CN113583262B - 用于关节软骨修复的近红外响应透明质酸水凝胶及其制备方法 - Google Patents

用于关节软骨修复的近红外响应透明质酸水凝胶及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于关节软骨修复的近红外响应透明质酸水凝胶及其制备方法，该水凝胶以偶氮苯衍生物修饰的透明质酸和环糊精衍生物修饰的透明质酸为原料按质量比为1：1经交联反应而成，偶氮苯衍生物为采用长烷基链修饰的四邻甲氧基取代偶氮苯，环糊精衍生物为采用己二胺基修饰的环糊精。将偶氮苯衍生物修饰的透明质酸和环糊精衍生物修饰的透明质酸按比例溶解，将两种溶液混合均匀，静置或超声成胶即可。该水凝胶具有基于非共价交联水凝胶的自愈合性和可注射性，并可在近红外光的刺激下发生部分凝胶‑溶胶转变，使凝胶表面发生交联网络密度的降低形成水化层，这种基于近红外光响应的力学及水化层的形成，使之将在软骨修复领域具有潜在的意义。

Description

用于关节软骨修复的近红外响应透明质酸水凝胶及其制备 方法
技术领域
本发明属于生物医学材料领域，涉及透明质酸水凝胶，具体涉及一种用于关节软骨修复的近红外响应透明质酸水凝胶及其制备方法。
背景技术
关节是骨骼系统中骨与骨之间的功能性连接点。在滑膜关节中，关节的骨端覆盖着一层1-7mm厚的白色透明结缔组织——关节软骨(AC)，它是滑膜关节的负重组织，可减轻反复运动过程中关节面的摩擦，具有润滑和耐磨损的特性，并且还具有减轻冲击、吸收震荡的作用。由疾病或者创伤造成的关节软骨退变或损伤在临床上较为常见，由于关节软骨组织特殊，内部没有血管、淋巴和神经，受到创伤后只有极低或几乎没有有效的自身修复能力，若治疗不及时或不恰当，将导致严重的功能障碍。此外，关节上软骨病变可能会引起异常高的摩擦和炎症从而造成骨关节炎(OA)，因此如何改善关节部位的摩擦进行软骨修复对与骨修复领域具有重要意义。
水凝胶是一种非常有价值的生物医学应用材料，主要由相互交联的弹性高分子网络构成，是一类高含水的亲水多孔材料，液体被网络间的相互作用力所束缚，因此不能流动。水凝胶从外观上看是固体，实则是一种介于液体和固体之间的一种物质，凝胶的网络使其具有多孔性，在外力的作用下能够将液体挤出和吸入。由于水凝胶具有类似于天然关节的三维网络结构，所以具有许多特殊的力学性质，如可承受较大形变、生物相容性好、化学性能稳定以及表面摩擦系数低等等，因而水凝胶具有用于关节软骨的缺损修复的应用前景。
透明质酸(HA)为关节软骨间质的组成成分，能诱导胚胎干细胞分化为软骨细胞。在关节软骨修复方面，透明质酸水凝胶是一种理想的间质材料，高浓度下形成粘弹性水凝胶，这种水凝胶可在高剪切力作用下被破坏，当力减小时能可逆恢复。透明质酸通常通过酯化或其他化学方法相互交联成稳定支架，其独特的网络结构和高含水量决定了其特有的摩擦学性能。
除此之外，水凝胶具有非常优异的可设计性，通过调节水凝胶的单体组分、成胶形式、交联度等实验条件，制备出来的水凝胶可以对外界刺激做出反应，用于设计具有响应性功能的材料。但传统的水凝胶基质材料通过化学交联形成，获得的水凝胶材料虽然具有较好的机械强度，但脆性较大，在较大的挤压下容易破碎。另外通过化学交联后的凝胶各项性能均已固定，无法根据骨关节的运动状态进行调整从而实现对动态适配。
目前，一类具有三维网络结构、吸水性强、易保水、超仿生特点的智能响应性水凝胶被开发出来，其合成过程中加入了具有特殊响应性的结构或基团，可根据环境的温度、电场、磁场等变化做出规律性的结构和体积调整，或者导致水凝胶组成发生变化。其中光作为一直无创手段，在临床应用上具有广阔的应用前景，而传统的光响应性材料如偶氮苯等，主要是紫外光响应，但紫外波长的光穿透能力差，对细胞损伤程度高，所以在限制了其在生物医学领域的应用，尤其用于设计智能响应水凝胶用于体内软骨的润滑修复。
综上所述，水凝胶是一类广泛使用的生物医学材料，尤其是透明质酸水凝胶，在关节软骨修复应用上有广阔的应用前景，研发设计一种适配骨关节特殊运动环境的智能响应水凝胶，对骨修复领域具有重要意义。
发明内容
针对上述现有技术的不足之处，本发明的目的旨在提供一种用于关节软骨修复的近红外响应透明质酸水凝胶及其制备方法，该水凝胶具有基于非共价交联水凝胶的自愈合性和可注射性，并可在近红外光的刺激下发生部分凝胶-溶胶转变，使凝胶力学强度降低，表面发生交联网络密度的降低形成水化层，由于这种基于近红外光响应的力学及水化层的形成，使之将在软骨修复领域具有潜在的意义。
为达到上述目的，本发明提供的用于关节软骨修复的近红外响应透明质酸水凝胶，该水凝胶以偶氮苯衍生物修饰的透明质酸和环糊精衍生物修饰的透明质酸为原料经交联反应而成，所述偶氮苯衍生物为采用长烷基链修饰的四邻甲氧基取代偶氮苯，所述环糊精衍生物为采用己二胺基修饰的环糊精，所述偶氮苯衍生物修饰的透明质酸和环糊精衍生物修饰的透明质酸的质量比为1：1；
所述偶氮苯衍生物修饰的透明质酸结构式如式Ⅰ所示：
Figure BDA0003230347150000021
所述环糊精衍生物修饰的透明质酸结构式如式II所示：
Figure BDA0003230347150000031
上述式Ⅰ和式II中n表示聚合度，取值范围为1600-2200。
本发明提供的用于关节软骨修复的近红外响应透明质酸水凝胶，基于偶氮苯-环糊精主客体交联的光响应特性，其能够在光照的作用下，通过偶氮苯的顺-反异构转变，进行部分的成胶-溶胶转变，使材料表面发生交联网络密度的降低形成水化层，从而实现对基质材料的可逆力学调控，降低表面的摩擦系数，提高润滑度。此外，通过在偶氮苯分子上引入具有给电子效应的甲氧基，实现偶氮苯衍生材料的激发波长红移，红移到红光和近红外(NIR) 光，从而不仅避免了偶氮苯材料发生反式结构到顺式结构变化的紫外激发光对细胞/组织损伤，还具有更深的组织穿透性，此外，由于环糊精具有疏水性空腔，因而还可负载疏水性药物进行药物缓释协同关节软骨修复。
本发明还提供了一种上述用于关节软骨修复的近红外响应透明质酸水凝胶的制备方法，将式Ⅰ所示结构的偶氮苯衍生物修饰的透明质酸和式II所示结构的环糊精衍生物修饰的透明质酸按照前述质量之比计量称取后分别于磷酸盐缓冲盐溶液中溶解形成浓度为 2％-4％的溶液，将两种溶液混合均匀，静置或超声成胶即可。
上述用于关节软骨修复的近红外响应透明质酸水凝胶的制备方法，式Ⅰ所示结构的偶氮苯衍生物修饰的透明质酸和式II所示结构的环糊精衍生物修饰的透明质酸溶解于磷酸盐缓冲盐溶液中的溶液浓度相同，即两种溶液优选按照体积比为1：1的比例进行混合。两种溶液通常需要使用注射器进行混匀，时间2min左右即可，随着混和程度增加，体系的粘度增大，在此过程中一般会混入少量气泡，采用离心装置进行离心即可去除气泡。为了更充分发生主客体交联，该水凝胶可静置过夜或者超声至少2h。
上述用于关节软骨修复的近红外响应透明质酸水凝胶的制备方法中，所述偶氮苯衍生物修饰的透明质酸的制备合成路线如图1a和图1c所示。偶氮苯衍生物修饰的透明质酸的制备方法，包括以下步骤：
(11)制备四邻甲氧基取代偶氮苯
将2，6-二甲氧基苯胺溶于盐酸溶液中，冷却至0-5℃后，再加入NaNO2溶液并搅拌反应5-20min；在0-5℃条件下，将前述反应溶液加入至3,5-二甲氧基苯胺与水形成的悬浊液中，并加入碱溶液调节溶液pH至8-9，搅拌反应8-12h；对反应后的溶液进行萃取并收集有机溶液部分，对收集到的有机溶液依次进行浓缩、洗脱纯化处理后，得到四邻甲氧基取代偶氮苯；
所述2，6-二甲氧基苯胺、NaNO2和3,5-二甲氧基苯胺的质量比为2：1：2；
所述四邻甲氧基取代偶氮苯结构式如式Ⅲ所示：
Figure BDA0003230347150000041
(12)制备BOC保护的氨基十二烷酸
将12-氨基十二烷酸、二碳酸二叔丁酯和三乙胺溶解于甲醇中，加热至50℃-60℃反应 8-12h，反应结束后，去除溶剂并将得到的固体产物溶解于乙酸乙酯中，采用盐酸溶液洗涤后进行干燥，得到BOC保护的氨基十二烷酸；
所述12-氨基十二烷酸、二碳酸二叔丁酯和三乙胺的质量比为5：5：4；
所述的BOC保护的氨基十二烷酸结构式如式Ⅳ所示：
Figure BDA0003230347150000042
(13)制备长烷基链修饰的四邻甲氧基取代偶氮苯
于室温下，将步骤(12)制备得到的BOC保护的氨基十二烷酸以及乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳化二亚胺盐酸化物、4-(二甲基氨基)吡啶溶解于二氯甲烷中，搅拌20-30min后，加入步骤(11)制备得到的四邻甲氧基取代偶氮苯，于室温下反应至少12h，去除溶剂后对反应产物进行洗脱纯化处理，将纯化处理后的反应产物和三氟乙酸溶于二氯甲烷中，于室温下搅拌反应0.5-2h后，采用饱和Na2CO3溶液洗涤后，去除残余二氯甲烷得到固体产物，将固体产物用水洗涤后，得到长烷基链修饰的四邻甲氧基取代偶氮苯；
