CN110975011B - 一种皮肤溃疡修复基质的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种皮肤溃疡修复基质的制备方法，包括：将完成脱细胞去抗原和灭活处理的胶原膜组织用碱液浸泡进行增厚处理，然后用0.01～0.05M PBS溶液进行清洗至pH为6～7为止，并用所述PBS溶液浸泡1～6小时得到皮肤溃疡修复基质，然后用10～25kGy钴60辐照灭菌后备用。本发明提供的皮肤看溃疡修复基质的保护、支撑、屏障作用以及三维立体空间结构引导细胞长入和组织再生等的作用，能够有效保护促进创面的修复，较少瘢痕的形成。

Description

一种皮肤溃疡修复基质的制备方法

技术领域

本发明属于组织工程技术领域，涉及一种皮肤溃疡修复基质的制备方法。

背景技术

皮肤是人体的第一道防御屏障，具有维持机体稳态的重要功能，因此 无论何种原因引起的皮肤缺失性损伤，都需要及时给予治疗。小面积浅层皮 肤损伤是可以通过人体自身调节自行修复的，但伤口直径大于20cm或深至真皮层以及慢性皮肤溃疡患者，需要通过其他手段加以治疗。

慢性皮肤溃疡(chronicskinulcer，CSU)又叫难治性溃疡，是一种临床常见疾病。糖尿病足和静脉溃疡等都属于难治性溃疡。近年来随着人们生活水平提高以及社会老龄化，糖尿病(diabctesmellitus，DM)发病率逐年攀升。目前我国糖尿病患者约9200万，其中15％～25％的患者会患有足部溃疡。若不加以治疗，可能会导致截肢。

对于治疗各种皮肤缺损，传统的植皮方法存在诸多不能克服的缺点，如会造成多处创面，增加患者的痛苦；不能满足大面积植入的需求等。另外，如糖尿病足和静脉溃疡等一些难治性溃疡创面也无法通过简单植皮实现创面愈合。皮肤溃疡修复基质则为这些难题提供了解决的途径。

组织工程皮肤一般通过种子细胞和支架材料制备而成。支架材料的种类较多，但由于材料本身性质和处理方法等所限，目前报道的支架不能很好的满足细胞增殖要求或制备工艺繁琐。细胞外基质(extracellularmatrix，ECM) 是结缔组织中细胞外物质的总称，是一种很好的支架材料。它能够对生长因子起到存储、显示及释放的作用。已有很多报道证明细胞外基质能够有效的引导纤维细胞长入并促进新生血管形成。接种的细胞分泌的生长因子对溃疡、 烧烫伤等创面愈合过程有重要影响。生长因子可以直接促进移植细胞的增殖与分化，还可维持其生物功能；溃疡、深度烧烫伤等创面局部生长因子及其受体的活性下降和数量的相对或绝对的缺乏是创面难以愈合的病理生理基 础。

专利申请号为200910078357.0的中国发明专利(专利权已失效)公开了 一种以人源表皮细胞为种子细胞，人源成纤维细胞分泌形成的细胞外基质为生物支架构建组织工程皮肤的方法。该方法存在培养时间长(一般为20～50 天)、成本高和工艺复杂的缺陷。

专利申请号为200810116108.1的中国发明专利(专利权已失效)提及了一种以人源成纤维细胞为种子细胞，接种于凝胶生物材料中构建组织工程皮 肤的方法。该方法同样存在培养周期长(一般为15～20天)、成本高、工艺 复杂等缺点。

专利申请号为201510100264.9的中国发明专利申请，公开了一种组织工 程皮肤及其应用，其是以脱细胞真皮基质(Acellular dermal matrix，ADM) 作为支架材料，脐带间充质干细胞为种子细胞构建的组织工程皮肤。该技术 虽然缩短了培养时间，但在制备过程中需要在脱细胞真皮基质表面包被一层明胶，然后进行多次接种，并在ADM表面进行扎孔后培养一段时间，才可以 达到细胞膜覆盖ADM表面的效果。若不包被明胶则无法得到表面具有完整细胞膜的产品。该种制备方法不仅没有使脱细胞基质在细胞培养时充分发挥自身作用，而且工艺较为繁琐，成本高，不适合产业化。而且，这种制备方法也只能在ADM表面形成单层细胞膜，而细胞分泌的生长因子作为一种蛋白质会在体内快速降解，因而单层的细胞膜分泌生长因子的量远远不能满足调节创面微环境的作用，从而使其对创面的修复效果有限。另外，目前已报道的 组织工程皮肤类产品几乎都存在同样的问题，即由于产品形态而导致保质期 短，对存储条件和运输要求高的缺点。

