CN112843344A - 一种宫腔用交联透明质酸钠干细胞凝胶的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种宫腔用交联透明质酸钠干细胞凝胶的制备方法,包括交联透明质酸钠凝胶制备、羊膜间充质干细胞分离、羊膜间充质干细胞纯化培育、羊膜间充质干细胞提取和交联透明质酸钠干细胞凝胶混合制备五个步骤;本发明通过选择来源广泛、无伦理学限制、低免疫原性、无致瘤风险的hAMSCs作为干细胞成份,搭配透明质酸钠凝胶混合增强hAMSCs粘附、融合的特性,具有良好的生物学功能,且透明质酸钠凝胶具有粘附性,水溶液中可形成网状结构,将子宫内膜创面隔开,以发挥出机械屏障与空间阻隔作用,同时本发明从材料来源、伦理许可、实验操作、预期结果等方面均得到充分的保障,极大地方便产品的转化、规模化生产和后续的临床使用。
Description
技术领域
本发明涉及IUA粘连预防技术领域,尤其涉及一种宫腔用交联透明质酸钠干细胞凝胶的制备方法。
背景技术
宫腔粘连(IUA)是指由于损伤或感染等原因引起子宫内膜基底层损伤并发生瘢痕愈合,导致子宫腔、子宫峡部和宫颈管腔的宫壁发生部分或全部的粘连,引起宫腔缩小、有效内膜免疫减少、经量减少甚至闭经等症状的临床疾病,近年来IUA已成为导致女性不孕症的重要原因之一,约占不孕症发病因素的8%,同时还与复发性流产、胎儿生长受限、反复胚胎着床失败、胎盘植入部位异常等密切相关;
常用的IUA粘连预防方法包括在宫内放置球囊或节育器、向宫腔内注射透明质酸钠等生物胶、干细胞或人羊膜的宫内移植等,还会辅以雌激素类药物,但常规节育环屏障面积有限且存在嵌顿风险,预防效果不佳;球囊可能压迫宫腔,影响内膜血供和修复过程,影响宫颈机能;单独使用透明质酸钠等生物胶并不能显著改善患者的妊娠结局;雌激素类药物无法物理阻隔宫腔前后壁,且使用存在一定的禁忌症和血栓形成风险,因此IUA的预防和术后再粘连问题仍未得到根本改善,本发明提出一种宫腔用交联透明质酸钠干细胞凝胶的制备方法以解决现有技术中存在的问题。
发明内容
针对上述问题,本发明的目的在于提出一种宫腔用交联透明质酸钠干细胞凝胶的制备方法,该宫腔用交联透明质酸钠干细胞凝胶的制备方法通过选择来源广泛、无伦理学限制、低免疫原性、无致瘤风险的hAMSCs作为干细胞成份,搭配透明质酸钠凝胶混合增强hAMSCs粘附、融合的特性,具有良好的生物学功能,且透明质酸钠凝胶具有粘附性,水溶液中可形成网状结构,将子宫内膜创面隔开,以发挥出机械屏障与空间阻隔作用,同时本发明从材料来源、伦理许可、实验操作、预期结果等方面均得到充分的保障,极大地方便产品的转化、规模化生产和后续的临床使用。
为实现本发明的目的,本发明通过以下技术方案实现:一种宫腔用交联透明质酸钠干细胞凝胶的制备方法,包括以下步骤:
步骤一、在超声条件下,向透明质酸钠的碱性水溶液中滴加交联剂反应,反应结束后用酸碱调节剂调节pH值在6.8-7,然后加入有机溶剂沉淀后得到交联透明质酸钠凝胶备用;
步骤二、获取新鲜羊膜,将新鲜羊膜剪碎至1毫米大小的碎片后,加入0.25%胰蛋白酶中进行消化处理两次,然后再加入Ⅱ型胶原酶再次进行消化处理,分离出羊膜间充质干细胞;
步骤三、收集消化处理后的新鲜羊膜细胞滤液并离心处理,得到提纯后的羊膜间充质干细胞hAMSCs,然后将hAMSCs重悬于含10%胎牛血清的DMEM/F12的培养基中,置于37℃孵箱中恒温孵育;
步骤四、当hAMSCs细胞融合达到80%时,再次用0.25%胰蛋白酶消化处理,使用3~5代生长状态好的hAMSCs进行1:3传代,提取传代培育后的hAMSCs备用;
步骤五、将提取的hAMSCs加入交联透明质酸钠凝胶中混合均匀,得到交联透明质酸钠干细胞凝胶。
进一步改进在于:所述步骤一中的超声条件为在18~30℃温度条件和20-40kHz超声频率下超声30分钟,酸碱调节剂调节后还需平衡搅拌90~100分钟。
