JP2015523153A - 穿孔型軟骨製品 - Google Patents

Abstract

本発明は、穿孔した軟骨製品、穿孔した軟骨製品の生産方法、および軟骨製品を投与することによる対象の処置方法を提供する。任意に、軟骨製品は寸法が調節され、穿孔され、消化されて柔軟な軟骨製品を提供する。任意に、軟骨製品は、生存可能な軟骨細胞、軟骨形成因子などの生理活性因子、およびＩＩ型コラーゲンマトリックスを含む。任意に、軟骨製品は非免疫原性である。【選択図】図１５

Description

［関連案件の相互参照］
本願は、
ＭｃＡｎｄｒｅｗｓ， Ｈｅｌｄ ａｎｄ Ｍａｌｌｏｙの整理番号第２５５３２ＵＳ０１号が付された２０１１年７月１１日に出願した表題“Ｐｏｒａｔｅｄ Ｃａｒｔｉｌａｇｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ”の米国仮特許出願番号第６１／６７０，４２４号、
ＭｃＡｎｄｒｅｗｓ， Ｈｅｌｄ ａｎｄ Ｍａｌｌｏｙの整理番号第２５５３３ＵＳ０１号が付された２０１１年７月１１日に出願した表題“Ｄｉｓｒｕｐｔｅｄ Ｃａｒｔｉｌａｇｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ”の米国仮特許出願番号第６１／６７０，４３４号、および
ＭｃＡｎｄｒｅｗｓ， Ｈｅｌｄ ａｎｄ Ｍａｌｌｏｙの整理番号第２５５３４ＵＳ０１号が付された２０１１年７月１１日に出願した表題“Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｃａｒｔｉｌａｇｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ”の米国仮特許出願番号第６１／６７０，４４４号
の優先権を主張するものであり、上記文書の内容は参照として本明細書に援用される。
本願は、ＭｃＡｎｄｒｅｗｓ， Ｈｅｌｄ ａｎｄ Ｍａｌｌｏｙの整理番号第２５５３３ＵＳ０２号および第２５５３３ＷＯ０１号を付した米国ＰＣＴ出願の表題“Ｄｉｓｒｕｐｔｅｄ Ｃａｒｔｉｌａｇｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ”、ＭｃＡｎｄｒｅｗｓ， Ｈｅｌｄ ａｎｄ Ｍａｌｌｏｙの整理番号第２５５３４ＵＳ０２号および第２５５３４ＷＯ０１号を付した米国ＰＣＴ出願の表題“Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｃａｒｔｉｌａｇｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ”、およびＭｃＡｎｄｒｅｗｓ， Ｈｅｌｄ ａｎｄ Ｍａｌｌｏｙの整理番号第２５５３２ＵＳ０２号を付した表題“Ｐｏｒａｔｅｄ Ｃａｒｔｉｌａｇｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ”の米国出願と共出願されており、これらの内容は本明細書に援用される。

本発明は、治療に有益な軟骨製品ならびにそのような治療の産出方法および使用方法に関する。

関節軟骨損傷は、整形外科において未解決のままとなっている主な問題の１つである。米国では１年に５００，０００人超の患者が軟骨損傷を修復するために外科的手法を受けている。しかしながら、これら外科手術の多くは不十分な結果をもたらしている。

関節軟骨は主に、プロテオグリカンを含むＩＩ型コラーゲン繊維により形成される細胞外マトリックス全体に分布した軟骨細胞の低密度の集合からなる。コラーゲンは関節軟骨の形態および引っ張り強度に関与し、水とプロテオグリカンの相互作用は関節軟骨に、圧迫に強い性質、復元および耐久性をもたらす。硝子軟骨は、関節の骨部を覆う低摩擦に耐える表面を提供する。この被膜が摩耗または損傷して病変部となった場合、関節運動は疼痛を伴い、または著しく制限され得る。概して損傷した骨はうまく再生できるのに対して、硝子軟骨の再生はかなり制限されている。

現在の外科処置としては、微細破壊（ｍｉｃｒｏｆｒａｃｔｕｒｅ）、デブリードマン、骨軟骨移植、および自己軟骨細胞移植（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、ＡＣＩ）が挙げられる。これら処置の目標は、天然の硝子軟骨（ＩＩ型コラーゲン）を修復かつ再生することである。

微細破壊は、損傷した関節軟骨を除去した後、下にある軟骨下骨を物理的に損傷させて骨髄に曝露し、出血させる。これにより血餅が炎症性サイトカイン、増殖因子、およびＭＳＣを誘導して欠損部を埋めるが、この工程は関節軟骨を産出できず、かわりにＩ型コラーゲンから生成される線維軟骨創傷組織（ｆｉｂｒｏｃａｒｔｉｌａｇｅ ｓｃａｒ ｔｉｓｓｕｅ）の産生を刺激する。線維軟骨は長期の生体力学的性能が不十分であるため、異常な骨増殖を引き起こし変形性関節症のリスクを増大させる。

他の戦略として、自己軟骨細胞移植（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、ＡＣＩ）、デブリードマン、および骨軟骨移植が挙げられるがこれらはいずれも不十分である。

Ｇｏｍｅｓら（米国特許公開公報第２００４／０２３０３０３号）は、軟骨下骨基部ならびに軟骨キャップおよび基部を通して穿孔した穴を含む関節軟骨キャップを有して細胞遊走を可能にするインプラントを記載している。このインプラントは、ヒアルロニダーゼ（ＩＶ型、３ｍｇ／ｍＬ）およびトリプシン（一塩基二塩基（ｍｏｎｏｄｉｂａｓｉｃ）緩衝液３ｍｌ中、０．２５％）で３７℃、１８時間で消化できる。他の欠点と同様に、Ｇｏｍｅｓらは、柔軟性のある軟骨インプラント、生存可能な天然の軟骨細胞を含む軟骨インプラント、または非免疫原性の軟骨インプラントについては教示していない。

Ｃｈｅｎら（米国特許公開公報第２００９／００２４２２９号）は、失活させ（非細胞にする）、かつその後に再細胞化（ｒｅｃｅｌｌｕｌａｒｉｚｅｄ）した軟骨移植片を記載する。この移植片は、再細胞化を促進するために膜に微小な穴をあけられ得る（ｍｉｃｒｏｐｅｒｆｏｒａｔｅ）。この移植片は軟骨の分子態様を修飾する酵素を使用して失活させられ、プロテオグリカンを除去するコンドロイチナーゼやたとえばＢＥＮＺＯＮＡＳＥ．ＲＴＭ．（メルクインコーポレイティッド）といった組み換えエンドヌクレアーゼなどが用いられる。他の欠点と同様に、Ｃｈｅｎらは、柔軟性のある軟骨インプラント、生存可能な天然の軟骨細胞を含む軟骨インプラントまたは非免疫原性軟骨インプラントについては教示していない。

Ｓｔｅｉｎｗａｃｈｓら（米国特許公開公報第２００８／０２６９８９５号）は、多様な特性を有する軟骨インプラントを記載する。このインプラントは、軟骨細胞からｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖させることができ、または軟骨外植片となり得る。多様な特性の中で、このインプラントは、０．５ｍｍ〜２ｍｍの外径を備えたチャネルを有することができる。他の欠点と同様に、Ｓｔｅｉｎｗａｃｈｓらは、消化された軟骨インプラントまたは非免疫原性軟骨インプラントを教示していない。

Ｂａｒｄｏｓら（“Ｏｓｔｅｏｃｈｏｎｄｒａｌ Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｕｌｔｉｐｌｙ Ｉｎｃｉｓｅｄ Ｐｕｒｅ Ｃａｒｔｉｌａｇｅ Ａｌｌｏｇｒａｆｔ： Ｒｅｐａｉｒ Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ Ｆｏｃａｌ Ｃｈｏｎｄｒａｌ Ｄｅｆｅｃｔｓ ｉｎ ａ Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｍｏｄｅｌ”；Ａｍ Ｊ Ｓｐｏｒｔｓ Ｍｅｄ ２００９ ３７：５０Ｓ）は、平行な切り込みを備えるブタの軟骨試料を記載する。他の欠点と同様に、Ｂａｒｄｏｓらは、消化された軟骨試料または非免疫原性軟骨試料を教示していない。

Ｂｒａｖｅｎｂｏｅｒら（“Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｃａｒｔｉｌａｇｅ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｔｅｒｆａｃｉａｌ ｓｔｒｅｎｇｔｈ ａｆｔｅｒ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｉｎ ａ ｃａｒｔｉｌａｇｅ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｍｏｄｅｌ”；Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｅｓ Ｔｈｅｒ ２００４，６）は、ヒアルロニダーゼで処置し、その後コラゲナーゼで処置したウシの関節軟骨を記載する。他の欠点と同様に、Ｂｒａｖｅｎｂｏｅｒらは、複数の孔を備える軟骨試料または非免疫原性軟骨試料を教示していない。

Ｂｏｓら（“Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｏｖｉｎｅ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ａｒｔｉｃｕｌａｒ Ｃａｒｔｉｌａｇｅ”；Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ＆Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ Ｖｏｌ． ４６，Ｎｏ．４，Ａｐｒｉｌ ２００２，ｐｐ ９７６−９８５）は、コラゲナーゼＶＩＩで処置した軟骨試料を記載する。他の欠点と同様に、Ｂｏｓらは、複数の孔を備える軟骨試料または非免疫原性軟骨試料を教示していない。

当技術分野で必要とされているのは、たとえば関節鏡のカニューレを通して容易に投与でき、損傷した軟骨部位に沿うことができる柔軟性のある軟骨製品であって、かつ、最小限の瘢痕で軟骨を再生するための生存可能な軟骨細胞および軟骨形成因子を含むＩＩ型コラーゲンマトリックスを提供する柔軟な軟骨製品である。

本発明は、軟骨製品および軟骨製品の使用方法を提供する。本発明による軟骨製品は、コラーゲンマトリックスを含み、このコラーゲンマトリックス中に複数の孔を備える。任意に、コラーゲンマトリックスは、たとえばコラーゲンマトリックスの部分的消化により産生されるような断片化した細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質を含む。

本発明の例示的な軟骨製品のコラーゲンマトリックスは、以下の、
コラーゲンＩＩを含み、または硝子軟骨由来であることと、
任意にコラーゲンマトリックスに対して天然である生存可能な細胞を含むことと、
生理活性因子を含むことと、
天然の関節軟骨よりも実質的に短いＥＣＭタンパク質断片を含み、かつコラーゲンマトリックス中のコラーゲンの実質量が、たとえば部分的消化により産生されるため、天然の関節軟骨のコラーゲン実質量と比較して断片化していることと、
非修飾型関節軟骨試料よりも大きな柔軟性を示すことと、
凍結保存媒体中で凍結保存または製剤化され、かつ実質的に非免疫原性であることと
いった技術的特性のうちの１つ以上（たとえば各特性）を有する。

１つの実施形態では、コラーゲンマトリックスはＩＩ型コラーゲン（または「コラーゲンＩＩ」）を含む。任意に、コラーゲンマトリックス中のコラーゲンの大部分は、硝子軟骨（たとえば関節軟骨）により提供されるコラーゲンマトリックスなどのコラーゲンＩＩである。任意に、本軟骨製品は、軟骨下骨、石灰化軟骨、または軟骨下骨および石灰化軟骨の両方を欠いている。任意に、本軟骨製品は、放射層（ｒａｄｉａｌ ｌａｙｅｒ）、遷移層（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎａｌ ｌａｙｅｒ）、および表層（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ ｌａｙｅｒ）から選択される１つ以上の軟骨層を含む。

１つの実施形態では、本軟骨製品は生存可能な細胞を含む。任意に、生存可能な細胞は軟骨細胞である。任意に、生存可能な細胞は、コラーゲンマトリックスに対し天然である。任意に、生存可能細胞は、勾配を有してコラーゲンマトリックス全体に分布する。任意に、孔がこの勾配に沿って配置されている。

１つの実施形態では、本軟骨製品は軟骨形成因子などの生理活性因子を含む。任意に、軟骨形成因子は、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−７、ｂＦＧＦ、およびＩＧＦ−１からなる群から選択される。任意に、軟骨は、コラーゲンＩＩ、ヒアルロナン、およびアグリカンを含む。

１つの実施形態では、ＥＣＭタンパク質（たとえばコラーゲン）フラグメントは天然の関節軟骨のフラグメントよりも実質的に短い。さらに、またあるいは、コラーゲンマトリックス中のＥＣＭタンパク質の実質量は、天然の関節軟骨よりも断片化されている。任意に、ＥＣＭタンパク質フラグメントは、たとえば、コラゲナーゼ（たとえばＩＩ型）処置のような酵素的消化などの、天然の軟骨の部分的消化により産生される。

１つの実施形態では、コラーゲンマトリックスは約０．５〜約２．０ｍｍの厚さを有する。任意に、厚さは約１〜約２ｍｍである。任意に、厚さは約１〜約１．５ｍｍである。

１つの実施形態では、コラーゲンマトリックスは、同様の厚さの非修飾型関節軟骨よりも柔軟性がある。任意に、複数の孔の直径は約０．２ｍｍ〜約１．５ｍｍ（たとえば約１ｍｍ）である。任意に、コラーゲンマトリックスは約１０〜約５００孔／ｃｍ^２であり、たとえば約１０〜約６０孔／ｃｍ^２である。

１つの実施形態では、本軟骨製品は実質的に非免疫原性である。任意に、本軟骨製品は実質量のマクロファージを含まない。

いくつかの実施形態では、本発明の軟骨製品は消化されない。他の実施形態では、本発明の軟骨製品は、酵素的（たとえばコラゲナーゼ、プロナーゼ、プロテイナーゼＫなどの処置）、生化学的（たとえばパパイン）、熱的（たとえば過熱）、化学的（ケラチン硫酸塩（ｋｅｒａｔｉｎ ｓｕｌｆａｔｅ）、トシルリジンクロロメチルケトン（ｔｏｓｙｌｌｙｓｙｌｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｅ））、機械的（穿孔）手段を含む消化手段、当業者に知られている他のいずれかの手段、ならびに上記の任意の２つ以上の組み合わせにより部分的に消化される。

図１は、本発明の製品を作製可能な膝関節を表す。 図２は、本発明の関節軟骨および隣接する骨の層を表す。 図３は、本発明の凍結保存した軟骨製品における生存可能な軟骨細胞を表す。 図４は、本発明の凍結保存した軟骨製品における生存可能な軟骨細胞を表す。 図５は、本発明の凍結保存した軟骨製品における生存可能な軟骨細胞を表す。 図６は、本発明の凍結保存した軟骨製品における生存可能な軟骨細胞を表す。 図７は、本発明の凍結保存した軟骨製品における生存可能な軟骨細胞を表す。 図８は、本発明の凍結保存した軟骨製品における生存可能な軟骨細胞を表す。 図９は、本発明の軟骨製品の非免疫原性を表す。 図１０は、本発明の軟骨製品由来の軟骨形成因子の持続的な放出を表す。 図１１は、本発明の穿孔型（ｐｏｒａｔｅｄ）軟骨製品からの軟骨形成因子のより多くの放出を表す。 図１２は、本発明の消化型軟骨製品からの軟骨形成因子のより多くの放出を表す。 図１３は、本発明の凍結保存型軟骨製品からの軟骨形成因子のより多くの放出を表す。 図１４は、細胞生存率に関するヨウ素処置の効果を表す。 図１５は、本発明の軟骨製品を表す。図１５Ａは、本軟骨製品の表面に言及するため本明細書で使用される名称を表す。図１５Ｂは、表面積計算に使用される直径、厚さの計算に使用される高さ、および層または勾配の任意の向きを表す。 図１６は、コラーゲンマトリックスおよび骨を含む本発明の軟骨製品を表す。

