CN111084905A - 利用羊膜间充质干细胞制备人工羊膜的方法 - Google Patents

利用羊膜间充质干细胞制备人工羊膜的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开利用羊膜间充质干细胞制备人工羊膜的方法，制备方法包括以下步骤：(1)间充质干细胞分离提取及培养：将羊膜剪碎、消化、加入Ⅱ型胶原酶消化、离心、恒温孵育、传代培养；(2)人工羊膜的制备：将培养的hAMSCs(人羊膜间充质干细胞)与基质胶按一定比例混合注入24孔板中，制成圆形薄膜，即得到人工羊膜；(3)形态学观察：对细胞的生长、形态等情况进行动态追踪观察；(4)流式细胞术进行细胞存活率检测；(5)酶联免疫吸附试验(ELISA)测定血管源性生长因子VEJF的表达；(6)统计分析。本发明采用体外扩增hAMSCs，构建3D间充质干细胞，制成一定厚度且富含hAMSCs的人工羊膜，模拟并优化宫腔环境，可在体外将人工羊膜立体、定向活性培养。

Description

利用羊膜间充质干细胞制备人工羊膜的方法
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，具体为利用羊膜间充质干细胞制备人工羊膜的方法。
背景技术
腔粘连的治疗手段是以宫腔镜粘连分离术(Transcervical resection ofadhesion，TCRA)为主的综合治疗，但IUA复发率依旧很高。因此，预防再粘连的发生就成为IUA治疗的关键。研究表明，羊膜移植对预防IUA有显著作用。其中，hAMSCs(人羊膜间充质干细胞)的数量直接影响其转化效果。
间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells MSCs)具有自我更新和多向分化的能力。来源于胚胎发育早期中胚层的一类多能干细胞。是一种非血源性的多功能干细胞，广泛存在于人体不同组织中，如骨髓、脂肪、牙周膜及脐带，胎盘组织等。近几年来有学者发现其主要来源骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stemcells,BMSc)可以自体移植，避免了移植后的免疫排斥,骨髓间充质干细胞的体外扩增比较容易，而且具有跨系或跨胚层分化为不同组织来源细胞的潜能，所以在临床已经应用于中枢神经系统、心血管及免疫系统等多系统疾病的治疗，在癌症和遗传性疾病研究中也有涉及。BMSc可体外诱导分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌母细胞、并在一定的条件下诱导可分化为神经细胞，而且可进行自体移植，避免免疫排斥，被认为是治疗多种疾病的良好细胞来源。也有研究者认为在胎盘组织中也含有丰富的间充质干细胞，提示可以将其提取作为干细胞移植治疗的备选细胞。胎盘间充质干细胞具有采集方便、易于体外培养、扩增和诱导等特性，被认为是干细胞研究的一种理想种子细胞。
天然人羊膜中，hAMSCs含量较少，这一直是人们关注和研究的热点，它决定了羊膜移植后的成功率。为了改善TCRA术后羊膜直接移植入宫腔的效果，促进hAMSCs最大限度发挥再生修复作用，需要开发一种切实可行的羊膜间充质干细胞制备人工羊膜的方法。
发明内容
为解决以上现有问题，本发明提供利用羊膜间充质干细胞制备人工羊膜的方法。本发明通过以下技术方案实现。
利用羊膜间充质干细胞制备人工羊膜的方法，所述制备方法包括以下步骤：
(1)间充质干细胞分离提取及培养
将羊膜剪碎至1～3mm大小碎片后，加入胰蛋白酶消化2次，每次30min。加入Ⅱ型胶原酶消化，收集细胞滤液并离心，重悬于含胎牛血清的DMEM/F12培养基，37℃恒温孵育。培养液每2～3d更换1次，当细胞融合达到80％时，胰蛋白酶消化，1:3传代培养；