进一步改进在于:所述步骤一中交联剂为1,4-丁二醇二缩水甘油醚BDDE,交联反应时将物料在30~50℃环境下保温4小时并持续搅拌。
进一步改进在于:所述步骤二中的新鲜羊膜是从剖宫产手术中的羊膜组织中获取,用0.25%胰蛋白酶消化处理每次处理时间为30分钟,用Ⅱ型胶原酶消化处理时间为1小时。
进一步改进在于:所述步骤三中细胞滤液是经过滤后的细胞滤液,再将细胞滤液经转速1200r/min离心10分钟的离心处理纯化。
进一步改进在于:所述步骤三中的DMEM/F12的培养基还包含了100U/mL青链霉素,有效抗菌减少细胞被污染的概率,促进细胞分裂和增值,步骤二中恒温孵育时培养液每2天更换一次。
本发明的有益效果为:本发明通过选择来源广泛、无伦理学限制、低免疫原性、无致瘤风险的hAMSCs作为干细胞成份,搭配透明质酸钠凝胶混合增强hAMSCs粘附、融合的特性,具有良好的生物学功能,且透明质酸钠凝胶具有粘附性,水溶液中可形成网状结构,将子宫内膜创面隔开,以发挥出机械屏障与空间阻隔作用,同时本发明从材料来源、伦理许可、实验操作、预期结果等方面均得到充分的保障,极大地方便产品的转化、规模化生产和后续的临床使用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动性的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明制备流程图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
在本发明的描述中,需要说明的是,术语“中心”、“上”、“下”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系,仅是为了便于描述本发明和简化描述,而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作,因此不能理解为对本发明的限制。此外,术语“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等仅用于描述目的,而不能理解为指示或暗示相对重要性。
在本发明的描述中,需要说明的是,除非另有明确的规定和限定,术语“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解,例如,可以是固定连接,也可以是可拆卸连接,或一体地连接;可以是机械连接,也可以是电连接;可以是直接相连,也可以通过中间媒介间接相连,可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言,可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
根据图1所示,本实施例提供了一种宫腔用交联透明质酸钠干细胞凝胶的制备方法,包括以下步骤:
步骤一、在超声条件下,向透明质酸钠的碱性水溶液中滴加交联剂反应,反应结束后用酸碱调节剂调节pH值在6.8-7,然后加入有机溶剂沉淀后得到交联透明质酸钠凝胶备用;
步骤二、获取新鲜羊膜,将新鲜羊膜剪碎至1毫米大小的碎片后,加入0.25%胰蛋白酶中进行消化处理两次,然后再加入Ⅱ型胶原酶再次进行消化处理,分离出羊膜间充质干细胞;
步骤三、收集消化处理后的新鲜羊膜细胞滤液并离心处理,得到提纯后的羊膜间充质干细胞hAMSCs,然后将hAMSCs重悬于含10%胎牛血清的DMEM/F12的培养基中,置于37℃孵箱中恒温孵育;
步骤四、当hAMSCs细胞融合达到80%时,再次用0.25%胰蛋白酶消化处理,使用3~5代生长状态好的hAMSCs进行1:3传代,提取传代培育后的hAMSCs备用;
步骤五、将提取的hAMSCs加入交联透明质酸钠凝胶中混合均匀,得到交联透明质酸钠干细胞凝胶。
所述步骤一中的超声条件为在18~30℃温度条件和20-40kHz超声频率下超声30分钟,酸碱调节剂调节后还需平衡搅拌90~100分钟。
