CN106390200A - 组分特性增强的处理的ecm材料 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及组分特性增强的处理的ECM材料。描述的是具有改善的性质的医学移植材料和装置，该改善的性质涉及它们的组分特性。

Description

组分特性增强的处理的ECM材料
本申请是申请号为200780046919.2母案的分案申请。该母案的申请日为2007年10月23日；发明名称为“组分特性增强的处理的ECM材料”。
技术领域
相关申请参考
本申请要求2006年10月23日提交的标题为″组分特性增强的处理的ECM材料″的美国临时专利申请序号60/853,584的权益。该临时专利申请因此通过引用而整体结合到本文中。
本发明一般涉及医学移植材料，尤其是涉及得自组织材料的医学移植材料。
背景技术
已经提出用于医学移植、细胞培养和其它相关应用的各种处理的细胞外基质(ECM)材料。例如，已经提出包含得自小肠、胃或膀胱组织的粘膜下层的医学移植物和细胞培养材料。见，例如美国专利号4,902,508、4,956,178、5,281,422、5,554,389、6,099,567和6,206,931。此外，Cook Biotech Incorporated，West Lafayette，Indiana目前制备基于小肠粘膜下层的各种医学产品，其商标为和
例如在美国专利号6,379,710中，也已经提出得自肝基底膜的医学材料。以及已经提出用于医学和/或细胞培养应用的得自羊膜的ECM材料(见例如美国专利号4,361,552和6,576,618)和得自肾被膜的ECM材料(见2003年1月9日公布的国际PCT专利申请号WO 03/002165)。
已经尝试提供保留除胶原外的医学重要性物质的处理的ECM材料。然而，为了制备其中不希望有的组分已被除去的处理的ECM，材料典型地经过一组操作，该操作可以对包含在材料中的期望的组分具有不期望的后果。例如，已经显示除胶原之外，粘膜下层和其它ECM材料包括可以有助于材料生物活性及其在医学移植和其它用途中价值的各种期望的组分。例如，ECM材料可以包括当保留在处理的ECM中时可有益的生长因子、细胞粘连蛋白和蛋白聚糖。然而，难以在制备医学上可接受的移植物中有选择地保留这些组分，同时除去高水平的不希望有的组分。
生物材料需要保留不仅具有必需的物理性质和高水平的生物相容性和无菌性，而且具有期望的水平的有益组分。也需要用于制备和使用这些材料的方法，以及从这些材料形成的医疗装置。本发明解决了这些需要。
发明内容
在一个方面，本发明提供包括处理的细胞外基质(ECM)材料的医学移植材料。ECM材料保留胶原和非胶原组分，并期望显示血管源性特征。同时，ECM材料具有低水平的不希望有的组分例如天然脂质、核酸(例如DNA)和/或免疫球蛋白A(IgA)组分。在优选的实施方案中，ECM材料包括粘膜下层。
在一个实施方案中，本发明提供包括无菌、去细胞化细胞外基质(ECM)材料的医学移植材料。ECM材料包括不大于20μg/g水平的天然成纤维细胞生长因子-2(FGF-2)和天然免疫球蛋白A(IgA)。在一些形式中，材料可以具有不大于约4％的脂质含量。在优选的实施方案中，分离的ECM材料包括粘膜下层并具有不大于5μg/g水平的天然IgA和不大于约3％的天然脂质含量。
在还另一方面，本发明提供包括无菌、去细胞化细胞外基质(ECM)材料的医学移植材料。ECM材料具有至少约10ng/g的天然FGF-2含量和至少一种且各自为一定形式的以下物质：(i)不大于约20μg/g水平的天然IgA；(ii)不大于约4％重量水平的天然脂质；(iii)至少约50μg/g水平的天然透明质酸；和(iv)至少约500μg/g水平的天然硫酸酯化糖胺聚糖。在某些优选的实施方案中，ECM材料包括粘膜下层。在另外的形式中，ECM材料具有不大于约5μg/g水平的天然IgA和不大于约3％重量的天然脂质含量。
本发明还提供治疗患者的方法。该方法包括将本发明的医学移植材料移植至患者。
本发明还提供用于制备医学移植材料的方法。该方法包括提供起始细胞外基质(ECM)材料。该起始ECM材料被处理以减少材料的脂质、核酸和/或IgA和/或其它免疫球蛋白含量，同时材料保留显著水平的生长因子、蛋白聚糖和/或糖胺聚糖。在某些实施方案中，该方法包括用稀释的离子清洁剂溶液处理起始ECM材料，以破裂细胞和核膜，并用碱性溶液处理起始ECM材料，以溶解和除去DNA和其它核酸物质。该方法可以另外包括用有机溶剂处理ECM材料，以从材料中除去脂质，和/或用氧化性消毒剂溶液，例如含过氧化物的消毒剂溶液处理ECM材料，以将材料消毒。优选冲洗ECM材料，以除去这些溶液留下的残留物。
本发明的医学移植材料可以以各种形式提供。例如，医学移植材料可以一种或多种片、糊、海绵、非胶凝水溶液、粉末或凝胶提供。也考虑这些形式的组合。
各种形式的医学移植材料可以用于各种医学(包括兽医)应用。实例包括组织，例如以下组织的修复或重建：神经组织、皮肤组织(例如在伤口护理中)、心血管组织(包括血管组织和心脏组织)、心包组织、肌肉组织、膀胱组织、眼组织、牙周组织、骨、结缔组织例如腱或韧带及其它。
根据本文的描述，本发明的其他实施方案以及特征和优点将是显而易见的。
附图说明
图1描绘由单层的细胞外基质(ECM)材料形成的本发明的医学移植材料，该细胞外基质(ECM)材料从温血脊椎动物的组织分离。
图2描绘由两层的ECM材料形成的本发明的医学移植材料，该ECM材料从温血脊椎动物的组织分离。
图3提供本发明的一种人工瓣膜装置的侧视图，该装置包括附接至框架的ECM材料。
图4提供在图3中描绘的人工瓣膜装置的左侧视图。
图5提供在图3中描绘的人工瓣膜装置的右侧视图。
具体实施方式
为了促进理解本发明的原理的目的，现在将参考其某些实施方案并将使用具体的语言描述它们。然而应理解，并不因此而限制本发明的范围，如本发明所涉及领域的技术人员正常发生的那样，考虑在所述实施方案中的此类变化和进一步修改，和本文所述的本发明原理的此类进一步应用。
如上所述，在本发明的一个方面提供具有独特组分特性的细胞外基质移植材料，该组分特性为不希望有的组分低，同时保留显著水平的期望的组分。这些独特的材料可以通过处理方法来制备，该处理方法包括处理相对不纯的ECM起始材料，以减少不希望有的组分，例如核酸、脂质和/或免疫球蛋白例如IgA的含量，同时保留显著水平的期望的组分例如生长因子、蛋白聚糖和/或糖胺聚糖(GAGs)。通常，ECM起始材料将用温和的清洁剂溶液，例如离子型或非离子型清洁剂溶液处理。低浓度的清洁剂确保保留显著水平的期望的组分，例如如上所述的那些组分。在某些操作方式中，ECM材料将用十二烷基硫酸钠(SDS)的水溶液或另一种离子型或非离子型清洁剂溶液，在清洁剂浓度约0.05％-约1％，更优选约0.05％-约0.3％下处理。该处理可以持续一段时间，典型的约0.1小时-约10小时，更典型的约0.5小时-约2小时，以有效破坏细胞和核膜，并减少ECM材料的免疫球蛋白(例如IgA)含量。优选以该方式处理分离的ECM材料，破坏细胞和核膜并导致显著降低其IgA含量的材料，因此降低材料的免疫原性。例如，本发明处理的ECM材料可以具有不大于约20μg/g的天然IgA含量。在优选的实施方案中，本发明的ECM材料可以具有不大于15μg/g，不大于10μg/g，或甚至不大于5μg/g的天然IgA含量。在某些实施方案中，处理的ECM材料基本上不包括天然的IgA。″基本上不包括IgA″指分离的ECM材料包括低于可检测水平的IgA。用于检测IgA的方法在本领域中熟知，并包括例如酶联免疫吸附测定法(ELISA)。在这方面应理解，得自不同来源的ECM材料可能具有不同的在组织中占优势的免疫球蛋白。期望本文公开的处理技术将有效降低ECM材料中其它免疫球蛋白，包括在源组织中占优势的那些免疫球蛋白的含量。因此，本发明的其它方面涉及ECM材料的分离，该ECM材料具有显著降低水平(例如低于约20μg/g)的(i)在源组织中占优势的免疫球蛋白，或(ii)总免疫球蛋白含量(在组织中所有免疫球蛋白的和)。