(2)人工羊膜的制备
无血清DMEM/F12培养基按1:3～5稀释BD基质胶后分装入冻存管。实验前冰浴融化预先分装的BD基质胶，于冰上将培养的hAMSCs(人羊膜间充质干细胞)与基质胶按一定比例混合注入24孔板中，制成底面积为2cm2、厚度约3～5mm、细胞浓度为2×105～3×105/ml的圆形薄膜，即得到人工羊膜；
37℃培养箱放置20～50min使其成胶后，加入适量DMEM/F12完全培养基，隔天换液；
(3)形态学观察
自细胞培养起，分别在相隔同等时间对细胞的生长、形态等情况进行动态追踪观察，对比两组细胞的形态学改变；
(4)流式细胞术进行细胞存活率检测
分别收集对照组(不含BD基质胶)和实验组约1×105个的间充质干细胞，用AnnexinV-FIFC与PE细胞凋亡试剂盒进行染色，计算AnnexinV-FIFC/PE阳性细胞比例，并检测细胞存活率；
(5)酶联免疫吸附试验(ELISA)测定血管源性生长因子VEJF的表达
2D和3D细胞以同等密度种植在6孔板中，加入DMEM/F12培养48小时，收集其培养基，离心并储存在4℃。用酶联免疫吸附试验试剂盒测定血管源性生长因子多肽(VEGF)浓度；
(6)统计分析
用SPSS17.0进行统计分析，计量数据以
Figure BDA0002310112520000021
表示，两组独立数据之间的比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
优选的，所述步骤(1)中用来消化的胰蛋白酶为0.25％质量分数的胰蛋白酶。
优选的，所述人工羊膜制备步骤采用的间充质干细胞为所述步骤(1)方法培养的3～5代的细胞。
优选的，所述步骤(2)中与hAMSCs混合的基质胶浓度为50ul/cm2生长面积，所述hAMSCs与所述基质胶按照体积比为1:1的比例混合。
优选的，所述步骤(3)中细胞形态学的观察采用倒置相差显微镜。
本发明的有益效果：
本发明利用羊膜间充质干细胞制备人工羊膜的方法采用体外扩增hAMSCs，构建3D间充质干细胞，制成一定厚度且富含hAMSCs的人工羊膜，再利用细胞立体(三维)培养技术，模拟并优化宫腔环境，在体外将人工羊膜立体、定向培养，对比3D间充质干细胞与传统贴壁培养的2D间充质干细胞的生物活性，发现3D间充质干细胞在分泌营养因子上与2D间充质干细胞相比无明显差异，为后续研究hAMSCs影响羊膜移植成功率提供实验基础。
附图说明
图1为本发明人羊膜间充质干细胞(hAMSCs)的表达情况检测；
图2为本发明2D和3D间充质干细胞的形态学观察；
图3为本发明流式细胞术检测HAMSCs在2D、3D培养的凋亡率的检测结果图；
图4为本发明hAMSCs二维培养与三维培养后VEGF的表达情况对比图。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作更为详细、完整的说明。
具体实施例1
1.材料和方法
1.1材料和试剂
DMEM/F12培养基、10％胎牛血清、0.25％胰蛋白酶(1×)购于美国GIBCO公司，BD-基质胶购自BD公司，AnnexinV-FIFC细胞凋亡试剂盒、ELISA试剂盒购自RD公司。胎盘收集于遵义市妇幼保健院产科正常足月分娩的健康产妇，并获得产妇及家属的同意。本研究已经医院医学伦理委员会批准。
1.2利用羊膜间充质干细胞制备人工羊膜的方法的步骤
1.2.1间充质干细胞分离提取及培养
将羊膜剪碎至1mm大小碎片后，加入0.25％胰蛋白酶消化2次，每次30min。加入Ⅱ型胶原酶消化1h，收集细胞滤液并离心，重悬于含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基(含100U/mL青链霉素)中，37℃恒温孵育。培养液每2d更换1次，当细胞融合达到80％时，0.25％胰蛋白酶消化，1:3传代培养。本实验均采用3～5代的细胞。