发明内容

本发明的目的是解决现有的组织工程皮肤构建方法存在的培养周期长、成本高、工艺复杂、不适合产业化、不能满足调节创面微环境的作用，从而使其对创面的修复效果有限、保质期短，对存储条件和运输要求高的缺点。

为此，本发明提供了一种皮肤溃疡修复基质的制备方法，主要是采用脱细胞、去抗原和增厚处理后的天然细胞外基质作为生物支架，复合种子细胞在天然细胞外基质表面形成具有多层细胞的细胞膜，经冷冻干燥处理后即得皮肤溃疡修复基质；

所述种子细胞是自体或同种异体来源的成纤维细胞或干细胞。上述皮肤溃疡修复基质的制备方法，具体包括以下步骤：

1)步骤一、细胞外基质的制备：将完成脱细胞去抗原和灭活处理的胶原膜组织用碱液浸泡进行增厚处理，然后用0.01～0.05MPBS溶液进行清洗至pH为6～7为止，并用所述PBS溶液浸泡1～6小时得到细胞外基质，然后用10～25kGy钴60辐照灭菌后备用；

2)步骤二、培养基的配制：

2.1)、配制基础液：按9:1的体积比将DMEM/F12商用培养液与胎牛血清或新生牛血清混合为基础液；

2.2)、配制基础培养基：按500ml所述基础液标准加入胰岛素1～100ng，转铁蛋白1～50mg，亚硒酸钠1～30μg，氢化可的松10～600μg，表皮细胞生长因子1～20μg，碱性成纤维细胞生长因子1～100ng，转化生长因子β1～100ng，维生素C1～100mg，配制成基础培养基；

2.3)、配制培养基：向所述基础培养基中分别添加牛垂体提取液10～30μg/ml、腺嘌呤1～50mg、HRG50～300ng/ml和血小板衍生因子1～20ng/ml，分别配制成以下四种不同的培养基：

培养基a：基础培养基+牛垂体提取液10～30μg/ml；

培养基b：基础培养基+腺嘌呤1～100μg/ml；

培养基c：基础培养基+HRG50～300ng/ml；

培养基d：基础培养基+血小板衍生因子1～20ng/ml；

其中，所述牛垂体提取液、腺嘌呤、HRG和血小板衍生因子的浓度为终浓度；

3)步骤三、种子细胞的分离和体外培养：采用组织贴壁法从所需的组织中进行种子细胞的分离，或采用酶消化法从所需的组织中进行种子细胞的分离，或差速贴壁法从所需的组织中进行种子细胞的分离；

并用F12或MEM或DMEM或RPMI-1640培养基混合5％～20％的胎牛血清进行体外传代培养，培养温度为25～38℃，3％～7％的CO₂浓度；

4)步骤四、接种细胞和三维培养：在无菌环境下，按1×10⁴～10×10⁶个/cm²的接种密度在所述步骤一制备的细胞外基质上进行细胞接种，接种时刺入所述细胞外基质0.2～1mm进行接种，每次注入0.5～1.0ml，针孔密度为0.1～0.5个/cm2，并在所述细胞外基质表面进行点状接种，然后通过轻微振荡使所述种子细胞均匀分布在所述细胞外基质表面；

在37℃、5％的CO₂培养箱中，使接种后的细胞外基质完全浸没于培养基a中，培养1～2天，之后更换培养基b，浸没所述接种后的细胞外基质，培养1～2天后更换为培养基c，培养基c液面与所述接种后的细胞外基质平齐，继续培养1～2天后更换为培养基d，同样浸没所述接种后的细胞外基质，培养1～2天；培养期间每天换液；

5)步骤五、冻干包装和灭菌：将所述步骤三培养完成的样品进行冻干，控制冻干程序以5～12℃/min的速率降至-80～-20℃，保持1～4小时后，冷冻干燥10～24小时，之后进行包装，再以10～25kGy钴60辐照灭菌后即得皮肤溃疡修复基质。