除了用清洁剂介质处理ECM材料之外，ECM材料可以与参与达到期望的ECM组分特性的其它试剂接触。例如，可以用DNA可溶于其中的含水介质，优选碱性介质处理ECM材料。在某些形式中此类介质可以具有高于7-约9的pH，在一些实施方案中证明约8-约8.5的pH尤其有益。碱性含水介质可以包括缓冲剂，期望生物相容性缓冲剂例如三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)和/或螯合剂例如乙二胺四乙酸(EDTA)。在一个优选的形式中，核酸增溶性介质是TRIS-硼酸盐(borate)-EDTA(TBE)缓冲液。在另一个优选的形式中，核酸增溶性介质是氢氧化铵溶液。用DNA增溶性介质的该处理可以持续有效降低ECM材料的DNA含量的一段时间，典型的约0.1小时-约10小时，更典型的约0.5小时-约2小时。
除了用清洁剂和DNA-增溶性介质处理之外，制备本发明的医学移植材料的方法可以涉及用导致显著降低ECM材料的脂质组分水平的液体介质处理。例如，在某些实施方案中，产生的ECM材料的天然脂质含量可以被降至不大于约4％。这可以例如通过涉及以下步骤的制备方法来实现：用脂质可溶于其中的液体有机溶剂处理ECM材料。合适的此类有机溶剂包括例如水互溶性溶剂，包括极性有机溶剂。这些溶剂包括低分子量(例如C1-C4)的醇，例如甲醇、乙醇、异丙醇和丁醇、丙酮、氯仿及其它。另外的有机溶剂包括非极性溶剂例如己烷、苯、甲苯等。在更优选的实施方案中，处理的ECM材料将被处理至其天然脂质含量不大于约3％，或不大于约2.5％。用除去脂质的介质的该处理可以持续有效降低ECM材料的脂质含量的一段时间，典型的约0.1小时-约10小时，更典型的约0.1小时-约1小时。在某些实施方案中，将进行多次(两次或多次)此类处理。此外，用如上所述的降低脂质的介质的处理可以在用如上所述的清洁剂介质和/或含水(优选碱性)降低DNA的介质的处理之前或之后进行。在某些优选的实施方案中，用降低脂质的介质的处理将在用清洁剂介质和/或含水(优选碱性)介质的处理之前发生。
ECM材料也可以用消毒液处理。消毒液可以包括消毒剂例如醇、过氧化物或另一种氧化性或非氧化性消毒剂。在某些形式中，消毒液将是具有约0.1％-约0.3％过氧乙酸浓度的过氧乙酸溶液。例如，可以使用过氧乙酸和其它氧化性消毒剂处理溶液，例如在美国专利号6,206,931中所述的那些。
ECM材料也可以在贯穿其制备的各阶段(例如用自来水、高纯度水或缓冲液)冲洗，以便除去保留在材料内或材料上的引进的化学残留物。在优选的实施方案中，至少约90％的清洁剂残留物从材料中除去。更优选至少约95％，或至少约97％的清洁剂残留物从材料中除去。
可以以其中ECM材料与介质接触的任何合适的方式和任何合适的顺序，用清洁剂、DNA增溶性、脂质增溶性、冲洗和可能的其它液体介质进行处理。例如，在处理期间，可能在搅拌下，可将ECM材料浸在介质中。也可以使用其它接触方法例如用介质喷雾或喷淋ECM材料。以及，处理可以在任何合适的温度下进行。优选0℃-约50℃的温度，因为它们确保使ECM材料的胶原和其它期望的组分的显著变性最小化或避免其显著变性。更优选，处理温度为约0℃-约37℃，且更典型的为约20℃-约37℃。然而，应理解，本发明的广义方面内可使用其它温度。在其中形成管状或其它可闭合结构的实施方案中，包括腔的ECM材料可以在一端夹住，以允许该腔充满介质，并可以在另一端夹住，以基本上将管状ECM材料的近端和远端闭合。具有填充的腔的管状ECM材料可以浸在介质中，该介质可以是相同的或不同的介质。以这种方式，可以处理管状ECM材料的腔和外表面的每一个，而不必需要处理介质扩散或通过ECM材料。可以用本文使用的任何介质重复该方法，包括任何冲洗步骤。
处理例如上述那些处理和/或其它的化学和/或机械处理，将使ECM组织去细胞化，期望导致不含得自源组织的活细胞的处理的ECM组织。然而，在某些实施方案，例如以下描述的那些中的某些实施方案中，如此获得的无细胞ECM材料可以用于培养细胞或用细胞接种。
本发明处理的ECM材料可以得自任何合适的器官或其它组织来源，期望含大量胶原结缔组织的一种来源。可以使用人或其它动物组织来源。非人的动物来源可以是温血脊椎动物包括哺乳动物，并且牛、羊、山羊和猪来源是合适的。得自这些组织来源的合适的ECM材料可以包括粘膜下层、肾被膜、皮肤胶原、硬脑脊膜、心包、阔筋膜、浆膜、腹膜或基底膜层，包括肝基底膜。用于这些目的的合适的粘膜下层材料包括例如肠粘膜下层包括小肠粘膜下层、胃粘膜下层、膀胱粘膜下层和子宫粘膜下层。应理解，在分离包括粘膜下层的ECM中，一些或所有的来自源组织的原始粘膜下层可能连同得自一种或多种邻近组织层的材料一起被保留。相似的原则应用于其它富含胶原的层或本文命名的其它组织-回收的ECM材料可包括一些或所有的最初存在于源组织的特定组织，和/或在最终处理的ECM材料中可保持与邻近组织的连接。
本发明处理的、自然衍生的ECM材料将典型地包括丰富的胶原，最常见由以干重计，至少约80％重量的胶原构成。此类自然衍生的ECM材料将在最大程度上包括不随机定向的胶原纤维，例如一般作为单轴或多轴但有规则地定向纤维存在。当处理以保留天然生物活性组分时，ECM材料可以保留这些组分，作为固体散布在胶原纤维之间、之上和/或之中。用于本发明的特别期望的自然衍生的ECM材料将包括在光学显微镜检查下可容易确定的显著量的此类散布的、非胶原固体。在某些发明实施方案中，此类非胶原固体可以占ECM材料干重的显著百分比，例如在本发明的各种实施方案中，占至少约1％、至少约3％和至少约5％重量。
本发明处理的ECM材料也可显示血管源性特征，并因此有效诱导在用材料移入的宿主中的血管发生。在这方面，血管发生是以下的过程：机体通过该过程制备新血管以致增加对组织的血液供应。因此，血管源性材料当与宿主组织接触时，促进或支持新血管的形成。已开发出体内血管发生对生物材料植入的响应的测量方法。例如，一种此类方法使用皮下植入体模型，以确定材料的血管源性特征。见，C.Heeschen等，Nature Medicine 7(2001)，第7期，833-839。当与荧光微血管造影术联合时，该模型可以提供在生物材料中血管发生的定量和定性测量。C.Johnson等，Circulation Research 94(2004)，No.2，262-268。
最好制备用于本发明的医学移植材料和方法的生物重塑性ECM材料。生物重塑性并促进细胞侵袭和向内生长的此类材料提供特别的优点。生物重塑性材料可用于本文中，以促进在植入本发明的医学移植材料的部位的细胞生长。
如上所述，处理的粘膜下层(含粘膜下层)的ECM材料和任何其它的ECM材料可保留对源组织而言是天然的各种生长因子或其它有益的生物活性组分中的任何一种。例如，粘膜下层或其它ECM可以包括一种或多种天然的生长因子，例如基本成纤维细胞生长因子(FGF-2)、转化生长因子β(TGF-β)、表皮生长因子(EGF)、结缔组织生长因子(CTGF)、血管内皮生长因子(VEGF)和/或血小板衍生生长因子(PDGF)。以及，用于本发明的粘膜下层或其它ECM可包括其它生物材料，例如蛋白聚糖和/或糖胺聚糖，例如肝素、硫酸肝素、透明质酸、纤连蛋白等。因此，一般而言，处理的ECM材料将包括至少一种天然生物活性组分，该天然生物活性组分直接或间接地诱导细胞反应例如在细胞形态、增殖、生长、蛋白质或基因表达中的变化。
在优选的实施方案中，处理的ECM材料将显示其中以下非胶原组分以指定量存在的组分特性：
此外，除了保留天然生物活性组分之外，非天然生物活性组分例如由重组技术或其它方法合成产生的那些组分，也可掺入到粘膜下层或其它的ECM材料中。这些非天然生物活性组分可以是对应于以下的天然衍生或重组产生的蛋白质：天然存在于ECM组织中，但也许是不同种类的那些(例如应用至来自其它动物例如猪的胶原ECM的人蛋白质)。非天然的生物活性组分也可以是药物。可掺入用于本发明的ECM材料内和/或上的示例性药物包括例如抗生素、促进血栓的物质例如凝血因子，例如凝血酶、纤维蛋白原等。这些物质可立即在操作(例如通过使材料浸泡于含合适抗生素例如头孢唑林的溶液中)之前，或在材料移植入患者期间或之后，作为预制备步骤应用至ECM材料。