1.2.2人工羊膜的制备
无血清DMEM/F12培养基按1:3稀释BD基质胶后分装入冻存管。实验前冰浴融化预先分装的BD基质胶，于冰上将培养的hAMSCs(人羊膜间充质干细胞)与基质胶(浓度为50ul/cm2生长面积的基质胶)按1:1混合注入24孔板中，制成底面积为2cm2、厚度约3-5mm、细胞浓度为3×105/ml的圆形薄膜，即“人工羊膜”。37℃培养箱放置30min使其成胶后，加入适量DMEM/F12完全培养基，隔天换液。
1.2.3形态学观察
自细胞培养起，分别在第1、4、7天应用倒置相差显微镜对细胞的生长、形态等情况进行动态追踪观察，对比两组细胞的形态学改变。
1.2.4流式细胞术进行细胞存活率检测
分别收集对照组(不含BD基质胶)和实验组约1×105个的间充质干细胞，用AnnexinV-FIFC与PE细胞凋亡试剂盒进行染色，计算AnnexinV-FIFC/PE阳性细胞比例，并检测细胞存活率。
1.2.5酶联免疫吸附试验(ELISA)测定血管源性生长因子VEJF的表达
2D和3D细胞以同等密度种植在6孔板中，加入DMEM/F12培养48小时，收集其培养基，离心并储存在40℃。用酶联免疫吸附试验试剂盒测定血管源性生长因子多肽(VEGF)浓度。
1.2.6统计分析
用SPSS17.0进行统计分析，计量数据以
Figure BDA0002310112520000031
表示，两组独立数据之间的比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
2.结果与分析
2.1人羊膜间充质干细胞(hAMSCs)的表达
人羊膜间充质干细胞(hAMSCs)的表达情况检测如图所示(图1)，CD44、CD73、CD90以及CD105呈高表达，而CD45/34/11b/19/HLA-DR呈低表达。符合间充质干细胞的标志。
2.2 2D和3D间充质干细胞的形态学观察
细胞形态学观察2D间充质干细胞在原代培养3～4h开始贴壁，24h左右细胞呈完全贴壁生长，7d时细胞融合达80～90％，光学显微镜下可观察到呈均一长梭形的间充质干细胞(图2A)；BDM与间充质干细胞混合培养，则表现为聚集成球生长(图2B)。两组细胞大部分生长完好，很少见到衰老死亡的细胞。
2.3hAMSCs2D培养与3D培养凋亡率的比较
细胞存活率的比较,经过Annexin-V FITC染色后，流式细胞仪结果显示2D与3D间充质干细胞存活率分别为96％、91.6％(P＝0.234)，差异无统计学意义(表1，图3)。
表1流式细胞术检测HAMSCs在2D、3D培养的凋亡率
Figure BDA0002310112520000041
注：与2D组对比，*P＜0.05
2.5hAMSCs2D培养与3D培养VEGF表达量比较
血管源性生长因子蛋白表达比较ELISA法结果显示，与2D细胞相比，3D细胞的VEGF的表达量无统计学意义(P＝0.063)(表2，图4)。
表2 hAMSCs二维培养与三维培养后VEGF的表达(
Figure BDA0002310112520000042
n＝6)
Figure BDA0002310112520000043
本研究将人羊膜hAMSCs体外扩增，再与特定生物基质材料(生物支架)相混合，制成一定厚度且富含hAMSCs的“人工羊膜”，再利用细胞“立体(三维)”培养技术，模拟并优化宫腔环境，在体外将人工羊膜立体、定向培养，探究人工羊膜的生物活性，为后续研究hAMSCs影响羊膜移植成功率提供实验基础。