以下より、本明細書で使用する定義および略語を説明する。

「ＢＴＢ」は、膝関節から取得した骨−腱−骨（ｂｏｎｅ−ｔｅｎｄｏｎ−ｂｏｎｅ）移植片を意味し、膝蓋骨、膝蓋腱、および接着した脛骨ブロックを含む。

「軟骨製品」は、特段他の記載がない限り、本発明の軟骨製品を意味する。

「ＤＭＥＭ」は、ダルベッコ改変イーグル培地を意味する。

「Ｄ−ＰＢＳ」は、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水を意味する。

「ＥＣＭ」は、たとえば、軟骨のマトリックスのような細胞外マトリックスを意味する。

「例示的な」または「たとえば（ｅ．ｇ）」もしくは「例として（ｂｙ ｅｘａｍｐｌｅ）」は、非限定的な例を意味する。

たとえば、「天然のＥＣＭ」または「天然の軟骨」の文脈での「天然」は、ドナーの本来の自然状態のＥＣＭまたは軟骨により示される特性を指す。

「部分的な消化」（または「限定された消化」）は、酵素的な消化であって、１つ以上の消化可能な部位が消化されていないままであることを意味する。１つの実施形態では、部分的な消化は細胞を温存する消化であり、したがってさらなる消化は細胞の生存率を低下させる。１つの実施形態では、消化は、たとえば軟骨試料からの消化産物の放出を測定するなどの任意の方法、または物理的特性に対する消化の影響によりモニタリングできる。１つの実施形態では、部分的に消化したコラーゲンマトリックス（たとえば関節軟骨試料）は、非消化のコラーゲンマトリックスと比較して実質的に未変性であり、たとえば、消化コラーゲンマトリックスは、消化中その形状を保持したままである。

「ＱＣ」は、品質管理を意味する。

軟骨製品中の治療的細胞（たとえ軟骨細胞）および治療的生理活性因子（たとえば軟骨形成因子）に関して使用される際の「実質量」は、たとえば本処置方法にしたがって軟骨製品を投与する際にｉｎ ｖｉｖｏで測定可能な治療的作用を提供する量を意味する。

本技術に関して使用される際の物質を「欠いている」との文言は、このような物質を「実質的に含んでいない」または「実質的に欠いている」製品を含み、かつ、０％を含む、５％未満、より好ましくは２％未満、より好ましくは１％未満、より好ましくは０．５％未満のこのような物質を有する製品を含む。たとえば、本発明のいくつかの実施形態では、本技術に関して使用される際に、軟骨下骨、石灰化軟骨、または軟骨下骨および石灰化軟骨の両方を欠いている製品は、軟骨下骨、石灰化軟骨、またはその両方を実質的に含まない軟骨製品、軟骨下骨、石灰化軟骨、またはその両方を実質的に欠いている軟骨製品、ならびに、５％未満、２％未満、１％未満、０．５％未満、または０％の軟骨下骨、石灰化軟骨、またはその両方を含む製品を含む。

軟骨製品
本発明は、その内部に複数の孔を有するコラーゲンマトリックスを含む軟骨製品を提供する。任意に、コラーゲンマトリックスはＥＣＭタンパク質フラグメントを含み、たとえばコラーゲンマトリックスは消化された硝子軟骨である。

いくつかの実施形態では、本軟骨製品は、１つ以上の孔をその中に有するマトリックスを含む。

驚くべきことに、本発明の例示的な軟骨製品は、ＩＩ型コラーゲンおよびプロテオグリカン、生理活性因子、および生存可能な軟骨細胞を提供することにより健康で正常な関節軟骨の再生を支援する。

１つの実施形態では、本軟骨製品は柔軟性がある。例示的な柔軟性軟骨製品は、関節鏡カニューレ内で巻くことができ、破損することなく広範囲にわたり湾曲でき、かつ対象内で通常とは異なる標的部位に沿うことができる。驚くべきことに、生存可能な細胞および因子を備えた柔軟性軟骨製品を、ａ）コラーゲンマトリックスの厚さ；ｂ）穿孔（孔の寸法、孔の深さ、および孔密度）の度合い；およびｃ）消化の度合いを適切に構成することにより産生できることが見出された。

１つの実施形態では、本軟骨製品は軟骨細胞などの生存可能な細胞を含む。任意に、生存可能な細胞は天然の軟骨細胞である。任意に、生存可能な細胞は、ある勾配でコラーゲンマトリックス全体に分布する。任意に、孔はこの勾配に沿って配列される。１つの実施形態では、ＥＣＭタンパク質（たとえばコラーゲン）フラグメントは天然の関節軟骨のフラグメントよりも実質的に短い。さらに、またあるいは、コラーゲンマトリックス中のＥＣＭタンパク質の実質量は、天然の関節軟骨と比較して断片化されている。任意に、ＥＣＭタンパク質フラグメントは、たとえばコラゲナーゼ（たとえばＩＩ型）処置などの酵素的消化による、天然の軟骨の部分的消化により産生される。

１つの実施形態では、本軟骨製品は凍結保存のために製剤化され、たとえば凍結保存媒体を含む。任意に、本軟骨製品は凍結保存される。

本発明の１つの実施形態を例示するために、例示的な軟骨製品は、コラーゲンマトリックスとして、一連の孔（たとえばチャネル）を有する硝子（たとえば関節）軟骨の層（たとえばディスク）を含み、この軟骨の層は生存可能な天然の軟骨細胞および、コラゲナーゼなどのコラーゲン消化酵素での部分的な消化により産生されるコラーゲンフラグメントを含む。軟骨の層は、構造の強度を保持しつつ柔軟である。本軟骨製品は、軟骨下骨および石灰化軟骨を欠いており、放射層、遷移層、および表層を含み、それらにわたり生存可能な天然の軟骨細胞の分布の勾配がみられる。任意に、一連の孔の直径は約０．２ｍｍ〜約２．０ｍｍ（たとえば約１ｍｍ）である。任意に、軟骨の層は、約１０〜約５００孔／ｃｍ^２、たとえば、約１０〜約６０孔／ｃｍ^２を含む。任意に、本軟骨製品は凍結保存のために製剤化される。

１つの実施形態では、非修飾型コラーゲンマトリックス（たとえば単離型関節軟骨試料）と比較して、コラーゲンマトリックスはより高い柔軟性（たとえば低減した剛性率）を有するが、軟骨の機構的特性を保持している。このような特性の例（たとえば圧縮強度、ヤング率）は、ＭＡＮＳＯＵＲ（インターネットのＵＲＬ ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃａｒｔｉｌａｇｅｈｅａｌｔｈ．ｃｏｍ／ｉｍａｇｅｓ／ａｒｔｃａｒｔｂｉｏｍｅｃｈ．ｐｄｆから入手される“Ｂｉｏｍｅｃｈａｎｉｃｓ ｏｆ Ｃａｒｔｉｌａｇｅ”第５章）に記載されている。

１つの実施形態では、コラーゲンマトリックスは柔軟であり（たとえば、破損することなく折り畳み可能であるように柔軟であり）、少なくとも約０．１ＭＰａ、０．２ＭＰａ、０．３ＭＰａ、または０．４ＭＰａのヤング率を備える。

コラーゲンマトリックス
本発明の軟骨製品はコラーゲンマトリックスを含む。コラーゲンマトリックスは、コラーゲン繊維および生理活性因子を含む任意の細胞外マトリックスであってよい。コラーゲンマトリックスは任意の供給源から取得でき、かつ任意の寸法および形状であってよい。任意に、コラーゲンマトリックスは柔軟である（たとえば、関節鏡カニューレを介して巻かれまたは折り畳まれ、かつ投与できるような柔軟性がある）。

１つの実施形態では、コラーゲンマトリックスは対象から単離され（「天然のコラーゲンマトリックス」）、またはｉｎ ｖｉｔｒｏで培養される。

１つの実施形態では、コラーゲン繊維はＩＩ型コラーゲンを含む。任意に、コラーゲンマトリックスは、関節軟骨などの硝子軟骨である。任意に、関節軟骨は、下顎頭軟骨（ｃｏｎｄｏｙｌｅ ｃａｒｔｉｌａｇｅ）、大腿顆軟骨（ｆｅｍｕｒ ｃｏｎｄｏｙｌｅ ｃａｒｔｉｌａｇｅ）、脛骨プラトー軟骨（ｔｉｂｉａｌ ｐｌａｔｅａｕ ｃａｒｔｉｌａｇｅ）、大腿骨頭軟骨（ｆｅｍｏｒａｌ ｈｅａｄ ｃａｒｔｉｌａｇｅ）、上腕骨頭軟骨（ｈｕｍｏｒａｌ ｈｅａｄ ｃａｒｔｉｌａｇｅ）、距骨（ｔａｌｕｓ ｃａｒｔｉｌａｇｅ）、または寛骨臼軟骨（ａｃｅｔａｂｕｌｕｍ ｃａｒｔｉｌａｇｅ）である。任意に、関節軟骨は、放射層、遷移層、および表層から選択される１つ以上の軟骨の層を含む。

１つの実施形態では、コラーゲンマトリックスは断片化したＥＣＭタンパク質を含む。断片化したＥＣＭタンパク質は、天然のコラーゲンマトリックス（たとえばヒトなどの哺乳類から得た軟骨試料）の部分的な消化により任意に産生される。任意に、コラーゲンマトリックスは、コラーゲン分解酵素などのプロテイナーゼで部分的に消化される。有益なコラーゲン分解酵素としては、限定するものではないが、たとえば、コラゲナーゼ（たとえばＩ〜ＩＶ型細菌コラゲナーゼ）、他のエンドペプチダーゼ（たとえばトリプシン、パパイン、ペプシン）、およびエキソペプチダーゼ（たとえばカルボキシペプチダーゼ）が挙げられる。

１つの実施形態では、コラーゲンマトリックスは、軟骨下骨、石灰化軟骨またはその両方を欠いている。もし存在した場合、軟骨下骨および石灰化軟骨は、コラーゲンマトリックスの柔軟性を阻害する可能性がある。代替的な実施形態では、本軟骨製品は、たとえば、図１６Ａに表されるような（コラーゲンマトリックスと比較して）縮小した領域の骨プラグのような骨または図１６Ｂに表されるような骨のシェルを含む。

１つの実施形態では、コラーゲンマトリックスは関節軟骨由来であり、放射層、遷移層、および表層から選択される１つ以上の軟骨の層を含む。図２に表されるように、天然の関節軟骨の天然の軟骨細胞は、放射層の軟骨細胞の縦列から表層の平板化した細胞までの勾配で、これらの層にわたり分布している。表（「表面の」）層のコラーゲン繊維は、表面と平行である。放射層のコラーゲン繊維は、概して関節の表面に向かって（たとえば関節の表面と直交するように）方向付けられている。遷移層のコラーゲン繊維は、概して、放射層および表層よりも低密度に充填されており、関節の表面と比較して斜めに、またはよりランダムな形式で配置されている。

１つの実施形態では、コラーゲンマトリックスは約３ｍｍ未満の厚さ（図１５では「高さ」として表されている）を有する。任意に、コラーゲンマトリックスは約０．２〜約２ｍｍ、または約１ｍｍ〜約１．５ｍｍの厚さを有する。厚さは、たとえば、図１５Ａに表されるように、コラーゲンマトリックスの層に対し直交して測定できる（たとえば、表層の表面から放射層の表面までの距離）。驚くべきことに、厚さが低減されたコラーゲンマトリックスおよび適合された多孔性により、生存可能な細胞および因子のマトリックスを提供する能力を保持しつつ、損傷した組織に関節鏡検査により投与できかつ容易に沿うことができる柔軟性軟骨製品を提供できる。

１つの実施形態では、コラーゲンマトリックスは約０．５ｃｍ^２〜約５ｃｍ^２の面積を有する表面（たとえば、表層または放射層それぞれの表面などの、上面また下面）を有する。任意に、コラーゲンマトリックスは約３ｍｍ未満または約２ｍｍ未満（たとえば１ｍｍ〜約１．５ｍｍ）の厚さで隔てられる上面および下面を有する。

１つの実施形態では、コラーゲンマトリックスは、丸型の形状（たとえば楕円または円形）、長方形の形状、または正方形の形状で提供される。丸型コラーゲンマトリックスを含む軟骨製品の例は図１５に表される。任意に、コラーゲンマトリックスの幅（本明細書では、形状に関わらず「直径」を指す）は、たとえば図１５に表されるように、高さ（本明細書では「厚さ」を指す）よりも大きい。

１つの実施形態では、たとえば図１５に表されるように、コラーゲンマトリックスは、ディスクであり、すなわちコラーゲンマトリックス表面（たとえば上面または下面）の直径（または幅）は、コラーゲンマトリックスの厚さ（または側面の高さ）よりも大きい。任意に、上面、下面、またはその両方に孔が提供される。

孔
本発明の軟骨製品は複数の孔を有するコラーゲンマトリックスを含む。複数の孔は、軟骨の柔軟性を増大させ、かつそれを通じて細胞および因子が遊走できるような複数の経路を提供する任意の方法で構成できる。

孔はコラーゲンマトリックスの任意の表面全体に提供でき、かつコラーゲンマトリックスを通して部分的に（キャビティとして）または全体に（チャネルとして）延長できる。たとえば、図１５に表されるように、孔は上面、下面、またはその両方にわたり提供できる。

本発明によると、コラーゲンマトリックスの孔は、以下の
柔軟性のある軟骨製品；
優れた固着を有する軟骨製品；および
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）および軟骨細胞の遊走を促進する軟骨製品
といった技術的特性のうちの１つ以上を提供する。

１つの実施形態では、複数の孔はコラーゲンマトリックスの柔軟性に影響を与えるように構成される。孔の密度および寸法を変動させることにより、当業者は、本発明による柔軟なコラーゲンマトリックスを産生できる。任意に、複数の孔は、約０．２５ｍｍ〜約１．５ｍｍの直径たとえば、約０．５ｍｍ〜約１．５ｍｍ（たとえば約１ｍｍ）の直径を有する。任意に、コラーゲンマトリックスは、約１０〜約５００孔／ｃｍ^２、たとえば約１０〜約１００孔／ｃｍ^２または約１０〜約６０孔／ｃｍ^２（たとえば約３６孔／ｃｍ^２）の孔密度を備える。任意に、コラーゲンマトリックスは、総表面積の約３％〜約９０％（たとえば約５％〜約５０％、または約１０％〜約５０％）の総孔面積を有する上面または下面を備える。たとえば、３６孔／ｃｍ^２で約１ｍｍの直径の孔を有するコラーゲンマトリックスは、総表面積に対し約２８％の孔面積を有する。

複数の孔は、任意に固着を改善する。孔はコラーゲンマトリックスの表面積を増大でき、かつより良好な接着を提供でき、たとえば接着剤（たとえばティシールなどのフィブリン糊）の適用時の固着を促進し、または軟骨製品が任意に投与される対象における標的部位へのさらなる一体化を可能にする。