上述碱液浸泡处理系指在室温条件下，用1M碱溶液浸泡5～30min，或用1‰～1％的次氯酸钠浸泡1～2小时，进行浸泡处理，使所述胶原膜组织的厚度增加2～7倍。

上述碱溶液是氢氧化钠碱溶液、碳酸氢钠碱溶液，碳酸钠碱溶液和氢氧化钾碱溶液中的任一种。

上述胶原膜组织的厚度增加3～5倍。

上述步骤一中在制备的所述细胞外基质上均匀打孔处理后，然后用10～25kGy钴60辐照灭菌后备用；

所述孔的孔径为0.5～2mm，所述孔的孔密度为0.2～1个/cm₂，灭菌后备用。

上述胶原膜组织是同种异体皮肤和羊膜中的任一种；

或牛、猪来源的皮肤、心包膜和腹膜中的任一种。

上述干细胞是脐带间充质干细胞、脐血间充质干细胞、皮肤干细胞、口腔黏膜干细胞和牙髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、造血干细胞、肝脏干细胞、神经干细胞中的任一种。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

(1)本发明涉及的方法，单次接种即实现在细胞外基质表面形成多层细胞膜的效果，保证在修复创面时能够分泌足够量的多种细胞因子，诱导新生血管形成，促进创面愈合。加之天然细胞外基质的保护、支撑、屏障作用以及三维立体空间结构引导细胞长入和组织再生等的作用，能够有效保护促进创面的修复，较少瘢痕的形成。

(2)用碱液浸泡脱细胞处理后的胶原膜，不仅方法简单，而且使得到的细胞外基质胶原纤维结构更加疏松。这种疏松的胶原纤维结构不仅为细胞的生长增殖提供了更加适宜的三维空间结构，而且保证了培养基中的营养成分能够快速的交换渗透，极大的促进了细胞的增殖。之后用PBS溶液进行清洗浸泡，不仅去除了残留的试剂，而且改善了细胞生长增殖的微环境。使形成复层化细胞膜更加紧密的粘附在细胞外基质上，甚至能够使细胞部分长入基质中，也延长了细胞因子发挥作用的时间。

(3)采用冻干的方式进行处理，不仅保证了产品具有预期的使用效果，并且能够延长保质期，大大降低了运输和储存的要求。

(4)制备周期短，工艺简单，适合产业化，适用范围宽，创面修复效果好，减少瘢痕形成，愈合的创面与正常皮肤的弹性和韧性相近。

附图说明

图1A是经碱液浸泡处理后的牛心包膜的HE图片。

图1B是经碱液浸泡处理后的牛心包膜的HE图片。

图2A为培养2天后细胞外基质表面细胞膜的扫描电镜图。

图2B为培养3天后细胞外基质表面细胞膜的扫描电镜图。

图2C为培养5天后细胞外基质表面细胞膜的扫描电镜图。

图3为细胞外基质上单次接种细胞培养5天后的HE染色结果。

图4A为大鼠烧烫伤创面使用皮肤溃疡修复基质治疗后1w(1周)的实物图。

图4B为对照组治疗大鼠烧烫伤创面1w(1周)后的实物图。

图4C为大鼠烧烫伤创面使用皮肤溃疡修复基质治疗后3w(3周)的实物图。

图4D为对照组治疗大鼠烧烫伤创面3w(3周)后的实物图。。

具体实施方式

为了解决现有的组织工程皮肤构建方法存在的培养周期长、成本高、工艺复杂、不适合产业化、不能满足调节创面微环境的作用，从而使其对创面的修复效果有限、保质期短，对存储条件和运输要求高的缺点，本实施例提供了一种皮肤溃疡修复基质的制备方法：将种子细胞直接接种在经特殊处理的细胞外基质上，实现了细胞外基质表面细胞复层化和细胞外基质内部部分细胞长入的效果，并将其进行冻干灭菌处理，所制备的皮肤溃疡修复基质能够有效的促进糖尿病足部溃疡、静脉溃疡、深度烧烫伤等慢性伤口的愈合，并能减少瘢痕的形成，愈合的创面与正常皮肤的弹性和韧性相近。

该皮肤溃疡修复基质的制备方法具体是采用脱细胞、去抗原和增厚处理后的天然细胞外基质作为生物支架，复合种子细胞在天然细胞外基质表面形成多层细胞的细胞膜(具有2～10层细胞膜的细胞)，经冷冻干燥处理后即得皮肤溃疡修复基质；其中涉及的种子细胞是自体或同种异体来源的成纤维细胞或胚胎或干细胞。

