KR20110106855A - 골 치유를 위한 조직 유래된 줄기 세포와 결합된 동종이식편 - Google Patents
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Abstract
골 기판과 중간엽 줄기 세포 (MSC)를 결합시키는 방법이 개시되어 있다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 원치 않는 세포와 함께 MSC를 갖는 조직을 수득하는 단계를 포함한다. MSC 및 원치 않는 세포를 갖는 세포 현탁액을 형성하기 위해 조직을 소화시킨다. 세포 현탁액을 기판에 첨가한다. MSC가 접착하도록 기판을 배양한다. 원치 않는 세포를 제거하기 위해 기판을 헹군다. 다양한 실시양태에서, 조직은 지방 조직, 근육 조직 또는 골수 조직이다. 한 실시양태에서, MSC가 기판에 접착하는 기간 동안 기판 상에 배치된 MSC를 배양하는 단계, 및 그 후 기판으로부터 원치 않는 세포를 제거하기 위해 기판을 헹구는 단계에 의해 제조된 골 기판과 MSC의 결합물을 포함하는 동종이식편 생성물이 개시되어 있다. 다른 실시양태가 또한 개시되어 있다.
Description
재생 의학은 치료하려는 순간에 용이하게 이용가능할 수 있는 인간 성인 줄기 세포의 풍부한 공급원을 필요로 한다.
다량으로 수득될 수 있는 지방-유래된 줄기 세포 (ASC)는 조직 공학 전략에서 골 형성의 유도를 위한 세포 치료요법으로서 사용되어 왔다.
동종이식편은 줄기 세포와 결합될 수 있다. 이는 동종이식편 기판의 시딩(seeding) 전에 상당량의 조직 가공 및 세포 가공을 필요로 한다.
살아있는 세포로 시딩된 동종이식편은 일반적으로 더 양호한 수술 결과를 제공한다.
<발명의 요약>
한 실시양태에서, 원치 않는 세포와 함께 중간엽 줄기 세포를 갖는 지방 조직을 수득하는 단계; 중간엽 줄기 세포 및 원치 않는 세포를 갖는 세포 현탁액을 형성하기 위해 지방 조직을 소화시키는 단계; 시딩된 골 기판을 형성하도록 골 기판을 시딩하기 위해 중간엽 줄기 세포를 갖는 세포 현탁액을 첨가하는 단계; 중간엽 줄기 세포가 골 기판에 접착하는 기간 동안 시딩된 골 기판 상에서 중간엽 줄기 세포를 배양하는 단계; 및 골 기판으로부터 원치 않는 세포를 제거하기 위해 골 기판을 헹구는 단계를 포함하는, 골 기판과 중간엽 줄기 세포를 결합시키는 방법이 제공된다.
또 다른 실시양태에서, 원치 않는 세포와 함께 중간엽 줄기 세포를 갖는 지방 조직을 수득하는 단계; 중간엽 줄기 세포 및 원치 않는 세포를 갖는 세포 현탁액을 형성하기 위해 지방 조직을 소화시키는 단계; 시딩된 골 기판을 형성하도록 골 기판을 시딩하기 위해 중간엽 줄기 세포를 갖는 세포 현탁액을 첨가하는 단계; 중간엽 줄기 세포가 골 기판에 접착하는 기간 동안 시딩된 골 기판 상에서 중간엽 줄기 세포를 배양하는 단계; 및 골 기판으로부터 원치 않는 세포를 제거하기 위해 골 기판을 헹구는 단계에 의해 제조된 결합물, 및 골 기판과 중간엽 줄기 세포의 결합물을 포함하는 동종이식편 생성물이 제공된다.
또 다른 실시양태에서, 원치 않는 세포와 함께 중간엽 줄기 세포를 갖는 지방 조직을 수득하는 단계; 콜라게나제 I 용액의 제조, 및 0.2 ㎛ 필터 단위를 통한 용액의 여과, 콜라게나제 I 용액과 지방 용액의 혼합, 및 콜라게나제 I 용액과 혼합된 지방 용액의 진탕기 플라스크로의 첨가; 시각상 평활한 외관을 갖는 지방 조직을 제공하기 위해 약 75 RPM에서 약 45분 내지 60분 동안 연속적 교반하에 진탕기를 위치시키는 것; 펠릿을 제공하기 위한 성숙 지방세포를 함유하는 상청액의 흡인을 포함하는, 간질 혈관 분획물을 획득하기 위해 중간엽 줄기 세포 및 원치 않는 세포를 갖는 세포 현탁액을 형성하기 위해 지방 조직을 소화시키는 단계; 시딩된 골 기판을 형성하도록 골 기판을 시딩하기 위해 중간엽 줄기 세포를 갖는 세포 현탁액을 첨가하는 단계; 중간엽 줄기 세포가 골 기판에 접착하는 기간 동안 시딩된 골 기판 상에서 중간엽 줄기 세포를 배양하는 단계; 및 골 기판으로부터 원치 않는 세포를 제거하기 위해 골 기판을 헹구는 단계를 포함하는, 골 기판과 중간엽 줄기 세포를 결합시키는 방법이 제공된다.
또 다른 실시양태에서, 원치 않는 세포와 함께 중간엽 줄기 세포를 갖는 지방 조직을 수득하는 단계; 콜라게나제 I 용액의 제조, 및 0.2 ㎛ 필터 단위를 통한 용액의 여과, 콜라게나제 I 용액과 지방 용액의 혼합, 및 콜라게나제 I 용액과 혼합된 지방 용액의 진탕기 플라스크로의 첨가; 시각상 평활한 외관을 갖는 지방 조직을 제공하기 위해 약 75 RPM에서 약 45분 내지 60분 동안 연속적 교반하에 진탕기를 위치시키는 것; 펠릿을 제공하기 위한 성숙 지방세포를 함유하는 상청액의 흡인을 포함하는, 간질 혈관 분획물을 획득하기 위해 중간엽 줄기 세포 및 원치 않는 세포를 갖는 세포 현탁액을 형성하기 위해 지방 조직을 소화시키는 단계; 시딩된 골 기판을 형성하도록 골 기판 상에 펠릿을 첨가함으로써 골 기판을 시딩하기 위해 중간엽 줄기 세포를 갖는 세포 현탁액을 첨가하는 단계; 중간엽 줄기 세포가 골 기판에 접착하는 기간 동안 시딩된 골 기판 상에서 중간엽 줄기 세포를 배양하는 단계; 및 골 기판으로부터 원치 않는 세포를 제거하기 위해 골 기판을 헹구는 단계에 의해 제조된 결합물, 및 골 기판과 중간엽 줄기 세포의 결합물을 포함하는 동종이식편 생성물이 제공된다.
한 실시양태에서, 원치 않는 세포와 함께 중간엽 줄기 세포를 갖는 조직을 수득하는 단계; 중간엽 줄기 세포 및 원치 않는 세포를 갖는 세포 현탁액을 형성하기 위해 조직을 소화시키는 단계; 시딩된 골 기판을 형성하도록 골 기판을 시딩하기 위해 중간엽 줄기 세포를 갖는 세포 현탁액을 첨가하는 단계; 중간엽 줄기 세포가 골 기판에 접착하는 기간 동안 시딩된 골 기판 상에서 중간엽 줄기 세포를 배양하는 단계; 및 골 기판으로부터 원치 않는 세포를 제거하기 위해 골 기판을 헹구는 단계를 포함하는, 골 기판과 중간엽 줄기 세포를 결합시키는 방법이 제공된다.
또 다른 실시양태에서, 원치 않는 세포와 함께 중간엽 줄기 세포를 갖는 조직을 수득하는 단계; 중간엽 줄기 세포 및 원치 않는 세포를 갖는 세포 현탁액을 형성하기 위해 조직을 소화시키는 단계; 시딩된 골 기판을 형성하도록 골 기판을 시딩하기 위해 중간엽 줄기 세포를 갖는 세포 현탁액을 첨가하는 단계; 중간엽 줄기 세포가 골 기판에 접착하는 기간 동안 시딩된 골 기판 상에서 중간엽 줄기 세포를 배양하는 단계; 및 골 기판으로부터 원치 않는 세포를 제거하기 위해 골 기판을 헹구는 단계에 의해 제조된 결합물, 및 골 기판과 중간엽 줄기 세포의 결합물을 포함하는 동종이식편 생성물이 제공된다.
또 다른 실시양태에서, 원치 않는 세포와 함께 중간엽 줄기 세포를 갖는 골수 조직을 수득하는 단계; 중간엽 줄기 세포 및 원치 않는 세포를 갖는 세포 현탁액을 형성하기 위해 골수 조직을 소화시키는 단계; 시딩된 골 기판을 형성하도록 골 기판을 시딩하기 위해 중간엽 줄기 세포를 갖는 세포 현탁액을 첨가하는 단계; 중간엽 줄기 세포가 골 기판에 접착하는 기간 동안 시딩된 골 기판 상에서 중간엽 줄기 세포를 배양하는 단계; 및 골 기판으로부터 원치 않는 세포를 제거하기 위해 골 기판을 헹구는 단계를 포함하는, 골 기판과 중간엽 줄기 세포를 결합시키는 방법이 제공된다.
