CN108264581A - 一种自交联透明质酸钠及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药技术领域,涉及一种自交联透明质酸钠及其制备方法。本发明的制备方法包括下列步骤:将透明质酸钠溶解在溶剂中,在碱性条件下加入偶联剂(零长度交联剂)后进行偶联反应,然后用生理盐水清洗,再用有机溶剂沉淀,经过滤、洗涤及真空干燥,获得目标产品。通过上述方法制得的自交联透明质酸钠的溶解性好,同时可以避免交联剂的毒性以及因由交联剂引起的聚合物结构改变而导致的生物相容性降低。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域,涉及一种自交联透明质酸钠及其制备方法。
背景技术
透明质酸是一种由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰基-D-氨基葡萄糖以糖苷键交替连接而成的线性粘多糖。透明质酸是一种生物可吸收可降解的聚合物,具有独特的黏性和流变学性质。透明质酸具有很强的润滑作用,是许多人体组织的重要组成部分。透明质酸可以在透明质酸酶和自由基的作用下发生降解,因此限制了透明质酸作为生物材料的应用。同时,透明质酸水凝胶的物理性质过于柔软,导致其作为生物材料在体内使用时无法提供足够的支撑。
化学交联是增强透明质酸结构稳定性的有效方法。目前,主要通过使用双官能团交联剂向透明质酸分子中引入交联结构。双官能团交联剂大多为高反应活性的化学试剂,常见的有戊二醛、丁二烯、双环氧化合物(如1,4-丁二醇二缩水甘油醚和1,2,7,8-二环氧辛烷)等。透明质酸的羧基在双官能团交联剂的作用下活化,进而发生交联反应,交联化的透明质酸能够显示出较高的生物稳定性。然而,双官能团交联剂本身具有一定毒性,同时由交联剂连接的透明质酸聚合物的生物相容性和溶解性有所降低,因此限制了该方法的应用。
发明内容
针对现有技术中由双官能团交联剂介导的交联透明质酸的毒性大、生物相容性低、溶解性差等问题,本发明旨在提供一种自交联透明质酸钠及其制备方法。本发明利用偶联剂(又称零长度交联剂)来催化透明质酸钠分子内/分子间的酯化反应,得到自交联透明质酸钠。相比于由双官能团交联剂介导的交联透明质酸钠,自交联透明质酸钠在毒性、生物相容性和溶解性等方面均得到改善和提高。
具体而言,本发明采用如下技术方案:
一种自交联透明质酸钠的制备方法,其包括下列步骤:将透明质酸钠溶解于溶剂中,加入碱性物质并将溶液的pH值调节至7~14,然后加入交联剂并于-5~50℃反应2~8小时;反应完毕后,采用生理盐水洗涤,然后采用有机溶剂沉淀,经过滤、漂洗及真空干燥,得到自交联透明质酸钠。
在一项优选的技术方案中,所述透明质酸钠为无菌干粉,其分子量为3.0×105~2.5×106Da。
在一项优选的技术方案中,所述溶剂为极性非质子溶剂,所述极性非质子溶剂选自N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、二甲基亚砜(DMSO)中的任意一种,优选N-甲基吡咯烷酮。
在一项优选的技术方案中,所述透明质酸钠与所述溶剂之间的用量比为1g:10~10000mL,优选1g:40mL。
在一项优选的技术方案中,所述碱性物质选自氢氧化钠、碳酸氢钠、碳酸钠、三乙胺(TEA)中的任意一种,优选三乙胺。
在一项优选的技术方案中,所述偶联剂选自2-氯-1-甲基吡啶鎓碘化物(CMPI)、1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺(EDC)、二环己基碳二亚胺(DCC)、N,N'-二异丙基碳二亚胺(DIC)中的任意一种,优选2-氯-1-甲基吡啶碘化物。
在一项优选的技术方案中,所述偶联剂与所述透明质酸钠的重复单元之间的摩尔比为1:1~50,优选1:5~20。
在一项优选的技术方案中,所述有机溶剂选自丙酮、甲基叔丁基醚、异丙醚中的任意一种,优选丙酮。
在一项优选的技术方案中,所述漂洗采用丙酮/水混合溶剂来完成,其中丙酮与水之间的体积比为1~10:1,优选5:1。
