enfriada a cada tubo y se homogeneizó usando QiagenTissueLyser de acuerdo con las recomendaciones del fabricante en lml de medio de homogenización. Los homogenatos se centrifugaron luego a 16000g durante 10 minutos usando una mícrocentrífuga. Los sobrenadantes se recogieron y almacenaron a -80 °C hasta analizarse por ELISA para determinar expresión de proteínas. El volumen del sobrenadante fue aproximadamente igual al del volumen inicial de medio de homogenización (1 mi).

Para el ensayo de liberación de factores, los productos de cartílago criopreservados se descongelaron en un baño de agua a 37°C y se retiraron del medio de criopreservación seguido por enjuague por PBS. Cada producto de cartílago se colocó en un pocilio de un plato de 12 pocilios y se agregaron 2 mi de medio de crecimiento (DMEM +1% HSA+ antibiótico/antimicótico) y se incubó a 37°C durante hasta 14 días. Luego de la incubación, el medio de cultivo y tisular se transfirió a un tubo cónico de 15 mi y se centrifugó a 2000 rpm durante 5 min. El sobrenadante de cultivo se recogió y analizó por ELISA para determinar expresión de proteínas. El volumen del sobrenadante fue aproximadamente igual al del volumen inicial de medio de crecimiento (2ml).

La Tabla 4 enumera ejemplos de factores condrogénicosdetectados en los ensayos de liberación de factores y extracto tisular. Cada valor de expresión se proporciona en términos de cantidad de factor por volumen de sobrenadante por área de superficie superior (identificado en las Figuras 15A y 15B) del producto de cartílago (pg/ml/cm2) y cantidad de factor por área de superficie superior del producto de cartílago (pg/cm2).

TABLA 4 Factores condrogenicos Sin limitarse a la teoría, los inventores creen que los factores bioactivos (por ejemplo proteínas de factor de crecimiento) que median la producción de matriz extracelular y promueven la condrogénesis son importantes para una reparación del cartílago eficaz facilitada por productos de cartílago de la presente teenología.

Sorprendentemente, estos resultados indican que el producto de cartílago comprende una variedad de factores condrogénicos que facilitan el valor terapéutico en la reparación del cartílago articular.

EJEMPLO 17 Liberación sostenida de proteínas de productos de cartílago Los productos de cartílago de la presente invención pueden liberar factores en el microambiente mediante células o tejidos para potenciar su actividad funcional.

Para medir la cantidad de proteínas liberadas, los productos de cartílago del Ejemplo 9 se cultivaron en medio de cultivo entre 7-21 días y los sobrenadantes se recogieron y las proteínas clave se cuantificaron por ELISA. Los resultados se describen en las Figuras 10A y 10B, que indican que los productos de cartílago producen y liberan TGF-bI y TGF-?b en el sobrenadante durante al menos 21 días. Estos datos sugieren que el producto de cartílago tiene la capacidad de producir y sostener niveles de factores de crecimiento condrogénicos en el tiempo debido a la presencia de condrocitos viables y ECM densa.

EJEMPLO 18 Liberación de factores de los productos de cartílago Dorados Se investigó el efecto de la poración versus los productos de cartílago intactos en la proteína. Los productos de cartílago se generaron como se detalla en el Ejemplo 9 excepto que los parámetros de poración se modificaron. La mitad de los productos se poraron entre 36-50 poros/cm2 mientras que el resto se mantuvo intacto sin poración. La cantidad de TGF-bI se midió por ELISA de los sobrenadantes de ambas condiciones de productos de cartílago cultivados durante 7 días. Los resultados se describen en la Figura 11, que indican que la cantidad de TGF-bI liberada de los implantes de cartílago porados es mayor que los productos de cartílago intactos. Estos datos indican que las poraciones en el producto no solo contribuyen a la flexibilidad del producto sino que la poración también soporta una mayor liberación de factores condrogénicos. Sin limitarse a la teoría, los inventores especulan que la liberación potenciada se debe al área de superficie aumentada creada por los poros.