非天然生物活性组分可以通过任何合适的方式应用至粘膜下层或其它ECM组织。合适的方式包括例如喷雾、浸渍、浸没等。非天然生物活性组分可以在材料被附接至伸长的膜之前或之后应用至ECM组织。相似地，假如其它化学或生物组分包括于ECM组织中，那么非天然生物活性组分可以在与这些其它组分连接之前或之后应用。
本发明处理的粘膜下层或其它ECM组织的内毒素水平优选低于约12内毒素单位(EU)/克，更优选低于约5EU/克，且最优选低于约1EU/克。作为另外的优先选择，粘膜下层或其它ECM材料的生物负荷可低于约1集落形成单位(CFU)/克，更优选低于约0.5CFU/克。真菌水平期望类似地低，例如低于约1CFU/克，更优选低于约0.5CFU/克。核酸水平优选低于约2μg/mg，更优选低于约1μg/mg，病毒水平优选低于约50噬斑形成单位(PFU)/克，更优选低于约5PFU/克。
在某些实施方案中，内毒素水平可以被认为与一种或多种分离的、单片ECM材料的表面积有关。在此类情况下，ECM材料片可以显示低于约0.25EU/cm2的内毒素水平。在优选的实施方案中，ECM材料片显示低于约0.2EU/cm2、低于约0.1EU/cm2、且甚至低于约0.05/cm2的内毒素水平。在最优选的实施方案中，ECM材料片显示低于约0.025EU/cm2的内毒素水平。包括许多粘合或偶合的ECM材料片的多层ECM结构可以显示基于整个多层结构表面积的类似内毒素水平。
本发明处理的ECM材料可以以脱水或水化状态包装或贮藏。本发明医学移植材料的脱水可以通过本领域中已知的任何方式来实现。虽然也可以使用其它技术例如风干，但优选通过冻干或真空降压来完成脱水。当以干燥状态贮藏时，通常期望在使用之前再水化处理的ECM材料。在这方面，任何合适的润湿介质可以用于将医学材料再水化，作为实例包括水或缓冲盐水溶液。
在某些实施方案中，可以将处理的ECM材料交联。在医学移植材料内或在医学移植材料的两层或多层之间增加交联的量(或数目)可以用于增强其强度。然而，在医学移植材料内交联也可影响其生物重塑能力或其它生物活性特征。因此，在某些实施方案中，将提供基本上保留其天然交联水平的生物重塑性ECM材料，或可以审慎地选择在ECM材料内增加交联的量和/或类型，以保留期望水平的生物重塑能力或其它生物活性特征。
为了用于本发明，可通过光交联技术，或通过交联剂例如通过化学交联剂的应用，或通过脱水或其它方法诱导的蛋白质交联，实现处理的ECM材料的任何引入的交联。可使用的化学交联剂包括例如醛例如戊二醛、二酰亚胺例如碳二亚胺，例如1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、核糖或其它糖、酰基-叠氮化物、磺基-N-羟基琥珀酰胺或聚环氧化物，包括例如聚缩水甘油醚例如以商品名DENACOLEX810购自Nagese Chemical Co.，Osaka，Japan的乙二醇二缩水甘油醚，和以商品名DENACOL EX 313也购自Nagese Chemical Co.的甘油聚甘油醚。通常当使用时，聚甘油醚或其它聚环氧化物将具有2-约10个环氧化物基团/分子。优选，医学移植材料用包含转谷氨酰胺酶的交联剂交联。
本发明处理的ECM材料可以制备成各种物理形式，以适合各种医学应用。例如，分离的ECM材料可以一种或多种片、糊、泡沫状物、非胶凝水溶液、粉末或凝胶提供。也考虑这些形式的组合。在这方面，可在ECM材料已经如本文所述处理之前或之后获得ECM材料的构型。此外，ECM复合材料可以制备成较大的体积尺寸，然后分成较小的产品。此外，ECM材料可以天然衍生的层形式提供，或可能它本身就是从天然衍生的ECM材料制备的制备物品，例如海绵或流延片。
本发明的医学移植材料可用于各种医学(包括兽医)应用。实例包括修复或重建组织例如神经组织、皮肤组织，例如在伤口愈合例如施用至外部皮肤伤口，包括但不限于溃疡(例如糖尿病性溃疡或其它慢性溃疡)中、心血管组织(包括血管组织和心组织)、心包组织、肌肉组织、眼组织、牙周组织、骨、结缔组织例如腱或韧带、在胃肠瘘的处理中(例如处理成栓塞的形式，以至少堵塞瘘例如肛门直肠瘘、直肠阴道瘘或肠外瘘的主要开口)和其它。
在一个实施方案中，例如使用在美国专利号5,275,826和5,516,533中所述的技术，将处理的ECM材料制备成流体化组合物。在这方面，可以通过碾碎和/或用蛋白酶(例如胰蛋白酶或胃蛋白酶)消化材料，持续足以溶解材料并形成基本上均匀的溶液的一段时间，来制备ECM材料的溶液或悬浮液。期望通过撕碎、切割、碾碎、剪断等粉碎ECM材料。最好在冷冻或冻干状态下碾磨材料，虽然通过使片状材料的悬浮液在高速混合器中进行处理和如有必要，通过离心和倾析过量的废物脱水也可以获得好的结果。粉碎的材料可以干燥例如冷冻干燥形成粉末。此后，如有必要，粉末可以水化，即与水或缓冲盐水和任选其它药学上可接受的赋形剂组合，形成流体组织移植组合物，例如在25℃下的粘度为约2-约300,000cps。较高粘度的移植组合物可以具有凝胶或糊的一致性。
对于最典型地需要修复或增加以纠正创伤或疾病诱导的组织缺损的组织，例如骨或软组织，本发明的流体化ECM材料发现了作为可注射异种移植物的用途。本发明流体化组合物最好也用作植入物构建物的填充剂，该植入物构建物包含例如一片或多片胶原ECM材料，该胶原ECM材料形成密封(缝线合)囊，用于整容或创伤治疗的手术操作。
在一个示例性的制备中，将如本文所述制备的ECM材料减小成小片(例如通过切割)，该小片被装在平底不锈钢容器中。将液氮导入容器中以冷冻样品，然后将该样品在冷冻状态时粉碎形成粗粉末。可以例如用手扳压机，用圆柱状黄铜锭置于冷冻的样品顶部，进行此类处理。锭用作样品与压机轴之间的界面。可以将液氮定时性地加入至样品，以使样品保持冷冻。
可以利用粉碎ECM材料样品的其它方法，产生可依照本发明使用的粉末。例如，可以冷冻干燥ECM材料样品，然后使用手扳压机或其它碾磨工具碾磨。或者，可以在高剪切混合器中处理ECM材料，以在脱水和干燥之后产生粉末。
使用预冷的研钵和研杵进一步碾磨ECM材料粉末可以用于产生均匀、更细的产品。并且，在最终的碾磨期间当需要维持固体冷冻颗粒时，使用液氮。使用例如缓冲盐水可以使粉末容易地水化，以产生期望粘度的本发明的流体化组织移植材料。
为了制备另一种优选的流体化材料，ECM材料粉末可以筛过金属丝网，收集，并经过蛋白质分解消化，形成基本上均匀的溶液。例如，在室温下48小时内，可以用1mg/ml的胃蛋白酶(Sigma Chemical Co.，St.Louis Mo.)和0.1M乙酸消化粉末，用HCl调节至pH 2.5。在该处理之后，可以用氢氧化钠(NaOH)中和反应介质，以钝化胃蛋白酶的活性。溶解的粘膜下层然后可以通过溶液的盐沉淀而浓缩并分离，以进一步纯化和/或冷冻干燥，形成粉末形式的蛋白酶溶解的胶原ECM材料。
本发明的流体化组合物在组织置换、增强和/或修复中发现了广泛的应用。流体化组合物可以用于诱导在存在缺陷的区域中天然结缔组织或骨的再生。通过将有效量的流体化组合物注射入组织缺陷的部位或需要愈合的伤口，可以容易地利用胶原ECM材料的生物向性。
在矫形外科的应用中，本发明的医学移植材料可以用于修复骨组织，例如使用在美国专利号5,641,518中所述的一般技术。因此，材料的粉末形式可以植入待修复的损坏或患病的骨区域中。粉末可以单独使用，或与一种或多种另外的生物活性剂联合使用，例如在生理学上相容的矿物质、生长因子、抗生素、化学治疗药物、抗原、抗体、酶和激素。优选，粉末型植入物将被压成预定的三维形状，将其植入骨区域，在用内源性组织置换移植物期间将基本上保留其形状。
本发明处理的ECM材料也可以用作细胞生长基体，例如与支持受试者细胞，例如真核细胞例如内皮细胞、成纤维细胞、胎儿皮肤细胞、骨肉瘤细胞和腺癌细胞生长的营养素组合的片、糊或凝胶形式(见，例如国际PCT申请公布号WO 96/24661)。在优选的形式中，基体组合物将支持哺乳动物细胞包括人细胞的增殖和/或分化。