在一项优选的技术方案中,所述真空干燥的真空度为-0.08~-0.1MPa,温度为30~40℃,时间为5~12小时。
一种自交联透明质酸钠,其通过上述制备方法制得。
本发明利用零长度交联剂(zero-length crosslinker)来催化透明质酸钠分子内/分子间的酯化反应,进而得到自交联透明质酸钠。相比于由双官能团交联剂介导的交联透明质酸钠,自交联透明质酸钠在生物相容性、溶解性和毒性等方面均得到改善和提高。
具体实施方式
以下将结合具体的实施例对本发明的技术方案做出进一步的描述。除非另有说明,下列实施例中所使用的仪器、材料、试剂等均可通过常规商业手段获得。
实施例1:自交联透明质酸钠的制备。
将3.75g透明质酸钠无菌干粉(分子量为3.0×105~2.5×106Da)溶解于150mL NMP中,加入TEA将溶液调节至pH=10,然后加入0.08gCMPI并于0℃反应2h。反应完毕后,用40倍体积的生理盐水清洗,再用40倍体积的丙酮沉淀,经过滤,丙酮/水混合溶剂(V丙酮/V水=5/1)洗涤,于-0.1MPa、40℃条件下真空干燥8h,得到5.2%自交联透明质酸钠(其中百分数表示偶联剂的摩尔量与透明质酸钠的重复单元的摩尔量之间的比值)。
实施例2:自交联透明质酸钠的制备。
将3.75g透明质酸钠无菌干粉(分子量为3.0×105~2.5×106Da)溶解于150mLDMF中,加入NaHCO3将溶液调节至pH=11,然后加入0.14gCMPI并于25℃反应2h。反应完毕后,用40倍体积的生理盐水清洗,再用40倍体积的丙酮沉淀,经过滤,丙酮/水混合溶剂(V丙酮/V水=5/1)洗涤,于-0.1MPa、30℃条件下真空干燥10h,得到9%自交联透明质酸钠(其中百分数表示偶联剂的摩尔量与透明质酸钠的重复单元的摩尔量之间的比值)。
实施例3:自交联透明质酸钠的制备。
将3.75g透明质酸钠无菌干粉(分子量为3.0×105~2.5×106Da)溶解于150mLDMSO中,加入TEA将溶液调节至pH=10,然后加入0.34gEDC并于45℃反应2h。反应完毕后,用40倍体积的生理盐水清洗,再用40倍体积的丙酮沉淀,经过滤,丙酮/水混合溶剂(V丙酮/V水=5/1)洗涤,于-0.1MPa、40℃条件下真空干燥8h,得到22%自交联透明质酸钠(其中百分数表示偶联剂的摩尔量与透明质酸钠的重复单元的摩尔量之间的比值)。
实施例4:自交联透明质酸钠的鉴别。
称取干燥的自交联透明质酸钠粉末2~3mg和干燥的溴化钾粉末200~300mg,一同置于玛瑙研钵中,混合均匀并研细,用压片器压成薄片。采用傅立叶变换红外光谱仪,设定扫描波数范围为4000~400cm-1,分辨率为0.5cm-1,扫描次数为75次/s。先以溴化钾的空白片做背景扫描,再扫描样本的红外吸收图谱。将样品的红外吸收光谱与标准谱图对比,如果样品在3400cm-1、1610cm-1、1400cm-1、1040cm-1附近有特征吸收峰,则表明成功制得自交联透明质酸钠。采用上述方法对实施例1~3中所制备的样品进行测定,其红外特征吸收峰结果如表1所示。
表1.实施例1~3中样品的红外特征吸收峰
由表1可知,3种样品的红外吸收光谱在3400cm-1左右处有强的O-H和N-H伸缩振动吸收峰,其峰形较宽且尖锐,表明存在羟基结构,并且透明质酸钠分子内的羟基通过分子内或分子间的氢键结合;在1610cm-1及1400cm-1左右处有强的C=O和C-N反对称及对称伸缩振动吸收峰,表明存在羧基及酰胺基结构;在1040cm-1左右处有C-O伸缩振动吸收峰,属于糖的特征吸收峰。由此可知,实施例1~3中制备的3种样品均为目标产物——自交联透明质酸钠。
实施例5:自交联透明质酸钠的绝对分子量及其分布的测定。
采用多角度激光光散射仪与体积排阻色谱法联用(MALLS-GPC)来测定自交联透明质酸钠的绝对分子量及其分布。根据透明质酸钠特有的绝对折射率增量(dn/dc)和样品示差信号强度来计算透明质酸钠的含量,并通过数据分析来获得自交联透明质酸钠的结构特性。