EJEMPLO 19 Liberación de factores de los productos de cartílago digeridos Se investigó el efecto de la digestión de productos de cartílago en liberación de proteínas. Los productos de cartílago se generaron como se detalla en el Ejemplo 9 excepto que los parámetros de digestión se modificaron. La mitad de los productos no se sometieron a la digestión con colagenasa de 30 minutos antes de la criopreservación. La cantidad de TGF-bI liberado se midió por ELISA de los sobrenadantes de ambas condiciones de productos cultivados durante 14 días. Los resultados se describen en la Figura 12 que demuestra que la cantidad de TGF-bI liberada de los productos de cartílago digeridos con colagenasa es mayor que los productos de cartílago no digeridos. Estos datos indican que la digestión de colagenasa no solo contribuye a la flexibilidad y limpieza del producto sino que la digestión también soporta una mayor liberación de proteínas beneficiosas al microambiente.

EJEMPLO 20 Liberación de factor TGF-B de productos de cartílago criopreservados que contienen células vivas Se investigó el efecto de la criopreservación en liberación de proteínas. Los productos de cartílago se generaron como se detalla en el Ejemplo 9 (es decir, criopreservados). A continuación, algunos productos de cartílago se sometieron a tres congelados descongelados adicionales en H2O para matar todas las células dentro del producto ("desvita I ización ") . Como paso final, todos los productos de cartílago se descongelaron y cultivaron en pocilios separados en medio de crecimiento durante 21 días.

La cantidad de TGF-bI liberado de manera espontánea en el medio se midió por ELISA de los sobrenadantes de ambas condiciones de productos de cartílago cultivados durante los 21 días. Estos resultados se describen en la Figura 13, que demuestra que la cantidad de factor (TGF-bI) liberado de productos de cartílago criopreservados que contienen células vivas es mayor que los productos de cartílago desvitalizados todo durante el cultivo de 21 días. Estos datos indican que los productos de cartílago criopreservados contienen células viables que continúan produciendo y contribuyendo con factores beneficiosos tales como TGF-bI al microambiente en comparación con el cartílago sin células vivas.

EJEMPLO 21 Viabilidad celular luego del tratamiento con povidona-vodo de productos de cartílago Los esfuerzos por optimizar el procedimiento aséptico del tejido del donante son importantes para el uso terapéutico (y, por ejemplo, para cumplir con las normativas de Food&DrugAdministration (FDA) y del banco de tejidos respecto de la seguridad de los productos tisulares). Para minimizar la biocarga entrante portada por el tejido del donante, los productos de cartílago se trataron con una incubación con antibiótico durante la noche antes de la criopreservación, como se detalla en el Ejemplo 7. Para disminuir adicionalmente la biocarga del producto de cartílago, el tratamiento con povidona-yodo se analizó para observar cualquier cambio en la viabilidad celular o expresión de proteína. La povidona-yodo es un potente antiséptico ampliamente utilizado en el campo clínico para limpiar y descontaminar las superficies quirúrgicas.

Brevemente, los productos de cartílago se produjeron como se detalla en el Ejemplo 9, no obstante, antes de la incubación con antibiótico durante la noche, los productos de cartílago se sumergieron en un baño de povidona-yodo durante 1 seg. yluego se lavaron inmediatamente en solución salina 3 veces. Los productos de cartílago siguieron luego la incubación con antibiótico normal y el proceso de criopreservación. Para evaluar el efecto del tratamiento con povidona-yodo, la viabilidad celular (tinción LIVE/DEAD®) se analizó como se detalla en el Ejemplo 10. Los resultados se describen en las Figuras 14A a 14D. Se analizaron tres concentraciones de povidona-yodo, povidona-yodo al 10% (Figura 14A), povidona-yodo al 5% (Figura 14B), povidona-yodo al 1% (Figura 14C), y povidona yodo al 0% como control (Figura 14D). La tinción LIVE/DEAD® de productos de cartílago descongelados reveló que con concentraciones en aumento de povidona- yodo, la viabilidad celular también disminuyó en comparación con el producto de cartílago de control sin tratar.