所述步骤(12)制备得到的BOC保护的氨基十二烷酸、乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳化二亚胺盐酸化物、4-(二甲基氨基)吡啶、步骤(11)制备得到的四邻甲氧基取代偶氮苯以及三氟乙酸的质量比为10：6：1：10：30；
所述长烷基链修饰的四邻甲氧基取代偶氮苯结构式如式V所示：
Figure BDA0003230347150000051
(14)制备偶氮苯衍生物修饰的透明质酸
在氮气氛围下，将四丁基铵盐改性的透明质酸和步骤(13)制备得到的长烷基链修饰的四邻甲氧基取代偶氮苯的混合物溶解于二甲亚砜中，形成混合物溶液；在氮气氛围下，BOP试剂溶解于二甲亚砜中形成BOP溶液，并将BOP溶液加入前述混合物溶液中，室温下搅拌3-5h，搅拌完成后加0-5℃去离子水淬灭反应，并于室温下透析，透析前1-3天作为透析液的去离子水中加入氯化钠以使四丁基铵离子析出，透析完成后离心除去不溶性副产物，再用去离子水继续透析2-3天，最终透析获得产物经冷冻干燥处理，即得到如式Ⅰ所示结构的偶氮苯衍生物修饰的透明质酸；
所述四丁基铵盐改性的透明质酸、长烷基链修饰的氨基化偶氮苯以及BOP试剂的质量比为10：1：1。
上述用于关节软骨修复的近红外响应透明质酸水凝胶的制备方法中，步骤(11)中，采用两种不同位置甲氧基取代的苯胺通过重氮化反应形成氨基化修饰的偶氮苯。首先将2， 6-二甲氧基苯胺溶于盐酸溶液(本步骤盐酸溶液中盐酸的终浓度为为15％-21％)中，创造强酸性的环境并冷却到0-5℃后加入NaNO2溶液，利用其强氧化性使2，6-二甲氧基苯胺形成活性中间体。再使用碱溶液调节pH后，该活性中间体可以与3，5-二甲氧基苯胺发生重氮化反应形成氨基化偶氮苯，即四邻甲氧基取代偶氮苯。其中盐酸溶液中使用的盐酸为浓度37％的盐酸。调节pH的碱溶液，可采用本领域常规使用的碱溶液，本发明中使用NaOH 溶液或碳酸氢钠溶液进行pH调节，进一步优选浓度为2-5mol/L的NaOH溶液或碳酸氢钠溶液，更优先采用浓度为2mol/L的NaOH溶液或碳酸氢钠溶液，由于pH对产率很重要，因此选择较低pH的溶液在调节酸碱性时更加匹配。
进一步地，步骤(11)中所涉及的萃取、浓缩、洗脱纯化操作可以采用本领域相应操作所使用的常规试剂和方式进行。在本发明中，优选采用二氯甲烷对反应后的溶液进行萃取，使用分液漏斗将液体与有机层分开。优选采用旋蒸的方式对有机溶液部分进行浓缩，旋蒸用于减压条件下连续蒸馏溶剂，由于不断旋转，液体附于蒸馏器的壁上，形成一层液膜，加大了蒸发的面积，从而可使蒸发速度加快。本发明利用层析柱对原液进行分离纯化，优选采用甲醇-二氯甲烷或者甲醇-乙酸乙酯作为洗脱液，进一步优选为体积比1：10-1：3 的甲醇-乙酸乙酯作为洗脱液。所制备的四邻甲氧基取代偶氮苯具有较大的极性，因此使用甲醇-乙酸乙酯作为洗脱液可以保证产物较纯的收集且节约洗脱液。
上述用于关节软骨修复的近红外响应透明质酸水凝胶的制备方法中，考虑到在高分子链的作用的灵活性，通过酰胺化反应对氨基化的偶氮苯进行长烷基链修饰。因此通过步骤 (12)中制备获得式Ⅳ所示结构的BOC保护的氨基十二烷酸，再通过步骤(13)制备获得长烷基链修饰的四邻甲氧基取代偶氮苯。在步骤(12)和步骤(13)中，优选采用旋蒸的方式去除溶剂，旋蒸具体的操作方式和参数根据常规选择进行即可。此外，步骤(13)中所涉及的洗脱纯化操作也采用本领域相应操作所使用的常规试剂和方式进行即可。本发明中，步骤(13)中，对反应产物的洗脱纯化优选采用甲醇/乙酸乙酯作为洗脱液，通过色谱分离纯化。
上述用于关节软骨修复的近红外响应透明质酸水凝胶的制备方法，所述环糊精衍生物修饰的透明质酸的合成路线如图1b和图1c所示，环糊精衍生物修饰的透明质酸的制备方法，包括以下步骤：
(21)制备对苯磺酰化的β-环糊精
于冰浴条件下，将β-环糊精溶解于去离子水中形成β-环糊精溶液；将对甲苯磺酰氯溶于乙腈中，并加入前述β-环糊精溶液中形成反应溶液，再于冰浴条件下搅拌反应2-3h；搅拌结束后撤除冰浴，向反应溶液中滴加氢氧化钠溶液调节pH至7-8，滴加完成后搅拌至反应溶液澄清，再加入氯化铵调节pH至8.5-9，继续反应0.5h-1h；于0-5℃下恒温离心收集固体产物，并对固体产物进行洗涤、冷冻干燥后，即得到对苯磺酰化的β-环糊精；
所述β-环糊精和甲苯磺酰氯的质量比为5：1；
所述对苯磺酰化的β-环糊精结构式如式Ⅵ所示：
Figure BDA0003230347150000061
(22)制备己二胺基修饰的环糊精
于氮气条件下，将步骤(1)制备得到的对苯磺酰化的β-环糊精加入N，N-二甲基甲酰胺中并搅拌至β-环糊精完全溶解形成混合溶液；将熔化状态下的己二胺加入前述混合溶液中，并于60-80℃油浴条件下搅拌反应8-18h，反应结束后，反应溶液冷却至室温，对反应溶液进行沉淀、冷冻干燥后，即得到己二胺基修饰的环糊精；
所述对苯磺酰化的β-环糊精和己二胺的质量比为1：4；
所述己二胺基修饰的环糊精结构式如式VII所示：
Figure BDA0003230347150000071
(23)制备环糊精衍生物修饰的透明质酸
在氮气氛围下，将四丁基铵盐改性的透明质酸和步骤(22)制备得到的己二胺基修饰的环糊精的混合物溶解于二甲亚砜中，形成混合物溶液；在氮气氛围下，BOP试剂溶解于二甲亚砜中形成BOP溶液，并将BOP溶液加入前述混合物溶液中，室温下搅拌3-5h，搅拌完成后加0-5℃去离子水淬灭反应，并于室温下透析，透析前1-3天作为透析液的去离子水中加入氯化钠以使四丁基铵离子析出，透析完成后离心除去不溶性副产物，再用去离子水继续透析2-3天，最终透析获得产物经冷冻干燥处理，即得到如式II所示结构的环糊精衍生物修饰的透明质酸；
所述四丁基铵盐改性的透明质酸、己二胺基修饰的环糊精以及BOP试剂的质量比为3： 4：1。
上述用于关节软骨修复的近红外响应透明质酸水凝胶的制备方法，在制备己二胺基修饰的环糊精时，由于己二胺是固体，因此需熔化后再进行反应，己二胺的熔化为本领域常规操作，通常是在60℃油浴条件下熔化，然后利用注射器注入到对苯磺酰化的β-环糊精的 N，N-二甲基甲酰胺溶液中。此过程的操作速度通常应尽量快，因为在离开热环境以后，己二胺会很快的凝固，影响注射过程。
步骤(21)中，使用的氢氧化钠溶液的浓度为2mol/L-5mol/L。对恒温离心收集的固体产物依次采用去离子水、冰丙酮和乙醚进行洗涤，再经冷冻干燥，即得到对苯磺酰化的β-环糊精。
步骤(22)中，采用冰丙醇和乙醚依次对反应溶液进行沉淀操作，具体方式为：先采用冰丙酮对反应溶液进行沉淀并收集固体产物，之后将固体产物再次溶解于N，N-二甲基甲酰胺中后，重复上述操作2-3次；之后使用乙醚进行同样的操作，并重复该操作2-3次，继后收集固体产物，收集的固体产物进一步经冷冻干燥即得到己二胺基修饰的环糊精。在采用冰丙酮、乙醚对反应溶液进行沉淀时，冰丙酮/乙醚与含有己二胺基修饰的环糊精的N， N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液的体积比优选1：6-15，进一步优选为1：9，最后使用乙醚进行沉淀，这是由于乙醚的挥发性更好，可以通过真空干燥时更快的除去，此过程不需控温。
上述用于关节软骨修复的近红外响应透明质酸水凝胶的制备方法，步骤(14)和步骤 (23)中所述的四丁基铵盐改性的透明质酸(HA-TBA)可以采用现有技术制备，经季铵盐修饰后的透明质酸，可增加透在有机体系中的溶解性。在本发明中，四丁基铵盐改性的透明质酸制备方法包括以下步骤：
将透明质酸溶于去离子水中形成透明质酸溶液，在透明质酸溶液中加入离子交换树脂，继续搅拌30-60min，通过真空过滤从树脂中收集透明质酸溶液，随后采用四丁基氢氧化铵将透明质酸溶液滴定至pH为7.02-7.05，进行冷冻干燥处理，得到四丁基铵盐改性的透明质酸；
所述透明质酸、离子交换树脂的质量比为1：3；
所述季铵盐修饰的透明质酸结构式如式Ⅷ所示：
Figure BDA0003230347150000081
式Ⅷ中，n表示聚合度，取值范围为1600-2200。
与现有技术相比，本发明提供的用于关节软骨修复的近红外响应透明质酸水凝胶及其制备方法具有以下有益技术效果：
(1)本发明提供的用于关节软骨修复的近红外响应透明质酸水凝胶，该水凝胶具有基于非共价交联水凝胶的自愈合性和可注射性，可在光照作用下通过偶氮苯的顺-反异构转变，进行部分的成胶-溶胶转变，使凝胶力学强度降低，表面发生交联网络密度的降低形成水化层，从而实现对基质材料的可逆力学调控，降低表面的摩擦系数，提高润滑，由于这种基于近红外光响应的力学及水化层的形成，将在软骨修复领域具有潜在的意义。
(2)本发明提供的用于关节软骨修复的近红外响应透明质酸水凝胶，通过在偶氮苯分子上引入具有给电子效应的甲氧基，使传统偶氮苯的紫外激发向红光甚至近红外光(NIR) 进行红移，红移到红光和近红外(NIR)光，从而有效解决偶氮苯材料发生反式结构到顺式结构变化的紫外激发对细胞/组织损伤的问题，且红光和近红外(NIR)光具有更深的组织穿透性，使之更适合体内组织应用。