複数の孔は、ＭＳＣおよび軟骨細胞（たとえば、コラーゲンマトリックスから遊走するコラーゲンマトリックスに対して内在性のドナー細胞およびコラーゲンマトリックス内へと遊走するインプラントレシピエントの細胞）の遊走を任意に促進する。

１つの実施形態では、孔はチャネルまたはキャビティである。チャネルは、コラーゲンマトリックスの２つの表面にわたって（たとえば上面および下面にわたり）延びる任意の孔である。キャビティは、コラーゲンマトリックスの２つの面を貫いて延びていない任意の孔である。任意に、孔は、たとえば２次元の列に配列される。任意に、コラーゲンマトリックスは１つ以上の細胞層またはＥＣＭ層（たとえば、放射層、表層、または遷移層）を含み、かつ孔は、層に対して実質的に直交して（すなわち９０°±４５°）延びるか、層に対して実質的に対角線上に延びており、またはコラーゲンマトリックスはある勾配の細胞を含み、かつ孔は、たとえば図１５に表されるように、勾配にそって配列されるかまたは勾配と実質的に平行（すなわち０°±４５°）である。

１つの実施形態では、コラーゲンマトリックスは、約０．３ｍｍ〜約２ｍｍ、約０．５ｍｍ〜約１．５ｍｍ、約０．８ｍｍ〜約１．２ｍｍ、または約１ｍｍから選択される直径を有する複数の孔を含む。

１つの実施形態では、コラーゲンマトリックスは複数の孔を含み、表面積の約３％〜約９０％（たとえば、約３％〜約５０％、または約５％〜約５０％、または約３％〜約３０％、または約５％〜約５０％）が穿孔されている。たとえば、３６孔／ｃｍ^２の孔密度で１ｍｍの直径を備えた円筒状の孔を含むコラーゲンマトリックスは、コラーゲンマトリックスの総表面積の１ｃｍ^２あたり約２８ｍｍ^２の孔面積［（０．５ｍｍの孔半径）×（π）×（３６孔／ｃｍ^２）］、すなわち２８％の孔表面積を含む。

１つの実施形態では、孔の寸法は、コラーゲンマトリックスの厚さまたは孔の長さの約５０％〜約１５０％である。

孔は、たとえば、ドリルまたは組織パンチを使用したコラーゲンマトリックスの機械的除去など、任意の方法で作製できる。

断片化ＥＣＭ
１つの実施形態では、本発明の軟骨製品は、断片化ＥＣＭタンパク質を含む（たとえば、本軟骨製品は部分的に消化したコラーゲンマトリックスを含む）。

１つの実施形態では、断片化ＥＣＭタンパク質は、コラーゲン（たとえばＩＩ型）断片またはプロテオグリカン断片である。任意に、コラーゲンマトリックスは関節軟骨である。

断片化ＥＣＭタンパク質は任意の方法で産生できる。断片化ＥＣＭタンパク質は、天然のコラーゲンマトリックス（すなわち対象から単離したコラーゲンマトリックス）の部分的消化により任意に産生される。任意に、コラーゲンマトリックスは、たとえば、コラーゲン分解酵素（たとえばコラゲナーゼ）またはプロテオグリカン分解酵素（たとえばヒアルロニダーゼ（ｈｙａｌｕｒａｎｉｄａｓｅ））などの消化酵素（たとえばプロテイナーゼ）で部分的に消化される。

本発明によると、コラーゲンマトリックスの部分的な消化は、以下の
細胞因子および生存可能な細胞を放出しかつ遊走を可能にするゆるい構造のＥＣＭ、
生存可能な細胞を保持する天然のＥＣＭ、
細胞およびＥＣＭの間の生理学的相互作用の保存、
残屑のない清浄な軟骨製品、
天然の軟骨の充填密度を実質的に保持するＥＣＭ線維を含む軟骨製品、
より良好な柔軟性を有する軟骨製品、
マクロファージの除去および免疫原性の低減、
といった技術的特性のうちの１つ以上を提供する。

断片化ＥＣＭは、細胞因子および生存可能な細胞を放出しかつそれらの遊走を可能にするゆるいコラーゲンマトリックスを提供する。たとえば、細胞（たとえば軟骨形成）因子が、対象への投与時に周辺の微小環境中に浸出（ｌｅａｃｈ ｏｕｔ）できる。本明細書に提供される技術を用いて、当業者は消化を調節（ｔａｉｌｏｒ）してこのような技術的特性を提供できる。

１つの実施形態では、ＥＣＭの断片化は、生存可能な天然の細胞の実質量を保持する量に限定される。さらなる断片化では、コラーゲンマトリックスは、本軟骨製品を任意に投与する前にその細胞の集合を未熟な状態で放出できる。本明細書に提供される技術を使用して、当業者は消化を調節してこのような技術的な特性を提供できる。

１つの実施形態では、ＥＣＭは、細胞およびＥＣＭの間の正常な相互作用を保存する形式で断片化される。たとえば、その形式においてＥＣＭおよび／または細胞因子は軟骨細胞を活性化し、すなわち、Ｇ０期からＧ１期への移行を誘導し、かつＭＳＣの軟骨細胞への浸潤および分化も誘導する。理論に束縛されるものではないが、本発明者らは、これらの機能が治療上の効果を高めると考えている。

１つの実施形態では、ＥＣＭは、生理活性因子およびＥＣＭの間の正常な相互作用を保存する方法で断片化される。たとえば、生理活性因子は、消化前のレベルと比較して約５０％超または約７０％超のレベルが保持される。

１つの実施形態では、ＥＣＭは、軟骨製品から残屑を除く形式で断片化される。微視的なおよび／または巨視的な残屑（たとえばＥＣＭフラグメント）は、軟骨製品の穿孔時により多く存在し、もし本技術の軟骨製品から残屑が取り除かれていなければ、対象に投与した際に疼痛および他の副作用の引き金となる可能性がある。

１つの実施形態では、ＥＣＭの断片化は、天然の軟骨の充填密度を実質的に保持する断片化ＥＣＭ線維を提供する量に限定される。このような技術的特性は、天然の軟骨の機構的特性を有する軟骨製品を提供する。

１つの実施形態では、ＥＣＭの断片化は、以下の、
視覚的に無傷であり、
柔軟性があり（たとえば、破損することなく折り畳みもしくは湾曲可能であり、関節鏡に適合するよう巻くことができるように）、
生存可能な天然の細胞を保持し、
非分解の生物学的因子（たとえば増殖因子）を保持し、かつ
生物学的因子（たとえば増殖因子）のレベルを増大する、
といった技術的特性のいずれか（たとえば各特性）を有するコラーゲンマトリックスを提供する量に限定される。

１つの実施形態では、本軟骨製品は、断片化ＥＣＭを有さない同じコラーゲンマトリックスと比較して、断片化ＥＣＭを有することにより、より柔軟性を示す。任意に、本軟骨製品は、本軟骨製品の直径（または幅）の５０％以下の直径を有するカニューレに挿入できるような柔軟性を有する。たとえば、２ｃｍの直径を有するディスク形状の軟骨製品は、関節鏡のカニューレ（たとえば約１ｃｍ未満の直径を有するカニューレ）内に巻き込まれ得るような柔軟性を有する。

生存可能な細胞
１つの実施形態では、本発明の軟骨製品は生存可能な軟骨細胞を含む。任意に、本軟骨製品は、天然の軟骨製品（すなわちコラーゲンマトリックスが対象から単離される）であり、かつ生存可能な軟骨細胞は天然であり、すなわちコラーゲンマトリックスに本来存在する。生存率は、たとえば生体染色、位相差顕微鏡などの使用を介する任意の方法により示される。

１つの実施形態では、コラーゲンマトリックスは関節軟骨由来であり、関節軟骨に対し天然の（または内在性の）生存可能な軟骨細胞を含む。天然の軟骨細胞は、放射層、遷移層、および表層から選択される１つ以上（たとえば全て）の関節軟骨の層にわたり分布している。あるいは、本発明は、外来のまたは天然ではない（すなわち追加された）軟骨細胞を有するコラーゲンマトリックスを考慮している。１つの実施形態では、コラーゲンマトリックスは、その表面に生存可能な軟骨細胞を含む。任意に、コラーゲンマトリックスの表面の軟骨細胞の少なくとも７０％が生存可能である。いくつかの実施形態では、本軟骨製品は、少なくとも約５０％の生存可能な細胞、あるいは少なくとも６０％の生存可能な細胞を含む。いくつかの実施形態では、本軟骨製品は、少なくとも約７０％の生存可能な細胞、あるいは約７５％の生存可能な細胞、あるいは約８０％の生存可能な細胞を含む。

表面の生存可能な細胞のパーセンテージは、たとえば顕微鏡技術を使用して定量化できる。

１つの実施形態では、軟骨細胞の一部はＧ_０期にある。理論に縛られるものではないが、本発明者らは、ＥＣＭまたはＥＣＭ因子が軟骨細胞を活性化すると考えている。この活性化は、Ｇ_０期からＧ_１期への移行として観察できる。

１つの実施形態では、コラーゲンマトリックスは、少なくとも、およそ５００細胞／ｍｍ^２、６００細胞／ｍｍ^２、７００細胞／ｍｍ^２、８００細胞／ｍｍ^２、１２００細胞／ｍｍ^２、または１５００細胞／ｍｍ^２のうちいずれかの量の生存可能な軟骨細胞を含む（たとえば、面積はコラーゲン試料の上面または下面から計算される）。１つの実施形態では、コラーゲンマトリックスは表層を含み、表層は少なくともおよそ１００細胞／ｍｍ^２または２００細胞／ｍｍ^２のいずれかの量の生存可能な軟骨細胞を含み、任意に、コラーゲンマトリックスは部分的に消化される（たとえばコラゲナーゼにより消化される）。１つの実施形態では、コラーゲンマトリックスは遷移層を含み、遷移層は少なくともおよそ１００細胞／ｍｍ^２、２００細胞／ｍｍ^２、または４００細胞／ｍｍ^２のうちいずれかの量の生存可能な軟骨細胞を含み、任意に、コラーゲンマトリックスは部分的に消化される（たとえばコラゲナーゼにより消化される）。１つの実施形態では、コラーゲンマトリックスは、放射（層）を含み、放射層は少なくともおよそ１００細胞／ｍｍ^２または２００細胞／ｍｍ^２のうちいずれかの量の生存可能な軟骨細胞を含み、任意に、コラーゲンマトリックスは部分的に消化される（たとえばコラゲナーゼにより消化される）。生存可能な軟骨細胞は、本明細書に教示される方法、またはたとえばＢｏｓら（ＡＲＴＨＲＩＴＩＳ ＆ ＲＨＥＵＭＡＴＩＳＭ； Ｖｏｌ． ４６， Ｎｏ． ４， Ａｐｒｉｌ ２００２， ｐｐ ９７６−９８５）により詳述されるような、当業者に知られている他の方法を使用して定量化される。

軟骨細胞は、軟骨形成および軟骨の修復を促進する因子を発現することに加え軟骨マトリックスのホメオスタシスの維持において重要であると考えられている。理論に縛られるものではないが、本発明者らは、天然の関節軟骨の細胞学的かつ構造学的な組織の保存により優れた治療的製品が得られると考えられる。

理論に縛られるものではないが、本発明者らは、本発明の軟骨製品のコラーゲンマトリックスは軟骨細胞の生存率を保存し、それらのｅｘ−ｖｉｖｏ（レシピエント対象を含む）での寿命を延ばすと考えている。さらに、レシピエント対象に投与した際、コラーゲンマトリックスはレシピエントのＭＳＣを誘導して（軟骨製品の）コラーゲンマトリックスに浸潤させて軟骨細胞へと分化させることができ、これにより本軟骨製品に軟骨細胞を補充していると考えられる。

実施例１０に記載されるように、本発明の軟骨製品は、部分的な消化および凍結保存の後でさえも、生存可能な軟骨細胞の実質量を含むことができる。生存可能な軟骨細胞の実質量は、存在した場合、軟骨製品の治療上の作用を高める量である。

生理活性因子
１つの実施形態では、本発明の軟骨製品は生理活性因子を含む。任意に、生理活性因子は軟骨形成因子を含む。任意に、軟骨形成因子はＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−７、ｂＦＧＦ、およびＩＧＦ−１のうちの１つ以上（たとえば各因子）を含む。

任意に、軟骨はＩＩ型コラーゲン、ヒアルロナン、およびアグリカンを含む細胞外マトリックスを含む。

任意に、軟骨は、たとえばＳｏｘ５、Ｓｏｘ６、およびＳｏｘ９などの転写因子を含む。

１つの実施形態では、軟骨はＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−７、ｂＦＧＦ、ＩＧＦ−１、ＩＩ型コラーゲン、ヒアルロナン、アグリカン、Ｓｏｘ５、Ｓｏｘ６、およびＳｏｘ９を含む。

１つの実施形態では、コラーゲンマトリックスは天然のコラーゲンマトリックスであり、かつ生理活性因子はコラーゲンマトリックスに本来存在する因子である。

実施例１６に記載されるように、本発明の軟骨製品は、部分的消化および凍結保存後であっても生理活性因子（たとえば軟骨形成因子）を含むことができる。さらに、または代替的に、本発明の軟骨製品は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで培養される際に生物学的因子を放出できる。
軟骨製品中の所定の因子の量は、たとえば実施例１６に記載されるように、組織可溶化液アッセイにより決定できる。軟骨から放出される因子の量は、たとえば実施例１６に記載されるように、培養アッセイにより決定できる。たとえば、実施例１６および表４に表されるように、本発明の軟骨製品は、以下の、
ａ．少なくとも約１１ｐｇ／ｃｍ^２の、たとえば約１１〜約６２８ｐｇ／ｃｍ^２の量のＴＧＦ−β１を含む、
ｂ．少なくとも約４ｐｇ／ｃｍ^２の、たとえば約４〜約１１２ｐｇ／ｃｍ^２の量のＴＧＦ−β３を含む、
ｃ．少なくとも約３ｐｇ／ｃｍ^２の、たとえば約３〜約２３ｐｇ／ｃｍ^２の量のＢＭＰ−７を含む、
ｄ．少なくとも約１６９ｐｇ／ｃｍ^２の、たとえば約１６９〜約３６５ｐｇ／ｃｍ^２の量のｂＦＧＦを含む、
ｅ．少なくとも約１１１ｐｇ／ｃｍ^２の、たとえば約１１１〜７７９ｐｇ／ｃｍ^２の量のＩＧＦ−１を含む、
ｆ．培養される際に、本軟骨製品は少なくとも約２６１７ｐｇ／ｃｍ^２の、たとえば約２６１７〜約１７８１８ｐｇ／ｃｍ^２の量のＴＧＦ−β１を放出する、
ｇ．培養される際に、本軟骨製品は少なくとも約１３３ｐｇ／ｃｍ^２の、たとえば約１３３〜約６２３ｐｇ／ｃｍ^２の量のＴＧＦ−β２を放出する、
ｈ．培養される際に、本軟骨製品は少なくとも約１４ｐｇ／ｃｍ^２の、たとえば約１４〜約２８４２ｐｇ／ｃｍ^２の量のＩＧＦ−１を放出する、
といった技術的特性のうちの１つ以上（たとえば各特性）を有することができる。