또 다른 실시양태에서, 원치 않는 세포와 함께 중간엽 줄기 세포를 갖는 골수 조직을 수득하는 단계; 중간엽 줄기 세포 및 원치 않는 세포를 갖는 세포 현탁액을 형성하기 위해 골수 조직을 소화시키는 단계; 시딩된 골 기판을 형성하도록 골 기판을 시딩하기 위해 중간엽 줄기 세포를 갖는 세포 현탁액을 첨가하는 단계; 중간엽 줄기 세포가 골 기판에 접착하는 기간 동안 중간엽 줄기 세포 및 골 기판을 배양하는 단계; 및 골 기판으로부터 원치 않는 세포를 제거하기 위해 골 기판을 헹구는 단계에 의해 제조된 결합물, 및 골 기판과 중간엽 줄기 세포의 결합물을 포함하는 동종이식편 생성물이 제공된다.
한 실시양태에서, 원치 않는 세포와 함께 중간엽 줄기 세포를 갖는 근육 조직을 수득하는 단계; 중간엽 줄기 세포 및 원치 않는 세포를 갖는 세포 현탁액을 형성하기 위해 근육 조직을 소화시키는 단계; 시딩된 골 기판을 형성하도록 골 기판을 시딩하기 위해 중간엽 줄기 세포를 갖는 세포 현탁액을 첨가하는 단계; 중간엽 줄기 세포가 골 기판에 접착하는 기간 동안 시딩된 골 기판 상에서 중간엽 줄기 세포를 배양하는 단계; 및 골 기판으로부터 원치 않는 세포를 제거하기 위해 골 기판을 헹구는 단계를 포함하는, 골 기판과 중간엽 줄기 세포를 결합시키는 방법이 제공된다.
또 다른 실시양태에서, 원치 않는 세포와 함께 중간엽 줄기 세포를 갖는 근육 조직을 수득하는 단계; 중간엽 줄기 세포 및 원치 않는 세포를 갖는 세포 현탁액을 형성하기 위해 근육 조직을 소화시키는 단계; 시딩된 골 기판을 형성하도록 골 기판을 시딩하기 위해 중간엽 줄기 세포를 갖는 세포 현탁액을 첨가하는 단계; 중간엽 줄기 세포가 골 기판에 접착하는 기간 동안 시딩된 골 기판 상에서 중간엽 줄기 세포를 배양하는 단계; 및 골 기판으로부터 원치 않는 세포를 제거하기 위해 골 기판을 헹구는 단계에 의해 제조된 결합물, 및 골 기판과 중간엽 줄기 세포의 결합물을 포함하는 동종이식편 생성물이 제공된다.
다른 실시양태가 또한 개시되어 있다.
본 발명의 예시적인 실시양태가 도면에 예시되어 있으며, 도면에서:
도 1은 골 기판과 중간엽 줄기 세포의 결합의 순서도를 예시하고;
도 2는 원하는 줄기 세포 및 원치 않는 세포를 함유하는 간질 혈관 분획물의 펠릿의 선행 기술의 예를 예시하고;
도 3은 3-D 해면 매트릭스 구조를 갖고 및 중간엽 줄기 세포 (MSC)가 접착될 수 있는 스트립 (도 3a 및 3b) 및 맞춤못 (도 3c 및 3d)의 다양한 예를 예시하고;
도 4는 CCK-8 검정을 이용한 총 살아있는 ASC의 표준 곡선을 예시하고;
도 5는 골형성 배지에서 배양된 ASC에 의한 광물 침착을 예시하고;
도 6은 세포가 골 표면에 접착된 것을 나타낸 H&E 염색을 예시한다.
도 1은 골 기판과 중간엽 줄기 세포의 결합의 순서도를 예시하고;
도 2는 원하는 줄기 세포 및 원치 않는 세포를 함유하는 간질 혈관 분획물의 펠릿의 선행 기술의 예를 예시하고;
도 3은 3-D 해면 매트릭스 구조를 갖고 및 중간엽 줄기 세포 (MSC)가 접착될 수 있는 스트립 (도 3a 및 3b) 및 맞춤못 (도 3c 및 3d)의 다양한 예를 예시하고;
도 4는 CCK-8 검정을 이용한 총 살아있는 ASC의 표준 곡선을 예시하고;
도 5는 골형성 배지에서 배양된 ASC에 의한 광물 침착을 예시하고;
도 6은 세포가 골 표면에 접착된 것을 나타낸 H&E 염색을 예시한다.
<상세한 설명>
별도의 기재가 없는 경우, 인간 성인 줄기 세포는 일반적으로 중간엽 줄기 세포 또는 MSC라고 지칭된다. MSC는 2개 이상의 별개의 발달 경로에 따라 분화하는 능력을 갖는 만능성 세포이다. 지방-유래된 줄기 세포 또는 ASC는 지방 조직으로부터 유래된 줄기 세포이다. 간질 혈관 분획물 또는 SVF는 일반적으로 MSC를 함유하는 조직의 소화 후 수득된 원심분리된 세포 펠릿을 지칭한다. 한 실시양태에서, 펠릿은 다중 유형의 줄기 세포를 포함할 수 있다. 이들 줄기 세포는 예를 들어, 조혈 줄기 세포, 상피 선조 세포 및 중간엽 줄기 세포 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 중간엽 줄기 세포는 골 기판으로의 접착에 의해 다른 줄기 세포로부터 여과되나, 다른 줄기 세포 (즉, 원치 않는 세포)는 골 기판에 접착하지 않는다. 골 기판에 접착하지 않는 다른 세포는 또한 이들 원치 않는 세포에 포함될 수 있다.
지방 유래된 줄기 세포가 사체로부터 단리되고, 유동세포계측법을 이용하여 특징화될 수 있고, 3-계통 분화 (골형성, 연골형성 및 지방형성)가 시험관내에서 수행될 수 있다. 최종 생성물은 조직학을 이용하여 미세 구조에 대해 및 생화학 검정을 이용하여 세포 개수에 대해 특징화될 수 있다. 이러한 일관된 세포-기재 생성물은 골 재생에 유용할 수 있다.
조직 공학 및 재생 의학 접근법은 신체 조직을 재생할 큰 가망을 제공한다. 이식 전 스캐폴드 내 세포의 시딩 및 시험관내 배양을 기초로 하는, 가장 광범위하게 연구된 조직 공학 접근법은 세포 공급원 및 세포 증식 및 분화를 제어하는 능력이다. 많은 연구원들이 지방 조직-유래된 줄기 세포 (ASC)가 다중 분화 능력을 보유한다는 것을 입증하였다. 예를 들어, 하기 참고문헌들을 참조하며, 이들은 참고로 포함된다:
또한, 지방 조직은 아마 성인 줄기 세포의 가장 풍부하고 접근가능한 공급원일 것이다. 지방 조직 유래된 줄기 세포는 조직 재생에 대한 큰 잠재성을 갖는다. 그럼에도 불구하고, ASC 및 골수-유래된 줄기 세포 (BMSC)는 성장 및 형태학에 관해서 현저하게 유사하며, 이는 풍부한 소포체 및 세포질 부피에 비해 큰 핵을 갖는 섬유모세포 특징을 나타낸다. 예를 들어, 하기 참고문헌들을 참조하며, 이들은 참고로 포함된다:
ASC 및 BMSC의 다른 공통 특징은 전사 및 세포 표면 프로파일에서 발견될 수 있다. ASC를 사용한 골 조직 공학의 분야에서 여러 연구가 이미 수행되었다. 예를 들어, 하기 참고문헌들을 참조하며, 이들은 참고로 포함된다:
이들 연구는 지방 조직으로부터 수득된 줄기 세포가 대부분의 물질 표면에 대한 양호한 부착 특성 및 시험관내에서 및 생체내에서 골모세포-유사 세포로 분화하는 능력을 나타낸다는 것을 입증하였다. 최근에, ASC가 혈관화 과정을 자극할 수 있는 것으로 나타났다. 예를 들어, 하기 참고문헌들을 참조하며, 이들은 참고로 포함된다:
동종이계 물질로서 탈광물화된 골 기판은 구조 및 기능의 면에서 자가 골과의 밀접한 관계로 인해 유망한 골 조직-공학 스캐폴드이다. MSC와 결합시, 이들 스캐폴드는 매트릭스 단독과 비교하여 골 결손부 내에서 골 형성을 가속화하고 향상시키는 것으로 나타났다. 예를 들어, 하기 참고문헌들을 참조하며, 이들은 참고로 포함된다:
본원에 논의된 바와 같이, 인간 ASC 시딩된 골 기판은 조직학, 생화학 검정 및 유동세포계측법을 이용하여 미세구조, 세포 개수 및 세포 동일성의 면에서 특징화될 수 있다. 한 실시양태에서, 이들 기판은 탈광물화 공정으로 이전에 처리된 골 물질을 포함할 수 있다.
도 1은 줄기 세포 생성물로 동종이식편을 제조하는 과정의 순서도이다. 한 실시양태에서, 간질 혈관 분획물이 동종이식편을 시딩하는데 사용될 수 있다. 용어 "시딩"이 동종이식편 내에 또는 적어도 동종이식편에 부착하여 줄기 세포의 첨가 및 배치에 관한 것이라는 것이 본 개시물로부터 틀림없이 명백할 것이나, 특정 과정에 제한되지 않는다. 도 2는 원하는 줄기 세포를 함유하는 간질 혈관 분획물의 펠릿을 예시한다.
예시적 실시양태에서, 골 기판과 중간엽 줄기 세포를 결합시키는 방법이 제공된다. 상기 방법은 원치 않는 세포와 함께 중간엽 줄기 세포를 갖는 지방 조직을 수득하는 단계를 포함할 수 있다. 원치 않는 세포는 조혈 줄기 세포 및 다른 간질 세포를 포함할 수 있다. 상기 방법은 중간엽 줄기 세포 및 원치 않는 세포의 적어도 일부 또는 전체를 갖는 세포 현탁액을 형성하기 위해 지방 조직을 소화시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 이에 이어서, 중간엽 줄기 세포를 농축시키기 위해 원치 않는 세포 및 다른 구성요소의 일부를 마이너스로 고갈시키는 것이 따라올 수 있다.