(3)本发明提供的用于关节软骨修复的近红外响应透明质酸水凝胶，由于环糊精具有疏水性空腔，可负载疏水性药物进行药物缓释协同关节软骨修复；此外由于选择主体生物大分子为透明质酸，是关节软骨滑液的重要组成部分，这将更匹配骨关节的环境，在骨修复上具有天然的优势。
(4)本发明提供的用于关节软骨修复的近红外响应透明质酸水凝胶的制备方法，采用两种不同位置甲氧基取代的苯胺通过重氮化反应形成氨基化修饰的偶氮苯，考虑到在高分子链的作用的灵活性，通过酰胺化反应对氨基化的偶氮苯进行长烷基链修饰，同理，对β- 环糊精也做了类似的修饰，前述修饰方法都是化学合成原理上比较成熟的方法，制备出的水凝胶都保持了非共价交联的可注射性跟自愈合性，这在水凝胶的应用上具有重要的意义。
附图说明
图1为本发明近红外响应透明质酸水凝胶化学合成示意图，其中图a为长烷基链修饰的四邻甲氧基取代偶氮苯(mAzo)的合成路线图，图b为己二胺基修饰的环糊精(CD-HDA)的合成路线图，图c为mAzo与CD-HDA分别接枝到透明质酸的合成路线图。
图2为实施例3所制备的产物的核磁图谱，图a为长烷基链修饰的四邻甲氧基取代偶氮苯(mAzo)的核磁图谱，图b为偶氮苯衍生物修饰的透明质酸(mAzo-HA)的核磁图谱，图c为己二胺基修饰的环糊精(CD-HDA)的核磁图谱，图d为环糊精衍生物修饰的透明质酸(CD-HA)的核磁图谱。
图3为实施例3制备的四邻甲氧基取代偶氮苯的光致异构性能表征图，其中图a为625nm近红外光刺激下偶氮苯异构化的紫外吸收图谱，图b为625nm近红外光刺激下偶氮苯异构化的核磁氢谱。
图4为实施例1-3制备的近红外光响应水凝胶的流变学性能表征，其中，图a-c为水凝胶终浓度分别为2wt％、3wt％、4wt％的流变性能说明图，图d-f为凝胶宏观自愈合性能说明图，图g为可注射性能说明图。
图5为实施例1-3制备的近红外光响应水凝胶的光控力学性能的表征图，其中，图A为625nm光照刺激下水凝胶发生交联网络密度降低的示意图，图B为625nm近红外光照刺激下水凝胶发生力学可逆变化的表征图。
图6为实施例3制备的近红外光响应水凝胶的冰冻切片图。
具体实施方式
以将结合附图对本发明各实施例的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施例，都属于本发明。
以下实施例中，所涉及的四丁基铵盐改性的透明质酸(HA-TBA)，均采用相同方法合成，合成路线如图1c所示，利用四丁基氢氧化铵(TBA-OH)对其进行季铵盐修饰，可增加透明质酸在有机体系中的溶解性。具体的制备方法如下：
首先将3g透明质酸(HA)溶于150mL去离子水中形成透明质酸溶液，透明质酸溶液置于250mL单颈圆底烧瓶中。在透明质酸溶液中加入9g的Dowex离子交换树脂，继续搅拌30分钟。通过真空过滤从树脂中收集透明质酸溶液，随后加入四丁基氢氧化铵(TBA-OH) 将透明质酸溶液滴定至pH为7.02-7.05，冷冻干燥后，即得季铵盐修饰的透明质酸 (HA-TBA)，备用。
此外，以下实施例中所涉及到化学试剂，如无特殊说明，均可通过市场购买获得。
实施例1
本实施例提供的用于关节软骨修复的近红外响应透明质酸水凝胶，其制备方法步骤如下：
(1)制备偶氮苯衍生物修饰的透明质酸(mAzo-HA)
(11)制备四邻甲氧基取代偶氮苯(mAzo)
将1g颗粒状2，6-二甲氧基苯胺溶于1.2mL水和1.5mL浓度为37wt％盐酸形成的混合溶液中，冷却至2℃后，缓慢加入4mL浓度为1.8mol/L的NaNO2溶液并搅拌20分钟。2℃下，将上述混合溶液缓慢加入到1g 3，5-二甲氧基苯胺与40mL水形成的悬浊液中，再加入浓度为2mol/L碳酸氢钠溶液调节反应溶液pH至8，搅拌过夜(约12h)。使用二氯甲烷对反应后的溶液进行萃取，分液漏斗将液体与有机层分开，旋蒸浓缩有机溶液部分并使用体积比1：10的甲醇/乙酸乙酯作为洗脱剂，通过层析柱进行纯化，得到红色固体，即为四邻甲氧基取代偶氮苯(mAzo)。
(12)制备BOC保护的氨基十二烷酸
将1g 12-氨基十二烷酸，1g二碳酸二叔丁酯和0.8g三乙胺(TEA)溶解于15mL甲醇中，50℃反应过夜(约12h)。反应结束后，旋蒸除去溶剂，将得到的固体产物溶解在乙酸乙酯中，用浓度为0.25mol/L的HCl溶液洗涤两次，真空干燥，得到BOC保护的氨基十二烷酸。
(13)制备长烷基链修饰的四邻甲氧基取代偶氮苯
在室温下，将步骤(12)制备得到的1g BOC保护的氨基十二烷酸g与0.6g乙基-3-[3- 二甲基氨基丙基]碳化二亚胺盐酸化物(EDC)和0.1g 4-(二甲基氨基)吡啶(DMAP)溶解在60mL二氯甲烷(DCM)中，搅拌反应20min后，加入步骤(11)制备得到的1g四邻甲氧基取代偶氮苯，室温下反应24h。旋蒸除去溶剂后，使用甲醇/乙酸乙酯按1：1体积比配成溶液作为洗脱剂，对反应产物通过色谱纯化，将纯化处理后的反应产物和3g三氟乙酸(CF3COOH)溶于10mL二氯甲烷(DCM)中，室温下搅拌1h小时后，使用饱和Na2CO3 溶液洗涤，旋蒸除去残留DCM得到深红色固体产物，进一步用水将固体产物洗涤数次，得到长烷基链修饰的四邻甲氧基取代偶氮苯。
(14)制备偶氮苯衍生物修饰的透明质酸(mAzo-HA)
在单口圆底烧瓶中加入2.5g季铵盐修饰的透明质酸(Mw＝690KDa)和0.25g步骤(13) 制备得到的长烷基链修饰的四邻甲氧基取代偶氮苯形成混合物，通入氮气；按季铵盐修饰的透明质酸质量分数为2％加入无水二甲亚砜(DMSO)，搅拌30min，至混合物完全溶解；取另一单口圆底烧瓶，加入0.25g BOP试剂，通氮气，加入20mL无水二甲亚砜，使BOP 试剂完全溶解于无水二甲亚砜后，再加入至季铵盐修饰的透明质酸(HA-TBA)与长烷基链修饰的四邻甲氧基取代偶氮苯的混合溶液中，并在室温下搅拌3小时；搅拌完成后加5mL 4℃去离子水淬灭反应，之后进行透析处理(室温下透析5天，每天换水2次)：前3天加入氯化钠透析TBA盐；离心除去不溶性副产物，再返回用去离子水继续透析2天；所得透析液经冷冻干燥，即可获得式Ⅰ所示结构的偶氮苯衍生物修饰的透明质酸(mAzo-HA)，并将mAzo-HA置于-20℃保存。
(2)制备环糊精修饰的透明质酸(CD-HA)
(21)制备对苯磺酰化的β-环糊精
在4℃冰浴下，将50gβ-环糊精和300mL去离子水在单颈圆底烧瓶中混合搅拌30min，将10g对甲苯磺酰氯溶于25mL乙腈的混合溶液倒入其中，在冰浴下搅拌反应2h。再将单颈圆底烧瓶从冰浴中取出，向其中滴加20mL浓度为5mol/L的氢氧化钠水溶液，滴加完成后搅拌30分钟，直至溶液澄清，再向体系中加入氯化铵调节pH到8.5，继续反应1h。反应完成后，将上述液体倒入离心管中，在4℃下恒温离心，倒去上清，再用去离子水清洗上述沉淀，重复上述离心过程两次；再用冰丙酮和冰乙醚对沉淀进行洗涤，重复上述离心过程。使用真空冻干机将下层沉淀进行冻干，即可获得对苯磺酰化的β-环糊精(CD-Tos)。
(22)制备己二胺基修饰的环糊精
取10g对苯磺酰化的β-环糊精(CD-Tos)加入干燥三颈圆底烧瓶中并连接球形冷凝管并通入氮气，排除烧瓶中的氧气，再使用注射器加入50mL的N，N-二甲基甲酰胺(DMF) 搅拌直到CD-Tos完全溶解。将40g己二胺(HAD)在60℃的油浴中熔化，然后用注射器将己二胺溶液加入到CD-Tos与DMF的混合溶液中，此时溶液变黄。该体系在80℃油浴中搅拌反应18h，然后冷却至室温。取50mL锥形离心管，每个盛45mL冰丙酮，加入5mL 反应溶液，使其沉淀。将沉淀在4℃，离心2分钟，倒上清。再将每管沉淀溶解在5mLDMF 中，加入45mL冰丙酮进行沉淀，在4℃，离心2分钟，倒上清。重复这个步骤三次。之后采用乙醚进行上述同样过程，并重复这个步骤两次。最后使用真空冻干机对沉淀进行冻干，得到干燥的白色粉末，即己二胺基修饰的环糊精(CD-HAD)。
(23)制备环糊精衍生物修饰的透明质酸(CD-HA)
向烧瓶中加入3g季铵盐修饰的透明质酸(HA-TBA)和4g己二胺基修饰的环糊精(CD-HAD)，通入氮气除去体系的空气。然后通过注射器加入125mL无水二甲亚砜溶液 DMSO，该体系搅拌30min，直到完全溶解。然后将1g BOP试剂溶于20mLDMSO溶液中，通过注射器将溶液注入到HA-TBA/CD-HAD混合溶液中，在常温下搅拌3h。然后使用10mL 4℃去离子水猝灭反应并转移到透析袋中进行透析处理(室温下透析5天，每天换水2次)：前3天加入氯化钠，使HA-TBA中的TBA盐析出，然后通过高速离心的方式去除BOP偶联反应中的不溶性副产物，再返回用去离子水继续透析2天。最后将所得透析液通过真空冻干机进行冻干，即获得式II所示结构的环糊精衍生物修饰的透明质酸(CD-HA)。
(3)制备近红外响应透明质酸水凝胶