理論に縛られるものではないが、本発明者らは、増殖因子、軟骨形成因子、および細胞外のマトリックス産生を媒介しかつｉｎ ｖｉｖｏで軟骨形成を促進する他の生理活性因子が、軟骨製品により促進されるため、有効な軟骨修復にとって重要であると考えている。たとえば、ＴＧＦ‐β １〜３は軟骨形成の分化を促進し、かつコラーゲン発現を調節しており；ＢＭＰ‐２およびＢＭＰ‐７はＭＳＣの軟骨形成を誘導し、かつ軟骨細胞によるＥＣＭ産生を刺激し；ｂＦＧＦは軟骨細胞の増殖を刺激し；ＩＧＦ‐１はＥＣＭ合成を誘導し；ならびにＥＣＭ（コラーゲン、ヒアルロナン、およびアグリカン）は軟骨形成の機構的調節を媒介する。

製剤
本発明によると、本軟骨製品は凍結保存媒体と共に任意に製剤化される。

１つの実施形態では、凍結保存媒体は１つ以上の細胞透過型凍結保存剤、１つ以上の非細胞透過型凍結保存剤、またはこれらの組み合わせを含む。

任意に、凍結保存媒体は、限定するものではないが、たとえば、ＤＭＳＯ、グリセロール、グリコール、プロピレングリコール、エチレングリコール、またはそれらの組み合わせから選択される１つ以上の細胞透過型凍結保存剤を含む。

任意に、凍結保存媒体は、限定するものではないが、たとえば、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシエチルデンプン、多糖類（ｐｏｌｙｓａｃｈａｒｉｄｅ）、単糖類、糖アルコール、アルギン酸塩、トレハロース、ラフィノース、デキストラン、またはそれらの組み合わせから選択される１つ以上の非細胞透過型凍結保存剤を含む。

他の有益な凍結乾剤の例は、“Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ”（ＢｉｏＦｉｌｅｓ Ｖｏｌｕｍｅ ５ Ｎｕｍｂｅｒ ４‐Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標） ｄａｔａｓｈｅｅｔ）に記載される。

１つの実施形態では、凍結保存媒体は細胞透過型凍結保存剤を含み、その細胞透過型凍結保存剤の大部分はＤＭＳＯである。任意に、凍結保存媒体はグリセロールの実質量を含まない。

１つの実施形態では、凍結保存媒体は、たとえば約１〜約５０容量％のＤＭＳＯ（たとえば約１０容量％）でＤＭＳＯを含む。

１つの実施形態では、凍結保存媒体は、アルブミン（たとえばＨＳＡもしくはＢＳＡ）、電解質溶液（たとえばＰｌａｓｍａ−Ｌｙｔｅ、ＰＢＳ、もしくは生理食塩水）、またはそれらの組み合わせなどの追加的成分を含む。

１つの実施形態では、凍結保存媒体は、１〜約２０重量％のアルブミン（たとえばＨＳＡ）、およびＤＭＳＯなどの約１〜約５０容量％（たとえば約１０容量％）の凍結保存剤を含む。

非免疫原性
１つの実施形態では、本軟骨製品は実質的に非免疫原性である。

本発明の軟骨製品は、免疫原性を低減する１つ以上の技術的特性を有する。このような技術的特性の例は、限定するものではないが、
非隔絶細胞の不在、
免疫特権をもつ（ｉｍｍｕｎｏｐｒｉｖｉｌｅｇｅｄ）ＭＳＣ細胞の存在ならびに低レベルの循環免疫原性細胞およびＴＮＦ−α、
凍結保存による選択的殺傷、
を含む。

本明細書に教示されるように、本発明の特定の実施形態は、コラーゲンマトリックスに本来存在する軟骨細胞などの生存可能な細胞を有するコラーゲンマトリックスを含む。また本発明は、マトリックスに添加される軟骨細胞などの非天然の細胞を有する軟骨製品も考慮する。外来性（および内在性）軟骨細胞が免疫原性の潜在的な源であるのに対して、本発明の軟骨製品は驚くべきことに低い免疫原性または免疫原性が全くないことを示した。理論に縛られるものではないが、本発明者らは、コラーゲンマトリックスに埋め込まれている軟骨細胞（特に天然の軟骨細胞）は、本軟骨製品が投与される対象において周辺環境からより有効に隔絶され、このことにより免疫原性を低減していると考えている。

１つの実施形態では、本軟骨製品は、循環免疫原性細胞およびＴＮＦ−αがほとんどないレベルである。任意に、このような軟骨製品はリポ多糖（ＬＰＳ）に対する反応性を実質的に欠いている。このような軟骨製品は、たとえば、洗浄／すすぎ、消化、凍結保存、またはそれらのいずれかの組み合わせの製造ステップを実施することにより提供できる。

製造
軟骨製品は任意の方法で生産できる。１つの実施形態では、本発明は、軟骨試料を提供することと、この軟骨試料を穿孔することと、この軟骨試料を部分的に消化することとを含む、軟骨製品の作製方法を提供する。

１つの実施形態では、本方法は、軟骨試料から軟骨下骨および／または石灰化軟骨を除去することを含む。

１つの実施形態では、本方法は、穿孔および部分的な消化の前記ステップの後に軟骨試料を凍結保存することを含む。任意に、凍結保存ステップは、生存可能な細胞を残す形式で凍結保存することを含む。

１つの実施形態では、部分的消化のステップは、生存可能な細胞の実質量を保持する形式で実施される。

１つの実施形態では、軟骨試料は、軟骨試料の柔軟性を増大させる程度まで穿孔される。

１つの実施形態では、軟骨試料の処理は、実質量の熱を発生させない形式で実施される。任意に、軟骨組織を切断することは、低速度でののこぎりもしくはドリルおよび／または組織パンチの使用を含む。

１つの実施形態では、本工程は、軟骨試料を（たとえば連続的にまたは定期的に）冷却することを含む。

軟骨試料
軟骨試料は任意の供給源より入手可能であり、任意の形状、厚さ、および表面積で提供できる。任意に、供給源はヒト対象などの対象である。任意に、供給源は屍体である。

１つの実施形態では、軟骨試料は、ＩＩ型コラーゲンを含む任意の軟骨試料である。任意に、軟骨試料は硝子軟骨、線維軟骨、および弾性軟骨から選択される。

１つの実施形態では、軟骨試料は硝子軟骨を含む。任意に、軟骨試料は、関節軟骨試料である（たとえばドナーの骨から得られる）。任意に、軟骨試料は、軟骨下骨および／または石灰化軟骨から単離（すなわち分離）される。軟骨は、骨軟骨プラグ（たとえば組織パンチを使用する）の形態で軟骨試料を取り出した後軟骨下骨から単離することができ、または軟骨は、ドナーの骨上に存在する状態で軟骨下骨から直接分離できる（たとえばドナーの骨から軟骨を薄く切り出すことにより）。他の有用な硝子軟骨は鼻軟骨、気管軟骨、および喉頭軟骨を含む。

１つの実施形態では、軟骨試料は関節軟骨である。関節軟骨は任意のドナーの骨から得ることができる。任意に、軟骨試料は大腿骨、脛骨、腓骨、上腕骨、尺骨、橈骨などの長骨、または手もしくは足（距骨）の骨などの短骨、骨盤骨（たとえば寛骨臼）などの扁平骨、椎骨などの不規則骨、および種子骨から得ることができる。関節軟骨は任意の骨の顆状突起（ｃｏｎｄｏｙｌｅ）から得ることができる。任意に、軟骨試料はプラグ（たとえば１ｃｍまたは２ｃｍのプラグ）として得られる。任意に、軟骨試料は、軟骨下骨および／または石灰化軟骨が除去されている。

１つの実施形態では、軟骨試料は線維軟骨を含む。任意に、軟骨試料は、恥骨結合、線維輪、椎間板、半月板、および顎関節から選択される供給源より得られる。

１つの実施形態では、軟骨試料は弾性軟骨を含む。任意に、軟骨試料は、耳、喉頭、喉頭蓋から選択される供給源より得られる。

１つの実施形態では、軟骨試料は、哺乳類、有蹄動物、偶蹄目の生物、ブタ、霊長類、より高位の霊長類、またはヒトから得られる。

１つの実施形態では、軟骨試料は、厚さがスクリーニングされる。任意に、厚さは０．２ｍｍ〜約２．０ｍｍであり、たとえば、約１ｍｍ〜約１．５ｍｍである。たとえば、最小の厚さよりも薄い軟骨試料は廃棄され、最大の厚さよりも厚い軟骨試料は寸法を小さくするよう整えられる。驚くべきことに、軟骨試料の厚さを低減し、および軟骨試料を穿孔することにより、生存可能な細胞および生理活性因子のマトリックスを提供する能力を保持しつつ損傷した組織部位に容易に沿う、柔軟な軟骨製品が得られる。

１つの実施形態では、コラーゲン試料は、約０．５ｃｍ^２〜約５ｃｍ^２の面積を有するある表面（たとえば上（「上位の」）面または下（「下位の」）面）を有する。任意に、コラーゲン試料は、約３ｍｍ未満（たとえば１ｍｍ〜約１．５ｍｍ）の厚さで隔てられる上面および下面を有する。

１つの実施形態では、コラーゲン試料は、丸い形状（たとえば楕円または円形）、長方形の形状、または正方形の形状で提供される。

１つの実施形態では、コラーゲン試料を取得することは、たとえば冷却溶媒、冷却室、冷却プレートを使用して試料を冷却することを含む。１つの実施形態では、試料を得ることは、実質的な熱量を発生させることなく、たとえば低速ののこぎりを使用して単離することを含む。いくつかの実施形態では、冷却は氷冷槽の使用を含む。

穿孔
本発明の軟骨製品を生産する方法は、軟骨試料を穿孔するステップを含む。穿孔は、軟骨の柔軟性を増大させるいずれかの方法で行うことができ、かつそれを通じて細胞および因子が遊走できる複数の経路を提供する。

１つの実施形態では、軟骨は、レーザー穿孔（ｌａｓｅｒ ｐｏｒａｔｉｏｎ）または機械的穿孔（ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ｐｒｏｒａｔｉｏｎ）を使用して穿孔される。

１つの実施形態では、軟骨は機械的穿孔を使用して穿孔される。任意に、機械的穿孔はドリル（ｄｒｉｌｌｉｎｇ）、押抜き（ｐｕｎｃｈｉｎｇ）、水力穿孔（たとえば高圧流体削孔）、またはそれらの組み合わせにより提供される。任意に、軟骨は、単一押抜き装置または複数押抜き装置を使用して穿孔される。

１つの実施形態では、軟骨試料は、軟骨試料の柔軟性を増大させる程度まで穿孔される。任意に、軟骨試料は、約０．２５ｍｍ〜約２ｍｍ（たとえば約０．２５ｍｍ〜約１．５ｍｍ、または約０．５ｍｍ〜約１．５ｍｍ）の直径を有する孔を提供するよう穿孔される。任意に、軟骨試料は、約１０〜約４００孔／ｃｍ^２、たとえば約１０〜約１００孔／ｃｍ^２、または約２０〜約６０孔／ｃｍ^２（たとえば約３６孔／ｃｍ^２）を提供するよう穿孔される。任意に、軟骨試料は軟骨の層を含み、および孔は軟骨の層の大部分（たとえば全体）を通過している。

１つの実施形態では、軟骨試料は、軟骨試料の表面積の１ｃｍ^２あたり約１０ｍｍ^２〜約５０ｍｍ^２の穿孔表面積の程度まで穿孔される。たとえば、３６孔／ｃｍ^２の孔密度で１ｍｍの直径の円筒状の孔を備えるコラーゲンマトリックスは、１ｃｍ^２あたり約２８ｍｍ^２の穿孔表面積［（０．５ｍｍ孔半径）×（π）×（３６孔／ｃｍ^２）］を含む。

１つの実施形態では、軟骨試料の穿孔は、たとえば冷却溶媒および／または冷却室または冷却プレートを使用して試料を冷却する（たとえば連続的にまたは定期的に）ことを含む。１つの実施形態では、軟骨試料の穿孔は、たとえば低速ののこぎりまたは組織パンチを使用して、実質量の熱を発生させることなく軟骨試料を穿孔することを含む。

消化
本発明の軟骨製品は、たとえばプロテイナーゼまたはプロテオグリカン消化酵素などの消化酵素を使用して、軟骨試料を部分的に消化することにより産生できる。

本発明の製造方法によると、部分的な消化のステップは軟骨試料のＥＣＭを修飾し、かつ、以下の
細胞因子および生存可能な細胞を放出し、かつそれらの遊走を可能にするゆるいＥＣＭ、
生存可能な天然の細胞を保持する天然のＥＣＭ、
細胞とＥＣＭとの間の生理的相互作用の保存、
残屑のない清浄な軟骨製品、
天然の軟骨の充填密度を実質的に保持するＥＣＭ線維を含む軟骨製品、
より大きな柔軟性を備えた軟骨製品、
マクロファージの除去および免疫原性の低減、
といった技術的特性のうちの１つ以上を提供する方法で実施できる。

１つの実施形態では、部分的消化のステップは、ＥＣＭをゆるめる、たとえばコラーゲン内のペプチド結合を切断する方法で実施される。ゆるいＥＣＭは細胞因子および生存可能な細胞を放出し、かつそれらの遊走を可能にする。たとえば、生物（たとえば軟骨形成）因子は、対象への投与時に周辺の微小環境へと浸出（ｌｅａｃｈ ｏｕｔ）できる。本明細書に提供される技術を用いて、当業者は消化を調節してこのような技術特性を提供できる。

１つの実施形態では、部分的消化のステップは、たとえば、細胞温存量（ｃｅｌｌ−ｓｐａｒｉｎｇ ａｍｏｕｎｔ）まで消化を限定することにより、生存可能な天然の細胞の実質量を保持する方法で実施される。本明細書に提供される技術を用いて、当業者は消化を調節してこのような技術的特性を提供できる。

１つの実施形態では、部分的消化のステップは、細胞とＥＣＭとの間の通常の相互作用を保存する方法で実施される。たとえば、その方法においてＥＣＭおよび／または細胞因子は軟骨細胞を活性化し、すなわちＧ０期からＧ１期への移行を誘導し、かつまたＭＳＣを誘導して浸潤させて軟骨細胞へと分化させる。理論に縛られるものではないが、本発明者らは、これらの機能が治療上の作用を高めると考えている。

１つの実施形態では、部分的消化のステップは、軟骨試料から残屑を除く方法で実施される。微視的かつ／または巨視的な残屑（たとえばＥＣＭフラグメント）は、軟骨試料の穿孔時においてさらに多量に存在しており、かつ本技術の軟骨製品から残屑が除かれていない場合、対象に投与された際に疼痛および他の有害な応答の引き金となる可能性がある。

１つの実施形態では、部分的消化のステップは、天然の軟骨の充填密度を実質的に保持する断片化されたＥＣＭ線維を提供する方法で実施される。たとえば、部分的消化は、軟骨試料の構造的強度を破壊することのない量まで限定できる。このような技術特性は天然の軟骨の機構的特性を有する軟骨製品を提供して、たとえば、長期間持続する重量負荷型軟骨移植片を提供する。