다음, 상기 방법은 중간엽 줄기 세포를 갖는 세포 현탁액을 골 기판에 첨가하는 단계를 포함한다. 이에 이어서, 중간엽 줄기 세포가 골 기판에 접착하는 기간 동안 중간엽 줄기 세포 및 골 기판을 배양하는 단계가 따라올 수 있다. 원하는 생성물을 제공하기 위해, 상기 방법은 골 기판으로부터 원치 않는 세포를 제거하기 위해 골 기판을 헹구는 단계를 포함한다.
한 실시양태에서, 동종이식편 생성물은 상기 예시적 실시양태에 의해 제조된 것과 같은 골 기판과 중간엽 줄기 세포의 결합물을 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 지방 조직은 사체 공여자로부터 수득될 수 있다. 전형적인 공여자는 1백8십만개의 MSC를 함유하는 지방 2 리터를 제공한다. 한 실시양태에서, 골 기판은 지방 조직과 동일한 사체 공여자로부터 유래될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 지방 조직은 환자로부터 수득될 수 있다. 또한, 골 기판 및 지방 조직 둘 모두는 동일한 환자로부터 수득될 수 있다. 이는 장골의 일부 (예를 들어, 장골릉)의 제거가 환자로부터 외과적 시술에 의해 제거될 수 있고, 지방 세포가 지방흡입을 이용하여 제거될 수 있다는 것을 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 지방 조직, 다른 조직 및 골 기판의 다른 공급원 및 공급원들의 조합이 사용될 수 있다.
임의로, 지방 조직은 소화전 또는 소화 동안 세척될 수 있다. 세척은 75 RPM에서 37℃에서 10분 이상 동안 열 진탕기를 이용하는 것을 포함할 수 있다. 지방 조직의 세척은 지방 조직과 실질적으로 동등한 부피의 PBS로 세척하는 것을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 지방 조직의 세척은 약 37℃에서 1% 페니실린 및 스트렙토마이신을 갖는 PBS로 세척하는 것을 포함한다.
예를 들어, 지방 조직의 세척은 약 3분 내지 5분 동안 조직의 교반 및 상 분리를 포함할 수 있다. 이에 이어서, 하층 용액의 흡인 제거가 따라올 수 있다. 세척은 투명한 하층 용액이 수득될 때까지 지방 조직의 세척을 수회 반복하는 것을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 지방 조직의 세척은 지방 조직과 실질적으로 동등한 부피의 성장 배지에 의한 세척을 포함할 수 있다.
또 다른 예시적 실시양태에서, 골 기판과 중간엽 줄기 세포를 결합시키는 방법이 제공된다. 상기 방법은 원치 않는 세포와 함께 중간엽 줄기 세포를 갖는 골수 조직을 수득하는 단계를 포함할 수 있다. 원치 않는 세포는 조혈 줄기 세포 및 다른 간질 세포를 포함할 수 있다. 상기 방법은 중간엽 줄기 세포 및 원치 않는 세포를 갖는 세포 현탁액을 형성하기 위해 골수 조직을 소화시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 이에 이어서, 중간엽 줄기 세포를 농축시키기 위해 원치 않는 세포 및 다른 구성요소의 일부를 고갈시키고 MSC를 자연적으로 선택하는 것이 따라올 수 있다.
다음, 상기 방법은 중간엽 줄기 세포를 갖는 세포 현탁액을 골 기판에 첨가하는 단계를 포함한다. 이에 이어서, 중간엽 줄기 세포가 골 기판에 접착하는 기간 동안 중간엽 줄기 세포 및 골 기판을 배양하는 단계가 따라올 수 있다. 원하는 생성물을 제공하기 위해, 상기 방법은 골 기판으로부터 원치 않는 세포를 제거하기 위해 골 기판을 헹구는 단계를 포함한다.
한 실시양태에서, 동종이식편 생성물은 상기 예시적 실시양태에 의해 제조된 것과 같은 골 기판과 중간엽 줄기 세포의 결합물을 포함할 수 있다.
또 다른 예시적 실시양태에서, 골 기판과 중간엽 줄기 세포를 결합시키는 방법이 제공된다. 상기 방법은 원치 않는 세포와 함께 중간엽 줄기 세포를 갖는 근육 조직을 수득하는 단계를 포함할 수 있다. 원치 않는 세포는 조혈 줄기 세포 및 다른 간질 세포를 포함할 수 있다. 상기 방법은 중간엽 줄기 세포 및 원치 않는 세포를 갖는 세포 현탁액을 형성하기 위해 근육 조직을 소화시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 이에 이어서, 중간엽 줄기 세포를 농축시키기 위해 MSC를 자연적으로 선택하는 것이 따라올 수 있다.
다음, 상기 방법은 중간엽 줄기 세포를 갖는 세포 현탁액을 골 기판에 첨가하는 단계를 포함한다. 이에 이어서, 중간엽 줄기 세포가 골 기판에 접착하는 기간 동안 중간엽 줄기 세포 및 골 기판을 배양하는 단계가 따라올 수 있다. 원하는 생성물을 제공하기 위해, 상기 방법은 골 기판으로부터 원치 않는 세포를 제거하기 위해 골 기판을 헹구는 단계를 포함한다.
한 실시양태에서, 동종이식편 생성물은 상기 예시적 실시양태에 의해 제조된 것과 같은 골 기판과 중간엽 줄기 세포의 결합물을 포함할 수 있다.
또 다른 예시적 실시양태에서, 골 기판과 중간엽 줄기 세포를 결합시키는 방법이 제공된다. 상기 방법은 원치 않는 세포와 함께 중간엽 줄기 세포를 갖는 조직을 수득하는 단계를 포함할 수 있다. 원치 않는 세포는 조혈 줄기 세포 및 다른 간질 세포를 포함할 수 있다. 상기 방법은 중간엽 줄기 세포 및 원치 않는 세포의 적어도 일부를 갖는 세포 현탁액을 형성하기 위해 조직을 소화시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 이에 이어서, 중간엽 줄기 세포를 농축시키기 위해 원치 않는 세포 및 다른 구성요소의 일부를 마이너스로 고갈시키는 것이 따라올 수 있다.
다음, 상기 방법은 중간엽 줄기 세포를 갖는 세포 현탁액을 골 기판에 첨가하는 단계를 포함한다. 한 실시양태에서, 이러한 기판은 탈광물화 공정으로 처리된 골 물질을 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 이러한 기판은 비-골 물질일 수 있으며, 콜라겐 기재 물질이 포함될 수 있다 (그러나 이에 제한되지 않는다). 이에 이어서, 중간엽 줄기 세포가 골 기판에 접착하는 기간 동안 중간엽 줄기 세포 및 골 기판을 배양하는 단계가 따라올 수 있다. 원하는 생성물을 제공하기 위해, 상기 방법은 골 기판으로부터 원치 않는 세포를 제거하기 위해 골 기판을 헹구는 단계를 포함한다.
한 실시양태에서, 동종이식편 생성물은 상기 예시적 실시양태에 의해 제조된 것과 같은 골 기판과 중간엽 줄기 세포의 결합물을 포함할 수 있다.
세포 현탁액의 소화는 콜라게나제 I 용액의 제조, 및 0.2 ㎛ 필터 단위를 통한 용액의 여과, 콜라게나제 I 용액과 지방 조직의 혼합, 및 콜라게나제 I 용액과 혼합된 세포 현탁액의 진탕기 플라스크로의 첨가를 포함할 수 있다. 세포 현탁액의 소화는 시각상 평활한 외관을 갖는 지방 조직을 제공하기 위해 약 75 RPM에서 약 45분 내지 60분 동안 연속적 교반하에 진탕기를 위치시키는 것을 추가로 포함할 수 있다.
세포 현탁액의 소화는 간질 혈관 분획물이라고 지칭될 수 있는 펠릿을 제공하기 위한 성숙 지방세포를 함유하는 상청액의 흡인을 추가로 포함할 수 있다 (예를 들어, 도 2 참조). 시딩 전에, 골 기판을 가볍게 두드려 건조시키기 위해 랩 스폰지 또는 다른 메커니즘이 사용될 수 있다.