按照制备过程，该皮肤溃疡修复基质的制备方法，主要包括细胞外基质的制备、培养基的配制、种子细胞的分离和体外培养、接种细胞和三维培养、冻干等步骤；具体制备过程如下：

步骤一、细胞外基质的制备：

脱细胞：用于制备细胞外基质的胶原膜组织在除去脂肪和其他杂物后，进行脱细胞去抗原和灭活处理，具体的处理方法可参照专利申请号为CN201110145229.0、CN201210251134.1、CN201310358048.5、CN201310117569.1和CN201310109216.7中记载的任一种脱细胞去抗原和灭活处理方式均可。如专利申请号为CN201310109216.7中提及的方法：将前处理完成的胶原膜置于2.0M氯化钾和0.1M的氨水混合溶液中浸泡60分钟，之后更换用等量的纯化水震摇1小时，如此交替循环处理3次，最后用纯化水清洗至pH值6.0～8.0。

细胞外基质的获取：将上述处理完成的胶原膜组织(简称胶原膜)用1M碱溶液浸泡5～30min，如氢氧化钠溶液、碳酸氢钠溶液，碳酸钠溶液、氢氧化钾溶液等，或用1‰～1％的次氯酸钠浸泡1～2小时，使胶原膜的厚度增加2～7倍，较优的是增厚3～5倍。然后用大量的0.01～0.05MPBS溶液进行清洗至pH为6～7为止，并用PBS溶液浸泡1～6小时得到细胞外基质。该步骤是通过碱液的作用使胶原膜的胶原纤维结构更加疏松，图1B所示(与图1A相比，说明碱液处理可有效的疏松胶原纤维结构)，便于细胞更好的粘附甚至长入，使产品的结构和性能更加稳定。

另外用PBS溶液清洗浸泡不仅可使胶原膜内部微环境更加适合细胞生长增殖，而且能够去除其他残留试剂，保证细胞外基质不会对细胞的增殖产生任何负面影响。然后将细胞外基质裁切成一定的规格，如圆形、矩形等，也可在细胞外基质上进行打孔(分为打通和不打通，孔径0.5～2mm)处理，使孔均匀分布在细胞外基质上，孔密度为0.2～1个/cm²，10～25kGy钴60辐照灭菌后备用。

不难看出，此时这里的细胞外基质为经过碱液增厚处理的脱细胞胶原膜，主要成分为Ⅰ、Ⅲ型胶原，包括同种异体皮肤、羊膜等，也包括如牛、猪等异种来源的皮肤、心包膜、腹膜等组织膜类。不仅与人体皮肤的成分相近，而且具有一定的弹性与韧性，几乎无免疫原性。同时处理后的胶原膜具有更加疏松的三维立体空间结构，能够引导细胞和长入和组织再生，使愈合的创面具有接近正常皮肤的特性，还能抑制瘢痕形成。

步骤二：培养基的配制：

按9:1的体积比将DMEM/F12商用培养液与胎牛血清或新生牛血清混合为基础液；再按500ml基础液标准加入胰岛素1～100ng，转铁蛋白1～50mg，亚硒酸钠1～30μg，氢化可的松10～600μg，表皮细胞生长因子1～20μg，碱性成纤维细胞生长因子1～100ng，转化生长因子β1～100ng，维生素C1～100mg，配制成基础培养基，再用基础培养基配制成以下培养基，其中添加物的浓度为终浓度：

培养基a：基础培养基+牛垂体提取液10～30μg/ml；

培养基b：基础培养基+腺嘌呤1～100μg/ml；

培养基c：基础培养基+HRG50～300ng/ml；

培养基d：基础培养基+血小板衍生因子1～20ng/ml；

添加的牛垂体提取液、腺嘌呤、HRG、血小板衍生因子都具有促进细胞生长增殖的效果，有助于实现细胞膜复层化。

步骤三、种子细胞的分离和体外培养：可参考现有技术进行相关种子细胞的分离和体外培养，如采用组织贴壁法从所需的胶原膜组织中进行种子细胞的分离，或采用酶消化法从所需的胶原膜组织中进行种子细胞的分离，或差速贴壁法从所需的胶原膜组织中进行种子细胞的分离；并用F12或MEM或DMEM或RPMI-1640培养基混合5％～20％的胎牛血清进行体外传代培养，培养温度为25～38℃，3％～7％的CO₂浓度。