采用上述方法测得聚乙二醇(PEG)标准品的重均分子量(Mw)与标示值的相对偏差为4.7%,实施例1中所制备的自交联透明质酸钠样品的分散度接近于1,分子量大于100万,所得的均方根半径约为140nm。
实施例6:自交联透明质酸钠的体外抗酶降解性研究。
以实施例1中所制备的样品为例,平行设置2组,实验组加入120U/mL的HAase溶液2mL,对照组加入相同体积的PBS,分别补加磷酸盐缓冲液至5mL,37℃恒温水浴2h,100℃加热30min,离心,取上清液1mL,稀释10倍,按糖醛酸的含量测定方法显色,在530nm处测定对照组样品的吸收度Λ0和实验组样品的吸收度Λn,以ΔΛn-Λ0表示酶降解量。
考察浓度为0U/mL、12U/mL、24U/mL、36U/mL、48U/mL、60U/mL、72U/mL的HAase溶液,CHA酶解产物吸收度的变化,以吸收度Λ做为纵坐标,酶的浓度(U/mL)为横坐标绘制曲线,并作线性回归。结果显示:酶解产物随着酶浓度的增加而增加,线性回归方程为Y=0.0076X+0.063,相关系数r=0.9996,吸收度(Λ)与HAase(U/mL)的关系如表2所示。
表2.样品吸收度与HAase酶浓度之间的关系
由表2可知,本发明的自交联透明质酸钠的吸收度能够随着HAase酶浓度的增加而增加,表明本发明的自交联透明质酸钠在生物相容性、溶解性及毒性方面得到有效改善。
Claims (10)
1.一种自交联透明质酸钠的制备方法,其包括下列步骤:
将透明质酸钠溶解于溶剂中,加入碱性物质并将溶液的pH值调节至7~14,然后加入交联剂并于-5~50℃反应2~8小时;反应完毕后,采用生理盐水洗涤,然后采用有机溶剂沉淀,经过滤、漂洗及真空干燥,得到自交联透明质酸钠。
2.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于:
所述透明质酸钠为无菌干粉,其分子量为3.0×105~2.5×106Da。
3.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于:
所述溶剂为N,N-二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮或二甲基亚砜。
4.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于:
所述透明质酸钠与所述溶剂之间的用量比为1g:10~10000mL。
5.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于:
所述碱性物质为氢氧化钠、碳酸氢钠、碳酸钠或三乙胺。
6.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于:
所述偶联剂为2-氯-1-甲基吡啶鎓碘化物、1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺、二环己基碳二亚胺或N,N'-二异丙基碳二亚胺。
7.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于:
所述偶联剂与所述透明质酸钠的重复单元之间的摩尔比为1:1~50。
8.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于:
所述有机溶剂为丙酮、甲基叔丁基醚或异丙醚。
9.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于:
所述漂洗采用丙酮/水混合溶剂来完成,其中丙酮与水之间的体积比为1~10:1;
所述真空干燥的真空度为-0.08~-0.1MPa,温度为30~40℃,时间为5~12小时。
10.一种自交联透明质酸钠,其通过根据权利要求1至9中任一项所述的制备方法制得。
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