１つの実施形態では、部分的消化のステップは、軟骨製品に対して柔軟性を付する方法で実施される。

１つの実施形態では、軟骨試料は、コラーゲン消化酵素（たとえばコラゲナーゼもしくはカテプシン）、またはプロテオグリカン消化酵素（たとえばヒアルロニダーゼ、アグリカナーゼ、もしくはパパイン）を使用して消化される。任意に、軟骨試料は、細胞マトリックス相互作用を保持する方法で消化される。たとえば、トリプシン消化は、マグネシウムおよびカルシウムを隔離するため概してＥＤＴＡなどのキレート剤と共に実施され、さもなければトリプシン作用は阻害される。このようなキレート剤はマトリックスから細胞を解離できる。実際に、トリプシン自体は細胞が接着または付着しているマトリックスタンパク質を切断できる。したがって、本発明の１つの実施形態は、軟骨細胞などの天然の細胞を保持する方法で軟骨試料を部分的に消化できる非解離性の消化の使用を考慮する。

１つの実施形態では、部分的な消化のステップは、軟骨試料（たとえば関節軟骨）中のコラーゲンＩＩを消化することを含む。ＩＩ型コラーゲンマトリックスの部分的消化に有用な消化酵素としては、コラゲナーゼ（たとえばＩＩ型、コラゲナーゼＩ〜ＩＶのいずれか、および細菌コラゲナーゼ）、他のエンドペプチダーゼ（たとえばトリプシン、パパイン、ペプシン）、ならびにエキソペプチダーゼ（たとえばカルボキシペプチダーゼ）が挙げられる。

１つの実施形態では、部分的な消化は非酵素的消化、たとえば、蒸気系、酸系、または開窓系の消化を含む。任意に、非酵素的消化は機械的消化であり、たとえば部分的細分化または開窓系消化である。

いくつかの実施形態では、本発明の軟骨製品は消化されない。他の実施形態では、本発明の軟骨製品は、酵素的（たとえばコラゲナーゼ、プロナーゼ、プロテイナーゼＫなどの処置）、生化学的（たとえばパパイン）、熱的（たとえば熱の増大）、化学的（ケラチン硫酸塩、およびトシルリジンクロロメチルケトン（ｔｏｓｙｌｌｙｓｙｌｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｅ））、機械的（たとえば穴あけ）消化手段、当業者に知られている他の消化手段、および上記のいずれかのうち２つ以上の組み合わせを含む消化手段により部分的に消化される。

凍結保存
本発明の軟骨製品は新鮮な状態で使用してもよく、または一定期間保存されてもよい。任意に、本軟骨製品は凍結−融解周期にかけられる。すなわち、凍結した後融解される。

１つの実施形態では、軟骨製品は凍結保存される。軟骨製品は、凍結保存媒体中で、凍結温度（たとえば−８０℃±５℃）でインキュベーションすることにより凍結保存されてもよい。

１つの実施形態では、凍結保存は制御された凍結方法を含み、すなわち軟骨製品が室温および−８０℃の間の１つ以上の中間温度で保存される。凍結保存は、たとえば、軟骨製品を４℃で３０分〜２４時間（たとえば約３０〜約９０分）インキュベートすること、その後軟骨製品を約−２０℃〜約−４０℃（たとえば約−３０℃）で約２０分〜約１２時間（たとえば約２０〜約６０分）インキュベートすること、およびその後たとえば、約４℃／分〜約−８０℃／分の速度で温度を低下させることにより使用まで−８０℃でインキュベートすることを含むことができる。あるいは、軟骨製品は−８０℃で迅速に凍結でき、または液体窒素で急激に凍結できる。

軟骨製品は、その後使用のため融解されてもよい。任意に、軟骨製品は、細胞の生存率が凍結−融解の周期後も驚くほど良好に保持されるような方法で凍結保存される。

１つの実施形態では、凍結保存は、１つ以上の細胞透過型凍結保存剤、１つ以上の細胞非細胞透過型凍結保存剤、またはそれらの組み合わせを含む凍結保存媒体中での保存を含む。任意に、凍結保存媒体はＤＭＳＯ、グリセロール、グリコール、プロピレングリコール、エチレングリコール、またはそれらの組み合わせから選択される１つ以上の細胞透過型凍結保存剤を含む。任意に、凍結保存媒体はポリビニルピロリドン、ヒドロキシエチルでんぷん、多糖類、単糖類、糖アルコール、アルギン酸塩、トレハロース、ラフィノース、デキストラン、またはそれらの組み合わせから選択される１つ以上の非細胞透過型凍結保存剤を含む。他の有用な凍結保存剤の例は、“Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ”（ＢｉｏＦｉｌｅｓ Ｖｏｌｕｍｅ ５ Ｎｕｍｂｅｒ ４‐Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）ｄａｔａｓｈｅｅｔ）に記載されている。

１つの実施形態では、凍結保存媒体は細胞透過型凍結保存剤を含み、その細胞透過型凍結保存剤の大部分がＤＭＳＯである。

１つの実施形態では、凍結保存媒体は、たとえば約１容量％〜約５０容量％（たとえば約１０容量％）のＤＭＳＯを含む。

１つの実施形態では、凍結保存媒体は、アルブミン（たとえばＨＳＡもしくはＢＳＡ）、電解質溶液（たとえばＰｌａｓｍａ−Ｌｙｔｅ）、またはそれらの組み合わせなどの追加的成分を含む。

１つの実施形態では、凍結保存媒体は、１重量％〜約２０重量％のアルブミンおよび約１容量％〜約５０容量％（たとえば約１０容量％）の凍結保存剤を含む。任意に、凍結保存剤はＤＭＳＯ（たとえば大部分の量で）を含む。

消毒処置
本発明の軟骨製品は、バイオバーデンを低減するために１つ以上の消毒溶液を用いて任意に処置される。任意に、軟骨製品は抗菌剤で処置される（たとえばその中でインキュベートされる）。任意に、軟骨製品は、ポビドンヨードで処置される（たとえば拭われる）。

いくつかの実施形態では、軟骨製品は抗菌剤で処置され、この抗菌剤は硫酸ゲンタマイシン（Ａｂｒａｘｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、イリノイ州シャンバーグ）、バンコマイシンＨＣｌ（ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ ＨＣｌ）（ホスピーラインコーポレイティッド、イリノイ州レイクフォレスト）、および／またはアンホテリシンＢ（シグマアルドリッチ、ミズーリ州セントルイス）である。

任意に、軟骨製品は殺真菌溶液で処置される。

細胞、生存率、および軟骨形成因子のスクリーニング
１つの実施形態では、軟骨製品は軟骨細胞、細胞生存率、ならびに生理活性因子および他のＥＣＭ成分（たとえば軟骨形成因子）などの１つ以上の構造的または機能的成分についてスクリーニングされる。

本発明者らの知見を介して、特定の成分が治療上の作用と相関することが発見された。

１つの実施形態では、スクリーニングされる成分は、表４に列挙される生理活性因子の１つ以上、生存可能な軟骨細胞の存在、またはそれらの組み合わせを含む。

雑記
１つの実施形態では、本発明の軟骨製品を製造する方法は、１つ以上の溶液で軟骨製品を処置することを含む。任意に、この１つ以上の溶液のｐＨは５〜１０の範囲である。任意に、処置溶液は生理食塩水、ＰＢＳ、Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ、および水のうちの１つ以上を含む。

使用方法
１つの実施形態では、本発明の軟骨製品を使用して、対象中の損傷組織を処置する。損傷組織は任意の損傷組織であってよい。処置方法は、たとえば、その必要のある対象に本発明の軟骨製品を投与することにより提供されてもよい。

１つの実施形態では、損傷組織は軟骨である。任意に、損傷組織は関節軟骨である。任意に、方法は、損傷した軟骨を除去することと、損傷組織を除去した部位に本軟骨製品を投与することとを含む。任意に、除去するステップは損傷組織を含むプラグを除去することを含み、軟骨製品は、プラグを除去することにより残された空壁に適合するよう切断または成形（またはその両方）される（たとえば、２ｃｍの直径のプラグを除去し、前記プラグの形状である２ｃｍの直径の軟骨製品に置き換える）。

１つの実施形態では、損傷組織は関節軟骨であり、方法は損傷組織部位を微細破壊することをさらに含み、たとえば損傷した関節軟骨を除去し次に根底の軟骨下骨を物理的に傷つけて骨髄に曝し出血を起こさせる。任意に、軟骨製品は微細破壊後に軟骨下骨上に配置される。

微細破壊（ｍｉｃｒｏｆｒａｃｔｕｒｉｎｇ）は、血餅を形成して、それにより炎症性サイトカイン、増殖因子およびＭＳＣを誘導することにより治癒を刺激できる技術である。微細破壊単独ではＩ型コラーゲンを含む線維軟骨の形成をもたらし、生物学的機構特性が不十分であり、かつ変形性関節症をもたらす異常な骨増殖がみられる。驚くべきことに、本発明者らの知見から、本軟骨製品が、ＩＩ型コラーゲンマトリックスを生存可能な軟骨細胞と共に提供して微細破壊により誘導されるＭＳＣの軟骨形成を促進することにより、これらの欠点を克服することが発見された。

１つの実施形態では、本発明の軟骨製品は関節鏡で投与される。驚くべきことに、本発明の柔軟な軟骨製品は、関節鏡で容易に投与でき（すなわち、関節鏡カニューレを介して投与できるよう柔軟である）、たとえば軟骨の表面に沿うなど、投与部位に沿うよう適合する。

１つの実施形態では、軟骨製品は投与部位で固定される。任意に、軟骨製品は接着剤（たとえばフィブリン糊）または機械的装置（たとえば生体で吸収可能なピンなどのピン）により固定される。

驚くべきことに、本発明者らの知見を介して、本発明の軟骨製品は、より良好な治癒を提供し、かつより大きな寸法の損傷を処置するために使用できる。

驚くべきことに、本発明者らの知見を介して、軟骨製品は、標的部位で軟骨内に効率良く統合される天然の機構的かつ機能的特性を有するコラーゲンマトリックスを提供する。理論に縛られるものではないが、本明細書に教示される軟骨製品の優れた治癒能力は、部分的に、ドナーのマトリックス（軟骨製品）、ドナー細胞、レシピエント（処置対象）細胞、およびレシピエントのマトリックス間での複合的相互作用によるものであることが考えられる。これは、概して対症療法にすぎない自己軟骨細胞の移植などの従来の療法よりも圧倒的に優れている。

実施例
実施例１．大腿骨顆および脛骨プラトーの単離
図１に表されるようなヒトの膝関節を入手した。

ヨウ素を関節と接触させることなく、ヨウ素（１０％ ポビドンヨード（ｐｏｖｉｄｉｏｎｅ−ｉｏｄｉｎｅ）Ｐｕｒｄｕｅ，“Ｂｅｔａｄｉｎｅ”）で膝関節の外面を洗浄した。軟骨表面を損傷させることなく膝関節を解剖して、大腿骨、脛骨、および腓骨を分離した。軟組織（脂肪、筋肉、筋膜、靭帯、および腱）を除去して脛骨プラトーおよび大腿骨顆上の関節軟骨表面を曝露させた。

関節軟骨（脛骨プラトーおよび大腿骨の顆部）を含む部分を、冷却プレート上で冷却した生理食塩水（０．９％塩化ナトリウム洗浄溶液、ＵＳＰ）中に配置することにより冷却した。

実施例２．軟骨プラグの単離
実施例１に詳述したように大腿骨顆および脛骨プラトーを得た。約１ｃｍまたは約２ｃｍの直径を有する骨軟骨プラグを大腿骨顆および脛骨プラトーから得た。プラグを単離する間、顆部および脛骨プラトーは、冷却した生理食塩水中へ定期的に浸漬し、または冷却生理食塩水に浸したワイプ（ｗｉｐｅ）でふくことにより、湿潤かつ冷却した状態に保たれていた。

損傷した軟骨領域を避けながら、組織パンチを使用して骨軟骨プラグを得た。具体的には、１ｃｍまたは２ｃｍの直径の組織パンチを使用して、関節表面から関節プラグ全体および下層の骨を取り出した。

実施例３．軟骨下骨および石灰化軟骨からの軟骨試料の単離
実施例２に詳述したように骨軟骨プラグを得た。軟骨下骨および石灰化軟骨を骨軟骨プラグから取り出して、軟骨ディスクの形態の軟骨試料を提供した。この工程の間、軟骨は過熱を防ぐため冷却した生理食塩水を用いて定期的に冷却された。

具体的には、各軟骨プラグをしっかりと保持し、湾曲した角度の歯を備えた矢じり状ののこぎりを使用して軟骨層から軟骨下骨層を切断した（取り出した）。軟骨下骨を取り出した後、残存する骨および石灰化軟骨を、軟骨ディスクの下側からそり落とした。過熱を防ぐため、のこびきおよびそり落としの工程にわたって、冷却生理食塩水に組織を頻繁に浸した。この工程を各軟骨ディスクについて繰り返した。

実施例４．軟骨試料の寸法処理
単離した軟骨ディスク形態の軟骨試料を実施例３に詳述したように入手し、その後、柔軟性を増大させるために寸法処理した。軟骨試料の厚さを、カリパスまたはディスク厚ゲージを使用して測定した。約１．５ｍｍより厚いディスクを約１．５ｍｍに整えた。約１ｍｍより薄いディスクは廃棄した。

実施例５．軟骨試料の穿孔
軟骨試料（軟骨ディスク）を入手し、実施例４に詳述したように寸法処理した後、穿孔して、図１５に表すように、約３６孔／ｃｍ^２の孔密度で約１ｍｍの直径の孔を有する軟骨層（ディスク）を提供した。

具体的には、孔のパターン（穿孔したステンレス製のスクリーン）を、軟骨試料の上に配置し、１ｍｍの生検パンチを使用してパターンに沿って軟骨に孔（穴）をあけた。その後、穿孔した軟骨試料を冷却生理食塩水に浸漬することにより冷却した。

実施例６．軟骨試料の部分的消化
軟骨試料（軟骨ディスク）を、実施例５に詳述したように入手し、その後ＩＩ型コラゲナーゼで消化した。

具体的には、コラゲナーゼをＤＭＥＭ（２００ユニット／ｍｌＩＩ型コラゲナーゼ、シグマ）中で製剤化した。穿孔した軟骨試料を３７℃±２℃で３０±２分間コラゲナーゼ懸濁液中でインキュベートした。コラゲナーゼ溶液を除去し、ディスクを冷却生理食塩水ですすいだ。

実施例７．軟骨製品の抗菌処置
軟骨試料（軟骨ディスク）を実施例７に詳述したように取得し、その後、硫酸ゲンタマイシン（５０μｇ／ｍｌ、Ａｂｒａｘｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、イリノイ州シャンバーグ）、バンコマイシンＨＣｌ（５０μｇ／ｍｌ、ホスピーラインコーポレイティッド、イリノイ州レイクフォレスト）、およびアンホテリシンＢ（２．５μｇ／ｍＬ；シグマアルドリッチ、ミズーリ州セントルイス）を含むＤＭＥＭを含有する抗菌溶液で、３７℃±２℃、１８時間〜４８時間インキュベートした。インキュベートした後、抗菌溶液を除去しディスクを冷却生理食塩水ですすいだ。

実施例８．凍結保存
軟骨製品を実施例８に詳述したように取得し、凍結保存溶液中で凍結保存した。

凍結保存溶液は、１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（Ｂｉｏｎｉｃｈｅ Ｔｅｏ． Ｉｎｖｅｒｉｎ Ｃｏ）および５％のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ；バクスター社）を含むＰｌａｓｍａＬｙｔｅ−Ａ（バクスターヘルスケアコーポレーション）を含有していた。