EJEMPLO 22 Tratamiento de defectos condrales en cabras con productos de cartílago En una modalidad, se analiza la eficacia de un producto de cartílago en un modelo animal, por ejemplo un modelo animal de defectos condrales focal.

Brevemente, los defectos condrales focales se inducen en las babillas de una cabra y se tratan luego con microfractura únicamente o microfractura con productos de cartílago (producidos en el Ejemplo 9). A los 3, 6 y 12 meses, las articulaciones se recogen y el tejido de reparación se analiza para determinar el volumen de relleno de defecto así como también la tinción de colágeno tipo II que indica la formación de tejido de reparación de cartílago articular. Asimismo, se puede evaluar las cabras para determinar la seguridad del producto monitoreando la inflamación o molestia general del animal durante el estudio.

Los productos de cartílago de la presente teenología aumentan sustancialmente la reparación del cartílago de acuerdo con al menos uno o más de los siguientes criterios no taxativos.

• Seguridad • Morfología bruta • Calidad de tejido de reparación con relación al tejido circundante natural • Integración del tejido de reparación • Evaluación histológica • Tinción de matriz extracelular • Relleno de volumen de defecto • Evaluación mecánica • Ensayos de ¡ndentación de tejido de reparación • Evaluación del tejido de reparación mediante el sistema de clasificación O'Driscoll EJEMPLO 23 Condroaénesis de células viables en productos de cartílago Este estudio demuestra que las células viables en el producto de cartílago son funcionales y tienen el potencial de depositar ECM saludable que contribuirá con la reparación del cartílago adecuada.

Los condrocitos se aíslan y se expanden de los productos de cartílago de la presente invención. El cultivo prolongado ¡n vitro de condrocitos resulta en la desdiferenciación de algunas células (por ejemplo, a un linaje fibroblástico más primitivo). Luego, estas células se colocan en un medio de diferenciación (por ejemplo que contiene factores de crecimiento). Con el tiempo, estas células demuestran condrogénesis/r? vitro.

EJEMPLO 24 Expresión aénica de condrocitos en productos de cartílago Los productos de cartílago se generan como se detalla en el Ejemplo 9 (excepto, con y sin criopreservación). Los condrocitos dentro del producto de cartílago se examinan para determinar la expresión de genes esenciales que estimulan los condrocitos funcionalmente activos. Se detectan los niveles de expresión sustanciales de lo siguiente: colágeno tipo II, agrecano, SOX5, SOX6, y SOX9.

EJEMPLO 25 El efecto estimulante de condrocitos en productos de cartílago en MSC exóaenas.

Las células madre mesenquimales aisladas (por ejemplo de un donante diferente) se co-cultivan con condrocitos aislados de productos de cartílago de la presente invención.

Los condrocitos estimulan los MSC para diferenciarse en condrocitos y estimulan la condrogénesis resultante en este modelo. Estos resultados demuestran que la eficacia terapéutica de productos de cartílago de la presente invención se debe, en parte, al efecto estimulante de los condrocitos del producto de cartílago en las células MSC del receptor.

EJEMPLO 26 Productos de cartílago con corte en espiral Los productos de cartílago se producen de acuerdo con el método detallado en el Ejemplo 9 excepto que, en vez de poradas, las muestras de cartílago están cortadas en espiral ya sea con remoción de tejido (por ejemplo como se describe en las Figuras 20A y 20B o las Figuras 21A y 21B) o sin remoción de tejido (por ejemplo como se detalla en la Figura 17C). Se produjeron productos de cartílago adicionales usando el mismo método excepto que el paso de digestión parcial se elimina.

Los productos de cartílago con corte en espiral son flexibles y pueden adaptarse a un sitio diana en un paciente y pueden administrarse fácilmente a través de artroscopio.

Los productos de cartílago con corte en espiral muestran la eficacia en un modelo de defectos condrales, como se detalla en el Ejemplo 22.