将偶氮苯衍生物修饰的透明质酸(mAzo-HA)和环糊精衍生物修饰的透明质酸(CD-HA)按设计浓度2％溶于PBS中。再将两种溶液在ep管中以1:1的体积比搅拌在一起，使用人工搅拌以确保水凝胶均匀，然后离心除去滞留的空气。超声两个小时，以便更完全的成胶。
实施例2
本实施例提供的用于关节软骨修复的近红外响应透明质酸水凝胶，其制备方法步骤如下：
(1)制备偶氮苯衍生物修饰的透明质酸(mAzo-HA)
(11)制备四邻甲氧基取代偶氮苯(mAzo)
将1g颗粒状2，6-二甲氧基苯胺溶于1.2mL水和1.5mL浓度为37wt％盐酸形成的混合溶液中，冷却至3℃后，缓慢加入4mL浓度为1.8mol/L的NaNO2溶液并搅拌20分钟。3℃下，将上述混合溶液缓慢加入到1g 3，5-二甲氧基苯胺与40mL水形成的悬浊液中，再加入浓度为2mol/L碳酸氢钠溶液调节反应溶液pH至8.5，搅拌过夜(约12h)。使用二氯甲烷对反应后的溶液进行萃取，分液漏斗将液体与有机层分开，旋蒸浓缩有机溶液部分并使用体积比1：10的甲醇/乙酸乙酯作为洗脱剂，通过层析柱进行纯化，得到红色固体，即为四邻甲氧基取代偶氮苯(mAzo)。
(12)制备BOC保护的氨基十二烷酸
将1g 12-氨基十二烷酸，1g二碳酸二叔丁酯和0.8g三乙胺(TEA)溶解于15mL甲醇中，60℃反应过夜(约12h)。反应结束后，旋蒸除去溶剂，将得到的固体产物溶解在乙酸乙酯中，用浓度为0.25mol/L的HCl溶液洗涤两次，真空干燥，得到BOC保护的氨基十二烷酸。
(13)制备长烷基链修饰的四邻甲氧基取代偶氮苯
在室温下，将步骤(12)制备得到的1g BOC保护的氨基十二烷酸g与0.6g乙基-3-[3- 二甲基氨基丙基]碳化二亚胺盐酸化物(EDC)和0.1g 4-(二甲基氨基)吡啶(DMAP)溶解在60mL二氯甲烷(DCM)中，搅拌反应25min后，加入步骤(11)制备得到的1g四邻甲氧基取代偶氮苯，室温下反应24h。旋蒸除去溶剂后，使用甲醇/乙酸乙酯按1：1体积比配成溶液作为洗脱剂，对反应产物通过色谱纯化，将纯化处理后的反应产物和3g三氟乙酸 (CF3COOH)溶于10mL二氯甲烷(DCM)中，室温下搅拌1h小时后，使用饱和Na2CO3 溶液洗涤，旋蒸除去残留DCM得到深红色固体产物，进一步用水将固体产物洗涤数次，得到长烷基链修饰的四邻甲氧基取代偶氮苯。
(14)制备偶氮苯衍生物修饰的透明质酸(mAzo-HA)
在单口圆底烧瓶中加入2.5g季铵盐修饰的透明质酸(Mw＝690KDa)和0.25g步骤(13) 制备得到的长烷基链修饰的四邻甲氧基取代偶氮苯形成混合物，通入氮气；按季铵盐修饰的透明质酸质量分数为2％加入无水二甲亚砜(DMSO)，搅拌30min，至混合物完全溶解；取另一单口圆底烧瓶，加入0.25g BOP试剂，通氮气，加入20mL无水二甲亚砜，使BOP 试剂完全溶解于无水二甲亚砜后，再加入至季铵盐修饰的透明质酸(HA-TBA)与长烷基链修饰的四邻甲氧基取代偶氮苯的混合溶液中，并在室温下搅拌3小时；搅拌完成后加5mL 4℃去离子水淬灭反应，之后进行透析处理(室温下透析5天，每天换水2次)：前3天加入氯化钠透析TBA盐；离心除去不溶性副产物，再返回用去离子水继续透析2天；所得透析液经冷冻干燥，即可获得式Ⅰ所示结构的偶氮苯衍生物修饰的透明质酸(mAzo-HA)，并将mAzo-HA置于-20℃保存。
(2)制备环糊精修饰的透明质酸(CD-HA)
(21)制备对苯磺酰化的β-环糊精
在4℃冰浴下，将50gβ-环糊精和300mL去离子水在单颈圆底烧瓶中混合搅拌30min，将10g对甲苯磺酰氯溶于25mL乙腈的混合溶液倒入其中，在冰浴下搅拌反应2h。再将单颈圆底烧瓶从冰浴中取出，向其中滴加20mL浓度为5mol/L的氢氧化钠水溶液，滴加完成后搅拌30分钟，直至溶液澄清，再向体系中加入氯化铵调节pH到9，继续反应1h。反应完成后，将上述液体倒入离心管中，在4℃下恒温离心，倒去上清，再用去离子水清洗上述沉淀，重复上述离心过程两次；再用冰丙酮和冰乙醚对沉淀进行洗涤，重复上述离心过程。使用真空冻干机将下层沉淀进行冻干，即可获得对苯磺酰化的β-环糊精(CD-Tos)。
(22)制备己二胺基修饰的环糊精
取10g对苯磺酰化的β-环糊精(CD-Tos)加入干燥三颈圆底烧瓶中并连接球形冷凝管并通入氮气，排除烧瓶中的氧气，再使用注射器加入50mL的N，N-二甲基甲酰胺(DMF) 搅拌直到CD-Tos完全溶解。将40g己二胺(HAD)在60℃的油浴中熔化，然后用注射器将己二胺溶液加入到CD-Tos与DMF的混合溶液中，此时溶液变黄。该体系在80℃油浴中搅拌反应18h，然后冷却至室温。取50mL锥形离心管，每个盛45mL冰丙酮，加入5mL 反应溶液，使其沉淀。将沉淀在4℃，离心2分钟，倒上清。再将每管沉淀溶解在5mLDMF 中，加入45mL冰丙酮进行沉淀，在4℃，离心2分钟，倒上清。重复这个步骤三次。之后采用乙醚进行上述同样过程，并重复这个步骤两次。最后使用真空冻干机对沉淀进行冻干，得到干燥的白色粉末，即己二胺基修饰的环糊精(CD-HAD)。
(23)制备环糊精衍生物修饰的透明质酸(CD-HA)
向烧瓶中加入3g季铵盐修饰的透明质酸(HA-TBA)和4g己二胺基修饰的环糊精(CD-HAD)，通入氮气除去体系的空气。然后通过注射器加入125mL无水二甲亚砜溶液 DMSO，该体系搅拌30min，直到完全溶解。然后将1g BOP试剂溶于20mLDMSO溶液中，通过注射器将溶液注入到HA-TBA/CD-HAD混合溶液中，在常温下搅拌3h。然后使用10mL 4℃去离子水猝灭反应并转移到透析袋中进行透析处理(室温下透析5天，每天换水2次)：前3天加入氯化钠，使HA-TBA中的TBA盐析出，然后通过高速离心的方式去除BOP偶联反应中的不溶性副产物，再返回用去离子水继续透析2天。最后将所得透析液通过真空冻干机进行冻干，即获得式II所示结构的环糊精衍生物修饰的透明质酸(CD-HA)。
(3)制备近红外响应透明质酸水凝胶
将偶氮苯衍生物修饰的透明质酸(mAzo-HA)和环糊精衍生物修饰的透明质酸(CD-HA)按设计浓度3％溶于PBS中。再将两种溶液在ep管中以1:1的体积比搅拌在一起，使用人工搅拌以确保水凝胶均匀，然后离心除去滞留的空气。超声两个小时，以便更完全的成胶。
实施例3
本实施例提供的用于关节软骨修复的近红外响应透明质酸水凝胶，其制备方法步骤如下：
(1)制备偶氮苯衍生物修饰的透明质酸(mAzo-HA)
(11)制备四邻甲氧基取代偶氮苯(mAzo)
将1g颗粒状2，6-二甲氧基苯胺溶于1.2mL水和1.5mL浓度为37wt％盐酸形成的混合溶液中，冷却至4℃后，缓慢加入4mL浓度为1.8mol/L的NaNO2溶液并搅拌20分钟。4℃下，将上述混合溶液缓慢加入到1g 3，5-二甲氧基苯胺与40mL水形成的悬浊液中，再加入浓度为2mol/L碳酸氢钠溶液调节反应溶液pH至8.5，搅拌过夜(约12h)。使用二氯甲烷对反应后的溶液进行萃取，分液漏斗将液体与有机层分开，旋蒸浓缩有机溶液部分并使用体积比1：10的甲醇/乙酸乙酯作为洗脱剂，通过层析柱进行纯化，得到红色固体，即为四邻甲氧基取代偶氮苯(mAzo)。
(12)制备BOC保护的氨基十二烷酸
将1g 12-氨基十二烷酸，1g二碳酸二叔丁酯和0.8g三乙胺(TEA)溶解于15mL甲醇中，50℃反应过夜(约12h)。反应结束后，旋蒸除去溶剂，将得到的固体产物溶解在乙酸乙酯中，用浓度为0.25mol/L的HCl溶液洗涤两次，真空干燥，得到BOC保护的氨基十二烷酸。
(13)制备长烷基链修饰的四邻甲氧基取代偶氮苯
在室温下，将步骤(12)制备得到的1gBOC保护的氨基十二烷酸g与0.6g乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳化二亚胺盐酸化物(EDC)和0.1g 4-(二甲基氨基)吡啶(DMAP)溶解在60mL二氯甲烷(DCM)中，搅拌反应30min后，加入步骤(11)制备得到的1g四邻甲氧基取代偶氮苯，室温下反应24h。旋蒸除去溶剂后，使用甲醇/乙酸乙酯按1：2体积比配成溶液作为洗脱剂，对反应产物通过色谱纯化，将纯化处理后的反应产物和3g三氟乙酸 (CF3COOH)溶于10mL二氯甲烷(DCM)中，室温下搅拌1h小时后，使用饱和Na2CO3 溶液洗涤，旋蒸除去残留DCM得到深红色固体产物，进一步用水将固体产物洗涤数次，得到长烷基链修饰的四邻甲氧基取代偶氮苯。
(14)制备偶氮苯衍生物修饰的透明质酸(mAzo-HA)
在单口圆底烧瓶中加入2.5g季铵盐修饰的透明质酸(Mw＝690KDa)和0.25g步骤(13) 制备得到的长烷基链修饰的四邻甲氧基取代偶氮苯形成混合物，通入氮气；按季铵盐修饰的透明质酸质量分数为2％加入无水二甲亚砜(DMSO)，搅拌30min，至混合物完全溶解；取另一单口圆底烧瓶，加入0.25g BOP试剂，通氮气，加入20mL无水二甲亚砜，使BOP 试剂完全溶解于无水二甲亚砜后，再加入至季铵盐修饰的透明质酸(HA-TBA)与长烷基链修饰的四邻甲氧基取代偶氮苯的混合溶液中，并在室温下搅拌3h；搅拌完成后加5mL 4℃去离子水淬灭反应，之后进行透析处理(室温下透析5天，每天换水2次)：前3天加入氯化钠透析TBA盐；离心除去不溶性副产物，再返回用去离子水继续透析2天；所得透析液经冷冻干燥，即可获得式Ⅰ所示结构的偶氮苯衍生物修饰的透明质酸(mAzo-HA)，并将 mAzo-HA置于-20℃保存。