步骤四、接种细胞和三维培养：在无菌环境下，按1×10⁴～10×10⁶个/cm2 的接种密度在细胞外基质上进行细胞接种。接种时用顶端尖锐的器具刺入细胞外基质0.2～1mm进行“打针式”接种即注射其中，每次注入0.5～1.0ml，针孔密度为0.1～0.5个/cm²，并在细胞外基质表面进行点状接种即逐滴滴在细胞外基质表面上，然后通过轻微振荡使细胞均匀分布在细胞外基质表面。培养条件：37℃，5％CO₂，在37℃、5％的CO₂培养箱中，使接种后的细胞外基质完全浸没于培养基a中，培养1～2天，之后更换培养基b，浸没所述接种后的细胞外基质，培养1～2天后更换为培养基c，培养基c液面与所述接种后的细胞外基质平齐，继续培养1～2天后更换为培养基d，同样浸没所述接种后的细胞外基质，培养1～2天；培养期间每天换液。

这里提及的细胞即为种子细胞，是自体或同种异体来源的成纤维细胞、干细胞，如脐带间充质干细胞、脐血间充质干细胞、皮肤干细胞、口腔黏膜干细胞和牙髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、造血干细胞、肝脏干细胞和神经干细胞中等。

接种的较优选择是在细胞外基质的粗糙面上进行接种，因为粗糙面的胶原纤维结构更加疏松，能够更好的为细胞的生长增殖提供三维立体空间。加之步骤一中的碱液浸泡疏松了胶原纤维(胶原膜)的结构，使得到的细胞外基质具有更加适宜细胞生长增殖的立体空间，最终使得细胞易于紧密粘附在细胞外基质上，甚至引导细胞长入其中。另外，此接种方法也增加了使细胞对细胞外基质的粘附性，并在其的表面形成复层化的细胞膜，如图2A、图2B、图2C(细培养后的胞外基质表面的细胞膜呈复层化)和图3所示，在碱液处理后的细胞外基质表面紧密粘附了多层细胞，内部浅层也分布了一定量的细胞)。

步骤五、冻干包装和灭菌：将培养完成的样品进行冻干，控制冻干程序以5～12℃/min的速率降至-80～-20℃，保持1～4小时后，冷冻干燥10～24小时，得到冻干后的样品。对样品进行包装，再次10～25kGy钴60辐照灭菌后得到皮肤溃疡修复基质。

通过该方法得到的皮肤溃疡修复基质，移植后产品中的丰富的细胞因子首先发挥作用，调节创面不利细胞和组织再生的微环境，解除微循环毛细血管痉挛，从而促进上皮再生修复和皮肤血管重塑。此时，细胞外基质的作用主要是保护创面，保持湿润环境，释放细胞因子等。当有新生血管和肉芽组织出现后，细胞外基质的作用便突显出来，其天然的三维立体结构能够有效的引导细胞长入，能够保护促进创面愈合，并能够防止形成的胶原纤维过度累积，较少瘢痕的形成，愈合的创面与正常皮肤的弹性和韧性相近。

以下结合实例对本发明技术方案做进一步的详细说明。

实施例1

将牛心包膜进行脱细胞处理清洗完成后，在室温条件下用1M氢氧化钠溶液浸泡5min，之后用大量的0.01MPBS溶液进行清洗至pH为7左右。此时牛心包膜厚度增加了3～4倍。然后将牛心包膜浸没在PBS溶液中2h。将牛心包膜剪切成10cm的圆形，10kGy钴60辐照灭菌后备用。

按9:1的体积比将DMEM/F12商用培养液与10％的胎牛血清混合为基础液；再按500ml基础液标准加入胰岛素50ng，转铁蛋白30mg，亚硒酸钠10μg，氢化可的松60μg，表皮细胞生长因子20μg，碱性成纤维细胞生长因子40ng，转化生长因子β20ng，腺嘌呤10mg，维生素C30mg。

将灭菌后的牛心包膜平铺在直径为10cm的无菌培养皿上，轻轻按压使其完全贴附在培养皿底部。取于新生儿脐带，以传代培养至2～6代的脐带间充质干细胞为种子细胞，按5×10⁵/cm²的接种密度在牛心包膜粗糙面上进行接种。接种时先用2ml的无菌注射器刺入牛心包膜1mm，每次注入0.5ml，针孔密度为0.5个/cm²，多个点均匀接种，然后将细胞液滴在牛心包表面，轻轻振荡使其均匀覆盖在牛心包上。加入适量配制的培养基a使其刚刚浸没牛心包膜，贴壁生长2小时，然后再补加培养基a使其液面距离牛心包膜表面1cm左右，放入37℃5％CO₂培养箱中进行振荡培养，培养1天，之后更换培养基b，淹没牛心包膜，培养2天后更换为培养基c，液面与牛心包膜平齐，继续培养1天后更换为培养基d，同样浸没牛心包膜，培养2天。培养期间每天换液。