한 실시양태에서, 중간엽 줄기 세포를 갖는 세포 현탁액을 골 기판에 첨가하는 단계는 골 기판 상으로의 시딩을 위해 세포 펠릿을 사용하는 것을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 중간엽 줄기 세포를 갖는 세포 현탁액을 골 기판에 첨가하는 단계는 골 기판 상으로의 시딩을 위해 세포 펠릿을 사용하는 것을 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 중간엽 줄기 세포를 갖는 세포 현탁액을 골 기판에 첨가하는 단계는 피질골의 골 기판 상으로의 시딩을 위해 세포 펠릿을 사용하는 것을 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 중간엽 줄기 세포를 갖는 세포 현탁액을 골 기판에 첨가하는 단계는 해면골의 골 기판 상으로 세포 펠릿을 첨가하는 것을 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 중간엽 줄기 세포를 갖는 세포 현탁액을 골 기판에 첨가하는 단계는 분말골의 골 기판 상으로 세포 펠릿을 첨가하는 것을 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 중간엽 줄기 세포를 갖는 세포 현탁액을 골 기판에 첨가하는 단계는 피질골/해면골의 골 기판 상으로 세포 펠릿을 첨가하는 것을 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 중간엽 줄기 세포를 갖는 세포 현탁액을 골 기판에 첨가하는 단계는 탈광물화된 해면골의 골 기판 상으로 세포 펠릿을 첨가하는 것을 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 방법은 골 기판을 헹군 후 골 기판을 냉동보존 배지에 위치시키는 것을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 냉동보존 배지는 최종 생성물을 저장하기 위해 제공될 수 있다. 예를 들어, 방법은 최종 생성물을 저장하기 위해 골 기판을 헹군 후 골 기판을 동결된 상태로 유지시키는 것을 포함할 수 있다. 동결된 상태는 약 -80℃일 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 피콜(Ficoll) 밀도 용액이 사용될 수 있다. 예를 들어, 중간엽 줄기 세포의 농도를 마이너스로 고갈시키는 것은 일정 부피의 PBS 및 일정 부피의 피콜 밀도 용액을 지방 용액에 첨가하는 것을 포함할 수 있다. PBS의 부피는 5 ml일 수 있고, 피콜 밀도 용액의 부피는 25 ml일 수 있으며, 여기서 밀도는 1.073 g/ml이다. 중간엽 줄기 세포의 농도를 마이너스로 고갈시키는 것은 또한 지방 용액을 약 1160 g에서 약 30분 동안 약 실온에서 원심분리하는 것을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 방법은 브레이크를 사용하지 않고 지방 용액의 원심분리를 정지시키는 것을 포함할 수 있다.
중간엽 줄기 세포의 농도를 마이너스로 고갈시키는 것은 선택적이고, 다음에 유핵 세포를 함유하는 상부층 및 계면의 수집, 및 적혈구 및 세포 파편의 하부층의 폐기를 포함할 수 있다. 중간엽 줄기 세포의 농도를 마이너스로 고갈시키는 것은 또한 유핵 세포의 상부층의 양의 약 2배의 부피의 D-PBS의 첨가, 및 수집된 세포를 세척하기 위한 세포를 함유하는 용기의 반전을 포함할 수 있다. 중간엽 줄기 세포의 농도를 마이너스로 고갈시키는 것은 수집된 세포를 펠릿화하기 위해 수집된 세포를 원심분리하며 감속 동안 브레이크를 사용하는 것을 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 중간엽 줄기 세포의 농도를 마이너스로 고갈시키는 것은 수집된 세포를 약 900 g에서 약 5분 동안 약 실온에서 원심분리하는 것을 포함할 수 있다. 원치 않는 세포의 일부를 마이너스로 고갈시키는 것은 수집된 세포의 원심분리 후 상청액의 폐기, 및 성장 배지에서 수집된 세포의 재현탁을 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 중간엽 줄기 세포를 갖는 세포 현탁액을 골 기판에 첨가하는 단계는 골 기판 상으로 세포 펠릿을 첨가하는 것을 포함할 수 있다. 중간엽 줄기 세포를 갖는 용액을 골 기판에 첨가하는 단계는 탈광물화 공정으로 처리된 골 기판 상으로 세포 펠릿을 첨가하는 것을 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 중간엽 줄기 세포를 갖는 세포 현탁액을 골 기판에 첨가하는 단계는 피질골의 골 기판 상으로 세포 펠릿을 첨가하는 것을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 중간엽 줄기 세포를 갖는 세포 현탁액을 골 기판에 첨가하는 단계는 해면골의 골 기판 상으로 세포 펠릿을 첨가하는 것을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 중간엽 줄기 세포를 갖는 세포 현탁액을 골 기판에 첨가하는 단계는 분말골의 골 기판 상으로 세포 펠릿을 첨가하는 것을 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 중간엽 줄기 세포를 갖는 세포 현탁액을 골 기판에 첨가하는 단계는 피질골/해면골의 골 기판 상으로 세포 펠릿을 첨가하는 것을 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 중간엽 줄기 세포를 갖는 세포 현탁액을 골 기판에 첨가하는 단계는 탈광물화된 해면골의 골 기판 상으로 세포 펠릿을 첨가하는 것을 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 방법은 골 기판을 헹군 후 골 기판을 냉동보존 배지에 위치시키는 것을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 냉동보존 배지는 최종 생성물을 저장하기 위해 제공될 수 있다. 방법은 최종 생성물을 저장하기 위해 골 기판을 헹군 후 골 기판을 동결된 상태로 유지시키는 것을 포함할 수 있다. 동결된 상태는 약 -80℃일 수 있다.
시딩된 동종이식편을 중간엽 줄기 세포가 골 기판에 접착하는 기간 동안 배양한다. 원치 않는 세포를 헹구고 골 기판으로부터 제거한다. 배양 후, 골 기판을 가볍게 두드려 건조시키기 위해 랩 스폰지 또는 다른 메커니즘을 사용할 수 있다.
중간엽 줄기 세포는 고착 의존적이다. 중간엽 줄기 세포는 골 기판에 자연적으로 접착한다. 중간엽 줄기 세포는 비-면역원성이고, 골을 재생한다. 원치 않는 세포는 일반적으로 고착 독립적이다. 이는 원치 않는 세포가 일반적으로 골 기판에 접착하지 않는다는 것을 의미한다. 원치 않는 세포는 면역원성일 수 있고, 혈액 및 면역계 세포를 생성할 수 있다. 헹굼 동안 세포 정제를 위해, 중간엽 줄기 세포는 골에 접착하나, 원치 않는 세포, 예컨대 조혈 줄기 세포는 골 기판 상의 중간엽 줄기 세포의 실질적으로 균일한 집단을 떠나 헹궈 제거된다.
세포외 매트릭스를 광물화하고 골을 생성하는 능력은 MSC에서만 독특한 것이 아니다. 사실은, ASC는 유사한 조건 하에 골모세포로 분화하는 유사한 능력을 보유한다. 인간 ASC는 다른 세포 공급원과 대조적으로 독특한 장점을 제공한다. ASC의 다능성 특징, 뿐만 아니라 인간 신체 내 그의 풍부함은 이들 세포가 조직 공학 적용에서 바람직한 공급원이 되게 한다.
다양한 실시양태에서, 골 기판 (예를 들어, 피질 해면 맞춤못, 스트립, 큐브, 블록, 디스크 및 과립, 뿐만 아니라 맞춤못, 스트립, 큐브, 블록, 디스크 및 과립으로 형성된 다른 기판)은 매트릭스를 남기도록 혈액, 지질 및 다른 세포를 제거하기 위해 탈광물화 공정으로 처리될 수 있다. 도 3은 스트립 (도 3a 및 3b) 및 맞춤못 (도 3c 및 3d)의 다양한 예를 예시한다. 일반적으로, 이들 기판은 3-D 해면 매트릭스 구조를 가질 수 있으며, 여기에 MSC가 접착할 수 있다.
또한, 이러한 방법 및 결합 생성물은 조직의 관련 생물학적 특징을 변경시키지 않는 가공을 수반한다. 지방/줄기 세포의 가공은 항생제, 세포 배지, 콜라게나제의 사용을 수반할 수 있다. 이들 중 어떠한 것도 줄기 세포의 관련 생물학적 특징에 영향을 주지 않는다. 이들 중간엽 줄기 세포의 관련 생물학적 특징은 재생 및 복구에 집중된다. 줄기 세포의 가공은 계속 분화하고 복구하는 세포의 능력을 변경시키지 않는다.
자극 또는 환경 단서의 부재하에, 중간엽 줄기 세포 (MSC)는 분화되지 않은 채 남아있고, 조직, 예컨대 뼈, 연골, 지방 및 근육을 형성하는 그의 잠재성을 유지한다. 골유도 매트릭스에 부착시, MSC는 생체내에서 골모세포성 계통을 따라 분화하는 것으로 나타났다. 예를 들어, 하기 참고문헌들을 참조하며, 이들은 참고로 포함된다:
실시예 1
지방 회수
사체 공여자로부터 지방을 회수하였다. 지방흡입 기기를 이용하여 지방 흡인액을 수집하고 웨트 아이스(wet ice) 상에서 배송할 수 있었다.
세척
열 진탕기에서 RPM=75, 37℃에서 10분 동안 지방 조직을 가온하였다. 동등한 부피의 37℃의 예비가온된 포스페이트 완충된 염수 (PBS), 1% 페니실린/스트렙토마이신으로 지방을 세척하였다. 다음, 조직을 세척하기 위해 지방을 교반하였다. 약 3분 내지 5분 동안 상 분리를 수행하였다. 하층 용액을 흡인하였다. 투명한 하층 용액을 수득할 때까지 세척을 3회 내지 4회 반복하였다.
용액을 동등한 부피의 성장 배지 (DMEM/F12, 10% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신)에서 현탁하고 냉장고에서 약 4℃에서 저장하였다.
세포 현탁액의 소화 및 동종이식편과의 결합
간질 혈관 분획물 (SVF)을 획득하기 위해 지방의 소화를 수행한 다음, 동종이식편 상으로 용액을 결합시켰다.
소화는 1% 소 태아 혈청 (FBS) 및 0.1% 콜라게나제 I을 포함하는 콜라게나제 I 용액의 제조를 수반하였다. 용액을 0.2 ㎛ 필터 단위를 통해 여과하였다. 이러한 용액은 제조 1 시간 내에 사용해야 한다.
다음, 세척된 지방을 꺼내고 1:1 비율로 콜라게나제 I 용액과 혼합하였다. 혼합물을 진탕기 플라스크에 첨가하였다.