也可以使用类似于在Ann.Plast.Surg.，1995，35：3740380；和J.Surg.Res.，1996，60：107-114中所述的那些技术的技术，将本发明处理的ECM材料用于体壁修复，包括例如用于腹壁缺损例如疝的修复。在此类应用中，本发明的优选的医学移植材料促进在重塑组织中有利的组构化、血管形成和一致性。在皮肤病学的应用中，可以使用本领域和文献(见，例如Annals of Plastic Surgery 1995，35：381-388)已知的一般移植技术，将本发明的医学移植材料用于部分或全部厚度伤口的修复和用于皮肤的增厚。此外，在烧伤治疗的区域中，一般已知提供培养的表皮移植物(优选培养的表皮自体移植物或CEA)移植在其上的皮肤替代物。此类培养的移植物已经典型地包括将角质化细胞和/或成纤维细胞移植到皮肤替代物上。根据本发明，医学移植材料可以例如以片的形式用作皮肤替代物，且CEA因此移植在该材料上。在实践本发明的该方面的一个模式中，可以例如通过接种或转移角质化细胞片，将角质化细胞移植在粘膜下层的粘膜侧面上。成纤维细胞也可以移植在粘膜下层的粘膜侧面和/或对(内)侧面上。
本发明处理的ECM材料也可以用于在泌尿生殖应用中的组织移植。例如，可以使用与在美国专利号5,645,860；Urology，1995，46：396-400；和J. Urology，1996，155：2098中一般描述的那些技术相应的技术，将医学移植材料用于膀胱修复，以提供用于膀胱再生的支架。在流体化的形式中，本发明的医学移植材料也可以发现在内窥镜注射操作以纠正膀胱输尿管返流的用途。在此类应用中，可以例如在患者输尿管口以下的区域中进行注射，以诱导在注射部位的平滑肌生长和胶原形成。
一般而言，当配置用作组织移植物时，本发明处理的ECM材料可以包括可以切割或另外配置成用于其最终用途的期望尺寸的一片或多片ECM材料。在许多情况下，将移植材料的尺寸制成比其应用的组织缺陷大。以该方式制成医学移植材料的尺寸允许容易附接至周围的组织。
一旦规定尺寸的ECM移植材料已经置于缺陷上、内或周围，那么可以使用几种已知的合适附接手段中的任何一种将材料附接至周围组织。合适的附接手段包括例如生物相容性粘合剂(例如纤维蛋白胶)、U形钉固定、缝线合等。优选，通过缝线合将医学移植材料附接至周围组织。当前本领域可得到各种合成材料用作缝线。例如，包含ProleneTM、VicrylTM、MersileneTM、PanacrylTM和MonocrylTM的缝线考虑用于本发明。本领域的那些技术人员熟知其它缝线材料。因此上述材料仅用作实例，因此决非用于限制。
在其它领域中，用本发明的ECM材料形成的医学移植材料可以用于神经病学应用中，例如用于需要硬脑脊膜替代物修复由于创伤、肿瘤切除或减压操作的缺陷的技术中。
本发明片形式的处理的ECM医学移植材料，可以由单层或多层的材料组成。因此，在某些实施方案中，可以使用单个分离层的ECM材料或多层的ECM构建物。用于本发明的示例性多层ECM构建物可例如具有层压在一起的2-约10个分离的ECM层。
用于本发明的多层ECM构建物可以按任何合适的式样制备。在这方面，可以使用各种用于将ECM层层压在一起的技术。这些技术包括例如在加热、不加热或冻干条件下脱水热粘合，使用胶粘剂、胶或其它粘合剂，用化学试剂或辐射(包括UV辐射)交联，或这些技术相互之间或与其它合适方法的任何组合。关于可以用于本发明的多层ECM构建物的另外信息及其制备方法，可参考例如美国专利号5,711,969、5,755,791、5,855,619、5,955,110、5,968,096，和参考美国专利申请公布号20050049638。
用于本发明的单层ECM或多层ECM构建物或其它生物相容性材料在其结构中可以具有或可以缺乏穿孔或裂缝线，在某些实施方案中可以具有例如在美国申请专利公布号20050021141中所述的网状结构。此类网状图案结构可以用于提供用于本发明的可高度形变的ECM或其它植入物片段。
在另外的实施方案中，本发明的处理的ECM可以经受使材料膨胀的处理。可以通过控制ECM材料与一种或多种碱性物质的接触直至材料膨胀，将膨胀的材料分离，按某些形式形成此类膨胀的材料。例如，接触可以足以将ECM材料膨胀至其最初总体积的至少120％(即1.2倍)，或按某些形式膨胀至其最初体积的至少约2倍。此后，例如通过中和和/或冲洗，可以任选使膨胀的材料与碱性介质分离。可以以任何合适的方式将收集的、膨胀材料用于医疗装置的制备。例如，在期望的形状或构型的移植物构建物的形成中，可以将膨胀的材料富集生物活性组分、干燥和/或模塑等。在某些实施方案中，用膨胀的ECM材料形成的医学移植材料和/或装置可以是可高度压缩的(或可膨胀的)，以便材料可以压缩，以便例如从带导管的递送装置的腔内递送，此后从装置展开后膨胀，以便被锚定在患者体内和/或引起患者体内管道的闭合。
可以通过控制如上所述的处理的ECM材料与含氢氧化钠的水溶液或其它介质的接触，来形成膨胀的ECM材料。材料的碱处理可以引起材料的物理结构的变化，该变化又引起该材料的膨胀。此类变化可包括在材料中胶原的变性。在某些实施方案中，优选使材料膨胀至其最初总体积的至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍或至少约6倍或甚至更多倍。膨胀的幅度涉及几个因素，包括例如用于待膨胀的材料处理中的碱性介质的浓度或pH、暴露时间和温度。
可以处理以制备膨胀材料的ECM材料可以包括本文所公开的那些ECM材料中的任何一种或其它合适的ECM。典型的此类ECM材料将包括具有自然发生的分子内交联和自然发生的分子间交联的胶原原纤维网络。在本文所述的膨胀处理之后，自然发生的分子内交联和自然发生的分子间交联可以保留在处理的胶原基质材料中，足以维持胶原基质材料作为完整的胶原片材料；然而，在胶原片材料中的胶原原纤维可以变性，且胶原片材料的碱处理的厚度可以大于起始材料的厚度，例如最初厚度的至少120％，或最初厚度的至少两倍。
例如，用于处理重塑性材料的碱性物质浓度可以为约0.5-约2M，更优选约1M的浓度。另外，在某些实施方案中碱性物质的pH可以为约8-约14。在优选的方面，碱性物质的pH为约10-约14，且最优选约12-约14。
如上所述，除浓度和pH之外，其它因素例如温度和暴露时间将有助于膨胀的程度。在该方面，在某些变体中，在约4-约45℃下进行胶原材料在碱性物质中的暴露。在优选的实施方案中，在约25-约40℃下，最优选在37℃下进行暴露。此外，暴露时间可以为至少约1分钟-约5小时或更长。在一些实施方案中，暴露时间为约1-约2小时。在特别优选的实施方案中，胶原材料在约37℃下暴露于pH 14的1M NaOH溶液中，持续约1.5-2小时。此类处理导致重塑性材料的胶原变性和显著膨胀。材料的胶原基质的变性可以观察为在材料的胶原包装特征中的变化，例如起始材料的紧密结合胶原网络的明显破坏。当通过肉眼或在适度的放大倍数，例如放大100倍下观察时，非膨胀的ECM或其它胶原材料可以具有提供基本上一致、连续表面的紧密结合的胶原网络。相反，膨胀的胶原材料可以具有相当不同的表面，不同之处在于表面是不连续的，而是当在相同的放大倍数，例如约100倍下观察时，在股或束之间的材料中被大量间隙分离的许多区域中，存在胶原股或束。因此，膨胀的胶原材料通常似乎比相应的非膨胀胶原材料有更多的孔。此外，在许多情况下，膨胀的胶原材料可以证明具有增加的孔隙率，例如通过测量与未处理的起始材料比较增加的对水或其它流体通过的渗透率可以证明。膨胀的ECM或其它胶原材料的更多泡沫和多孔结构可以允许该材料流延或制备成各种海绵或泡沫形状，用于医学材料和装置的制备。它可进一步允许制备可高度压缩并在压缩后膨胀的构建物。此类性质可有用，例如，当制备的医学移植材料被压缩并装入展开装置(例如其腔)中时，该装置用于递送至患者内，此后展开在植入部位膨胀。
在此类碱处理之后，材料可以与碱性介质分离并为了进一步使用而处理。例如，收集的材料可以在进一步处理材料以形成本发明的医学移植材料之前，被中和和/或用水冲洗以从材料中除去碱性。