本研究采用的BD基质胶是一种生物支架材料，其在室温条件下，聚合形成具有生物学活性的三维基质，模拟体内细胞基底膜的结构、组成和功能，有利于体外细胞的培养和分化，以及对细胞形态、生化功能的研究。本研究将BD基质胶与细胞悬液混合制成BD基质胶-hAMSCs薄膜。观察发现，BD基质胶中的细胞大小均一，呈三维球形生长。已知间充质干细胞发挥治疗的效应主要通过其旁分泌效应而非细胞替代作用。其旁分泌效应又是通过释放营养因子和抗炎因子实现。因此，进一步对比了3D与2D间充质干细胞的旁分泌功能。鉴于VEGF对创伤修复和血管再生具有重要作用；通过蛋白水平检测VEGF表达量显示：人工羊膜3D间充质干细胞VEGF表达量与2D间充质干细胞无明显差异。
综上所诉，对比3D间充质干细胞与传统贴壁培养的2D间充质干细胞的生物活性，发现3D间充质干细胞在分泌营养因子上与2D间充质干细胞相比无明显差异。
显然，所描述的实施例仅是本发明的个别实施例，而不是全部实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施，都属于本发明的保护范围。

Claims (5)

1.利用羊膜间充质干细胞制备人工羊膜的方法，其特征在于：所述制备方法包括以下步骤：
(1)间充质干细胞分离提取及培养
将羊膜剪碎至1～3mm大小碎片后，加入胰蛋白酶消化2次，每次30min。加入Ⅱ型胶原酶消化，收集细胞滤液并离心，重悬于含胎牛血清的DMEM/F12培养基，37℃恒温孵育。培养液每2～3d更换1次，当细胞融合达到80％时，胰蛋白酶消化，1:3传代培养；
(2)人工羊膜的制备
无血清DMEM/F12培养基按1:3～5稀释BD基质胶后分装入冻存管。实验前冰浴融化预先分装的BD基质胶，于冰上将培养的hAMSCs(人羊膜间充质干细胞)与基质胶按一定比例混合注入24孔板中，制成底面积为2cm2、厚度约3～5mm、细胞浓度为2×105～3×105/ml的圆形薄膜，即得到人工羊膜；
37℃培养箱放置20～50min使其成胶后，加入适量DMEM/F12完全培养基，隔天换液；
(3)形态学观察
自细胞培养起，分别在相隔同等时间对细胞的生长、形态等情况进行动态追踪观察，对比两组细胞的形态学改变；
(4)流式细胞术进行细胞存活率检测
分别收集对照组(不含BD基质胶)和实验组约1×105个的间充质干细胞，用AnnexinV-FIFC与PE细胞凋亡试剂盒进行染色，计算AnnexinV-FIFC/PE阳性细胞比例，并检测细胞存活率；
(5)酶联免疫吸附试验(ELISA)测定血管源性生长因子VEJF的表达
2D和3D细胞以同等密度种植在6孔板中，加入DMEM/F12培养48小时，收集其培养基，离心并储存在4℃。用酶联免疫吸附试验试剂盒测定血管源性生长因子多肽(VEGF)浓度；
(6)统计分析
用SPSS17.0进行统计分析，计量数据以
Figure FDA0002310112510000011
表示，两组独立数据之间的比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
2.根据权利要求1所述的利用羊膜间充质干细胞制备人工羊膜的方法，其特征在于：所述步骤(1)中用来消化的胰蛋白酶为0.25％质量分数的胰蛋白酶。
3.根据权利要求1所述的利用羊膜间充质干细胞制备人工羊膜的方法，其特征在于：所述人工羊膜制备步骤采用的间充质干细胞为所述步骤(1)方法培养的3～5代的细胞。
4.根据权利要求1所述的利用羊膜间充质干细胞制备人工羊膜的方法，其特征在于：所述步骤(2)中与hAMSCs混合的基质胶浓度为50ul/cm2生长面积，所述hAMSCs与所述基质胶按照体积比为1:1的比例混合。
5.根据权利要求1所述的利用羊膜间充质干细胞制备人工羊膜的方法，其特征在于：所述步骤(3)中细胞形态学的观察采用倒置相差显微镜。
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