(2)制备环糊精修饰的透明质酸(CD-HA)
(21)制备对苯磺酰化的β-环糊精
在4℃冰浴下，将50gβ-环糊精和300mL去离子水在单颈圆底烧瓶中混合搅拌30min，将10g对甲苯磺酰氯溶于25mL乙腈的混合溶液倒入其中，在冰浴下搅拌反应2h。再将单颈圆底烧瓶从冰浴中取出，向其中滴加20mL浓度为5mol/L的氢氧化钠水溶液，滴加完成后搅拌30分钟，直至溶液澄清，再向体系中加入氯化铵调节pH到8.5，继续反应1h。反应完成后，将上述液体倒入离心管中，在4℃下恒温离心，倒去上清，再用去离子水清洗上述沉淀，重复上述离心过程两次；再用冰丙酮和冰乙醚对沉淀进行洗涤，重复上述离心过程。使用真空冻干机将下层沉淀进行冻干，即可获得对苯磺酰化的β-环糊精(CD-Tos)。
(22)制备己二胺基修饰的环糊精
取10g对苯磺酰化的β-环糊精(CD-Tos)加入干燥三颈圆底烧瓶中并连接球形冷凝管并通入氮气，排除烧瓶中的氧气，再使用注射器加入50mL的N，N-二甲基甲酰胺(DMF) 搅拌直到CD-Tos完全溶解。将40g己二胺(HAD)在60℃的油浴中熔化，然后用注射器将己二胺溶液加入到CD-Tos与DMF的混合溶液中，此时溶液变黄。该体系在80℃油浴中搅拌反应18h，然后冷却至室温。取50mL锥形离心管，每个盛45mL冰丙酮，加入5mL 反应溶液，使其沉淀。将沉淀在4℃，离心2分钟，倒上清。再将每管沉淀溶解在5mLDMF 中，加入45mL冰丙酮进行沉淀，在4℃，离心2分钟，倒上清。重复这个步骤三次。之后采用乙醚进行上述同样过程，并重复这个步骤两次。最后使用真空冻干机对沉淀进行冻干，得到干燥的白色粉末，即己二胺基修饰的环糊精(CD-HAD)。
(23)制备环糊精衍生物修饰的透明质酸(CD-HA)
向烧瓶中加入3g季铵盐修饰的透明质酸(HA-TBA)和4g己二胺基修饰的环糊精(CD-HAD)，通入氮气除去体系的空气。然后通过注射器加入125mL无水二甲亚砜溶液 DMSO，该体系搅拌30min，直到完全溶解。然后将1g BOP试剂溶于20mL DMSO溶液中，通过注射器将溶液注入到HA-TBA/CD-HAD混合溶液中，在常温下搅拌3h。然后使用10mL 4℃去离子水猝灭反应并转移到透析袋中进行透析处理(室温下透析5天，每天换水2次)：前3天加入氯化钠，使HA-TBA中的TBA盐析出，然后通过高速离心的方式去除BOP偶联反应中的不溶性副产物，再返回用去离子水继续透析2天。最后将所得透析液通过真空冻干机进行冻干，即获得式II所示结构的环糊精衍生物修饰的透明质酸(CD-HA)。
(3)制备近红外响应透明质酸水凝胶
将偶氮苯衍生物修饰的透明质酸(mAzo-HA)和环糊精衍生物修饰的透明质酸(CD-HA)按设计浓度4％溶于PBS中。再将两种溶液在ep管中以1:1的体积比搅拌在一起，使用人工搅拌以确保水凝胶均匀，然后离心除去滞留的空气。超声两个小时，以便更完全的成胶。
实施例4
本实施例提供的用于关节软骨修复的近红外响应透明质酸水凝胶，其制备方法步骤如下：
(1)制备偶氮苯衍生物修饰的透明质酸(mAzo-HA)
(11)制备四邻甲氧基取代偶氮苯(mAzo)
将1g颗粒状2，6-二甲氧基苯胺溶于1.2mL水和1.5mL浓度为37wt％盐酸形成的混合溶液中，冷却至5℃后，缓慢加入4mL浓度为1.8mol/L的NaNO2溶液并搅拌20分钟。5℃下，将上述混合溶液缓慢加入到1g 3，5-二甲氧基苯胺与40mL水形成的悬浊液中，再加入浓度为2mol/L碳酸氢钠溶液调节反应溶液pH至8，搅拌过夜(约12h)。使用二氯甲烷对反应后的溶液进行萃取，分液漏斗将液体与有机层分开，旋蒸浓缩有机溶液部分并使用体积比1：5的甲醇/乙酸乙酯作为洗脱剂，通过层析柱进行纯化，得到红色固体，即为四邻甲氧基取代偶氮苯(mAzo)。
(12)制备BOC保护的氨基十二烷酸
将1g 12-氨基十二烷酸，1g二碳酸二叔丁酯和0.8g三乙胺(TEA)溶解于15mL甲醇中，60℃反应过夜(约12h)。反应结束后，旋蒸除去溶剂，将得到的固体产物溶解在乙酸乙酯中，用浓度为0.25mol/L的HCl溶液洗涤两次，真空干燥，得到BOC保护的氨基十二烷酸。
(13)制备长烷基链修饰的四邻甲氧基取代偶氮苯
在室温下，将步骤(12)制备得到的1gBOC保护的氨基十二烷酸g与0.6g乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳化二亚胺盐酸化物(EDC)和0.1g 4-(二甲基氨基)吡啶(DMAP)溶解在60mL二氯甲烷(DCM)中，搅拌反应30min后，加入步骤(11)制备得到的1g四邻甲氧基取代偶氮苯，室温下反应24h。旋蒸除去溶剂后，使用甲醇/乙酸乙酯按1：2体积比配成溶液作为洗脱剂，对反应产物通过色谱纯化，将纯化处理后的反应产物和3g三氟乙酸 (CF3COOH)溶于10mL二氯甲烷(DCM)中，室温下搅拌1h小时后，使用饱和Na2CO3 溶液洗涤，旋蒸除去残留DCM得到深红色固体产物，进一步用水将固体产物洗涤数次，得到长烷基链修饰的四邻甲氧基取代偶氮苯。
(14)制备偶氮苯衍生物修饰的透明质酸(mAzo-HA)
在单口圆底烧瓶中加入2.5g季铵盐修饰的透明质酸(Mw＝690KDa)和0.25g步骤(13) 制备得到的长烷基链修饰的四邻甲氧基取代偶氮苯形成混合物，通入氮气；按季铵盐修饰的透明质酸质量分数为2％加入无水二甲亚砜(DMSO)，搅拌30min，至混合物完全溶解；取另一单口圆底烧瓶，加入0.25g BOP试剂，通氮气，加入20mL无水二甲亚砜，使BOP 试剂完全溶解于无水二甲亚砜后，再加入至季铵盐修饰的透明质酸(HA-TBA)与长烷基链修饰的四邻甲氧基取代偶氮苯的混合溶液中，并在室温下搅拌3小时；搅拌完成后加5mL 4℃去离子水淬灭反应，之后进行透析处理(室温下透析5天，每天换水2次)：前3天加入氯化钠透析TBA盐；离心除去不溶性副产物，再返回用去离子水继续透析2天；所得透析液经冷冻干燥，即可获得式Ⅰ所示结构的偶氮苯衍生物修饰的透明质酸(mAzo-HA)，并将mAzo-HA置于-20℃保存。
(2)制备环糊精修饰的透明质酸(CD-HA)
(21)制备对苯磺酰化的β-环糊精
在4℃冰浴下，将50gβ-环糊精和300mL去离子水在单颈圆底烧瓶中混合搅拌30min，将10g对甲苯磺酰氯溶于25mL乙腈的混合溶液倒入其中，在冰浴下搅拌反应2h。再将单颈圆底烧瓶从冰浴中取出，向其中滴加20mL浓度为6.6mol/L的氢氧化钠水溶液，滴加完成后搅拌30分钟，直至溶液澄清，再向体系中加入氯化铵调节pH到9，继续反应1h。反应完成后，将上述液体倒入离心管中，在4℃下恒温离心，倒去上清，再用去离子水清洗上述沉淀，重复上述离心过程两次；再用冰丙酮和冰乙醚对沉淀进行洗涤，重复上述离心过程。使用真空冻干机将下层沉淀进行冻干，即可获得对苯磺酰化的β-环糊精(CD-Tos)。
(22)制备己二胺基修饰的环糊精
取10g对苯磺酰化的β-环糊精(CD-Tos)加入干燥三颈圆底烧瓶中并连接球形冷凝管并通入氮气，排除烧瓶中的氧气，再使用注射器加入50mL的N，N-二甲基甲酰胺(DMF) 搅拌直到CD-Tos完全溶解。将40g己二胺(HAD)在60℃的油浴中熔化，然后用注射器将己二胺溶液加入到CD-Tos与DMF的混合溶液中，此时溶液变黄。该体系在80℃油浴中搅拌反应18h，然后冷却至室温。取50mL锥形离心管，每个盛45mL冰丙酮，加入5mL 反应溶液，使其沉淀。将沉淀在4℃，离心2分钟，倒上清。再将每管沉淀溶解在5mLDMF 中，加入45mL冰丙酮进行沉淀，在4℃，离心2分钟，倒上清。重复这个步骤三次。之后采用乙醚进行上述同样过程，并重复这个步骤两次。最后使用真空冻干机对沉淀进行冻干，得到干燥的白色粉末，即己二胺基修饰的环糊精(CD-HAD)。
(23)制备环糊精衍生物修饰的透明质酸(CD-HA)
向烧瓶中加入3g季铵盐修饰的透明质酸(HA-TBA)和4g己二胺基修饰的环糊精(CD-HAD)，通入氮气除去体系的空气。然后通过注射器加入125mL无水二甲亚砜溶液 DMSO，该体系搅拌30min，直到完全溶解。然后将1g BOP试剂溶于20mLDMSO溶液中，通过注射器将溶液注入到HA-TBA/CD-HAD混合溶液中，在常温下搅拌3h。然后使用10mL 4℃去离子水猝灭反应并转移到透析袋中进行透析处理(室温下透析5天，每天换水2次)：前3天加入氯化钠，使HA-TBA中的TBA盐析出，然后通过高速离心的方式去除BOP偶联反应中的不溶性副产物，再返回用去离子水继续透析2天。最后将所得透析液通过真空冻干机进行冻干，即获得式II所示结构的环糊精衍生物修饰的透明质酸(CD-HA)。