本发明的医学移植材料也可以与一种或多种第二组分联合使用，以构建各种医疗装置。在某些实施方案中，处理的ECM材料被附接至膨胀性元件，例如自膨胀性或强制膨胀性(例如球囊膨胀性)支架或框架。本发明的此类装置可以适用于在心血管系统内，包括在动脉或静脉内展开。某些装置适合作为血管瓣膜，例如用于经皮植入动脉内或腿部静脉或足部静脉内以治疗静脉机能不全。
用本发明处理的ECM材料制备的人工瓣膜装置可以植入身体的通道作为无框架的瓣膜装置，或如上所述，ECM材料可以附接至膨胀性框架。ECM材料可以用于形成生物相容性覆盖物例如套筒和/或用于形成小叶或其它瓣膜结构(见，例如WO 99/62431和WO 01/19285)。在形成瓣膜结构的一种模式中，处理的ECM材料可以按一定方式附接至支架，由此方式它形成1个、2个或多个小叶、尖突、袋或类似的结构，该结构阻止沿一个方向相对于另一个方向流动。在此类装置的具体应用中，将作为血管瓣膜构建的此类装置植入，以治疗例如在腿部发生的人静脉机能不全。
现在参考图1，描绘了由得自温血脊椎动物组织的本发明的单层处理的ECM材料11形成的片状医学移植物10。图2描绘由本发明的两层处理的ECM材料11形成的医学移植装置20。如在图1和图2中描绘的片状医学移植装置可以用于本文所述的各种移植应用中，包括但不限于伤口护理和软组织支持应用。
现在参考图3-5，描绘了本发明的人工瓣膜装置31的各种侧视图。本发明处理的ECM材料被附接至框架元件33，并提供在植入患者的构型中的两个小叶34和35。尤其是，图3提供在平行于小叶34和35的接合上边缘34a和35a的方向取得的人工瓣膜装置31的侧视图。图4提供从左侧取得的在图3中描绘的装置31的视图。图5提供从右侧取得的在图3中描绘的装置31的视图。装置31特别好地适用于血管应用，例如植入患者的血管通道。
如从图3-5可见，小叶34和35包括互相接合的各自的自由边缘34a和35a和各自的固定边缘36和40，在装置31植入部分限制血管壁的通路后，该固定边缘36和40将各自对着血管壁施加力以便各自形成捕获血液的元件。在所示装置31中，小叶边缘与血管壁接触的通路包括基本上沿血管壁纵向延伸的许多部分，该血管壁连接至沿血管壁纵向延伸和环绕血管壁周围延伸的杯成形部分。尤其是，小叶34的固定边缘36包括相对的纵向延伸部分37和38，它们各自延伸至杯成形部分39的对侧。因此，小叶35的固定边缘40包括相对的纵向延伸部分41和42，它们各自延伸至杯成形部分43的对侧。
可以用许多不同的方法表达接触或接合的小叶面积的数量。在植入物的最初构型中，接合长度(例如LOC)取决于人工瓣膜的构型，期望为至少约2mm并可长达约50mm或更长。在本发明的某些实施方案中，在植入物的最初构型中，接合长度可以是约5-约30mm，更典型的约5-约15mm。接合长度可以代表人工瓣膜的全部长度的实际百分数，例如该假体全部长度的至少约5％或至少约10％。在某些实施方案中，小叶的接合长度占全部装置长度的10％-80％，典型的约30％-约60％，且更典型的约35％-约55％。
在另外的方面，可以通过使小叶的外部边缘在充分距离内互相紧密接近，沿框架基本上纵向取向来提供长的接合长度。因此，为了例证的目的参考图3-5，在充分距离内例如2-50mm，典型的约5-约30mm，且更典型的约5-约15mm，将小叶34的小叶外部边缘部分37配置成沿血管壁与小叶35的小叶外部边缘部分41紧密接近接触。对沿血管壁的对侧循行的小叶边缘部分(例如边缘部分38和42，图3-5)来讲是同样的。优选小叶边缘在这些距离内例如在约5mm内，更优选在约3mm内，且最优选在约1mm内保持紧密接近。应理解，该紧密接近可能涉及使小叶边缘沿血管壁互相紧密循行，或可能使它们沿基本上同样的通路(例如两者沿框架的单一支柱)附接，并因此显示当它们沿血管壁通过时基本上不互相分开。
为了促进对本发明各方面的进一步理解，提供以下具体的实施例。应理解，这些实施例是示例性的，并不限制本发明。
实施例1
该实施例描述本发明的一种处理的ECM材料的制备。
猪的小肠得自包装工厂并切开和剖开，以显示其内部的部分。在最初的清洁以除去在肠内包含的内容物之后，用机械在各侧面摩擦各个肠，以除去粘膜层和浆膜层，并以分离主要的结缔组织层包括粘膜下层，用于进一步处理。在37℃下在1∶10(重量∶体积)0.1％十二烷基硫酸钠(SDS)溶液中处理粘膜下层1小时，接着在37℃下在1∶10(重量∶体积)89mM tris、硼酸盐、乙二胺四乙酸(TBE)溶液中处理1小时。在这些最初的处理之后，在室温下用1∶10(重量∶体积)高纯度水冲洗粘膜下层5分钟。在室温下在1∶5(重量∶体积)100％异丙醇(IPA)溶液中处理粘膜下层30分钟之前，第二次重复该冲洗步骤。第二次重复该IPA处理步骤，接着如上所述冲洗粘膜下层两次。然后在室温下在1∶10(重量∶体积)0.2％PAA/5％特别变性的醇溶液中处理粘膜下层2小时。最后，在室温下在1∶10(重量∶体积)高纯度水中冲洗粘膜下层5分钟。在测试粘膜下层的SDS残留之前，重复该冲洗步骤共4次冲洗。通过使用清洁剂检测试剂盒(Chemetrics)测量SDS的含量，其表明除去了超过97％的最初清洁剂。得到的粘膜下层组织用于以下的实施例。
实施例2
该实施例证明与用于制备粘膜下层ECM材料的另一种方法相比，使用在实施例1中所述的方法提高了脂质含量的减少。
获得10批切开的猪小肠，并分成大约相等的两组。如在美国专利号6,206,931的实施例1中所述处理一组(在下文中称为″对照组″)。简而言之，未加工的肠首先用过氧乙酸处理，接着用机械摩擦各侧面以分离粘膜下组织层，并冲洗以除去化学残留物。如在上面的实施例1中所述制备第二组(在下文中称为″测试组″)。
通过叠加4个粘膜下层(湿的)并冻干得到的叠层，将各批的材料用于制备3个4层的冻干片。使用低温环氧乙烷循环对四层的片灭菌。从各片中切割1cm×1cm样品，用于脂质的含量分析。每批每组分析3个样品(3个样品×10批)，每组共30个样品。将各样品称重(初始重量)，然后用100％的乙醇溶液处理24小时，接着用丙酮溶液处理24小时，以提取脂质。随后干燥样品约48小时并称重(最终重量)。通过(初始重量-最终重量)/初始重量，来计算脂质含量。
进行分布分析，以确定何种分布(正态、对数正态、威布尔或γ)最适合各组数据。分布分析表明，对照组的脂质含量最适合对数正态分布，它对应的平均脂质含量为8.06+/-5.59％。分布分析表明，测试组的脂质含量最适合威布尔分布，它对应的平均脂质含量为2.51+/-2.51％。
所有的样品使用未配对t检验，p值达1.08×10-5。使用配对t检验，比较批匹配对照组的结果与相应的测试组结果，p值达6.2×10-5。两种p值均小于0.05，表明与对照材料相比，测试材料的脂质含量统计学上显著减少。
实施例3
该实施例证明使用在实施例1中所述的方法提高了IgA含量的减少。
获得10批切开的猪小肠，并分成大约相等的两组。如在美国专利号6,206,931的实施例1中所述处理一组(在下文中称为″对照组″)。简而言之，未加工的肠首先用过氧乙酸处理，接着在各侧面上摩擦以分离粘膜下组织层，并冲洗以除去化学残留物。如在上面的实施例1中所述制备第二组(在下文中称为″测试组″)。
通过叠加4个粘膜下层(湿的)并冻干得到的叠层，将各批的材料制备成3个、4层的冻干片。使用低温环氧乙烷循环对四层的片灭菌。从各片中切割1cm×1cm样品，用于免疫球蛋白A(IgA)的含量分析。每批每组分析3个样品(3个样品×10批)，每组共30个样品。将各样品称重(初始重量)，置于1.5mL离心管中，并在400μl的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中碾磨90秒。接着离心样品，并分离上清液，用无菌的PBS稀释1∶5。使用得自Bethyl Laboratories，Bethyl，Texas的试剂盒，通过ELISA，测定这些稀释的样品的IgA含量。通过测试组的IgA含量/对照组的初始重量，来计算IgA的重量含量。
进行分布分析，以确定何种分布(正态、对数正态、威布尔或γ)最适合各组数据。分布分析表明对照组的IgA含量最适合正态分布，它对应的平均IgA含量为50.4+/-27.7μg/g。一个测试组样品测试为1.54μg/g，而所有的其它测试组样品测试为0μg/g。因此不进行测试组的分布分析，因为分布基本上为单点。