用无菌PBS溶液反复清洗培养完成的牛心包膜，然后控制冻干程序以5℃/min的速率降至-80℃，保持1小时后，冷冻干燥10小时。冻干后进行包装，再次10kGy钴60辐照灭菌后得到皮肤溃疡修复基质。

实施例2

将牛心包膜进行脱细胞处理清洗完成后，在室温条件下用1‰次氯酸钠溶液浸泡2h，之后用大量的0.05MPBS溶液进行清洗至pH为7左右。此时牛心包膜厚度增加了3～6倍。然后将牛心包膜浸没在PBS溶液中6h。将牛心包膜剪切成10cm的圆形，25kGy钴60辐照灭菌后备用。

按9:1的体积比将DMEM/F12商用培养液与10％的胎牛血清混合为基础液；再按500ml基础液标准加入胰岛素60ng，转铁蛋白50mg，亚硒酸钠20μg，氢化可的松100μg，表皮细胞生长因子20μg，碱性成纤维细胞生长因子50ng，转化生长因子β40ng，牛垂体提取液5mg，维生素C50mg。

将灭菌后的牛心包膜平铺在直径为10cm的无菌培养皿上，轻轻按压使其完全贴附在培养皿底部。以由人皮肤经胰蛋白酶处理、分离并体外培养的表皮干细胞为种子细胞，按1×10⁴/cm²的接种密度在牛心包膜粗糙面上进行接种。接种时先用2ml的无菌注射器刺入牛心包膜0.5mm，每次注入0.6ml，针孔密度为0.3个/cm²，多个点均匀接种，然后将细胞液滴在牛心包表面，轻轻振荡使其均匀覆盖在牛心包上。加入适量配制的培养基a使其刚刚浸没牛心包膜，贴壁生长2小时。然后再补加培养基a使其液面距离牛心包膜表面1cm左右。放入37℃5％CO2培养箱中进行振荡培养。培养2天，之后更换培养基b，淹没牛心包膜，培养1天后更换为培养基c，液面与牛心包膜平齐，继续培养2天后更换为培养基d，同样浸没牛心包膜，培养2天。培养期间每天换液。

用无菌PBS溶液反复清洗培养完成的牛心包膜，然后控制冻干程序以12℃/min的速率降至-20℃，保持4小时后，冷冻干燥24小时。冻干后进行包装，再次25kGy钴60辐照灭菌后得到皮肤溃疡修复基质。

实施例3

将猪腹膜进行脱细胞处理清洗完成后，在室温条件下用1％次氯酸钠溶液浸泡1h，之后用大量的0.05MPBS溶液进行清洗至pH为7左右。此时猪腹膜厚度增加了4～7倍。然后将猪腹膜浸没在PBS溶液中6h。将猪腹膜剪切成10cm的圆形，10kGy钴60辐照灭菌后备用。

按9:1的体积比将DMEM/F12商用培养液与10％的新生牛血清混合为基础液；再按500ml基础液标准加入胰岛素10ng，转铁蛋白1mg，亚硒酸钠1μg，氢化可的松600μg，表皮细胞生长因子1μg，碱性成纤维细胞生长因子100ng，转化生长因子β100ng，HRG15mg，维生素C100mg。

将灭菌后的猪腹膜平铺在直径为10cm的无菌培养皿上，轻轻按压使其完全贴附在培养皿底部。以体外培养脐带血干细胞为种子细胞，按10×10⁷/cm²的接种密度在猪腹膜粗糙面上进行接种。接种时先用2ml的无菌注射器刺入牛心包膜0.2mm，每次注入1ml，针孔密度为0.4个/cm2，多个点均匀接种，然后将细胞液滴在猪腹膜表面，轻轻振荡使其均匀覆盖在猪腹膜上。加入适量配制的培养基a使其刚刚浸没猪腹膜，贴壁生长2小时。然后再补加培养基a使其液面距离猪腹膜表面1cm左右，放入37℃5％CO₂培养箱中进行振荡培养，培养2天，之后更换培养基b，淹没猪腹膜，培养1天后更换为培养基c，液面与猪腹膜平齐，继续培养2天后更换为培养基d，同样浸没猪腹膜，培养1天。培养期间每天换液；

用无菌PBS溶液反复清洗培养完成的猪腹膜，然后控制冻干程序以8℃/min的速率降至-40℃，保持3小时后，冷冻干燥16小时。冻干后进行包装，再次25kGy钴60辐照灭菌后得到皮肤溃疡修复基质。