(3)制备近红外响应透明质酸水凝胶
将偶氮苯衍生物修饰的透明质酸(mAzo-HA)和环糊精衍生物修饰的透明质酸(CD-HA)按设计浓度4％溶于PBS中。再将两种溶液在ep管中以1:1的体积比搅拌在一起，使用人工搅拌以确保水凝胶均匀，然后离心除去滞留的空气。超声两个小时，以便更完全的成胶。
实施例5
本实施例提供的用于关节软骨修复的近红外响应透明质酸水凝胶，其制备方法步骤如下：
(1)制备偶氮苯衍生物修饰的透明质酸(mAzo-HA)
(11)制备四邻甲氧基取代偶氮苯(mAzo)
将1g颗粒状2，6-二甲氧基苯胺溶于1.2mL水和1.5mL浓度为37wt％盐酸形成的混合溶液中，冷却至4℃后，缓慢加入4mL浓度为1.8mol/L的NaNO2溶液并搅拌5分钟。4℃下，将上述混合溶液缓慢加入到1g 3，5-二甲氧基苯胺与40mL水形成的悬浊液中，再加入浓度为2mol/L氢氧化钠溶液调节反应溶液pH至9，搅拌反应8h。使用二氯甲烷对反应后的溶液进行萃取，分液漏斗将液体与有机层分开，旋蒸浓缩有机溶液部分并使用体积比1： 5的甲醇/乙酸乙酯作为洗脱剂，通过层析柱进行纯化，得到红色固体，即为四邻甲氧基取代偶氮苯(mAzo)。
(12)制备BOC保护的氨基十二烷酸
将1g 12-氨基十二烷酸，1g二碳酸二叔丁酯和0.8g三乙胺(TEA)溶解于15mL甲醇中，50℃反应8h。反应结束后，旋蒸除去溶剂，将得到的固体产物溶解在乙酸乙酯中，用浓度为0.25mol/L的HCl溶液洗涤两次，真空干燥，得到BOC保护的氨基十二烷酸。
(13)制备长烷基链修饰的四邻甲氧基取代偶氮苯
在室温下，将步骤(12)制备得到的1gBOC保护的氨基十二烷酸g与0.6g乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳化二亚胺盐酸化物(EDC)和0.1g 4-(二甲基氨基)吡啶(DMAP)溶解在60mL二氯甲烷(DCM)中，搅拌反应30min后，加入步骤(11)制备得到的1g四邻甲氧基取代偶氮苯，室温下反应12h。旋蒸除去溶剂后，使用甲醇/乙酸乙酯按1：3体积比配成溶液作为洗脱剂，对反应产物通过色谱纯化，将纯化处理后的反应产物和3g三氟乙酸(CF3COOH)溶于10mL二氯甲烷(DCM)中，室温下搅拌0.5h小时后，使用饱和Na2CO3 溶液洗涤，旋蒸除去残留DCM得到深红色固体产物，进一步用水将固体产物洗涤数次，得到长烷基链修饰的四邻甲氧基取代偶氮苯。
(14)制备偶氮苯衍生物修饰的透明质酸(mAzo-HA)
在单口圆底烧瓶中加入2.5g季铵盐修饰的透明质酸(Mw＝690KDa)和0.25g步骤(13) 制备得到的长烷基链修饰的四邻甲氧基取代偶氮苯形成混合物，通入氮气；按季铵盐修饰的透明质酸质量分数为2％加入无水二甲亚砜(DMSO)，搅拌30min，至混合物完全溶解；取另一单口圆底烧瓶，加入0.25g BOP试剂，通氮气，加入20mL无水二甲亚砜，使BOP 试剂完全溶解于无水二甲亚砜后，再加入至季铵盐修饰的透明质酸(HA-TBA)与长烷基链修饰的四邻甲氧基取代偶氮苯的混合溶液中，并在室温下搅拌4小时；搅拌完成后加5mL 4℃去离子水淬灭反应，之后进行透析处理(室温下透析5天，每天换水2次)：前3天加入氯化钠透析TBA盐；离心除去不溶性副产物，再返回用去离子水继续透析2天；所得透析液经冷冻干燥，即可获得式Ⅰ所示结构的偶氮苯衍生物修饰的透明质酸(mAzo-HA)，并将mAzo-HA置于-20℃保存。
(2)制备环糊精修饰的透明质酸(CD-HA)
(21)制备对苯磺酰化的β-环糊精
在4℃冰浴下，将50gβ-环糊精和300mL去离子水在单颈圆底烧瓶中混合搅拌30min，将10g对甲苯磺酰氯溶于25mL乙腈的混合溶液倒入其中，在冰浴下搅拌反应2.5h。再将单颈圆底烧瓶从冰浴中取出，向其中滴加20mL浓度为5mol/L的氢氧化钠水溶液，滴加完成后搅拌30分钟，直至溶液澄清，再向体系中加入氯化铵调节pH到9，继续反应1h。反应完成后，将上述液体倒入离心管中，在4℃下恒温离心，倒去上清，再用去离子水清洗上述沉淀，重复上述离心过程两次；再用冰丙酮和冰乙醚对沉淀进行洗涤，重复上述离心过程。使用真空冻干机将下层沉淀进行冻干，即可获得对苯磺酰化的β-环糊精(CD-Tos)。
(22)制备己二胺基修饰的环糊精
取10g对苯磺酰化的β-环糊精(CD-Tos)加入干燥三颈圆底烧瓶中并连接球形冷凝管并通入氮气，排除烧瓶中的氧气，再使用注射器加入50mL的N，N-二甲基甲酰胺(DMF) 搅拌直到CD-Tos完全溶解。将40g己二胺(HAD)在60℃的油浴中熔化，然后用注射器将己二胺溶液加入到CD-Tos与DMF的混合溶液中，此时溶液变黄。该体系在70℃油浴中搅拌反应12h，然后冷却至室温。取50mL锥形离心管，每个盛45mL冰丙酮，加入5mL 反应溶液，使其沉淀。将沉淀在4℃，离心2分钟，倒上清。再将每管沉淀溶解在5mLDMF 中，加入45mL冰丙酮进行沉淀，在4℃，离心2分钟，倒上清。重复这个步骤三次。之后采用乙醚进行上述同样过程，并重复这个步骤两次。最后使用真空冻干机对沉淀进行冻干，得到干燥的白色粉末，即己二胺基修饰的环糊精(CD-HAD)。
(23)制备环糊精衍生物修饰的透明质酸(CD-HA)
向烧瓶中加入3g季铵盐修饰的透明质酸(HA-TBA)和4g己二胺基修饰的环糊精(CD-HAD)，通入氮气除去体系的空气。然后通过注射器加入125mL无水二甲亚砜溶液 DMSO，该体系搅拌30min，直到完全溶解。然后将1g BOP试剂溶于20mLDMSO溶液中，通过注射器将溶液注入到HA-TBA/CD-HAD混合溶液中，在常温下搅拌4h。然后使用10mL 4℃去离子水猝灭反应并转移到透析袋中进行透析处理(室温下透析5天，每天换水2次)：前3天加入氯化钠，使HA-TBA中的TBA盐析出，然后通过高速离心的方式去除BOP偶联反应中的不溶性副产物，再返回用去离子水继续透析2天。最后将所得透析液通过真空冻干机进行冻干，即获得式II所示结构的环糊精衍生物修饰的透明质酸(CD-HA)。
(3)制备近红外响应透明质酸水凝胶
将偶氮苯衍生物修饰的透明质酸(mAzo-HA)和环糊精衍生物修饰的透明质酸(CD-HA)按设计浓度4％溶于PBS中。再将两种溶液在ep管中以1:1的体积比搅拌在一起，使用人工搅拌以确保水凝胶均匀，然后离心除去滞留的空气。超声两个小时，以便更完全的成胶。
实施例6
本实施例提供的用于关节软骨修复的近红外响应透明质酸水凝胶，其制备方法步骤如下：
(1)制备偶氮苯衍生物修饰的透明质酸(mAzo-HA)
(11)制备四邻甲氧基取代偶氮苯(mAzo)
将1g颗粒状2，6-二甲氧基苯胺溶于1.2mL水和1.5mL浓度为37wt％盐酸形成的混合溶液中，冷却至4℃后，缓慢加入4mL浓度为1.8mol/L的NaNO2溶液并搅拌10分钟。4℃下，将上述混合溶液缓慢加入到1g 3，5-二甲氧基苯胺与40mL水形成的悬浊液中，再加入浓度为2mol/L氢氧化钠溶液调节反应溶液pH至9，搅拌反应10h。使用二氯甲烷对反应后的溶液进行萃取，分液漏斗将液体与有机层分开，旋蒸浓缩有机溶液部分并使用体积比1： 3的甲醇/乙酸乙酯作为洗脱剂，通过层析柱进行纯化，得到红色固体，即为四邻甲氧基取代偶氮苯(mAzo)。
(12)制备BOC保护的氨基十二烷酸
将1g 12-氨基十二烷酸，1g二碳酸二叔丁酯和0.8g三乙胺(TEA)溶解于15mL甲醇中，50℃反应10h。反应结束后，旋蒸除去溶剂，将得到的固体产物溶解在乙酸乙酯中，用浓度为0.25mol/L的HCl溶液洗涤两次，真空干燥，得到BOC保护的氨基十二烷酸。
(13)制备长烷基链修饰的四邻甲氧基取代偶氮苯
在室温下，将步骤(12)制备得到的1gBOC保护的氨基十二烷酸g与0.6g乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳化二亚胺盐酸化物(EDC)和0.1g 4-(二甲基氨基)吡啶(DMAP)溶解在60mL二氯甲烷(DCM)中，搅拌反应30min后，加入步骤(11)制备得到的1g四邻甲氧基取代偶氮苯，室温下反应24h。旋蒸除去溶剂后，使用甲醇/乙酸乙酯按1：2体积比配成溶液作为洗脱剂，对反应产物通过色谱纯化，将纯化处理后的反应产物和3g三氟乙酸 (CF3COOH)溶于10mL二氯甲烷(DCM)中，室温下搅拌2h小时后，使用饱和Na2CO3 溶液洗涤，旋蒸除去残留DCM得到深红色固体产物，进一步用水将固体产物洗涤数次，得到长烷基链修饰的四邻甲氧基取代偶氮苯。
(14)制备偶氮苯衍生物修饰的透明质酸(mAzo-HA)