所有的样品使用未配对t检验，p值达1.7×10-13。使用配对t检验，比较批匹配对照组的结果与相应的测试组结果，p值达1.88×10-4。两种p值均小于0.05，表明与对照组相比，测试组的材料的IgA含量统计学上显著减少。
实施例4
该实施例证明使用在实施例1中所述的方法提高了细胞核数量的减少。
获得10批切开的猪小肠，并分成大约相等的两组。如在美国专利号6,206,931的实施例1中所述处理一组(在下文中称为″对照组″)。简而言之，未加工的肠首先用过氧乙酸处理，接着摩擦各侧面以分离粘膜下组织层，并冲洗以除去化学残留物。如在上面的实施例1中所述制备第二组(在下文中称为″测试组″)。
切割各组中各批的样品，并用Hoechst 33258染色，用于鉴定细胞核。使用带紫外线过滤器的Olympus荧光显微镜，从随机部位获得各样品中细胞核的三个图像。图像通过Spot Insight数字照相机在共放大200倍下拍摄，并通过Spot RT计算机软件获得。这些图像代表0.263mm2的总面积。三个独立的分析者对各个获得图像的细胞核计数。按这3个计数的均值取得每个图像的细胞核数目。
进行分布分析，以确定何种分布(正态、对数正态、威布尔或γ)最适合各组数据。分布分析表明对照组的细胞核计数最适合威布尔分布，它对应的对照组平均每区域细胞核为473+/-193个细胞核。分布分析表明测试组的细胞核计数最适合γ分布，它对应的测试组平均每区域细胞核为26.7+/-36.1个细胞核。
使用配对t检验，比较批匹配对照组的结果与相应的测试组结果，p值达1.66×10-6。p值小于0.05，表明与对照材料相比，测试材料的细胞核含量统计学上显著减少。
实施例5
该实施例证明如在实施例1中所述处理的ECM材料保留天然的FGF-2。
获得10批未加工的猪小肠，并依照实施例1处理。如在上面的实施例2中所述，将各批的材料制备成3个、4层的冻干片，并使用低温环氧乙烷循环灭菌。从各片中切割1cm×1cm样品，用于FGF-2的含量分析。每批分析3个样品(3个样品×10批)，共30个样品。将各样品称重(初始重量)，置于1.5mL离心管中，并在400μl的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中碾磨3×30秒。接着离心样品，并分离上清液，用无菌的PBS稀释1∶5。使用R&D Systems FGF-2ELISA试剂盒，一式两份测定这些稀释的样品的FGF-2含量。通过由ELISA确定的FGF-2含量/样品的初始重量，来计算FGF-2的重量含量。
进行分布分析，以确定何种分布(正态、对数正态、威布尔或γ)最适合各组数据。分布分析表明FGF-2含量最适合正态分布，它对应的FGF-含量的平均值为25.0ng/g+/-12.9ng/g。
实施例6
该实施例证明如在实施例1中所述处理的ECM材料保留天然的透明质酸(HA)。
获得10批未加工的猪小肠，并依照实施例1处理。如在上面的实施例2中所述，将各批的材料制备成3个、4层的冻干片，并使用低温环氧乙烷循环灭菌。从各片中切割1cm×1cm样品，用于透明质酸(HA)的含量分析。每批分析3个样品(3个样品×10批)，共30个样品。将各样品称重(初始重量)，置于1.5mL离心管中，并在450μl的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中用50μl蛋白酶K在56℃下消化45分钟。接着离心样品，并分离上清液，用无菌的PBS稀释1∶40。使用得自Corgenics，Westminster，Colorado的试剂盒，通过ELISA，按一式两份测定这些稀释的样品的HA含量。通过由ELISA确定的HA含量/样品的初始重量，来计算HA的重量含量。
进行分布分析，以确定何种分布(正态、对数正态、威布尔或γ)最适合各组数据。分布分析表明测试样品的HA含量最适合对数正态分布，它对应的测试样品HA含量平均为303+/-209μg/g。
实施例7
该实施例证明如在实施例1中所述处理的ECM材料保留天然硫酸酯化糖胺聚糖(sGAGs)。
获得10批未加工的猪小肠，并依照实施例1处理。如在上面的实施例2中所述，将各批的材料制备成三个、四层的冻干片，并使用低温环氧乙烷循环灭菌。从各片中切割1cm×1cm样品，用于s(GAG)的分析。每批分析3个样品(3个样品×10批)，共30个样品。将各样品称重(初始重量)，置于1.5mL离心管中，并在450μl的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中用50μl蛋白酶K在56℃下消化45分钟。所有样品均涡旋震荡5秒，接着加入1.0mL的Blyscan染料试剂。用分光光度计在685nm按一式三份取得各样品的吸收度读数，并从肝素标准曲线计算sGAG的浓度。通过由吸收度读数确定的s(GAG)含量/样品的总重量，来计算sGAG的重量含量。
进行分布分析，以确定何种分布(正态、对数正态、威布尔或γ)最适合各组数据。分布分析表明sGAG含量最适合正态分布，它对应的s(GAG)含量的平均值为7588μg/g+/-6505μg/g。
实施例8
该实施例证明与另一种方法相比，已经依照实施例1处理的ECM材料的隔膜破裂力(burst force)。
获得10批切开的猪小肠，并分成大约相等的两组。如在美国专利号6,206,931中所述处理一组(在下文中称为″对照组″)。简而言之，未加工的肠首先用过氧乙酸处理，接着在两侧面摩擦，以分离粘膜下组织层，并冲洗以除去化学残留物。如在上面的实施例1中所述制备第二组(在下文中称为″测试组″)。
如在上面的实施例2中所述，将各批材料制备成3个、4层的冻干片，或通过将八个润湿的粘膜下层重叠并真空下压该构建物，制备成3个、8层真空压制片。使用低温环氧乙烷循环将这些片灭菌。从各片中切割2.5英寸×2.5英寸的样品，用于隔膜破裂力的测试。对于4层的冻干组每批分析3个样品(3个样品×9批)，共27个样品。对于8层真空压制组每批分析3个样品(3个样品×10批)，共30个样品。在测试前，各样品在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中再水化至少15分钟。使用Mullen破裂力测试器在断裂之前测量隔膜破裂力。
进行分布分析，以确定何种分布(正态、对数正态、威布尔或γ)最适合各组数据。分布分析表明对照4层冻干的破裂力最适合威布尔分布，它对应的平均破裂力为359+/-98kPa。分布分析表明测试的4层冻干的隔膜破裂力最适合对数正态分布，它对应的平均破裂力为378+/-79kPa。在两组之间隔膜破裂力的平均差异为5.3％。所有的样品使用未配对t检验，达到0.458的p值。使用配对t检验，比较批匹配的对照组的结果与相应的测试组的结果，达到0.060的p值。这些p值均大于0.05，表明本发明的4层冻干材料的隔膜破裂力与通过当前使用的方法制备的4层冻干材料相比，无统计学上显著性降低。
关于8层真空压制的材料，分布分析表明对照的8层真空压制的破裂力最适合对数正态分布，它相应的平均破裂力为915+/-234kPa。分布分析表明测试的8层真空压制的破裂力最适合对数正态分布，它相应的平均破裂力为872+/-269kPa。两组之间破裂力的平均差异为4.8％。所有样品使用未配对t检验，达到0.516的p值。使用配对t检验，比较批匹配的对照组的结果与相应的测试组的结果，达到0.217的p值。这些p值均大于0.05，表明8层真空压制的测试材料的破裂力与8层真空压制的对照材料相比，无统计学上显著性降低。
实施例9
该实施例证明与用于制备灭菌、分离粘膜下层组织的另一种方法相比，已经依照实施例1处理的ECM材料的缝线保持强度。
获得10批切开的猪小肠，并分成大约相等的两组。如在美国专利号6,206,931中所述处理一组(在下文中称为″对照组″)。简而言之，未加工的肠首先用过氧乙酸处理，接着在两侧面摩擦，以分离粘膜下组织层，并冲洗以除去化学残留物。如在上面的实施例1中所述制备第二组(在下文中称为″测试组″)。