조직이 시각 점검상 평활한 것으로 보일 때까지 플라스크를 약 45분 내지 60분 동안 연속적 교반 (약 RPM=75)으로 37℃에서 배양 진탕기에 위치시켰다.
소화물을 원심분리 튜브로 옮기고, 5분 동안 약 300 내지 500 g에서 실온에서 원심분리하였다. 그 후, 성숙 지방세포를 함유하는 상청액을 흡인하였다. 펠릿을 간질 혈관 분획물 (SVF)로서 확인하였다.
성장 배지를 모든 튜브에 첨가한 후 (즉, 총 40 ml를 4개의 튜브에 첨가함) 완만하게 진탕하였다.
세포 혼합물 모두를 50 ml 원심분리 튜브로 옮겼다. 샘플 200 ㎕를 취하고, 50 ㎕는 초기 세포 계수를 위해, 나머지 150 ㎕는 유동세포계측법을 위해 사용하였다.
분취액 세포 혼합물을 2개의 원심분리 튜브 (각각 10 ml)로 측정하고, 약 300 g에서 5분 동안 원심분리하였다. 상청액을 흡인하였다.
동종이식편 상으로 시딩하기 위해 1개의 튜브로부터 수득한 세포 펠릿을 사용하였다. 동종이식편은 탈광물화 공정으로 처리된 피질/해면 또는 둘 모두를 포함할 수 있다.
특정 부피의 성장 배지를 세포 펠릿에 첨가하고, 펠릿을 파괴하기 위해 진탕하였다. 매우 작은 부피의 세포 현탁액을 동종이식편 상에 첨가하였다. 37℃에서 수시간 동안 CO2 인큐베이터에서 배양한 후, 성장 배지 (DMEM/F12, 항생제 함유 10% FBS)를 더 첨가하였다. 이는 정적 "시딩" 공정이었다. 특정 골 기판을 위해 동적 "시딩" 공정을 사용할 수 있었다. 세포 현탁액 10 ml 및 골 기판을 궤도 진탕기 상에 50 ml 원심분리 튜브에 위치시키고, 100 내지 300 rpm에서 6시간 동안 교반하였다.
수일 (약 1일 내지 3일) 후, 동종이식편을 꺼내고, PBS에서 완전히 헹구고, 원치 않는 세포를 제거하기 위해 초음파 처리하였다. 동종이식편을 냉동보존 배지 (10% DMSO, 90% 혈청)에 넣고, 동결된 상태로 -80℃에서 유지시켰다. 중간엽 줄기 세포와 결합된 동결된 동종이식편이 최종 생성물이었다.
실시예 2
지방 회수
사체 공여자로부터 지방을 회수하였다. 지방흡입 기기를 이용하여 지방 흡인액을 수집하고 웨트 아이스 상에서 배송할 수 있었다.
세척
열 진탕기에서 RPM=75, 37℃에서 10분 동안 지방 조직을 가공하였다. 동등한 부피의 37℃의 예비가온된 포스페이트 완충된 염수 (PBS), 1% 페니실린/스트렙토마이신으로 지방을 세척하였다. 다음, 조직을 세척하기 위해 지방을 교반하였다. 약 3분 내지 5분 동안 상 분리를 수행하였다. 상청액 용액을 흡인 제거하였다. 투명한 하층 용액을 수득할 때까지 세척을 3회 내지 4회 반복하였다.
피콜 농축된 줄기 세포의 획득 및 동종이식편 상으로의 결합
피콜 농축된 줄기 세포를 획득하고, 동종이식편 상으로 시딩하였다. PBS 5 ml를 세포를 갖는 50 ml 튜브에 위치시키고, 1.073 g/ml 피콜 밀도 용액 25 ml를 피펫으로 튜브의 바닥에 첨가하였다.
튜브를 1160 g에서 30분 동안 실온에서 원심분리로 처리하고, 브레이크 없이 정지시켰다. 유핵 세포를 함유하는 상부층 및 계면 대략 15 내지 17 ml를 피펫으로 수집하고, 새로운 50 ml 일회용 원심분리 튜브로 옮겼다. 하부층은 적혈구 및 세포 파편을 함유하였고, 이를 폐기하였다.
다음, 2 부피의 D-PBS를 첨가하였다. 튜브를 캡핑하고, 세포를 세척하기 위해 반전에 의해 완만하게 혼합하였다.
그 후, 희석된 세포를 갖는 튜브를 세포를 펠릿화하기 위해 900 g에서 5분 동안 실온에서 원심분리로 처리하였으며, 감속 동안 브레이크를 사용하였다.
상청액을 폐기하고, 세척된 세포를 성장 배지 10 ml에서 재현탁하였다. 성장 배지 10 ml를 튜브에 첨가하고, 이를 완만하게 진탕하였다. 샘플 1 ml를 취하고, 100 ㎕는 세포 계수를 위해, 나머지 900 ㎕는 유동세포계측법을 위해 사용하였다.
나머지 세포 혼합물을 약 300 g에서 약 5분 동안 원심분리하였다. 상청액을 흡인하였다.
세포 펠릿을 동종이식편 상으로 "시딩"을 위해 사용하였다. 동종이식편은 탈광물화된 골, 피질골/해면골 또는 둘 모두를 포함할 수 있었다. 매우 작은 부피의 배지를 세포 펠릿에 첨가하고 진탕하였다. 세포 혼합물 100 ㎕를 24-웰 배양 플레이트 내에 15 mm 디스크 상으로 첨가하였다.
동종이식편을 약 37℃에서 CO2 인큐베이터에서 배양한 후, 성장 배지 (DMEM/F12, 항생제 함유 10% FBS) 1 ml를 첨가하였다. 이는 정적 "시딩" 공정이었다. 특정 골 기판을 위해 동적 "시딩" 공정을 사용할 수 있었다.
수일 (약 1일 내지 3일) 후, 동종이식편을 꺼내고, 원치 않는 세포를 제거하기 위해 PBS에서 완전히 헹구었다. 동종이식편을 냉동보존 배지 (10% DMSO, 90% 혈청)에 넣고, 동결된 상태로 -80℃에서 유지시켰다. 줄기 세포와 결합된 동결된 동종이식편이 최종 생성물이었다.
실시예 3
골수 회수
사체 공여자로부터 지방을 회수하였다. 지방흡입 기기를 이용하여 지방 흡인액을 수집하고 웨트 아이스 상에서 배송할 수 있었다.
세척
50 ml 일회용 원심분리에서 6 내지 8 부피의 둘베코의 포스페이트 완충된 염수 (D-PBS)를 첨가하고 완만하게 반전시키고 튜브의 바닥에 세포를 펠릿화하기 위해 원심분리 (10분 동안 800 g)로 처리함으로써 골수 샘플을 세척하였다.
줄기 세포의 획득 및 동종이식편 상으로의 결합
상청액을 폐기하고, 모든 튜브로부터의 세포 펠릿을 성장 배지 (DMEM, 낮은 글루코스, 10% FBS 및 1% 펜/스트랩 함유) 1 내지 2 ml에서 재현탁하였다. 세포 혼합물을 동종이식편 상으로 시딩하였다. 37℃에서 CO2 인큐베이터에서 수시간 배양하였으며, 성장 배지를 더 첨가하였다. 수일 후, 동종이식편을 꺼내고, PBS에서 완전히 헹구고, 냉동보존 배지 (10% DMSO, 90% 혈청)에 넣고, 동결된 상태로 유지시켰다.
실시예 4
골격근 회수
사체 공여자로부터 골격근을 회수할 수 있었다.
세척
잘게 저민 골격근 (1 내지 3 mm 입방체)을 37℃에서 3시간 동안 α-MEM 중 3 mg/ml 콜라게나제 D 용액에서 소화시켰다. 용액을 100 um 나일론 메쉬로 여과하였다. 용액을 500 g에서 5분 동안 원심분리하였다.
줄기 세포의 획득 및 동종이식편 상으로의 결합
상청액을 폐기하고, 모든 튜브로부터의 세포 펠릿을 성장 배지 (DMEM, 낮은 글루코스, 10% FBS 및 1% 펜/스트랩 함유) 1 내지 2 ml에서 재현탁하였다. 세포 혼합물을 동종이식편 상으로 시딩하였다. 37℃에서 CO2 인큐베이터에서 수시간 배양하였으며, 성장 배지를 더 첨가하였다. 수일 후, 동종이식편을 꺼내고, PBS에서 완전히 헹구고, 냉동보존 배지 (10% DMSO, 90% 혈청)에 넣고, 동결된 상태로 유지시켰다.
실시예 5
지방 회수
사망 24시간 내에 사체 공여자로부터 지방을 회수하고 웨트 아이스 상에서 동등한 부피의 DMEM에서 배송하였다.
세척
지방을 PBS로 3회 세척하고, 37℃로 예비가온된 콜라게나제 유형 I로 보충된 PBS의 동등한 부피에서 현탁하였다. 조직을 45분 내지 60분 동안 연속적 교반하에 37℃에서 진탕 수조에 위치시키고, 5분 동안 실온에서 원심분리하였다. 성숙 지방세포를 함유하는 상청액을 흡인하였다. 펠릿을 SVF (간질 혈관 분획물)로서 확인하였다.
피질 해면골 회수
인간 피질 해면골을 동일한 공여자로부터의 장골릉으로부터 회수하였다. 샘플을 스트립 (20×50×5 mm)로 절단한 후, 3시간 동안 HCl로 탈광물화 공정으로 처리하고, pH가 중성이 될 때까지 PBS로 헹궜다.