所述步骤一中交联剂为1,4-丁二醇二缩水甘油醚BDDE,交联反应时将物料在30~50℃环境下保温4小时并持续搅拌。
所述步骤二中的新鲜羊膜是从剖宫产手术中的羊膜组织中获取,用0.25%胰蛋白酶消化处理每次处理时间为30分钟,用Ⅱ型胶原酶消化处理时间为1小时。
所述步骤三中细胞滤液是经过滤后的细胞滤液,再将细胞滤液经转速1200r/min离心10分钟的离心处理纯化。
所述步骤三中的DMEM/F12的培养基还包含了100U/mL青链霉素,有效抗菌减少细胞被污染的概率,促进细胞分裂和增值,步骤二中恒温孵育时培养液每2天更换一次。
该宫腔用交联透明质酸钠干细胞凝胶的制备方法通过选择来源广泛、无伦理学限制、低免疫原性、无致瘤风险的hAMSCs作为干细胞成份,搭配透明质酸钠凝胶混合增强hAMSCs粘附、融合的特性,具有良好的生物学功能,且透明质酸钠凝胶具有粘附性,水溶液中可形成网状结构,将子宫内膜创面隔开,以发挥出机械屏障与空间阻隔作用,同时本发明从材料来源、伦理许可、实验操作、预期结果等方面均得到充分的保障,极大地方便产品的转化、规模化生产和后续的临床使用。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解,本发明不受上述实施例的限制,上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理,在不脱离本发明精神和范围的前提下,本发明还会有各种变化和改进,这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (6)
1.一种宫腔用交联透明质酸钠干细胞凝胶的制备方法,其特征在于包括以下步骤:
步骤一、在超声条件下,向透明质酸钠的碱性水溶液中滴加交联剂反应,反应结束后用酸碱调节剂调节pH值在6.8-7,然后加入有机溶剂沉淀后得到交联透明质酸钠凝胶备用;
步骤二、获取新鲜羊膜,将新鲜羊膜剪碎至1毫米大小的碎片后,加入0.25%胰蛋白酶中进行消化处理两次,然后再加入Ⅱ型胶原酶再次进行消化处理,分离出羊膜间充质干细胞;
步骤三、收集消化处理后的新鲜羊膜细胞滤液并离心处理,得到提纯后的羊膜间充质干细胞hAMSCs,然后将hAMSCs重悬于含10%胎牛血清的DMEM/F12的培养基中,置于37℃孵箱中恒温孵育;
步骤四、当hAMSCs细胞融合达到80%时,再次用0.25%胰蛋白酶消化处理,使用3~5代生长状态好的hAMSCs进行1:3传代,提取传代培育后的hAMSCs备用;
步骤五、将提取的hAMSCs加入交联透明质酸钠凝胶中混合均匀,得到交联透明质酸钠干细胞凝胶。
2.根据权利要求1所述的一种宫腔用交联透明质酸钠干细胞凝胶的制备方法,其特征在于:所述步骤一中的超声条件为在18~30℃温度条件和20-40kHz超声频率下超声30分钟,酸碱调节剂调节后还需平衡搅拌90~100分钟。
3.根据权利要求1所述的一种宫腔用交联透明质酸钠干细胞凝胶的制备方法,其特征在于:所述步骤一中交联剂为1,4-丁二醇二缩水甘油醚BDDE,交联反应时将物料在30~50℃环境下保温4小时并持续搅拌。
4.根据权利要求1所述的一种宫腔用交联透明质酸钠干细胞凝胶的制备方法,其特征在于:所述步骤二中的新鲜羊膜是从剖宫产手术中的羊膜组织中获取,用0.25%胰蛋白酶消化处理每次处理时间为30分钟,用Ⅱ型胶原酶消化处理时间为1小时。
5.根据权利要求1所述的一种宫腔用交联透明质酸钠干细胞凝胶的制备方法,其特征在于:所述步骤三中细胞滤液是经过滤后的细胞滤液,再将细胞滤液经转速1200r/min离心10分钟的离心处理纯化。
6.根据权利要求1所述的一种宫腔用交联透明质酸钠干细胞凝胶的制备方法,其特征在于:所述步骤三中的DMEM/F12的培养基还包含了100U/mL青链霉素,有效抗菌减少细胞被污染的概率,促进细胞分裂和增值,步骤二中恒温孵育时培养液每2天更换一次。
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