实施例4

将猪真皮进行脱细胞处理清洗完成后，在室温条件下用1M氢氧化钾溶液浸泡1h，之后用大量的0.05MPBS溶液进行清洗至pH为7左右。此时猪真皮厚度增加了2～4倍。然后将猪真皮浸没在PBS溶液中4小时。将猪真皮剪切成10cm的圆形，15kGy钴60辐照灭菌后备用。

按9:1的体积比将DMEM商用培养液与10％的新生牛血清混合为基础液；再按500ml基础液标准加入胰岛素1ng，转铁蛋白10mg，亚硒酸钠5μg，氢化可的松80μg，表皮细胞生长因子15μg，碱性成纤维细胞生长因子30ng，转化生长因子β70ng，血小板衍生因子5mg，维生素C80mg。

将灭菌后的猪真皮平铺在直径为10cm的无菌培养皿上，轻轻按压使其完全贴附在培养皿底部。以新生儿包皮经酶消化处理、分离体外培养得到的成纤维细胞为种子细胞，按5×10⁶/cm²的接种密度在猪腹膜粗糙面上进行接种。接种时先用2ml的无菌注射器刺入猪真皮0.3mm，每次注入0.1ml，针孔密度为0.1个/cm²，多个点均匀接种，然后将细胞液滴在猪真皮表面，轻轻振荡使其均匀覆盖在猪真皮上。加入适量配制的培养基a使其刚刚浸没猪真皮，贴壁生长2小时，然后再补加培养基a使其液面距离猪真皮表面1cm左右。放入37℃5％CO₂培养箱中进行振荡培养，培养1天，之后更换培养基b，淹没猪真皮，培养1天后更换为培养基c，液面与猪真皮平齐，继续培养2天后更换为培养基d，同样浸没猪真皮，培养1天。培养期间每天换液；

用无菌PBS溶液反复清洗培养完成的猪真皮，然后控制冻干程序以6℃/min的速率降至-60℃，保持3小时后，冷冻干燥20小时。冻干后进行包装，再次15kGy钴60辐照灭菌后得到皮肤溃疡修复基质。

实施例5

SD大鼠10只，体重200～250g，雌雄各半，分笼饲养3d(英文day的简写，“天”的意思)，烫伤前一天禁食，并以戊巴比妥钠(35mg/kg)腹腔注射麻醉，背部剃毛，擦干皮肤。以脊柱为中线，在大鼠的背部两侧分别用自控手持烫伤仪制造直径为2cm的圆形创面，烫伤温度为80℃，烫伤时间为5s。同时腹腔注射10mL林格氏液抗休克，分笼饲养。经组织病理学检查得知烫伤程度为深Ⅱ度。烫伤3d后去除坏死皮肤组织，对创面进行处理，然后将复水后的皮肤溃疡修复基质(材料组)和未接种细胞的牛心包膜(对照组)剪裁成适合的尺寸，分别覆盖在创面上，缝合，打包固定。腹腔内注射含青霉素的生理盐水(20000IU/mL)0.2mL预防感染，大鼠分笼饲养。

1w(材料组,图4A；对照组图4B，w为周的英文week的简写)和3w(材料组图4C；对照组图4D)后拍照结果显示：

在移植后1w，材料组能与大鼠的自体皮肤较好的融合，随着时间延长，移植物中毛细血管的数量逐渐增多，3w后基本愈合，瘢痕较少。对照组未完全愈合，移植区瘢痕形成，颜色较深。结果表明材料组在烧/烫伤创面愈合过程中能促进创面愈合、减少瘢痕形成。

观察应用材料组合对照组后创面的愈合时间、创面愈合率、创面的炎症反应以及有无过敏反应等情况。其中创面愈合率的计算时间点选取术后11天、18天、25天进行，计算公式为：

固定时间创面愈合率＝(治疗前创面面积－固定时间创面面积)/治疗前创面面积×100％。

在观察过程中材料组前期炎症反应较小，无过敏反应出现，创面愈合时间和愈合率结果如表1所示。表明应用材料组后创面的平均愈合时间为18天，对照组为25天。应用材料组的创面修复效果明显优于对照组。

表1.深Ⅱ度烧/烫伤创面愈合时间和愈合率

	材料组	对照组
			创面愈合时间（天）	18	25
愈合率（烫后11天，%）	88	18
			愈合率（烫后18天，%）	100	67
愈合率（烫后25天，%）		97