Luego de un período de tiempo, los productos de cartílago con corte en espiral e implantados y tejido del hospedador circundante se retiran y analizan, y usando los marcadores adecuados, se observa uno o más de lo siguiente: a. integración en el cartílago del hospedador b. infiltración de células hospedadoras y ECM rica en colágeno tipo II; c. expresión sustancial de factores bioactivos tales como factores condrogénicos d. niveles sustanciales de condrocitos e. niveles de expresión sustanciales de colágeno tipo II, agrecano, SOX5, SOX6, y SOX9.

Los productos de cartílago con corte en espiral muestran eficacia superior al tratar sujetos (por ejemplo defectos del cartílago). Debido, en parte, a la flexibilidad potenciada provista por el corte en espiral, pueden producirse productos de cartílago más grandes (por ejemplo, mayor espesor, mayor área o mayor volumen) que pueden ser fácilmente manipulados y se adaptan a un sitio diana (por ejemplo, hueco que permanece luego de retirar un defecto del cartílago). Debido, en parte, a las interrupciones de la configuración (corte en espiral), el producto de cartílago pueden expandirse o contraerse (por ejemplo lateralmente) in vivo para proveer una integración potenciada al cartílago del hospedador.

EJEMPLO 27 Productos de cartílago alterados mecánicamente Los productos de cartílago se producen de acuerdo con el método detallado en el Ejemplo 9, excepto que, en vez de porarse, las muestras de cartílago se alteran mecánicamente usando cortes alineados, cortes radiales, cortes de intersección, cortes que forman aros, o cortes que forman múltiples aros. Cada tipo de alteración mecánica se llevó a cabo al menos dos veces en diferentes muestras de cartílago, una vez con remoción de tejido (por ejemplo como se describe en las Figuras 18A a 18D y Figuras 19A y 19B) y una vez sin remoción de tejido (por ejemplo como se detalla en las Figuras 17A a 17C). Se produjeron productos de cartílago adicionales usando el mismo método excepto que el paso de digestión parcial se elimina.

Los productos de cartílago alterados mecánicamente tienen las siguientes propiedades superiores, que están presentes en mayor grado en los productos parcialmente digeridos.

Los productos de cartílago alterados mecánicamente son flexibles y pueden adaptarse a un sitio diana en un paciente y pueden administrarse fácilmente a través de artroscopio.

Los productos de cartílago alterados mecánicamente muestran la eficacia en un modelo de defectos condrales, como se detalla en el Ejemplo 22.

Luego de un período de tiempo, los productos de cartílago alterados mecánicamente e implantados y tejido del hospedador circundante se retiran y analizan, y usando los marcadores adecuados, se observa uno o más de lo siguiente: a. integración en el cartílago del hospedador b. infiltración de células hospedadoras y ECM rica en colágeno tipo II; c. expresión sustancial de factores bioactivos tales como factores condrogénicos d. niveles sustanciales de condrocitos e. niveles de expresión sustanciales de colágeno tipo II, agrecano, SOX5, SOX6, y SOX9.

Las citaciones proporcionadas en la presente se incorporan a la presente mediante esta referencia para el asunto citado.

Modalidades adicionales de la presente invención pueden encontrarse en los siguientes párrafos.

En algunas modalidades, la presente teenología proporciona un producto de cartílago que comprende una matriz de colágeno alterada.

En algunas modalidades, el producto de cartílago contiene matriz de colágeno que comprende alteraciones enzimáticas.

En algunas modalidades, la matriz de colágeno es digerida por colagenasa, opcionalmente donde la matriz de colágeno es digerida por colagenasa II.

En algunas modalidades, la presente tecnología proporciona un producto de cartílago donde la matriz de colágeno comprende alteraciones mecánicas. En algunas modalidades, las alteraciones mecánicas son alteraciones mecánicas parciales, donde la matriz de colágeno está sustancialmente intacta. En aun otras modalidades, las alteraciones mecánicas se seleccionan de: corte en espiral, ranuras, estrías, fenestraciones y poros. En modalidades adicionales, las alteraciones mecánicas pueden ser alteraciones mecánicas completas, opcionalmente donde la matriz de colágeno está picada. En algunas modalidades, las alteraciones mecánicas son del tipo con remoción de tejido. En otra modalidad, las alteraciones mecánicas son del tipo sin remoción de tejido.