세포 현탁액의 소화 및 동종이식편과의 결합
지방-유래된 줄기 세포 (ASC)를 이식편 상으로 첨가하고, 37℃에서 CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 그 후, 항생제 및 다른 파편을 제거하기 위해 동종이식편을 PBS에서 완전히 헹궜다. 결국에는, 이식편을 냉동보존 배지에 넣고, 동결된 상태로 -80℃에서 유지시켰다.
실시예 6
지방-유래된 줄기 세포 특징화
유동세포계측법 분석
유동세포계측법을 위해 하기 항체를 사용하였다. PE 항-CD73 (클론 AD2) 벡톤 딕킨슨(Becton Dickinson), PE 항-CD90 (클론 F15-42-1) AbD 세로테크(SeroTec), PE 항-CD105 (클론 SN6) AbD 세로테크, PE 항-섬유모세포/상피 세포 (클론 D7-FIB) AbD 세로테크, FITC 항-CD34 (클론 8G12) 벡톤 딕킨슨, FITC 항-CD45 (클론 2D1) 벡톤 딕킨슨 및 PE 항-CD271 (클론 ME20.4-1.H4) 밀테니 바이오테크(Miltenyi BioTec). 이소형 대조는 FITC 마우스 IgG1 카파 (클론 MOPC-21) 벡톤 딕킨슨, PE 마우스 IgG1 카파 (클론 MOPC-21) 벡톤 딕킨슨 및 PE 마우스 IgG2a 카파 (클론 G155-178) 벡톤 딕킨슨이었다.
세포의 작은 분취액을 프로피디움 요오다이드/세제 용액으로 염색하고, 형광 현미경 상에서 혈구계를 이용하여 형광 핵을 계수하였다. 이러한 총 세포 개수를 사용하여 염색 튜브 당 세포의 개수를 5.0 × 105개 초과의 세포로 조정하였다. 유동세포계측 세척 완충액 (2% FBS 및 0.1% NaN3으로 보충된 PBS)으로 세포를 세척하고, 지정된 항체로 염색하고, 획득 전에 다시 세척하였다. 15분 동안 실온 (15 내지 30℃)에서 염색하였다. 15-mW, 488-nm, 아르곤-이온 레이져 (비디 이뮤노사이토메트리 시스템스 (BD Immunocytometry Systems; 미국 캘리포니아주 산호세))가 장착된 FACScan 유동세포계측기 상에서 각 샘플에 대해 20,000개 이상의 세포를 획득하였다. 세포계측기 QC 및 셋업은 기구 기능성 및 직선성을 확인하기 위해 스페로테크 레인보우 (3 ㎛, 6 피크) 보정 비드 (스페로테크 인크.(SpheroTech Inc.))의 실행을 포함하였다. 유동세포계측 데이터를 수집하고, 셀퀘스트(CellQuest) 소프트웨어 (비디 이뮤노사이토메트리 시스템스)를 이용하여 분석하였다. 전방 (FSC) 및 측각 광 산란기 (SSC) 특징에 의해 작은 세포 및 큰 세포를 확인하였다. 형광색소 표지된 항체와 인큐베이션 없이 유동세포계측기 상에서 세포를 획득함으로써 자가형광을 검정하였다. 공급자의 추천사항에 따라 다양한 직접 표지된 항체로 표면 항원 발현을 결정하였다. 이소형-매칭된 음성 대조에 비해 세포의 20% 미만의 항체 염색을 음성으로 간주하였다 (이는 백혈병 림프종 시험을 위한 면역표현형검사 백혈구에 대한 실행 표준임). 벡톤 딕킨슨 비아-프로브(Via-Probe) (7-AAD)를 이용하여 작은 세포 및 큰 세포의 생존성을 결정하였다.
시험관내 3-계통 분화
골형성 - 간질 배지를 골형성 유도 배지 (스템프로(Stempro)® 골형성 분화 키트, 인비트로젠(Invitrogen))로 대체함으로써 골형성을 거치도록 일차 ASC의 전면성장 배양물을 유도하였다. 배양물에 3주 이하의 기간 동안 3일 내지 4일마다 신선한 골형성 유도 배지를 공급하였다. 그 후, 세포를 10% 중성 완충된 포르말린에서 고정시키고, DI 물로 헹궜다. 알리자린 레드 (시그마(Sigma))에 의한 인산칼슘에 대한 염색에 의해 골형성 분화를 결정하였다.
지방형성 - 간질 배지를 지방형성 유도 배지 (스템프로® 지방형성 분화 키트, 인비트로젠)로 대체함으로써 지방형성을 거치도록 일차 ASC의 전면성장 배양물을 유도하였다. 배양물에 2주 이하의 기간 동안 3일 내지 4일마다 신선한 지방형성 유도 배지를 공급하였다. 그 후, 세포를 10% 중성 완충된 포르말린에서 고정시키고, PBS로 헹궜다. 오일 레드 O (시그마)에 의한 지방 소구체에 대한 염색에 의해 지방형성 분화를 결정하였다.
연골형성 - 간질 배지를 연골형성 유도 배지 (스템프로® 연골형성 분화 키트, 인비트로젠)로 대체함으로써 연골형성을 거치도록 일차 ASC의 전면성장 배양물을 유도하였다. 배양물에 3주 이하의 기간 동안 3일 내지 4일마다 신선한 연골형성 유도 배지를 공급하였다. 그 후, 세포를 10% 중성 완충된 포르말린에서 고정시키고, PBS로 헹궜다. 알시안 블루 (시그마)에 의한 프로테오글리칸에 대한 염색에 의해 연골형성 분화를 결정하였다.
최종 생성물 특징화
세포 계수를 CCK-8 검정으로 수행할 수 있었다. 세포 계수 키트 8 (CCK-8, 도진도 몰레큘라 테크놀로지스(Dojindo Molecular Technologies), 미국 메릴랜드)은 세포 증식 검정에서 생존가능한 세포의 개수의 결정을 위한 민감성 비색 검정을 허용한다. 도 4와 관련하여, CCK-8 검정을 이용한 총 살아있는 ASC의 표준 곡선이 예시되어 있다. WST-8 [2-(2-메톡시-4-니트로페닐)-3-(4-니트로페닐)-5-(2,4-디술포페닐)-2H-테트라졸륨, 일나트륨 염]은 세포 내 데히드로게나제에 의해 환원되어 황색 생성물 (포르마잔)을 제공하며, 이는 조직 배양 배지에서 가용성이다. 세포 내 데히드로게나제의 활성에 의해 생성된 포르마잔 염료의 양은 살아있는 세포의 개수에 정비례한다. 동종이식편을 해동하고, PBS로 헹군 후, 가볍게 두드려 건조시켰다. 성장 배지 및 CCK-8 용액을 10:1의 비율로 동종이식편에 첨가하고, 37℃에서 2시간 동안 배양하고, 460 nm로 설정된 여기 및 650 nm로 설정된 방출로 플레이트 판독기에서 평가하였다. 결과는 오직 ASC에 기초한 표준 곡선 (도 1)으로부터 내삽하였다 (통과=3).
조직학
배양이 종결되었을 때, 구축물을 48시간 동안 10% 중성 완충된 포르말린 (시그마; 미국 미주리주 세인트 루이스)에서 고정시키고, 프로세서 (시타델(Citadel) 2000; 서모 샌돈(Thermo Shandon), 미국 펜실베니아주 피츠버그)에 밤새 두고, 파라핀에 봉입하였다. 섹션을 8 ㎛로 절단하고, 유리 슬라이드 상에 탑재하고, 헤마톡실린 및 에오신 (H&E)으로 염색하였다. 통상적인 광학 현미경법을 이용하여 매트릭스 및 세포 형태학에 대해 섹션을 분석하였다.
통계 분석
모든 정량적 데이터를 평균 ± 표준 편차로서 표시하였다. 통계 분석을 일원 분산 분석으로 수행하였다. p≤0.05의 값을 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
결과
최종 생성물 외관
도 3은 스트립, 맞춤못 및 디스크의 외관을 예시한다. 이들 실시양태에서, 모두는 피질 바닥 및 해면 상단을 갖는다. 다른 실시양태를 사용할 수 있다.