Claims (5)

1.细胞外基质在制备皮肤溃疡修复基质中的应用，其特征在于，采用脱细胞、去抗原和增厚处理后的天然细胞外基质作为生物支架，复合种子细胞在天然细胞外基质表面形成具有多层细胞的细胞膜，经冷冻干燥处理后即得皮肤溃疡修复基质；

所述种子细胞是自体或同种异体来源的成纤维细胞或干细胞；

所述皮肤溃疡修复基质的制备方法，具体包括以下步骤：

步骤一、细胞外基质的制备：将完成脱细胞去抗原和灭活处理的胶原膜组织用碱液浸泡进行增厚处理，然后用0.01～0.05M PBS溶液进行清洗至pH为6～7为止，并用所述PBS溶液浸泡1～6小时得到细胞外基质，然后用10～25kGy钴60辐照灭菌后备用；

步骤二、培养基的配制：

1)、配制基础液：按9:1的体积比将DMEM/F12商用培养液与胎牛血清或新生牛血清混合为基础液；

2)、配制基础培养基：按500ml所述基础液标准加入胰岛素1～100ng，转铁蛋白1～50mg，亚硒酸钠1～30μg，氢化可的松10～600μg，表皮细胞生长因子1～20μg，碱性成纤维细胞生长因子1～100ng，转化生长因子β1～100ng，维生素C1～100mg，配制成基础培养基；

3)、配制培养基：向所述基础培养基中分别添加牛垂体提取液10～30μg/ml、腺嘌呤1～50mg、HRG50～300ng/ml和血小板衍生因子1～20ng/ml，分别配制成以下四种不同的培养基：

培养基a：基础培养基+牛垂体提取液10～30μg/ml；

培养基b：基础培养基+腺嘌呤1～100μg/ml；

培养基c：基础培养基+HRG50～300ng/ml；

培养基d：基础培养基+血小板衍生因子1～20ng/ml；

其中，所述牛垂体提取液、腺嘌呤、HRG和血小板衍生因子的浓度为终浓度；

步骤三、种子细胞的分离和体外培养：采用组织贴壁法从所需的组织中进行种子细胞的分离，或采用酶消化法从所需的组织中进行种子细胞的分离，或差速贴壁法从所需的组织中进行种子细胞的分离；并用F12或MEM或DMEM或RPMI-1640培养基混合5％～20％的胎牛血清进行体外传代培养，培养温度为25～38℃，3％～7％的CO₂浓度；

步骤四、接种细胞和三维培养：在无菌环境下，按1×10⁴～10×10⁶个/cm²的接种密度在所述步骤一制备的细胞外基质上进行细胞接种，接种时刺入所述细胞外基质0.2～1mm进行接种，每次注入0.5～1.0ml，针孔密度为0.1～0.5个/cm²，并在所述细胞外基质表面进行点状接种，然后通过轻微振荡使所述种子细胞均匀分布在所述细胞外基质表面；在37℃、5％的CO₂培养箱中，使接种后的细胞外基质完全浸没于培养基a中，培养1～2天，之后更换培养基b，浸没所述接种后的细胞外基质，培养1～2天后更换为培养基c，培养基c液面与所述接种后的细胞外基质平齐，继续培养1～2天后更换为培养基d，同样浸没所述接种后的细胞外基质，培养1～2天；培养期间每天换液；

步骤五、冻干包装和灭菌：将所述步骤三培养完成的样品进行冻干，控制冻干程序以5～12℃/min的速率降至-80～-20℃，保持1～4小时后，冷冻干燥10～24小时，之后进行包装，再以10～25kGy钴60辐照灭菌后即得皮肤溃疡修复基质。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述碱液浸泡处理系指在室温条件下，用1M碱溶液浸泡5～30min，或用1‰～1％的次氯酸钠浸泡1～2小时，进行浸泡处理，使所述胶原膜组织的厚度增加2～7倍。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述碱液是氢氧化钠碱溶液、碳酸氢钠碱溶液，碳酸钠碱溶液和氢氧化钾碱溶液中的任一种。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：在制备的所述细胞外基质上均匀打孔处理后，然后用10～25kGy钴60辐照灭菌后备用，所述孔的孔径为0.5～2mm，所述孔的孔密度为0.2～1个/cm2，灭菌后备用。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述胶原膜组织是同种异体皮肤和羊膜中的任一种；或牛、猪来源的皮肤、心包膜和腹膜中的任一种。

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