在单口圆底烧瓶中加入2.5g季铵盐修饰的透明质酸(Mw＝690KDa)和0.25g步骤(13) 制备得到的长烷基链修饰的四邻甲氧基取代偶氮苯形成混合物，通入氮气；按季铵盐修饰的透明质酸质量分数为2％加入无水二甲亚砜(DMSO)，搅拌30min，至混合物完全溶解；取另一单口圆底烧瓶，加入0.25g BOP试剂，通氮气，加入20mL无水二甲亚砜，使BOP 试剂完全溶解于无水二甲亚砜后，再加入至季铵盐修饰的透明质酸(HA-TBA)与长烷基链修饰的四邻甲氧基取代偶氮苯的混合溶液中，并在室温下搅拌5小时；搅拌完成后加5mL 4℃去离子水淬灭反应，之后进行透析处理(室温下透析5天，每天换水2次)：前3天加入氯化钠透析TBA盐；离心除去不溶性副产物，再返回用去离子水继续透析2天；所得透析液经冷冻干燥，即可获得式Ⅰ所示结构的偶氮苯衍生物修饰的透明质酸(mAzo-HA)，并将mAzo-HA置于-20℃保存。
(2)制备环糊精修饰的透明质酸(CD-HA)
(21)制备对苯磺酰化的β-环糊精
在4℃冰浴下，将50gβ-环糊精和300mL去离子水在单颈圆底烧瓶中混合搅拌30min，将10g对甲苯磺酰氯溶于25mL乙腈的混合溶液倒入其中，在冰浴下搅拌反应3h。再将单颈圆底烧瓶从冰浴中取出，向其中滴加20mL浓度为6.6mol/L的氢氧化钠水溶液，滴加完成后搅拌30分钟，直至溶液澄清，再向体系中加入氯化铵调节pH到8.5，继续反应1h。反应完成后，将上述液体倒入离心管中，在4℃下恒温离心，倒去上清，再用去离子水清洗上述沉淀，重复上述离心过程两次；再用冰丙酮和冰乙醚对沉淀进行洗涤，重复上述离心过程。使用真空冻干机将下层沉淀进行冻干，即可获得对苯磺酰化的β-环糊精(CD-Tos)。
(22)制备己二胺基修饰的环糊精
取10g对苯磺酰化的β-环糊精(CD-Tos)加入干燥三颈圆底烧瓶中并连接球形冷凝管并通入氮气，排除烧瓶中的氧气，再使用注射器加入50mL的N，N-二甲基甲酰胺(DMF) 搅拌直到CD-Tos完全溶解。将40g己二胺(HAD)在60℃的油浴中熔化，然后用注射器将己二胺溶液加入到CD-Tos与DMF的混合溶液中，此时溶液变黄。该体系在60℃油浴中搅拌反应8h，然后冷却至室温。取50mL锥形离心管，每个盛45mL冰丙酮，加入5mL 反应溶液，使其沉淀。将沉淀在4℃，离心2分钟，倒上清。再将每管沉淀溶解在5mLDMF 中，加入45mL冰丙酮进行沉淀，在4℃，离心2分钟，倒上清。重复这个步骤三次。之后采用乙醚进行上述同样过程，并重复这个步骤两次。最后使用真空冻干机对沉淀进行冻干，得到干燥的白色粉末，即己二胺基修饰的环糊精(CD-HAD)。
(23)制备环糊精衍生物修饰的透明质酸(CD-HA)
向烧瓶中加入3g季铵盐修饰的透明质酸(HA-TBA)和4g己二胺基修饰的环糊精(CD-HAD)，通入氮气除去体系的空气。然后通过注射器加入125mL无水二甲亚砜溶液 DMSO，该体系搅拌30min，直到完全溶解。然后将1g BOP试剂溶于20mLDMSO溶液中，通过注射器将溶液注入到HA-TBA/CD-HAD混合溶液中，在常温下搅拌5h。然后使用10mL 4℃去离子水猝灭反应并转移到透析袋中进行透析处理(室温下透析5天，每天换水2次)：前3天加入氯化钠，使HA-TBA中的TBA盐析出，然后通过高速离心的方式去除BOP偶联反应中的不溶性副产物，再返回用去离子水继续透析2天。最后将所得透析液通过真空冻干机进行冻干，即获得式II所示结构的环糊精衍生物修饰的透明质酸(CD-HA)。
(3)制备近红外响应透明质酸水凝胶
将偶氮苯衍生物修饰的透明质酸(mAzo-HA)和环糊精衍生物修饰的透明质酸(CD-HA)按设计浓度3％溶于PBS中。再将两种溶液在ep管中以1:1的体积比搅拌在一起，使用人工搅拌以确保水凝胶均匀，然后离心除去滞留的空气。超声两个小时，以便更完全的成胶。
以下对实施例1-4制备的部分中间产物和水凝胶进行性能分析。
为了证明相关化合物的已经成功合成，通过核磁共振氢谱对实施例3制备的mAzo、mAzo-HA、CD-HAD、CD-HA进行表征，结果如图2所示。由图2可以看出，相关的特征峰可以说明化合物的mAzo、mAzo-HA、CD-HAD、CD-HA已经成功合成。
为了考察偶氮苯的光致异构性能，通过紫外吸收光谱和核磁共振氢谱对实施例3制备的mAzo进行表征。在625nm光照下，偶氮苯反式-顺式的变化，在利用紫外吸收光谱进行表征时，约在350nm左右发现π-π*特征转变峰，在450nm左右发现n-π*特征转变峰，表明光致异构现象的出现；在利用核磁共振氢谱进行表征时，首先将偶氮苯小分子溶解在氘代DMSO中，浓度约为8mg/mL，测试前需要避光10h以上，测试完后，使用625nm波长光进行照射30min而后再迅速进行核磁测试。由于偶氮苯的光致异构特性，会使相关氢原子的化学位移发生变化，如图3所示，相关变化在图3中被明显的观察到；图a是625nm红光(40mW/cm2，30min)照射前后mAzo-NH2的UV/vis吸收光谱，图b是1H-NMR核磁共振氢谱(DMSO-d6，298K，400MHz)。
为了体现所制备的水凝胶材料的力学性能以及良好的体内应用价值，使用流变仪对实施例1-3制备的不同浓度(2％、3％、4％)的水凝胶进行了测试，结果如图4所示。图a-b不同浓度超分子水凝胶的频率扫描和应变扫描；图c是4wt％浓度水凝胶的振荡振幅扫频。图d-f是自愈性能的宏观观察和图g是注射性能。可以发现随着浓度的增加，水凝胶的模量在不断增加，在不同应变循环下，该水凝胶具有良好的自愈合性能，此外通过宏观的断开-重合实验以及注射器注射实验，均证明高浓度水凝胶不仅具有良好稳定的力学性能，也具有良好的自愈合和可注射性能，这些性能的出现为水凝胶的体内应用铺平的道路。
为了证明该水凝胶具有光响应性的力学响应，通过对625nm光照下实施例1-3制备的水凝胶的储能/损耗模量进行流变学的测量，如图5所示。图a是625nm光照射下偶氮苯与β-环糊精之间的解离导致交联密度下降的示意图。在470nm光照射下异构化是可逆的，在黑暗中是热弛豫的。图b是不同浓度超分子水凝胶在625nm红光照射和暗光照射下的可逆存储模量变化。由图5可以知道，发现在625nm的光照下，储能模量会下降，具体原因是反式偶氮苯转变为顺式偶氮苯，偶极矩降低，将从环糊精的空腔中脱离，发生主客体作用的解离，导致水凝胶的交联网络降低，力学性能降低。当移除625nm的光照后，偶氮苯具有自发的热弛豫过程，又重新回到反式结构，水凝胶的交联网络恢复，导致力学强度的恢复。
为了证明该水凝胶在软骨修复上具有潜在的应用价值，尤其是能够产生可控的润滑条件，减轻骨关节环境的摩擦，从而对软骨修复产生积极作用，对实施例3制备的近红外光响应水凝胶进行冰冻切片观察，如图6所示，为不同光照时间下近红外光响应透明质酸水凝胶冰冻切片图。在625nm波长的光照射下，由水凝胶材料的切片图可以看出，其交联网络会发生降低，由于交联网络的降低，发生了部分的凝胶-溶胶转变，使得材料表面会形成一层水化层，由于这层水化层的存在，可以进行有效的润滑，在关节软骨修复上具有巨大的应用潜力。
以上性能分析表明通过本发明提供的近红外光响应的透明质酸水凝胶不仅具有传统非共价作用形成水凝胶的自愈合性和可注射性，还具有光控的力学响应，以及光控的部分凝胶-溶胶转变，形成水化层，这些功能的形成，对于软骨修复，尤其是减轻摩擦用于骨关节方面修复具有重大意义。
本领域的普通技术人员将会意识到，这里所述的实施例是为了帮助读者理解本发明的原理，应被理解为本发明的保护范围并不局限于这样的特别陈述和实施例。本领域的普通技术人员可以根据本发明公开的这些技术启示做出各种不脱离本发明实质的其它各种具体变形和组合，这些变形和组合仍然在本发明的保护范围内。

Claims (6)

1.一种用于关节软骨修复的近红外响应透明质酸水凝胶，其特征在于：该水凝胶以偶氮苯衍生物修饰的透明质酸和环糊精衍生物修饰的透明质酸为原料经交联反应而成，所述偶氮苯衍生物采用长烷基链修饰的四邻甲氧基取代偶氮苯，所述环糊精衍生物采用己二胺基修饰的环糊精，所述偶氮苯衍生物修饰的透明质酸和环糊精衍生物修饰的透明质酸的质量比为1：1；
所述偶氮苯衍生物修饰的透明质酸结构式如式Ⅰ所示：
Figure FDA0003230347140000011
所述环糊精衍生物修饰的透明质酸结构式如式Ⅱ所示：
Figure FDA0003230347140000012
2.一种用于关节软骨修复的近红外响应透明质酸水凝胶的制备方法，其特征在于：将权利要求1所述结构的偶氮苯衍生物修饰的透明质酸和环糊精衍生物修饰的透明质酸按照权利要求1所述质量之比计量称取后分别于磷酸盐缓冲盐溶液中溶解形成质量浓度为2％-4％的溶液，将两种溶液等体积混合均匀，静置或超声成胶即可。
3.根据权利要求2所述的用于关节软骨修复的近红外响应透明质酸水凝胶的制备方法，其特征在于：所述偶氮苯衍生物修饰的透明质酸的制备方法，包括以下步骤：
(11)制备四邻甲氧基取代偶氮苯
将2，6-二甲氧基苯胺溶于盐酸溶液中，冷却至0-5℃后，再加入NaNO2溶液并搅拌反应5-20min；在0-5℃条件下，将前述反应溶液加入至3,5-二甲氧基苯胺与水形成的悬浊液中，并加入碱溶液调节溶液pH至8-9，搅拌反应8-12h；对反应后的溶液进行萃取并收集有机溶液部分，对收集到的有机溶液依次进行浓缩、洗脱纯化处理后，得到四邻甲氧基取代偶氮苯；