En aun otra modalidad, el producto de cartílago incluye una matriz de colágeno que comprende alteraciones mecánicas, donde las alteraciones mecánicas se extienden en todo el espesor de la matriz de colágeno. En aun otra modalidad, las alteraciones mecánicas se seleccionan de: corte en espiral, estrías, estríasde intersección, estríasradiales, corte de aro y poros.

En otras modalidades, el producto de cartílago contiene matriz de colágeno que comprende alteraciones mecánicas, donde las alteraciones mecánicas se extienden en menos de todo el espesor de la matriz de colágeno. En algunas modalidades, las alteraciones mecánicas se seleccionan de: corte en espiral, estrías, estríasde intersección y estríasradiales.

En algunas modalidades, el producto de cartílago de la presente teenología incluye una matriz de colágeno que tiene un espesor de alrededor de 0.2 mm a alrededor de 2.0 mm, de manera alternativa un espesor de alrededor de 1 mm a alrededor de 1.5 mm.

En aun otra modalidad, la presente tecnología proporciona un producto de cartílago donde la matriz de colágeno contiene células viables, opcionalmente donde las células viables son naturales a la matriz de colágeno. En aun otras modalidades, el producto de cartílago de la presente tecnología incluye una matriz de colágeno que está descelularizada.

En algunas modalidades, el producto de cartílago de la presente tecnología, comprende además una capa de hueso, opcionalmente donde la capa de hueso es natural a la matriz de colágeno. En algunas modalidades, la capa de hueso tiene un área de superficie sustancialmente menor que la de la matriz de colágeno. En aun otra modalidad, la capa de hueso es un tapón, un tapón pelado, o una capa o hueso pelado.

En algunas modalidades, el producto de cartílago de la presente tecnología contiene matriz de colágeno que es una matriz de colágeno humana natural. En aun otra modalidad, la matriz de colágeno comprende cartílago hialino.

En aun otra modalidad, el producto de cartílago de la presente tecnología comprende cartílago hialino. En algunas modalidades, el cartílago hialino comprende cartílago articular.

En aun otra modalidad, el producto de cartílago de la presente tecnología contiene una matriz de colágeno, donde la matriz de colágeno comprende condrocitos viables en una cantidad de al menos cualquiera de: alrededor de 500 células/mm2, alrededor de 600 células/mm2, alrededor de 700 células/mm2, alrededor de 800 células/mm2, alrededor de 1200 células/mm2, alrededor de 1500 células/mm2, y alrededor de 5000 células/mm2, opcionalmente donde los condrocitos viables son naturales a la matriz de colágeno.

En aun otra modalidad, el producto de cartílago de la presente tecnología contiene una matriz de colágeno, donde la matriz de colágeno comprende una o más capas que se seleccionan de: una capa tangencial, una capade transición y una capa radial. En algunas modalidades, la matriz de colágeno comprende una capa tangencial que comprende al menos cualquiera de: alrededor de 100 células/mm2, alrededor de 200 células/mm2, y alrededor de 1000 células/mm2, opcionalmente donde los condrocitos viables son naturales a la matriz de colágeno.

En algunas modalidades, el producto de cartílago contiene una matriz de colágeno que comprende una capa de transición que comprende al menos cualquiera de: alrededor de 100 células/mm2, alrededor de 200 células/mm2, y alrededor de 400 células/mm2, opcionalmente donde los condrocitos viables son naturales a la matriz de colágeno.

En otras modalidades, el producto de cartílago contiene una matriz de colágeno que comprende una capa radial que comprende al menos cualquiera de: alrededor de 100 células/mm2, y alrededor de 200 células/mm2, opcionalmente donde los condrocitos viables son naturales a la matriz de colágeno.