如在实施例8中所述，将各批材料制备成3个、4层的冻干片或3个、8层真空压制片。使用低温环氧乙烷循环将这些片灭菌。从各片中切割1cm×3cm的样品，用于缝线保持强度的测试。每批每组分析3个样品(3个样品×10批)，每组共30个样品。4层的冻干材料在两个主要的方向纵向和横向上切割，而8层的材料仅在一个方向上切割，因为该材料由于层的正交重叠而没有主要的方向。在测试之前，将各样品在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中再水化至少15分钟。将302/304不锈钢丝(与临床使用的5-0缝线的尺寸相等)穿过各测试物品的一端，咬合深度为2mm，并附接至拉伸试验机的可移动爪。用拉伸试验机的固定爪抓住各测试物品的另一端，并按150mm/min的恒定速率向上拉金属丝。记录各样品的最大力、断裂时拉伸率和失败模式。由于钢丝从SIS材料拉出，所以所有的测试样品(180/180，100％)失败。在所有的情况下，钢丝保持完整而SIS材料不完整。
测试的结果如下(平均值+/-标准差)：8层真空压制的对照组＝12.22+/-2.68N，8层真空压制的测试组＝12.77+/-1.81N(p＝0.3714)；4层冻干的对照组横向＝7.58+/-1.68N，4层冻干的测试组横向＝7.99+/-1.90N(p＝0.3801)；4层冻干的对照组纵向＝6.19+/-1.46N，4层冻干的测试组纵向＝6.14+/-1.41N(p＝0.8929)。在数据集上正态性拟合良度检验显示，没有数据集具有与正态分布的任何显著性偏差。因此，对各组数据(8层真空压制的、4层冻干的横向和4层冻干的纵向)进行两组样品的t检验(对照组与测试组比较)。所有p值均大于0.3714，表明测试材料与对照材料相比，缝线保持强度无统计学上显著性降低。
实施例10
该实施例证明与用于制备灭菌、分离的粘膜下层组织的另一种方法相比，已经依照实施例1处理的ECM材料的拉伸强度。
获得10批切开的猪小肠，并分成大约相等的两组。如在美国专利号6,206,931中所述处理一组(在下文中称为″对照组″)。简而言之，未加工的肠首先用过氧乙酸处理，接着在两侧面摩擦，以分离粘膜下组织层，并冲洗以除去化学残留物。如在上面的实施例1中所述制备第二组(在下文中称为″测试组″)。
如在实施例8中所述，将各批材料制备成3个、4层的冻干片或3个、8层真空压制的片。使用低温环氧乙烷循环将这些片灭菌。从各片中切割″狗骨″状样品，用于拉伸试验。每批每组分析3个样品(3个样品×10批)，每组共30个样品。4层的冻干材料在两个主要的方向纵向和横向上切割，而8层的材料仅在一个方向上切割。各样品在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中再水化，并使用Instron在100mm/分钟的形变速率下测试在断裂前的最终拉力(UTF)。
进行分布分析，以确定何种分布(正态、对数正态、威布尔或γ)最适合各组数据。分布分析表明对照的4层冻干的纵向UTF最适合对数正态分布，它对应的平均UTF为3.72+/-1.05lbs。分布分析表明4层冻干的测试材料的纵向UTF最适合正态分布，它对应的平均UTF为2.92+/-0.88lbs。在这些两组之间UTF的平均差异为21％。所有的样品使用未配对t检验，达到3.6×10-3的p值。使用配对t检验，比较批匹配的对照组的结果与相应的测试组的结果，达到3.4×10-3的p值。这些p值均小于0.05，表明4层冻干的试验材料的纵向UTF与4层冻干的对照材料相比，统计学上显著性降低。
类似地，分布分析表明对照的4层冻干的横向UTF最适合对数正态分布，它对应的平均UTF为3.2+/-0.96lbs。分布分析表明4层冻干的测试材料的纵向UTF最适合对数正态分布，它对应的平均UTF为2.48+/-0.90lbs。在这些两组之间UTF的平均差异为22％。所有的样品使用未配对t检验，达到7.1×10-3的p值。使用配对t检验，比较对照组的结果与相应的测试组的结果，达到5.11×10-2的p值。这些p值均小于0.05，表明4层冻干的试验材料的横向UTF与4层冻干的对照材料相比，统计学上显著性降低。
关于8层材料，分布分析表明对照的8层真空压制的UTF最适合威布尔分布，它相应的平均UTF为10.78+/-3.35lbs。分布分析表明8层真空压制的试验材料的UTF最适合正态分布，它相应的平均UTF为7.46+/-2.45lbs。这些两组之间UTF的平均差异为31％。所有样品使用未配对t检验，达到6.4×10-5的p值。使用配对t检验，比较批匹配的对照组的结果与相应的测试组的结果，达到9.9×10-7的p值。这些p值均小于0.05，表明8层真空压制的测试材料的UTF与8层真空压制的对照材料相比，统计学上显著性降低。
实施例11
该实施例证明实施例1的处理的ECM材料显示血管原性特征。
由按以下方法处理的猪小肠粘膜下层(SIS)形成植入圆盘：对照的冻干(按美国专利号6,206,931的实施例1中所述制备)、对照的真空压制(按美国专利号6,206,931的实施例1中所述制备)、测试的冻干(按实施例1中所述制备)、测试的真空压制(按实施例1中所述制备)和伤口护理产品(PR)。在植入前用低温环氧乙烷循环将对照和测试圆盘灭菌。PR产品接受无菌和消毒处理。将各圆盘植入小鼠的皮下背侧，持续3周。在3周之后，探查各圆盘的毛细血管形成。使用荧光微血管造影术、完整功能性微血管系统的成像方法，定性测量血管发生。使用荧光微球的血管输注，接着使用二甲苯从植入物提取荧光物质，然后用荧光板读数器定量，测量血管(Vessell)容量作为血管发生的度量。最后，通过薄切片和H&E染色在组织学上检测植入物，以说明细胞向内生长。
荧光微血管造影术表明所有圆盘支持血管发生。测试的冻干圆盘具有与对照的冻干圆盘相似的结果。测试的真空压制圆盘表现优于对照的真空压制圆盘。PR圆盘具有明显少的血管生长，并且研究的两个样品仅一个区域具有任何的向内生长。PR圆盘的血管容量结果显著小于对照。测试的任何其它圆盘统计学上均没有差异。组织学证实微血管造影术的发现。冻干的对照圆盘和冻干的测试圆盘具有显著的纤维血管向内生长。真空压制的对照圆盘仅具有较少的渗透。真空压制的测试圆盘具有更多的细胞向内生长，反映微血管造影术的结果，但可能由于该材料的致密性质，所以在近边缘处还具有未结合SIS的迹象。在PR圆盘中明显可见非常少的细胞向内生长，提示非常少的功能性重塑的证据。
实施例12
该实施例提供在用于大鼠腹壁修复模型时，实施例1的处理的ECM与另一种处理的ECM的比较。
获得10批切开的猪小肠，并分成大约相等的两组。如在美国专利号6,206,931的实施例2中所述处理一组(在下文中称为″对照组″)。简而言之，未加工的肠首先用过氧乙酸处理，接着在两侧面摩擦，以分离粘膜下组织层，并冲洗。如在上面的实施例1中所述制备第二组(在下文中称为″测试组″)。
将各批材料制备成4层真空压制的试验移植物或4层真空压制的对照移植物。在大鼠腹部筋膜中形成2cm×2cm的缺损，并植入各移植物以提供修复。在2、4或8周之后，处死大鼠并除去移植物。从各移植物切除狗骨状片，测试其机械强度。
比较测试的移植物与其对照物在各时间点断裂时的机械强度。另外，在外植体记录任何并发症。记录的并发症包括感染、形成腹部粘连和形成血清肿。在各时间点，测试的移植物与相应的对照移植物相比具有相似的断裂时UTF。测试的移植物引发较少的宿主负反应。尤其是，在试验材料中在所有点仅记录到一个血清肿，而在对照移植物中看见了5个血清肿。最后，组织学表明测试的移植物重塑如果不比对照的移植物好，也与对照的移植物一样好。
实施例13
该实施例描述本发明的另一种处理的ECM材料的制备。