ASC 특징화
유동세포계측법 - SVF의 면역표현형
상당한 개수의 MSC가 존재하는가를 결정하기 위해 SVF를 CD105, CD90 및 CD73으로 염색하였다. 간질 혈관 분획물의 면역표현형은 공여자 사이에 일치하였다. 큰 세포 (평균 3%)는 하기 면역표현형 및 평균 백분율을 가졌다: D7-FIB+ (36%), CD105+ (43%), CD90+ (63%), CD73+ (28%) 및 CD34+ (62%). 작은 세포 (평균 97%)는 오직 작은 백분율의 시험되는 마커를 함유하므로, 이러한 방법으로 면역표현형검사될 수 없었다: D7-FIB (5%), CD105 (6%), CD90 (15%), CD73 (6%) 및 CD34 (10%). SVF는 상당한 집단의 CD34+ 세포 (큰 CD34+ 62% 및 작은 CD34+ 10%)를 함유하였다. CD45+ 세포 (큰 15% 및 작은 3%)의 불충분은 SVF가 상당한 개수의 WBC (CD45+: 낮은 FSC, 낮은 SSC) 또는 조혈 줄기 세포 (CD34+, 낮은 CD45+, 중간 FSC, 낮은 SSC)를 함유하지 않는다는 것을 제안하였다. 항-섬유모세포/상피 세포 (클론 D7-FIB) 항체는 MSC에 대한 양호한 마커인 것으로 보고되었다. 큰 세포는 D7-FIB+ 36%였고, 작은 세포는 D7-FIB+ 5%였다. CD271은 SVF 세포 상에 음성이어야 하고, 큰 세포는 CD271+ 10%였고, 작은 세포는 CD271+ 0%였다. SVF의 접착 후 (ASC, P1), 면역표현형은 큰 세포 및 작은 세포 둘 모두에 대해 더 균질하게 되었다. 큰 세포 (53%)는 하기 면역표현형 및 백분율을 가졌다: D7-FIB+ (93%), CD105+ (98%), CD90+ (96%) 및 CD73+ (99%). 작은 세포 (47%)는 하기 면역표현형 및 백분율을 가졌다: D7-FIB+ (77%), CD105+ (75%), CD90+ (58%) 및 CD73+ (83%). ASC는 CD34 마커 발현 (P3: 큰 4% 및 작은 1%) (P1: 큰 8% 및 작은 6%)을 손실하였고, CD45+ 세포는 낮은 상태로 남았다 (P3: 큰 2% 및 작은 2%) (P1: 큰 3% 및 작은 1%). 이는 소수의 WBC (CD45+, 낮은 FSC, 낮은 SSC) 또는 조혈 줄기 세포 (CD34+, 낮은 CD45+, 중간 FSC, 낮은 SSC)가 존재한다는 것을 제안하였다. 접착성 및 배양된 세포에 대한 항-섬유모세포/상피 세포 (클론 D7-FIB) 항체는 증가된 발현을 나타내었다. 큰 세포는 D7-FIB+ 93%였고, 작은 세포는 D7-FIB+ 77%였다. CD271은 SVF의 접착 및 배양 후 양성으로 되어야 한다. P3의 경우, 큰 세포는 CD271+ 4%였고, 작은 세포는 CD271+ 1%였다. P1의 경우, 큰 세포는 CD271+ 27%였고, 작은 세포는 CD271+ 3%였다. CD271은 배양된 MSC에 대한 유용한 마커인 것으로 보이지 않았으나, 더 많은 데이터가 필요하였다.
MSC의 추정 평균 총 백분율
MSC의 평균 총 백분율을 추정하기 위해 CD105를 선택하였으나; 혼합 집단에서 MSC를 분별할 수 있는 단일 표면 마커가 없었다. 평균 3% 큰 세포, 평균 43% CD105+ 세포를 갖는 SVF의 경우, 평균 총 백분율은 1.3%였다. 평균 98% 작은 세포, 평균 6% CD105+ 세포를 갖는 SVF의 경우, 평균 총 백분율은 5.9%였다. 큰 세포 및 작은 세포의 총 조합은 SVF에 대해 평균 총 7.2% MSC를 제공하였다.
시험관내 3-계통 분화
도 5는 골 형성의 초기 단계를 나타내는 골형성 배지 (A)에서 배양된 ASC에 의한 광물 침착을 예시한다. 샘플을 알리자린 레드 S로 염색하였다. 음성 대조 (D)는 골 형성의 징후를 나타내지 않았다. 지방형성 배지 (B)에서 배양된 ASC에서 관찰된 지방 소구체는 지방세포로의 분화를 나타내었다. 샘플을 오일 레드 O로 염색하였다. 사진 E는 음성 대조이다. 연골형성 배지 (C)에서 배양된 ASC에 의해 생성된 프로테오글리칸은 연골형성의 초기 단계를 나타내었다. 샘플을 알시안 블루로 염색하였다. 음성 대조 (F)는 연골형성의 징후를 나타내지 않았다.
골형성 분화에 대해, 배양 제2주 동안 형태학적 변화가 보였다. 21-일 유도 기간의 끝에, 일부 칼슘 결정이 명백하게 눈에 보였다. 세포 분화를 알리자린 레드 염색에 의해 확인하였다 (도 3a).
전면성장 ASC의 유도에 의해 지방형성 잠재성을 검정하였다. 유도 사이클 (7일 내지 14일)의 끝에, 일관된 세포 공포형성이 유도된 세포에서 명백하였다. 공포는 오일 레드 O 염색에 의해 지방산에 대해 밝게 염색되었다 (도 3b). 전면성장 ASC의 유도에 의해 연골형성 잠재성을 검정하였다. 유도 사이클 (14일 내지 21일)의 끝에, 유도된 세포는 비-유도된 대조 세포와 명백하게 상이하였다. 알시안 블루 염색에 의해 세포 분화를 확인하였다 (도 3c).
최종 생성물 특징화
세포 계수: CCK-8 검정
8명의 공여자로부터 28개의 이식편을 시험하였으며, 평균 50,000개 살아있는 세포/이식편을 가졌다.
조직학
기본 기판 (해면골 매트릭스)과 관련하여 세포 형태학을 나타내기 위해 H&E를 수행하였다. 줄기 세포를 신장시키고, 해면골의 표면에 접착하였다. 도 6은 H&E 염색의 예시이며, 이는 줄기 세포가 골 표면에 접착하였다는 것을 나타내었다.
결론
시험관내에서 및 생체내에서 ASC의 골형성을 향상시키는 DBM의 능력은 MSC를 골모세포로 유도할 수 있는 이들 매트릭스 혼입된 골유도 인자와 골선조의 상호작용으로 인한 것이라고 여겨진다. 결과적으로, 골형성 세포 공급원의 DBM으로의 혼입은 결손부 부위 내 토착 골선조의 이동 및 증식에 대한 필요성을 잠재적으로 제한할 수 있으며, 이는 골 형성 및 골통합의 증가된 속도를 허용한다. 예를 들어, 하기 참고문헌들을 참조하며, 이들은 참고로 포함된다:
많은 연구는 정제된 배양-증식된 인간 MSC가 절정에 달하는 시험관내에서 골형성 계통으로 지정될 수 있으며 결국 광물화된 매트릭스 제조에 이르게 한다. 예를 들어, 하기 참고문헌들을 참조하며, 이들은 참고로 포함된다:
세포외 매트릭스를 광물화하고 골을 생성하는 능력은 MSC에서만 독특한 것이 아니다. 사실은, ASC는 유사한 조건 하에 골모세포로 분화하는 유사한 능력을 보유한다. 인간 ASC는 다른 세포 공급원과 대조적으로 독특한 장점을 제공한다. ASC의 다능성 특징, 뿐만 아니라 인간 신체 내 그의 풍부함은 이들 세포가 조직 공학 적용에서 바람직한 공급원이 되게 한다. 이러한 일관된 세포-기재 새로운 생성물은 골 재생에 효과적인 잠재성을 갖는다.
Claims (63)
- 원치 않는 세포와 함께 중간엽 줄기 세포를 갖는 지방 조직을 수득하는 단계;
중간엽 줄기 세포 및 원치 않는 세포를 갖는 세포 현탁액을 형성하기 위해 지방 조직을 소화시키는 단계;
시딩(seeding)된 골 기판을 형성하도록 골 기판을 시딩하기 위해 중간엽 줄기 세포를 갖는 세포 현탁액을 첨가하는 단계;
중간엽 줄기 세포가 골 기판에 접착하는 기간 동안 시딩된 골 기판 상에서 중간엽 줄기 세포를 배양하는 단계; 및
골 기판으로부터 원치 않는 세포를 제거하기 위해 골 기판을 헹구는 단계
를 포함하는, 골 기판과 중간엽 줄기 세포를 결합시키는 방법. - 제1항에 있어서, 지방 조직의 수득이 사체 공여자로부터의 회수를 포함하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 골 기판이 사체 공여자로부터 유래되고, 지방 조직의 수득이 골 기판과 동일한 사체 공여자로부터의 회수를 포함하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 지방 조직의 수득이 환자로부터의 회수를 포함하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 골 기판이 사체 공여자로부터 유래되고, 지방 조직의 수득이 골 기판과 동일한 환자로부터의 회수를 포함하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 지방 조직의 소화가 콜라게나제 I 용액의 제조, 및 0.2 ㎛ 필터 단위를 통한 용액의 여과, 콜라게나제 I 용액과 지방의 혼합, 및 콜라게나제 I 용액과 지방의 진탕기 플라스크로의 첨가를 포함하는 것인 방법.
- 제6항에 있어서, 지방의 소화가 시각상 평활한 외관을 갖는 지방 조직을 제공하기 위해 약 75 RPM에서 약 45분 내지 60분 동안 연속적 교반하에 진탕기를 위치시키는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 지방의 소화가 펠릿을 제공하기 위한 성숙 지방세포를 함유하는 상청액의 흡인을 추가로 포함하는 것인 방법.
- 제8항에 있어서, 중간엽 줄기 세포를 갖는 현탁액의 골 기판으로의 첨가가 세포 현탁액의 골 기판 상으로의 첨가를 포함하는 것인 방법.
- 제9항에 있어서, 중간엽 줄기 세포를 갖는 현탁액의 골 기판으로의 첨가가 탈광물화 공정으로 이전에 처리된 골 기판 상으로의 세포 현탁액의 첨가를 포함하는 것인 방법.
- 제9항에 있어서, 중간엽 줄기 세포를 갖는 현탁액의 골 기판으로의 첨가가 세포 현탁액의 피질골 상으로의 첨가를 포함하는 것인 방법.
- 제9항에 있어서, 중간엽 줄기 세포를 갖는 현탁액의 골 기판으로의 첨가가 세포 현탁액의 해면골 상으로의 첨가를 포함하는 것인 방법.