En otra modalidad, el producto de cartílago de la presente teenología contiene una matriz de colágeno, donde la matriz de colágeno es flexible, opcionalmente donde la matriz de colágeno tiene una flexibilidad de modo que puede doblarse o curvarse sin romperse. En algunas modalidades, el producto de cartílago contiene matriz de colágeno que tiene un módulo de Young de al menos alrededor de cualquiera de: 0.1 MPa, 0.2 MPa, 0.3 MPa, y 0.4 MPa.

Otra modalidad proporciona un método de tratamiento que comprende administrarle a un sujeto que lo necesita, un producto de cartílago de la presente tecnología. En algunas modalidades, el producto de cartílago se administra artroscópicamente. En otra modalidad, la administración comprende doblar o enrollar el producto de cartílago. En aun otra modalidad, el paso de administración se realiza junto con un procedimiento de microfractura.

En otra modalidad, el producto de cartílago de la presente tecnología incluye matriz de colágeno que comprende colágeno tipo II. En algunas modalidades, el producto de cartílago incluye matriz de colágeno que comprende cartílago hialino. En otras modalidades, el producto de cartílago incluye matriz de colágeno que es una matriz de colágeno natural, opcionalmente, donde la matriz de colágeno es una matriz de colágeno humana.

En aun otra modalidad, el producto de cartílago de la presente tecnología incluye una matriz de colágeno que es una matriz de colágeno natural, opcionalmente, donde la matriz de colágeno es una matriz de colágeno humana.

En algunas modalidades, el producto de cartílago comprende además un aditivo.

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Un producto de cartílago que comprende una matriz de colágeno, en donde la matriz de colágeno comprende una pluralidad de canales y en donde la matriz de colágeno contiene células viables natural a la matriz de colágeno.

2.- El producto de cartílago de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque los canales son de tipo con remoción de tejido.

3.- El producto de cartílago de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque los canales son de tipo sin remoción de tejido.

4.- El producto de cartílago de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque los canales se extienden en todo el espesor de la matriz de colágeno.

5.- El producto de cartílago de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque la matriz de colágeno tiene un espesor de alrededor de 0.2 mm a alrededor de 3.0 mm.

6.- El producto de cartílago de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque la matriz de colágeno tiene un espesor de alrededor de 1 mm a alrededor de 1.5 mm.

7.- El producto de cartílago de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque comprende adicionalmente una capa de hueso, en donde la capa de hueso es natural a la matriz de colágeno.

8.- El producto de cartílago de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque la capa de hueso tiene un área de superficie sustancialmente menor que la de la matriz de colágeno.

9.- El producto de cartílago de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque la matriz de colágeno comprende una capa radial, transicional o tangencial.

10.- El producto de cartílago de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque la pluralidad de canales son cilindricos.

11.- El producto de cartílago de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque la pluralidad de canales tienen un diámetro de aproximadamente 0.25 mm a aproximadamente 1.5 mm.

12.- El producto de cartílago de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque la matriz de colágeno comprende una densidad de canal de aproximadamente 10 a aproximadamente 500 poros por cm2.

13.- El producto de cartílago de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque la matriz de colágeno comprende factores bioactivos, en donde los factores bioactivos son naturales a la matriz de colágeno.

14.- El producto de cartílago de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque la pluralidad de canales se extienden en el hueso.

15.- El producto de cartílago de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque la pluralidad de canales no se extienden en el hueso.

16.- El producto de cartílago de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque la pluralidad de canales se extienden sustancialmente de forma perpendicular a la capa radial, transicional o tangencial.

17.- El producto de cartílago de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque las células viables naturales a la matriz de colágeno comprenden condrocitos viables.

18.- El producto de cartílago de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque el producto de cartílago está criopreservado.

19.- El producto de cartílago de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque comprende adicionalmente un medio de criopreservación.

20.- El producto de cartílago de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque el producto de cartílago no tiene hueso subcondral o cartílago calcificado.

21.- El producto de cartílago de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque el producto de cartílago se agota de células inmunogénicas.