猪小肠得自包装工厂并切开和剖开，以显示其内部部分。在最初的清洁以除去在肠内包含的内容物之后，用机械在各侧面摩擦各肠，以除去粘膜层和浆膜层，并分离主要的结缔组织层包括粘膜下层，用于进一步处理。在室温下在1∶5(重量∶体积)99％异丙醇(IPA)溶液中处理粘膜下层30分钟。第二次重复该IPA处理步骤，接着用自来水冲洗粘膜下层两次。然后在37℃下在1∶10(重量∶体积)0.1％十二烷基硫酸钠(SDS)热溶液中处理粘膜下层1小时，接着在37℃下在1∶10(重量∶体积)89mM tris、硼酸盐、乙二胺四乙酸(TBE)热溶液中处理1小时。然后用自来水冲洗处理的粘膜下层两次。在冲洗之后，在室温下用1∶10(重量∶体积)0.2％PAA/5％特别变性的醇溶液处理粘膜下层2小时。在这些处理步骤之后，在室温下用1∶10(重量∶体积)高纯度水冲洗粘膜下层5分钟。在测试和释放之前重复该冲洗步骤共4次冲洗。测试冲洗水的pH、电导率和PAA含量。在消毒之后测试粘膜下层样品的生物负荷以及物理性质。
在描述本发明的上下文中(尤其在权利要求书的上下文中)，术语″一″和″该″以及相似的指示物的使用视为涵盖单数和复数，除非本文另有说明或与上下文明显的矛盾。本文数值的范围的引用仅将用作对落在该范围内的各单独的值分别提及的速记方法，除非本文另外指出，并且如同本文分别引用的那样，各单独的值结合到说明书中。可以按任何合适的顺序实施本文描述的所有方法，除非本文另有说明或另外与上下文明显地矛盾。本文提供的任何和所有实施例或示例性语言(例如″例如″)的使用，仅用于更好地阐述本发明，并不是对本发明的范围提出限制，除非另有要求。本说明书中的语言均不应解释为表示本发明的实践所必需的任何不要求的元件。
本文描述了本发明优选的实施方案，包括发明人已知的实施本发明的最佳模式。当然，在阅读前述说明书之后，那些优选的实施方案的变化对本领域的普通技术人员将是显而易见的。发明人期望熟练的技术人员必要时采用此类变化，且发明人打算按本文特别描述以外的方式实践本发明。因此，本发明包括在适用的法律允许的权利要求中所述主题的所有修改和等同物。此外，本发明包括上述元件在其所有可能的变化中的任何组合，除非本文另有说明或另外与上下文明显地矛盾。另外，本文引用的所有出版物均表现出本领域的普通技术人员的能力，并且如同通过引用和全文描述而单独结合那样，通过引用而整体结合到本文中。

Claims (26)

1.一种医学移植材料，所述医学移植材料包含：
无菌、去细胞化细胞外基质(ECM)材料，所述无菌、去细胞化细胞外基质(ECM)材料包括胶原和非胶原组分，其中所述ECM材料包含粘膜下层，以及其中所述非胶原组分包括：
(i)不大于20μg/g水平的天然IgA；
(ii)不大于4％重量水平的天然脂质；
(iii)至少10ng/g水平的天然FGF-2；
(iv)至少50μg/g水平的天然透明质酸；和
(v)至少500μg/g水平的天然硫酸酯化糖胺聚糖。
2.权利要求1的医学移植材料，其中所述粘膜下层是肠、膀胱或胃粘膜下层。
3.权利要求2的医学移植材料，其中所述粘膜下层是小肠粘膜下层(SIS)。
4.一种医学移植材料，所述医学移植材料包含：
无菌、去细胞化细胞外基质(ECM)材料，所述无菌、去细胞化细胞外基质(ECM)材料包括胶原和非胶原组分，其中所述ECM材料包含粘膜下层，以及其中所述非胶原组分包括不大于20μg/g水平的天然IgA、不大于4％重量水平的天然脂质、至少10ng/g水平的天然FGF-2、至少50μg/g水平的天然透明质酸和至少500μg/g水平的天然糖胺聚糖。
5.权利要求4的医学移植材料，其中所述ECM材料包括不大于15μg/g水平的天然IgA。
6.权利要求4的医学移植材料，其中所述ECM材料包括不大于10μg/g水平的天然IgA。
7.权利要求4的医学移植材料，其中所述ECM材料包括不大于5μg/g水平的天然IgA。
8.权利要求4的医学移植材料，其中所述ECM材料基本上不含天然IgA。
9.权利要求4的医学移植材料，其中所述ECM材料包括的脂质含量不大于3%。
10.权利要求4的医学移植材料，其中所述ECM材料成形为片、凝胶、非胶凝含水组合物、粉末或海绵中的一种或多种。
11.权利要求10的医学移植材料，其中将所述ECM材料成形为片并冻干。
12.权利要求11的医学移植材料，其中所述ECM材料形成至少两个ECM层，且其中所述至少两个ECM层互相偶合。
13.权利要求4-12中任一项的医学移植材料，其中所述粘膜下层是肠、膀胱或胃粘膜下层。
14.权利要求13的医学移植材料，其中所述粘膜下层是小肠粘膜下层(SIS)。
15.一种医学移植材料，所述医学移植材料包含：
无菌、去细胞化细胞外基质材料，所述无菌、去细胞化细胞外基质材料显示血管源性特征并包括不大于20μg/g水平的天然IgA、不大于4％重量水平的天然脂质、至少10ng/g水平的天然FGF-2、至少50μg/g水平的天然透明质酸和至少500μg/g水平的天然糖胺聚糖，以及其中所述ECM材料包含粘膜下层。
16.权利要求15的医学移植材料，其中所述粘膜下层是肠、膀胱或胃粘膜下层。
17.权利要求16的医学移植材料，其中所述粘膜下层是小肠粘膜下层(SIS)。
18.权利要求1-17中任一项的医学移植材料在制备用于治疗患者的药物中的用途。
19.一种制备医学移植材料的方法，所述方法包括：
提供含有天然IgA、天然脂质、天然FGF-2、天然透明质酸，和天然硫酸酯化糖胺聚糖的起始细胞外基质(ECM)材料，以及其中所述ECM材料包含粘膜下层；和
有效地处理所述起始ECM材料，以保留所述天然FGF-2在至少10ng/g的水平，所述天然透明质酸在至少50μg/g的水平，以及所述天然硫酸酯化糖胺聚糖在至少500μg/g的水平，而减少所述天然IgA含量至低于20μg/g的水平，以及所述天然脂质至不大于4％重量，以及其中所述处理包括使所述起始细胞外基质材料与清洁剂水溶液接触。
20.权利要求19的方法，所述方法还包括在所述处理步骤之后冲洗所述ECM材料，以便从所述材料除去至少90％的清洁剂残留物。
21.一种细胞外基质材料，所述材料包含：
从温血脊椎动物分离的基本上无细胞的细胞外基质(ECM)材料，所述ECM材料的天然FGF-2含量为至少10ng/g，且脂质含量不大于4％，以及不大于20μg/g水平的天然IgA，至少50μg/g水平的天然透明质酸，以及至少500μg/g水平的天然糖胺聚糖，以及其中所述ECM材料包含粘膜下层。
22.一种细胞外基质材料，所述细胞外基质材料包含：
从温血脊椎动物分离的基本上无细胞的细胞外基质(ECM)材料，所述ECM材料保留不大于20μg/g水平的天然IgA、不大于4％重量水平的天然脂质、至少10ng/g水平的天然FGF-2、至少50μg/g水平的天然透明质酸和至少500μg/g水平的天然糖胺聚糖，且具有水平低于200个/0.263mm2的可见细胞核，以及其中所述ECM材料包含粘膜下层。
23.一种细胞外基质材料，所述细胞外基质材料包含：
从温血脊椎动物分离的基本上无细胞的细胞外基质(ECM)材料，所述ECM材料保留不大于20μg/g水平的天然IgA、不大于4％重量水平的天然脂质、至少10ng/g水平的天然FGF-2、至少50μg/g水平的天然透明质酸和至少500μg/g水平的天然糖胺聚糖，且具有含量低于2微克/克的核酸，以及其中所述ECM材料包含粘膜下层。
24.一种细胞外基质材料，所述细胞外基质材料包含：
从温血脊椎动物分离的基本上无细胞的细胞外基质(ECM)材料，所述ECM材料保留至少10ng/g水平的天然FGF-2、至少50μg/g水平的天然透明质酸和至少500μg/g水平的天然糖胺聚糖，且具有含量低于20微克/克的免疫球蛋白，以及含量小于4％重量水平的天然脂质，以及其中所述ECM材料包含粘膜下层。
25.一种细胞外基质材料，所述细胞外基质材料包含：
从温血脊椎动物分离的基本上无细胞的细胞外基质(ECM)材料，所述ECM材料具有不大于4％的脂质含量，不大于20μg/g水平的天然IgA，至少10ng/g水平的天然FGF-2，至少50μg/g水平的天然透明质酸，至少500μg/g水平的天然糖胺聚糖，且显示低于12EU/克的内毒素水平，以及其中所述ECM材料包含粘膜下层。
26.权利要求25的细胞外基质材料，其中所述材料显示低于5EU/克的内毒素水平。
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