各軟骨製品に対して、バイアルに約７ｍｌの凍結保存溶液を充填し、鉗子を使用して軟骨製品をバイアルに移した。凍結保存溶液中に配置する前に、本軟骨製品をふいて残存する液体（たとえば生理食塩水）を除去した。凍結保存溶液および本軟骨製品を含有するバイアル中にストッパーを配置した。

バイアルのキャップをしめ、圧着させ、袋に詰めた後バイアルを密封し、それから自動化冷凍装置中にバイアルを配置することにより約−８０℃で凍結保存した。
この冷凍装置を、以下の温度プログラム

ステップ１ ４．０°Ｃ／ｍで４℃まで温度を低下
ステップ２ ４℃で６０分温度を保持
ステップ３ １．０°Ｃ／ｍで−３０℃まで温度を低下
ステップ４ ３０分間−３０℃で温度を保持
ステップ５ ４．０°Ｃ／ｍで−８０℃まで温度を低下
ステップ６ −８０℃で温度を保持

を使用して、徐々に段階的な方法で温度を低下させるようプログラム化した。

実施例９．軟骨製品
実施例１〜実施例８に詳述した方法を使用して軟骨試料を単離、穿孔、消化、かつ凍結保存することにより、軟骨製品を作製した。軟骨製品は、天然の構造的機構を有し、適切な関節軟骨の修復を促進する。驚くべきことに、治療上活性な軟骨製品は、以下の、
軟骨形成能力を有する生存可能な天然の軟骨細胞を含有する、
生理活性因子を含有する、
非免疫原性である、
天然の構造的機構を有する柔軟な修復マトリックスを提供する、
といった技術的特性を有する。

実施例１０．多様な凍結方法を使用した凍結保存後の生存可能な軟骨細胞
実施例９由来の軟骨製品を凍結保存後の生存可能な軟骨細胞について解析した。

多様な凍結方法を調査して、細胞の生存率に対するそれらの影響を決定した。軟骨製品を、１０％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）および５％のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含むｐｌａｓｍａｌｙｔｅ−Ａ（塩化ナトリウム、グルコン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化カリウム、および塩化マグネシウム）を含有する凍結保存媒体中で製剤化した。

第１の一連の実験では、異なる凍結保存方法を試験して、軟骨製品内の生存可能細胞の保存に対する影響を決定した。

方法１：平衡化させる（すなわち凍結溶液の組織への浸透）ため、４℃で軟骨製品を保持し、続いて発泡スチロールボックス中に本製品を配置し、約−０．５℃／分の均一な冷却速度をもたらす−８０℃の冷凍装置で凍結した。

方法２、
ステップ１．段階的に温度を低下
ステップ２．４．０℃／ｍで４℃まで温度を低下
ステップ３．平衡化のため４℃で６０分間温度を保持
ステップ４．１．０℃で−３０℃まで温度を低下
ステップ５．３０分間−３０℃で温度を保持
ステップ６．４．０℃で−８０℃まで温度を低下
ステップ７．−８０℃で温度を保持

生存可能な細胞の存在を実証するために、軟骨製品をＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）生存率／細胞毒性キット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｉｎｃ．，オレゴン州ユージーン）を使用して染色し、細胞の生存率を定性的に評価した。染色は製造者のプロトコルにしたがって実施した。軟骨製品の薄い部分（たとえば約０．５ｃｍ×０．５ｃｍ×０．０２ｃｍ）を３７℃の水浴中で融解し、解析に使用した。染色した組織の評価は蛍光顕微鏡を使用して実施した。強く均一な緑色の蛍光は生存細胞の存在を示し、明るい赤色の蛍光は死細胞の存在を示した。

図３に表すように、段階的な方法により凍結保存した軟骨製品（方法２、図３Ｂ）は、単一の平衡化ステップの後に徐々に冷却するステップを含む方法を使用して凍結保存した軟骨製品（方法１、図３Ａ）と比較して、生存可能な軟骨細胞のレベルが高かった。軟骨細胞は関節軟骨内に存在する主要な細胞型であり、軟骨マトリックスのホメオスタシスの維持に不可欠である。さらに、軟骨細胞は軟骨形成および軟骨修復を促進する因子を発現する。凍結保存軟骨製品はいったん融解されると生存可能な細胞をほとんど保存できないことが文献でいくつか挙げられている（たとえばＡｃｏｓｔａ ｅｔ ａｌ， ２００７． Ｃｌｉｎ Ｏｒｔｈｏｐ Ｒｅｌａｔ Ｒｅｓ；４６０：２３４−９）ことから、生存可能な軟骨細胞が凍結保存の後も維持されることは極めて驚くべきことである。

第２の一連の実験では、平衡化の期間を、融解した軟骨製品中の生存可能な軟骨細胞のレベルに与えるそれらの影響について試験した。具体的には、細胞の生存率を、方法２を使用した凍結保存後に評価し（図４Ａ）、２時間の平衡化ステップ（図４Ｂ）また４時間の平衡化ステップ（図４Ｃ）を４℃での１時間の平衡化ステップに変えた凍結保存方法と比較した。驚くべきことに、図４に表すように、１時間の平衡化ステップは、２時間および４時間の平衡化に対して同等な（またはより良好な）細胞の生存率を提供した。

実施例１１．多様な凍結保存媒体中での凍結保存後の生存可能な軟骨細胞
実施例９からの軟骨製品を凍結保存後の生存可能な軟骨細胞について解析した。多様な凍結保存媒体を調査して、細胞の生存率に与えるそれらの影響を決定した。

第１の実験では、軟骨製品を、ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ Ａ中の１０％または２０％のＤＭＳＯを含む５％のＨＳＡを含有する凍結保存媒体中で製剤化した。実施例１０に詳述した方法でＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）染色を、最終的な軟骨製品を融解した製品について実施した。結果は図５に表される。１０％（図５Ａ）および２０％ＤＭＳＯ（図５Ｂ）の間での細胞生存率に定性的な差異はなかった。したがって、本軟骨製品を凍結保存媒体の濃度を低減させて製剤化して、融解時に生存可能な軟骨細胞を有する製品を提供できる。

第２の実験では、軟骨製品を、ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ Ａ中に０％または５％のＨＳＡおよび１０％のＤＭＳＯを含む５％のＨＳＡを含有する凍結保存媒体中で製剤化した。実施例１０に詳述した方法でＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）染色を、最終的な軟骨製品を融解した製品について実施した。結果を図６に示す。この研究では、０％のＨＳＡ（図６Ａ）および５％のＨＳＡ（図６Ｂ）の間で細胞の生存率に関する顕著な差異は見られなかった。しかしながら、凍結保存組織の長期間の安定性に対するＨＳＡの作用に関する本発明者らの知見によると、ＨＳＡは任意に含まれる。

第３の実験では、軟骨製品は、ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ−Ａまたは通常の生理食塩水中の１０％のＤＭＳＯ＋５％のＨＳＡ溶液を含有する凍結保存媒体中で製剤化される。実施例１０に詳述した方法でＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）染色を、最終的な軟骨製品を融解した製品について実施した。結果を図７に示す。ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ−Ａ（図７Ａ）および通常の生理食塩水（図７Ｂ）の間で細胞生存率に目立った差異は実証されなかった。しかしながら、本発明者らの知見によると、ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ−Ａは、低温保存中の軟骨製品の長期間の安定性に有益であり得る塩および無機物（たとえば塩化ナトリウム、グルコン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化カリウム、および塩化マグネシウム）を含んでいるため、任意に含まれる。本発明の軟骨製品に有用な凍結溶液は、ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ−Ａ中の１０％ＤＭＳＯ＋５％ＨＳＡを含む。

これらの結果から、本明細書に教示される軟骨製品は、多様な凍結保存媒体中で製剤化した場合、凍結／融解周期後に生存可能な軟骨細胞を含むことが示唆される。

実施例１２．融解後の持続した細胞の生存率
実施例９由来の軟骨製品を凍結保存後の生存可能な軟骨細胞について解析した。軟骨製品を融解した後の多様な時点で細胞の生存率を決定した。

軟骨製品を、ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ Ａ中の１０％のＤＭＳＯを含む５％のＨＳＡを含有する凍結保存媒体中で製剤化した。凍結保存および融解後、軟骨製品を、ＤＭＥＭ＋１％ＨＳＡ＋抗菌剤／抗真菌剤中で、最大１４日間培養した。培養０日目（図８Ａ）、７日目（図８Ｂ）、および１４日目（図８Ｃ）に軟骨製品を、実施例１０に詳述した方法でＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）染色により評価した。図８に表すように、軟骨細胞は、凍結／融解周期後の１４日の培養期間中で生存可能であった。したがって、本発明の軟骨製品は、治療上の作用に寄与する細胞成分を提供する。

実施例１３．細胞生存率の定量的評価
凍結保存後の細胞数および細胞生存率を、実施例９由来の軟骨製品で解析した。

凍結保存した軟骨製品を融解し、薄い区域を、実施例１０に詳述したようにＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）染色で染色した。生存可能な軟骨細胞および死んだ軟骨細胞を、それぞれ緑色の蛍光または赤色の蛍光のいずれかで示されるように１０×倍のレンズ下で視覚化し、０．３８ｍｍ^２の領域内で計測した。４つの別々のドナーからの無作為に選択した３つの区域を解析した。表１に詳述するように、生存可能な細胞の平均数は６４，９８９細胞／ｃｍ^２であり、細胞生存率は７０．５％であった。このデータは、本発明の軟骨製品が７０％の生存率を有し得ることを示す。

細胞の生存率

実施例１４．柔軟性のある軟骨製品
１つの実施形態では、本発明の軟骨製品は柔軟性が高く関節鏡で投与できる。驚くべきことに、穿孔および任意の消化により、軟骨製品は、関節鏡カニューレを通り抜けられるのに十分な柔軟性を有することができる。これは、通常は固くて破損することなく曲げることがほとんど不可能な天然の関節軟骨とは対照的である。

関節鏡で使用するための柔軟性および能力に対する影響を決定するために、多様な孔寸法および孔密度を評価した。軟骨製品を実施例４に詳述した方法を使用して作製し、穿孔のみまたは穿孔および消化によりさらに処理した。２つの異なる孔寸法を、直径０．６ｍｍおよび０．９ｍｍの孔で試験した。３つの異なる孔密度（１２、２５、および５０孔／ｃｍ^２）を試験した。さらに、３０分のコラゲナーゼ消化も、本軟骨製品の消化の影響を評価するために試験した。表２に詳述したように、処置条件の多様な組み合わせ（処置Ａ〜Ｌ）を試験した。処置Ａ〜Ｌにより作製した各軟骨製品は、本発明の例示的な軟骨製品である。

具体的には、各処置条件Ａ〜Ｌを対応する文字でラベル化し、１〜５（１＝最も柔軟である、５＝最も硬く、最も柔軟性がない）のスケールで軟骨製品の柔軟性を６人の評価者により盲検法で評価した。結果を表３に表す。この結果から、孔の寸法がより大きく（直径０．９ｍｍ）および孔の頻度がより高い（５０孔／ｃｍ^２）ものが、最も柔軟な軟骨製品であることが示された。この実験では、コラゲナーゼ処理は、柔軟性に顕著な差異を示さなかった。しかしながら、他の実験（データは示さず）において、ユーザーは、コラゲナーゼ処置による柔軟性により顕著な変化を見出した。

処置条件

多様な処置条件後の軟骨製品の柔軟性

実施例１５．軟骨製品の非免疫原性
実施例９由来の軟骨製品を免疫原性について解析した。具体的には、リポ多糖（ＬＰＳ）に対する応答で軟骨製品によるＴＮＦ−αの分泌を使用して免疫原性を決定した。本発明の凍結保存した軟骨製品のＴＮＦ−αの分泌を、未加工の（新鮮な）軟骨製品の分泌と比較した。

軟骨製品（未加工ｖｓ凍結保存）の断片（０．７８５ｃｍ^２）を組織培養媒体中に置き、細菌ＬＰＳ（１ｐｇ／ｍｌ、シグマ）に、２０〜２４時間曝露した。２４時間後、組織培養媒体を収集し、製造者のプロトコルにしたがってＴＮＦ−αＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄシステムズ）を使用してＴＮＦ−αの存在を試験した。ヒトｈＰＢＭＣは、ＬＰＳの刺激により高レベルのＴＮＦ−αを分泌する単球を含むことが知られており、アッセイの陽性対照として使用した。ＬＰＳのないｈＰＢＭＣおよび軟骨製品もまた、本分析の対照として含まれた。

結果を図９に表す。非凍結保存軟骨製品（「未加工製品」）はＬＰＳに応答して実質レベルのＴＮＦ−αを提供し、凍結保存した軟骨製品（「最終製品」）はＬＰＳに応答して実質レベルのＴＮＦ−αを提供しなかった。このことは、製造工程で軟骨試料の免疫原性が排除されることを示す。理論に縛られるものではないが、本発明者らは、生存可能な機能的マクロファージが処理されていない軟骨中の免疫原性の源であると考えている。

驚くべきことに、これらの結果は、軟骨製品から選択的にマクロファージが排除されて同種のインプラントの免疫原性を低減し得ることを示唆する。

実施例１６．軟骨製品中の生理活性因子
実施例９由来の軟骨製品を生理活性因子の存在について解析した。具体的には、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用して、本軟骨製品の培養上清中に放出された組織抽出物および因子を解析した。

組織抽出アッセイでは、実施例９の凍結保存した軟骨製品を、３７℃の温水槽で融解し、凍結保存媒体を除去して、その後ＰＢＳですすいだ。その後、各製品を細かく断片化し、液体窒素槽のホモジナイゼーション管中で急速に凍結した。あらかじめ冷却した５ｍｍのスチールビーズを各管に添加し、１ｍｌのホモジナイゼーション媒体中で製造者の推奨にしたがってＱｉａｇｅｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｌｙｓｅｒを使用してホモジナイズした。次に、破砕物を、微量遠心機を使用して１０分間１６０００ｇで遠沈した。上清を収集し、タンパク質発現についてＥＬＩＳＡにより解析されるまで−８０℃で保存した。上清容量は、ホモジナイゼーション媒体の初期容量（１ｍｌ）とほぼ等しかった。

因子放出アッセイでは、凍結保存した軟骨製品を、３７℃の温水槽で融解し、凍結保存媒体を除去して、その後ＰＢＳですすいだ。各軟骨製品を、１２ウェルディッシュのウェル上に置き、２ｍｌの増殖培地（ＤＭＥＭ＋１％ＨＳＡ＋抗菌剤／抗真菌剤）を添加して、３７℃で最大１４日間インキュベートした。インキュベート後、組織および培養媒体を１５ｍｌの円錐管に移し、５分間２０００ｒｐｍで遠心した。培養上清を収集し、タンパク質発現についてＥＬＩＳＡにより解析した。上清容量は、増殖培地の初期容量（２ｍｌ）とほぼ等しかった。

表４は、組織抽出アッセイおよび因子放出アッセイで検出される軟骨形成因子の例である。各発現値は、本軟骨製品の上側の表面積（図１５で同定）あたりの上清容量当たりの因子の量（ｐｇ／ｍｌ／ｃｍ^２）ならびに本軟骨製品の上側の表面積あたりの因子の量（ｐｇ／ｃｍ^２）で提供される。

軟骨形成因子

理論に縛られるものではないが、本発明者らは、細胞外マトリックス産生を媒介し、かつ軟骨形成を促進する生理活性因子（たとえば増殖因子タンパク質）が、本技術の軟骨製品により促進されるため、軟骨修復に重要であると考えている。