- 제9항에 있어서, 중간엽 줄기 세포를 갖는 현탁액의 골 기판으로의 첨가가 세포 현탁액의 분말골 상으로의 첨가를 포함하는 것인 방법.
- 제9항에 있어서, 중간엽 줄기 세포를 갖는 현탁액의 골 기판으로의 첨가가 세포 현탁액의 피질골/해면골 상으로의 첨가를 포함하는 것인 방법.
- 제9항에 있어서, 중간엽 줄기 세포를 갖는 현탁액의 골 기판으로의 첨가가 세포 현탁액의 탈광물화된 해면골 상으로의 첨가를 포함하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 최종 생성물을 저장하기 위해 골 기판을 헹군 후 골 기판을 냉동보존 배지에 위치시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
- 제1항에 있어서, 골 기판을 헹군 후 골 기판을 동결된 상태로 유지시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
- 제17항에 있어서, 동결된 상태가 약 -80℃인 방법.
- 제1항에 있어서, 골 기판이 탈광물화 공정으로 이전에 처리된 골 기판을 포함하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 골 기판이 피질골을 포함하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 골 기판이 해면골을 포함하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 골 기판이 분말골을 포함하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 골 기판이 피질골/해면골을 포함하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 골 기판이 탈광물화된 해면골을 포함하는 것인 방법.
- 골 기판과 중간엽 줄기 세포의 결합물 및 제1항의 방법에 의해 제조된 결합물을 포함하는 동종이식편 생성물.
- 원치 않는 세포와 함께 중간엽 줄기 세포를 갖는 지방 조직을 수득하는 단계;
콜라게나제 I 용액의 제조, 및 0.2 ㎛ 필터 단위를 통한 용액의 여과, 콜라게나제 I 용액과 지방 용액의 혼합, 및 콜라게나제 I 용액과 혼합된 지방 용액의 진탕기 플라스크로의 첨가;
시각상 평활한 외관을 갖는 지방 조직을 제공하기 위해 약 75 RPM에서 약 45분 내지 60분 동안 연속적 교반하에 진탕기를 위치시키는 것;
펠릿을 제공하기 위한 성숙 지방세포를 함유하는 상청액의 흡인
을 포함하는, 간질 혈관 분획물을 획득하기 위해 중간엽 줄기 세포 및 원치 않는 세포를 갖는 세포 현탁액을 형성하기 위해 지방 조직을 소화시키는 단계;
시딩된 골 기판을 형성하도록 골 기판을 시딩하기 위해 세포 현탁액을 첨가함으로써 골 기판을 시딩하기 위해 중간엽 줄기 세포를 갖는 세포 현탁액을 첨가하는 단계;
중간엽 줄기 세포가 골 기판에 접착하는 기간 동안 시딩된 골 기판 상에서 중간엽 줄기 세포를 배양하는 단계; 및
골 기판으로부터 원치 않는 세포를 제거하기 위해 골 기판을 헹구는 단계
를 포함하는, 골 기판과 중간엽 줄기 세포를 결합시키는 방법. - 골 기판과 중간엽 줄기 세포의 결합물 및 제26항의 방법에 의해 제조된 결합물을 포함하는 동종이식편 생성물.
- 원치 않는 세포와 함께 중간엽 줄기 세포를 갖는 조직을 수득하는 단계;
중간엽 줄기 세포 및 원치 않는 세포를 갖는 세포 현탁액을 형성하기 위해 조직을 소화시키는 단계;
시딩된 골 기판을 형성하도록 골 기판을 시딩하기 위해 중간엽 줄기 세포를 갖는 세포 현탁액을 첨가하는 단계;
중간엽 줄기 세포가 골 기판에 접착하는 기간 동안 시딩된 골 기판 상에서 중간엽 줄기 세포를 배양하는 단계; 및
골 기판으로부터 원치 않는 세포를 제거하기 위해 골 기판을 헹구는 단계
를 포함하는, 골 기판과 중간엽 줄기 세포를 결합시키는 방법. - 제28항에 있어서, 조직의 수득이 사체 공여자로부터의 회수를 포함하는 것인 방법.
- 제28항에 있어서, 골 기판이 사체 공여자로부터 유래되고, 조직의 수득이 골 기판과 동일한 사체 공여자로부터의 회수를 포함하는 것인 방법.
- 제28항에 있어서, 조직의 수득이 환자로부터의 회수를 포함하는 것인 방법.
- 제28항에 있어서, 골 기판이 사체 공여자로부터 유래되고, 조직의 수득이 골 기판과 동일한 환자로부터의 회수를 포함하는 것인 방법.
- 제28항에 있어서, 골 기판이 탈광물화 공정으로 이전에 처리된 골 기판을 포함하는 것인 방법.
- 제28항에 있어서, 골 기판이 피질골을 포함하는 것인 방법.
- 제28항에 있어서, 골 기판이 해면골을 포함하는 것인 방법.
- 제28항에 있어서, 골 기판이 분말골을 포함하는 것인 방법.
- 제28항에 있어서, 골 기판이 피질골/해면골을 포함하는 것인 방법.
- 제28항에 있어서, 골 기판이 탈광물화된 해면골을 포함하는 것인 방법.
- 골 기판과 중간엽 줄기 세포의 결합물 및 제28항의 방법에 의해 제조된 결합물을 포함하는 동종이식편 생성물.
- 원치 않는 세포와 함께 중간엽 줄기 세포를 갖는 골수 조직을 수득하는 단계;
중간엽 줄기 세포 및 원치 않는 세포를 갖는 세포 현탁액을 형성하기 위해 골수 조직을 소화시키는 단계;
시딩된 골 기판을 형성하도록 골 기판을 시딩하기 위해 중간엽 줄기 세포를 갖는 세포 현탁액을 첨가하는 단계;
중간엽 줄기 세포가 골 기판에 접착하는 기간 동안 시딩된 골 기판 상에서 중간엽 줄기 세포를 배양하는 단계; 및
골 기판으로부터 원치 않는 세포를 제거하기 위해 골 기판을 헹구는 단계
를 포함하는, 골 기판과 중간엽 줄기 세포를 결합시키는 방법. - 제40항에 있어서, 골수 조직의 수득이 사체 공여자로부터의 회수를 포함하는 것인 방법.
- 제40항에 있어서, 골 기판이 사체 공여자로부터 유래되고, 골수 조직의 수득이 골 기판과 동일한 사체 공여자로부터의 회수를 포함하는 것인 방법.
- 제40항에 있어서, 골수 조직의 수득이 환자로부터의 회수를 포함하는 것인 방법.
- 제40항에 있어서, 골 기판이 사체 공여자로부터 유래되고, 골수 조직의 수득이 골 기판과 동일한 환자로부터의 회수를 포함하는 것인 방법.
- 제40항에 있어서, 골 기판이 탈광물화 공정으로 이전에 처리된 골 기판을 포함하는 것인 방법.
- 제40항에 있어서, 골 기판이 피질골을 포함하는 것인 방법.
- 제40항에 있어서, 골 기판이 해면골을 포함하는 것인 방법.
- 제40항에 있어서, 골 기판이 분말골을 포함하는 것인 방법.
- 제40항에 있어서, 골 기판이 피질골/해면골을 포함하는 것인 방법.
- 제40항에 있어서, 골 기판이 탈광물화된 해면골을 포함하는 것인 방법.
- 골 기판과 중간엽 줄기 세포의 결합물 및 제40항의 방법에 의해 제조된 결합물을 포함하는 동종이식편 생성물.
- 원치 않는 세포와 함께 중간엽 줄기 세포를 갖는 근육 조직을 수득하는 단계;
중간엽 줄기 세포 및 원치 않는 세포를 갖는 세포 현탁액을 형성하기 위해 근육 조직을 소화시키는 단계;
시딩된 골 기판을 형성하도록 골 기판을 시딩하기 위해 중간엽 줄기 세포를 갖는 세포 현탁액을 첨가하는 단계;
중간엽 줄기 세포가 골 기판에 접착하는 기간 동안 시딩된 골 기판 상에서 중간엽 줄기 세포를 배양하는 단계; 및
골 기판으로부터 원치 않는 세포를 제거하기 위해 골 기판을 헹구는 단계
를 포함하는, 골 기판과 중간엽 줄기 세포를 결합시키는 방법. - 제52항에 있어서, 근육 조직의 수득이 사체 공여자로부터의 회수를 포함하는 것인 방법.
- 제52항에 있어서, 골 기판이 사체 공여자로부터 유래되고, 근육 조직의 수득이 골 기판과 동일한 사체 공여자로부터의 회수를 포함하는 것인 방법.
- 제52항에 있어서, 근육 조직의 수득이 환자로부터의 회수를 포함하는 것인 방법.
- 제52항에 있어서, 골 기판이 사체 공여자로부터 유래되고, 근육 조직의 수득이 골 기판과 동일한 환자로부터의 회수를 포함하는 것인 방법.
- 제52항에 있어서, 골 기판이 탈광물화된 골을 포함하는 것인 방법.
- 제52항에 있어서, 골 기판이 피질골을 포함하는 것인 방법.
- 제52항에 있어서, 골 기판이 해면골을 포함하는 것인 방법.
- 제52항에 있어서, 골 기판이 분말골을 포함하는 것인 방법.
- 제52항에 있어서, 골 기판이 피질골/해면골을 포함하는 것인 방법.
- 제52항에 있어서, 골 기판이 탈광물화된 해면골을 포함하는 것인 방법.
- 골 기판과 중간엽 줄기 세포의 결합물 및 제52항의 방법에 의해 제조된 결합물을 포함하는 동종이식편 생성물.
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