所述2，6-二甲氧基苯胺、NaNO2和3,5-二甲氧基苯胺的质量比为2：1：2；
(12)制备BOC保护的氨基十二烷酸
将12-氨基十二烷酸、二碳酸二叔丁酯和三乙胺溶解于甲醇中，加热至50℃-60℃反应8-12h，反应结束后，去除溶剂并将得到的固体产物溶解于乙酸乙酯中，采用盐酸溶液洗涤后进行干燥，得到BOC保护的氨基十二烷酸；
所述12-氨基十二烷酸、二碳酸二叔丁酯和三乙胺的质量比为5：5：4；
(13)制备长烷基链修饰的四邻甲氧基取代偶氮苯
于室温下，将步骤(12)制备得到的BOC保护的氨基十二烷酸以及乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳化二亚胺盐酸化物、4-(二甲基氨基)吡啶溶解于二氯甲烷中，搅拌20-30min后，加入步骤(11)制备得到的四邻甲氧基取代偶氮苯，于室温下反应至少12h，去除溶剂后对反应产物进行洗脱纯化处理，将纯化处理后的反应产物和三氟乙酸溶于二氯甲烷中，于室温下搅拌反应0.5-2h后，采用饱和Na2CO3溶液洗涤后，去除残余二氯甲烷得到固体产物，将固体产物用水洗涤后，得到长烷基链修饰的四邻甲氧基取代偶氮苯；
所述步骤(12)制备得到的BOC保护的氨基十二烷酸、乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳化二亚胺盐酸化物、4-(二甲基氨基)吡啶、步骤(11)制备得到的四邻甲氧基取代偶氮苯以及三氟乙酸的质量比为10：6：1：10：30；
(14)制备偶氮苯衍生物修饰的透明质酸
在氮气氛围下，将四丁基铵盐改性的透明质酸和步骤(13)制备得到的长烷基链修饰的四邻甲氧基取代偶氮苯的混合物溶解于二甲亚砜中，形成混合物溶液；在氮气氛围下，BOP试剂溶解于二甲亚砜中形成BOP溶液，并将BOP溶液加入前述混合物溶液中，室温下搅拌3-5h，搅拌完成后加0-5℃去离子水淬灭反应，并于室温下透析，透析前1-3天作为透析液的去离子水中加入氯化钠以使四丁基铵离子析出，透析完成后离心除去不溶性副产物，再用去离子水继续透析2-3天，最终透析获得产物经冷冻干燥处理，即得到如式Ⅰ所示结构的偶氮苯衍生物修饰的透明质酸；
所述四丁基铵盐改性的透明质酸、长烷基链修饰的氨基化偶氮苯以及BOP试剂溶的质量比为10：1：1。
4.根据权利要求3所述的用于关节软骨修复的近红外响应透明质酸水凝胶的制备方法，其特征在于：所述四丁基铵盐改性的透明质酸的制备方法包括以下步骤：
将透明质酸溶于去离子水中形成透明质酸溶液，在透明质酸溶液中加入离子交换树脂，继续搅拌30-60min，通过真空过滤从树脂中收集透明质酸溶液，随后采用四丁基氢氧化铵将透明质酸溶液滴定至pH为7.02-7.05，进行冷冻干燥处理，得到四丁基铵盐改性的透明质酸；
所述透明质酸、离子交换树脂的质量比为1：3。
5.根据权利要求2所述的用于关节软骨修复的近红外响应透明质酸水凝胶的制备方法，其特征在于，所述环糊精衍生物修饰的透明质酸的制备方法，包括以下步骤：
(21)制备对苯磺酰化的β-环糊精
于冰浴条件下，将β-环糊精溶解于去离子水中形成β-环糊精溶液；将对甲苯磺酰氯溶于乙腈中，并加入前述β-环糊精溶液中形成反应溶液，再于冰浴条件下搅拌反应2-3h；搅拌结束后撤除冰浴，向反应溶液中滴加氢氧化钠溶液调节pH至7-8，滴加完成后搅拌至反应溶液澄清，再加入氯化铵调节pH至8.5-9，继续反应0.5h-1h；于0-5℃下恒温离心收集固体产物，并对固体产物进行洗涤、冷冻干燥后，即得到对苯磺酰化的β-环糊精；
所述β-环糊精、对甲苯磺酰氯的质量比为5：1；
(22)制备己二胺基修饰的环糊精
于氮气条件下，将步骤(21)制备得到的对苯磺酰化的β-环糊精加入N，N-二甲基甲酰胺中并搅拌至β-环糊精完全溶解形成混合溶液；将熔化状态下的己二胺加入前述混合溶液中，并于60-80℃油浴条件下搅拌反应8-12h，反应结束后，反应溶液冷却至室温，对反应溶液进行沉淀、冷冻干燥后，即得到己二胺基修饰的环糊精；
所述对苯磺酰化的β-环糊精和己二胺的质量比为1：4；
(23)制备环糊精衍生物修饰的透明质酸
在氮气氛围下，将四丁基铵盐改性的透明质酸和步骤(22)制备得到的己二胺基修饰的环糊精的混合物溶解于二甲亚砜中，形成混合物溶液；在氮气氛围下，BOP试剂溶解于二甲亚砜中形成BOP溶液，并将BOP溶液加入前述混合物溶液中，室温下搅拌3-5h，搅拌完成后加0-5℃去离子水淬灭反应，并于室温下透析，透析前1-3天作为透析液的去离子水中加入氯化钠以使四丁基铵离子析出，透析完成后离心除去不溶性副产物，再用去离子水继续透析2-3天，最终透析获得产物经冷冻干燥处理，即得到如式Ⅱ所示结构的环糊精衍生物修饰的透明质酸；
所述四丁基铵盐改性的透明质酸、己二胺基修饰的环糊精以及BOP试剂的质量比为3：4：1。
6.根据权利要求5所述的用于关节软骨修复的近红外响应透明质酸水凝胶的制备方法，其特征在于所述四丁基铵盐改性的透明质酸的制备方法包括以下步骤：
将透明质酸溶于去离子水中形成透明质酸溶液，在透明质酸溶液中加入离子交换树脂，继续搅拌30-60min，通过真空过滤从树脂中收集透明质酸溶液，随后采用四丁基氢氧化铵将透明质酸溶液滴定至pH为7.02-7.05，进行冷冻干燥处理，得到四丁基铵盐改性的透明质酸；
所述透明质酸、离子交换树脂的质量比为1：3。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115558126A (zh) * 2021-11-29 2023-01-03 海诺生物科技有限公司 动态交联透明质酸水凝胶
CN114133596A (zh) * 2021-12-15 2022-03-04 山东理工大学 一种aba型光敏感凝胶剂的制备及其应用
CN114515249A (zh) * 2021-12-29 2022-05-20 河北麦森钛白粉有限公司 一种光照下具有不同颜色的抗菌粉体的制备方法
CN114315956B (zh) * 2022-01-10 2023-11-21 北京工商大学 一种利用氧化型谷胱甘肽衍生物制备多重响应型凝胶的方法
CN115444840B (zh) * 2022-09-15 2023-08-25 四川大学 一种前药、两性离子水凝胶及其制备方法、应用
CN115521507B (zh) * 2022-10-26 2023-09-26 清华大学 透明质酸超分子水凝胶及其制备方法和应用
CN115970066B (zh) * 2022-12-29 2024-09-27 成都爱睿康乐医疗器械有限公司 基于主客体相互作用的载药纳米凝胶生物润滑剂及其制备方法和应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6630457B1 (en) * 1998-09-18 2003-10-07 Orthogene Llc Functionalized derivatives of hyaluronic acid, formation of hydrogels in situ using same, and methods for making and using same
CN102569657A (zh) * 2011-12-21 2012-07-11 天津大学 光响应性芘-偶氮苯非共价修饰碳纳米管材料的制备
CN105107019A (zh) * 2015-09-10 2015-12-02 西南交通大学 一种用于关节软骨修复的红外响应高强水凝胶的制备方法
CN107216468A (zh) * 2017-05-22 2017-09-29 华中科技大学 一种超分子水凝胶及其制备方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6630457B1 (en) * 1998-09-18 2003-10-07 Orthogene Llc Functionalized derivatives of hyaluronic acid, formation of hydrogels in situ using same, and methods for making and using same
CN102569657A (zh) * 2011-12-21 2012-07-11 天津大学 光响应性芘-偶氮苯非共价修饰碳纳米管材料的制备
CN105107019A (zh) * 2015-09-10 2015-12-02 西南交通大学 一种用于关节软骨修复的红外响应高强水凝胶的制备方法
CN107216468A (zh) * 2017-05-22 2017-09-29 华中科技大学 一种超分子水凝胶及其制备方法

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