驚くべきことに、これらの結果は、本軟骨製品が関節軟骨修復の治療上の有効性を促進する多様な軟骨形成因子を含むことを示唆する。

実施例１７．軟骨製品からのタンパク質の持続的放出
本発明の軟骨製品は、細胞または組織により因子を微小環境内へ放出してそれらの機能活性を高めることができる。

放出される量またはタンパク質を測定するために、実施例９の軟骨製品を、培養媒体中で７〜２１日培養し、上清を収集し、鍵となるタンパク質をＥＬＩＳＡにより定量化した。結果を図１０に表す。この結果は、本軟骨製品がＴＧＦ−β１およびＴＧＦ−β２を上清内へと少なくとも２１日間産生かつ放出することを示す。これらのデータは、本軟骨製品が、生存可能な軟骨細胞および高密度のＥＣＭの存在により、長い期間軟骨形成増殖因子のレベルを産生かつ持続する性質を有することを示唆する。

実施例１８．穿孔した軟骨製品からの因子の放出
穿孔型軟骨製品対無傷の軟骨製品のタンパク質に対する影響を調査した。穿孔パラメータを修正したことを除き、軟骨製品を実施例９に詳述したように作製した。製品の半分を３６〜５０孔／ｃｍ^２で穿孔し、残りは穿孔せず無傷のままとした。７日間培養した両条件の軟骨製品の上清から、ＴＧＦ−β１の量をＥＬＩＳＡにより測定した。結果を図１１に表す。この結果から、穿孔した軟骨インプラントから放出されたＴＧＦ−β１の量は、無傷の軟骨製品よりも多いことが示される。これらのデータは、製品内の穿孔が製品の柔軟性に寄与するのみならず、より多くの軟骨形成因子の放出を支援することを示す。理論に縛られるものではないが、本発明者らは、増大した放出は、孔により作り出された表面積の増加によるものと推測する。

実施例１９．消化された軟骨製品からの因子の放出
タンパク質放出に対する軟骨製品の消化の影響を調査した。消化パラメータを修正したことを除き、軟骨製品を実施例９に詳述したように作製した。製品の半分は、凍結保存する前に３０分間のコラゲナーゼ消化を行わなかった。１４日間培養した両条件の製品の上清から、放出されたＴＧＦ−β１の量をＥＬＩＳＡにより測定した。結果を図１２に示す。この結果より、コラゲナーゼで消化された軟骨製品から放出されたＴＧＦ−β１の量は、非消化型の軟骨製品よりも多いことが実証される。これらのデータは、コラゲナーゼの消化が本製品の柔軟性および清浄度に寄与するだけでなく、微小環境へのより多くの有益なタンパク質の放出を支援することを示す。

実施例２０．生細胞を含む凍結保存型軟骨製品からのＴＧＦ−β因子の放出
タンパク質放出に対する凍結保存の影響を調査した。軟骨製品を実施例９に詳述したように作製した（すなわち凍結保存した）。次に、いくつかの軟骨製品を、Ｈ_２Ｏ中でさらに３回凍結融解して製品内の全ての細胞を殺傷（「失活化」）した。最終的なステップとして、全ての軟骨製品を融解し、別々のウェルにおいて増殖培地で２１日間培養した。

２１日間培養した両条件の軟骨製品の上清から、自発的に培地に放出されたＴＧＦ−β１の量をＥＬＩＳＡにより測定した。結果を図１３に表す。この結果より、生細胞を含む凍結保存した軟骨製品から放出された因子（ＴＧＦ−β１）の量は、２１日間の培養全期間にわたり失活化した軟骨製品よりも多かった。これらのデータは、凍結保存した軟骨製品は、生細胞をもたない軟骨と比較して、ＴＧＦ−β１などの有益な因子を微小環境へと産生し続けかつ寄与する生存可能な細胞を含むことを示唆している。

実施例２１．軟骨製品のポビドンヨード処置後の細胞生存率
ドナー組織の無菌処理を最適化する試みは、治療上の使用にとって重要である（および、たとえば、アメリカ食品医薬局（ＦＤＡ）および組織製品の安全性に関する組織バンクの規則を順守するために重要である）。ドナー組織によりもたらされるバイオバーデンを最小限にするため、実施例７に詳述したように、軟骨製品を凍結保存する前に一晩抗菌的インキュベーションで処置した。軟骨製品のバイオバーデンをさらに少なくするために、ポビドンヨード処置を試験して、細胞生存率またはタンパク質発現におけるいずれかの変化を観察した。ポビドンヨードは、外科処置する表面を清潔にし、かつ除染するために診療で広く使用される強力な消毒薬である。

手短に述べると、軟骨製品を実施例９に詳述したように作製したが、一晩の抗菌性インキュベーションの前に、軟骨製品をポビドンヨード槽に１秒間浸し、その直後に生理食塩水で３回洗浄した。次に、軟骨製品を通常の抗菌性インキュベーションし、凍結保存処理を行った。ポビドンヨード処置の影響を評価するために、細胞の生存率（ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）染色）を、実施例１０に詳述したように解析した。結果を図１４に表す。３つの濃度のポビドンヨード（１０％ポビドンヨード（図１４Ａ）、５％ポビドンヨード（図１４Ｂ）、１％ポビドンヨード（図１４Ｃ））および対照として０％のポビドンヨード（図１４Ｄ）を試験した。融解した軟骨製品のＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）染色から、対照である未処置の軟骨製品と比較して、ポビドンヨードの濃度が増加するほど細胞生存率が減少することが明らかとなった。

実施例２２．軟骨製品を用いたヤギの軟骨欠損の処置
１つの実施形態では、たとえば局所的軟骨欠損の動物モデルなどの動物モデルで軟骨製品の効果を試験する。

手短に述べると、局所的軟骨欠損をヤギの後膝関節内に誘導し、その後微細破壊単独または、軟骨製品（実施例９で作製）および微細破壊で処置した。３か月目、６か月目、および１２か月目に関節を収集し、修復組織を、関節軟骨修復組織の形成を示すＩＩ型コラーゲン染色および欠損部の充填容量について解析した。さらに、試験期間中にわたり炎症または一般的な苦痛をモニタリングすることによって、本製品の安全性についてヤギを試験できる。

本技術の軟骨製品は、限定するものではないが、以下の
安全性、
全体の形態、
天然の周辺組織と比較した修復組織の質、
修復組織の統合、
組織学的評価、
細胞外マトリックス染色、
欠損容量の充填、
機構的評価、
修復組織の圧入試験、
Ｏ’Ｄｒｉｓｃｏｌｌ ｇｒａｄｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍによる修復組織評価、
といった基準のうちの少なくとも１つ以上により、軟骨修復が実質的に増大した。

実施例２３．軟骨製品内の生存可能な細胞の軟骨形成
この試験は、本軟骨製品内の生存可能な細胞は機能的であり、適切な軟骨修復に寄与する健常なＥＣＭを作る能力を有することを実証する。

本発明の軟骨製品から軟骨細胞を単離し、増殖（ｅｘｐａｎｄ）させる。軟骨細胞の長期間のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養により、いくつかの細胞（たとえば、より原始的な線維芽細胞系）が脱分化する。次に、これらの細胞を分化媒体（たとえば増殖因子を含む）内に配置する。時間がたつにつれて、これらの細胞はｉｎ ｖｉｔｒｏで軟骨形成を示す。

実施例２４．軟骨製品内の軟骨細胞の遺伝子発現
軟骨製品を実施例９に詳述したように作製する（凍結保存の有無を除く）。軟骨製品内の軟骨細胞を、機能的に活性な軟骨細胞を刺激する必須の遺伝子の発現について試験した。以下の：ＩＩ型コラーゲン、アグリカン、ＳＯＸ５、ＳＯＸ６、およびＳＯＸ９の実質的な発現レベルが検出される。

実施例２５．外来性ＭＳＣにおける軟骨製品中の軟骨細胞の刺激作用
単離した間葉系細胞（たとえば異なるドナー由来）は、本発明の軟骨製品から単離した軟骨細胞と同時に培養される。

軟骨細胞はＭＳＣを刺激して軟骨細胞へと分化させ、このモデルで結果として起こる軟骨形成を刺激する。これらの結果は、本発明の軟骨製品の治療上の効果が、一部は、レシピエントのＭＳＣ細胞における軟骨製品の軟骨細胞の刺激作用によることを実証する。

本明細書に提供される引用は、引用される主題事項について本明細書に参照として援用される。

本発明のさらなる実施形態を、以下の段落に見出すことができる。

１つの実施形態では、本技術は、部分的に消化した軟骨を含む軟骨製品を提供し、この部分的に消化した軟骨は、（ａ）生存可能な天然の細胞、および（ｂ）複数の孔を含む。

他の実施形態では、本技術は、（ａ）コラーゲンマトリックス中のコラーゲンの実質量が、非修飾型関節軟骨と比較して断片化されているコラーゲンマトリックス、（ｂ）コラーゲンマトリックス中の複数の孔、および（ｃ）コラーゲンマトリックス中の生存可能な天然の細胞、
を含む軟骨製品を提供する。

別の実施形態では、本技術は部分的にコラゲナーゼで消化された軟骨を含む軟骨製品を提供し、この軟骨は複数の孔を含む。

さらなる実施形態では、本技術は、（ａ）コラーゲンマトリックス中のコラーゲンの実質量が、グリシン終結型コラーゲン断片であるコラーゲンマトリックス、および（ｂ）コラーゲンマトリックス中の複数の孔を含む、軟骨製品を提供する。

他の実施形態では、本技術は、約１０〜約１００孔／ｃｍ^２である軟骨を含む軟骨製品を提供し、（ａ）孔の直径は約０．２ｍｍ〜約２ｍｍであり、かつ（ｂ）軟骨は非修飾型関節軟骨よりも大きな柔軟性をもつ。いくつかの実施形態では、軟骨は部分的に消化されている。いくつかの実施形態では、孔の直径は、約０．２ｍｍ〜約２ｍｍ、約０．５ｍｍ〜約１．５ｍｍ、約０．８ｍｍ〜約１．２ｍｍ、または約１ｍｍから選択される。いくつかの実施形態では、軟骨は約２０〜約６０孔／ｃｍ^２の孔密度を有する。いくつかの実施形態では、軟骨製品は、生存可能な軟骨細胞の実質量を含む。いくつかの実施形態では、軟骨製品は硝子軟骨を含み、任意にこの硝子軟骨は、関節軟骨、下顎頭軟骨（ｃｏｎｄｏｙｌｅ ｃａｒｔｉｌａｇｅ）、大腿顆軟骨（ｆｅｍｕｒ ｃｏｎｄｏｙｌｅ ｃａｒｔｉｌａｇｅ）、および脛骨プラトー軟骨（ｔｉｂｉａｌ ｐｌａｔｅａｕ ｃａｒｔｉｌａｇｅ）から選択される。

いくつかの実施形態では、軟骨製品は軟骨下骨層を欠いており、任意に、軟骨製品は石灰化軟骨層を欠いている。

いくつかの実施形態では、本技術は約３ｍｍ未満の厚さを有する軟骨製品を提供する。いくつかの実施形態では、軟骨は約０．５ｍｍ〜約２ｍｍ、または約１ｍｍ〜約１．５ｍｍの厚さを有する。いくつかの実施形態では、本技術は軟骨製品を提供し、孔は軟骨の厚さの大部分にわたり延び、任意に孔は軟骨の厚さ全体にわたって延びる。いくつかの実施形態では、本技術は、凍結保存した軟骨製品を提供する。いくつかの実施形態では、軟骨製品は凍結／融解周期にかけられる。

いくつかの実施形態では、軟骨製品は軟骨形成因子を含み、任意に、この軟骨形成因子はＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−７、ｂＦＧＦ、ＩＧＦ−１のうち１つ以上を含む。

いくつかの実施形態では、本技術の軟骨製品は、
少なくとも約１１ｐｇ／ｃｍ^２、任意に約１１〜約６２８ｐｇ／ｃｍ^２の量のＴＧＦ−β１、
少なくとも約４ｐｇ／ｃｍ^２、任意に約４〜約１１２ｐｇ／ｃｍ^２の量のＴＧＦ−β３、
少なくとも約３ｐｇ／ｃｍ^２、任意に約３〜約２３ｐｇ／ｃｍ^２の量のＢＭＰ−７、
少なくとも約１６９ｐｇ／ｃｍ^２、任意に約１６９〜約３６５ｐｇ／ｃｍ^２の量のｂＦＧＦ、および
少なくとも約１１１ｐｇ／ｃｍ^２、任意に約１１１〜約７７９ｐｇ／ｃｍ^２の量のＩＧＦ−１、
を含み得る１つ以上の軟骨形成因子（ｃｈｏｍｄｒｏｇｅｎｉｃ ｆａｃｔｏｒｓ）を含む。

他の実施形態では、増殖培地中で培養する際、本技術の軟骨製品は、
少なくとも約２６１７ｐｇ／ｃｍ^２、任意に約２６１７〜約１７８１８ｐｇ／ｃｍ^２の量のＴＧＦ−β１、
少なくとも約１３３ｐｇ／ｃｍ^２、任意に約１３３〜約６２３ｐｇ／ｃｍ^２の量のＴＧＦ−β２、
少なくとも約１４ｐｇ／ｃｍ^２、任意に約１４〜約２８４２ｐｇ／ｃｍ^２の量のＩＧＦ−１、
のうちの１つ以上を放出する。

いくつかの実施形態では、本技術は軟骨を提供し、軟骨製品はＩＩ型コラーゲン、ヒアルロナン、およびアグリカンを含む。

いくつかの実施形態では、本技術は軟骨ディスクの形状の軟骨製品を提供し、任意に、円形または円筒形の軟骨製品を提供する。

他の実施形態では、本技術は、凍結／融解周期にかけられ、かつ１μｇ／ｍＬの細菌ＬＰＳを含む培地中で２０〜２４時間インキュベートした後にＴＮＦ−αの実質量を産生しない、軟骨製品を提供する。

いくつかの実施形態では、本技術は、約５００細胞／ｍｍ^２、約６００細胞／ｍｍ^２、約７００細胞／ｍｍ^２、約８００細胞／ｍｍ^２、約１２００細胞／ｍｍ^２、および約１５００細胞／ｍｍ^２のうちの少なくともいずれかの量の生存可能な軟骨細胞を含むコラーゲンマトリックスを含む軟骨製品を提供し、任意にこの生存可能な軟骨細胞はコラーゲンマトリックスに対し天然である。

他の実施形態では、本技術は、コラーゲンマトリックスが表層、遷移層、および放射層から選択される１つ以上の層を含む軟骨製品を提供する。

いくつかの実施形態では、本技術は、コラーゲンマトリックスが約１００細胞／ｍｍ^２および約２００細胞／ｍｍ^２のうちの少なくともいずれかを含む表層を含み、任意に生存可能な軟骨細胞がコラーゲンマトリックスに対し天然である、軟骨製品を提供する。

いくつかの実施形態では、本技術は、コラーゲンマトリックスが約１００細胞／ｍｍ^２、約２００細胞／ｍｍ^２、および約４００細胞／ｍｍ^２のうちの少なくともいずれかを含む遷移層を含み、任意に生存可能な軟骨細胞がコラーゲンマトリックスにとって天然である、軟骨製品を提供する。

いくつかの実施形態では、本技術は、コラーゲンマトリックスが約１００細胞／ｍｍ^２および約２００細胞／ｍｍ^２のうちの少なくともいずれかを含む放射層を含み、任意に生存可能な軟骨細胞がコラーゲンマトリックスに対し天然である、軟骨製品を提供する。

他の実施形態では、本技術は、コラーゲンマトリックスが柔軟である軟骨製品を提供し、任意にコラーゲンマトリックスは破損することなく湾曲または折り畳むことができるような柔軟性を有する。いくつかの実施形態では、コラーゲンマトリックスは、０．１ＭＰａ、０．２ＭＰａ、０．３ＭＰａ、および０．４ＭＰａのうちの少なくともおおよそいずれかのヤング率を有する。

いくつかの実施形態では、本技術は、本技術の軟骨製品をその必要のある対象に投与することを含む処置方法を提供する。いくつかの実施形態では、製品は関節鏡で投与される。他の実施形態では、製品は、製品を折り畳む、または巻くことにより投与される。いくつかの実施形態では、投与ステップは、微細破壊工程と併用して実施される。いくつかの実施形態では、軟骨製品は凍結保存される。他の実施形態では、軟骨製品は凍結／融解周期にかけられる。

本技術のいくつかの実施形態では、コラーゲンマトリックスは天然のコラーゲンマトリックスであり、任意にコラーゲンマトリックスは霊長類またはヒトから得られる。いくつかの実施形態では、軟骨製品は添加剤をさらに含む。

Claims (62)

1. 軟骨を含む軟骨製品であって、軟骨が、
   ａ．生存可能な天然の細胞；および
   ｂ．複数の孔
   を含む、軟骨製品。
2. 軟骨製品であって、
   ａ．コラーゲンマトリックスであって、コラーゲンマトリックス中のコラーゲンの実質量が非修飾型関節軟骨と比較して断片化されているコラーゲンマトリックス；
   ｂ．コラーゲンマトリックス中の複数の孔；および
   ｃ．コラーゲンマトリックス中の生存可能な天然の細胞
   を含む、軟骨製品。
3. 軟骨を含む軟骨製品であって、軟骨が複数の孔を備える、軟骨製品。
4. 軟骨製品であって、
   ａ．コラーゲンマトリックスであって、コラーゲンマトリックス中のコラーゲンの実質量がグリシン終結型コラーゲン断片であるコラーゲンマトリックス；および
   ｂ．コラーゲンマトリックス中の複数の孔
   を含む、軟骨製品。
5. 約１０〜約１００孔／ｃｍ^２を有する軟骨を含む軟骨製品であって、
   ａ．孔の直径が、約０．２ｍｍ〜約２ｍｍであり；および
   ｂ．軟骨が非修飾型関節軟骨よりも大きな柔軟性を有する
   軟骨製品。
6. 軟骨が部分的に消化されている、請求項１〜５のいずれか１項に記載の軟骨製品。
7. 前記部分的に消化されたコラーゲンが酵素で消化されたコラーゲンである、請求項１または６に記載の軟骨製品。
8. 前記酵素がプロテイナーゼであり、任意に前記プロテイナーゼがコラゲナーゼまたはコラゲナーゼＩＩである、請求項７に記載の軟骨製品。
9. 孔の直径が約０．２ｍｍ〜約２ｍｍ、約０．５ｍｍ〜約１．５ｍｍ、約０．８ｍｍ〜約１．２ｍｍ、または約１ｍｍから選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の軟骨製品。
10. 軟骨が約２０〜約６０孔／ｃｍ^２の孔密度を有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の軟骨製品。
11. 軟骨が生存可能な細胞を含む、請求項３または６に記載の軟骨製品。
12. 生存可能な細胞が軟骨細胞である、請求項１、２、または１１に記載の軟骨製品。
13. 軟骨製品が生存可能な軟骨細胞の実質量を含む、請求項１２に記載の軟骨製品。
14. 軟骨が硝子軟骨を含み、任意に、硝子軟骨が関節軟骨、下顎頭軟骨（ｃｏｎｄｏｙｌｅ ｃａｒｔｉｌａｇｅ）、大腿顆軟骨（ｆｅｍｕｒ ｃｏｎｄｏｙｌｅ ｃａｒｔｉｌａｇｅ）、および脛骨プラトー軟骨（ｔｉｂｉａｌ ｐｌａｔｅａｕ ｃａｒｔｉｌａｇｅ）から選択される、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の軟骨製品。
15. 軟骨製品が軟骨下骨層を欠いており、任意に軟骨製品が石灰化軟骨層を欠いている、請求項１４に記載の軟骨製品。
16. 軟骨が約３ｍｍ未満の厚さを有する、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の軟骨製品。
17. 軟骨が約０．５ｍｍ〜約２ｍｍまたは約１ｍｍ〜約１．５ｍｍの厚さを有する、請求項１６に記載の軟骨製品。
18. 孔が前記厚さの大部分にわたり延び、任意に孔が軟骨の厚さ全体にわたり延びる、請求項１６または１７に記載の軟骨製品。
19. 軟骨製品が凍結保存される、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の軟骨製品。
20. 軟骨製品が凍結／融解周期にかけられている、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の軟骨製品。
21. 軟骨製品が軟骨形成因子を含み、任意に、軟骨形成因子が、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−７、ｂＦＧＦ、ＩＧＦ−１のうちの１つ以上を含む、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の軟骨製品。
22. 軟骨製品が、
    ａ．少なくとも約１１ｐｇ／ｃｍ^２、任意に、約１１〜約６２８ｐｇ／ｃｍ^２の量のＴＧＦ−β１；
    ｂ．少なくとも約４ｐｇ／ｃｍ^２、任意に、約４〜約１１２ｐｇ／ｃｍ^２の量のＴＧＦ−β３；
    ｃ．少なくとも約３ｐｇ／ｃｍ^２、任意に、約３〜約２３ｐｇ／ｃｍ^２の量のＢＭＦ−７；
    ｄ．少なくとも約１６９ｐｇ／ｃｍ^２、任意に、約１６９〜約３６５ｐｇ／ｃｍ^２の量のｂＦＧＦ；および
    ｅ．少なくとも約１１１ｐｇ／ｃｍ^２、任意に、約１１１〜約７７９ｐｇ／ｃｍ^２の量のＩＧＦ−１
    のうちの１つ以上を含む、請求項２１に記載の軟骨製品。
23. 増殖培地中で培養される場合、軟骨製品が、
    ａ．少なくとも約２６１７ｐｇ／ｃｍ^２、任意に、約２６１７〜約１７８１８ｐｇ／ｃｍ^２の量のＴＧＦ−β１；
    ｂ．少なくとも約１３３ｐｇ／ｃｍ^２、任意に、約１３３〜約６２３ｐｇ／ｃｍ^２の量のＴＧＦ−β２；
    ｃ．少なくとも約１４ｐｇ／ｃｍ^２、任意に、約１４〜約２８４２ｐｇ／ｃｍ^２の量のＩＧＦ−１
    のうちの１つ以上を放出する、請求項２１に記載の軟骨製品。
24. 軟骨製品がＩＩ型コラーゲン、ヒアルロナン、およびアグリカンを含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の軟骨製品。
25. 軟骨製品が軟骨ディスクである、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の軟骨製品。
26. 軟骨ディスクの表面が円の形状である、請求項２５に記載の軟骨製品。
27. 軟骨ディスクが円筒の形状である、請求項２５に記載の軟骨製品。
28. 軟骨製品が凍結／融解周期にかけられており、かつ１μｇ／ｍｌの細菌ＬＰＳを含む培地中での２０〜２４時間インキュベーション後にＴＮＦ−αの実質量を産生しない、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の軟骨製品。
29. コラーゲンマトリックスが約５００細胞／ｍｍ^２、約６００細胞／ｍｍ^２、約７００細胞／ｍｍ^２、約８００細胞／ｍｍ^２、約１２００細胞／ｍｍ^２、および約１５００細胞／ｍｍ^２のうちの少なくともいずれかの量の生存可能な軟骨細胞を含み、任意に生存可能な軟骨細胞がコラーゲンマトリックスに対し天然である、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の軟骨製品。
30. コラーゲンマトリックスが表層、遷移層、および放射層から選択される１つ以上の層を含む、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の軟骨製品。
31. コラーゲンマトリックスが約１００細胞／ｍｍ^２および約２００細胞／ｍｍ^２のうちの少なくともいずれかを含む表層を含み、任意に生存可能な軟骨細胞がコラーゲンマトリックスに対し天然である、請求項３０に記載の軟骨製品。
32. コラーゲンマトリックスが約１００細胞／ｍｍ^２、約２００細胞／ｍｍ^２、および約４００細胞／ｍｍ^２のうちの少なくともいずれかを含む遷移層を含み、任意に生存可能な軟骨細胞がコラーゲンマトリックスに対し天然である、請求項３０に記載の軟骨製品。
33. コラーゲンマトリックスが約１００細胞／ｍｍ^２および約２００細胞／ｍｍ^２のうちの少なくともいずれかを含む放射層を含み、任意に生存可能な軟骨細胞がコラーゲンマトリックスに対し天然である、請求項３０に記載の軟骨製品。
34. コラーゲンマトリックスが柔軟であり、任意にコラーゲンマトリックスが破損することなく湾曲または折り畳むことのできるような柔軟性を有する、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の軟骨製品。
35. コラーゲンマトリックスが０．１ＭＰａ、０．２ＭＰａ、０．３ＭＰａ、および０．４ＭＰａのうちの少なくともおおよそいずれかのヤング率を有する、請求項３４に記載の軟骨製品。
36. 請求項１〜３５のいずれか１項に記載の軟骨製品を、その必要のある対象に投与することを含む処置方法。
37. 軟骨製品が関節鏡で投与される、請求項３６に記載の方法。
38. 投与することが軟骨製品を折り畳むまたは巻くことを含む、請求項３６に記載の方法。
39. 投与するステップが微細破壊（ｍｉｃｒｏｆｒａｃｔｕｒｅ）工程と併用して実施される、請求項３６に記載の方法。
40. 軟骨製品が凍結保存される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の軟骨製品。
41. 軟骨製品が凍結／融解周期にかけられている、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の軟骨製品。
42. 軟骨製品が軟骨形成因子を含み、任意に、軟骨形成因子がＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−７、ｂＦＧＦ、ＩＧＦ−１のうちの１つ以上を含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の軟骨製品。
43. 軟骨製品が、
    ａ．少なくとも約１１ｐｇ／ｃｍ^２、任意に、約１１〜約６２８ｐｇ／ｃｍ^２の量のＴＧＦβ−１；
    ｂ．少なくとも約４ｐｇ／ｃｍ^２、任意に、約４〜約１１２ｐｇ／ｃｍ^２の量のＴＧＦ−β３；
    ｃ．少なくとも約３ｐｇ／ｃｍ^２、任意に、約３〜約２３ｐｇ／ｃｍ^２の量のＢＭＰ−７；
    ｄ．少なくとも約１６９ｐｇ／ｃｍ^２、任意に、約１６９〜約３６５ｐｇ／ｃｍ^２の量のｂＦＧＦ；および
    ｅ．少なくとも約１１１ｐｇ／ｃｍ^２、任意に、約１１１〜７７９ｐｇ／ｃｍ^２の量のＩＧＦ−１
    のうちの１つ以上を含む、請求項４２に記載の軟骨製品。
44. 増殖培地中で培養される場合、軟骨製品が、
    ａ．少なくとも約２６１７ｐｇ／ｃｍ^２、任意に、約２６１７〜約１７８１８ｐｇ／ｃｍ^２の量のＴＧＦ−β１；
    ｂ．少なくとも約１３３ｐｇ／ｃｍ^２、任意に、約１３３〜約６２３ｐｇ／ｃｍ^２の量のＴＧＦ−β２；
    ｃ．少なくとも約１４ｐｇ／ｃｍ^２、任意に、約１４〜約２８４２ｐｇ／ｃｍ^２の量のＩＧＦ−１
    のうちの１つ以上を放出する、請求項４２に記載の軟骨製品。
45. 軟骨製品がＩＩ型コラーゲン、ヒアルロナン、およびアグリカンを含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の軟骨製品。
46. 軟骨製品が軟骨ディスクである、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の軟骨製品。
47. 軟骨ディスクの表面が円の形状である、請求項４６に記載の軟骨製品。
48. 軟骨ディスクが円筒の形状である、請求項４６に記載の軟骨製品。
49. 軟骨製品が凍結／融解周期にかけられており、かつ１μｇ／ｍｌの細菌ＬＰＳを含む培地中での２０〜２４時間インキュベーション後にＴＮＦ−αの実質量を産生しない、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の軟骨製品。
50. コラーゲンマトリックスが約５００細胞／ｍｍ^２、約６００細胞／ｍｍ^２、約７００細胞／ｍｍ^２、約８００細胞／ｍｍ^２、約１２００細胞／ｍｍ^２、約１５００細胞／ｍｍ^２、および約５０００細胞／ｍｍ^２のうちの少なくともいずれかの量の生存可能な軟骨細胞を含み、任意に生存可能な軟骨細胞がコラーゲンマトリックスに対し天然である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の軟骨製品。
51. コラーゲンマトリックスが表層、遷移層、および放射層から選択される１つ以上の層を含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の軟骨製品。
52. コラーゲンマトリックスが約１００細胞／ｍｍ^２および約２００細胞／ｍｍ^２のうちの少なくともいずれかを含む表層を含み、任意に生存可能な軟骨細胞がコラーゲンマトリックスに対し天然である、請求項５１に記載の軟骨製品。
53. コラーゲンマトリックスが約１００細胞／ｍｍ^２、約２００細胞／ｍｍ^２、および約４００細胞／ｍｍ^２のうちの少なくともいずれかを含む遷移層を含み、任意に生存可能な軟骨細胞がコラーゲンマトリックスに対し天然である、請求項５１に記載の軟骨製品。
54. コラーゲンマトリックス約１００細胞／ｍｍ^２および約２００細胞／ｍｍ^２のうちの少なくともいずれかを含む放射層を含み、任意に生存可能な軟骨細胞がコラーゲンマトリックスに対し天然である、請求項５１に記載の軟骨製品。
55. コラーゲンマトリックスが柔軟性があり、任意にコラーゲンマトリックスが破損することなく湾曲または折り畳むことができるような柔軟性を有する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の軟骨製品。
56. コラーゲンマトリックスが０．１ＭＰａ、０．２ＭＰａ、０．３ＭＰａ、および０．４ＭＰａのうち少なくともおおよそいずれかのヤング率を有する、請求項５５に記載の軟骨製品。
57. コラーゲンマトリックスが天然のコラーゲンマトリックスであり、任意に、コラーゲンマトリックスが霊長類またはヒトから得られる、請求項４０〜５６のいずれか１項に記載の軟骨製品。
58. 添加剤をさらに含む、請求項１〜５７のいずれか１項に記載の軟骨製品。
59. 請求項１〜１２のいずれか１項に記載の軟骨製品を、その必要のある対象に投与することを含む処置方法。
60. 軟骨製品が関節鏡で投与される、請求項５９に記載の方法。
61. 投与することが軟骨製品を折り畳むまたは巻くことを含む、請求項５９に記載の方法。
62. 投与するステップが微細破壊工程と併用して実施される、請求項５９に記載の方法。