CN106188584B - 一种透明质酸衍生物水凝胶及其制备方法 - Google Patents

一种透明质酸衍生物水凝胶及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种透明质酸衍生物水凝胶及制备方法，属于生物医用材料领域。所述的制备方法为，先采用碳二亚胺法将甲基丙烯酸2‑氨基乙基酯和L‑赖氨酸接枝于透明质酸分子上，然后将得到的透明质酸衍生物与水溶性光引发剂在水中实施光化学聚合，即得到透明质酸衍生物水凝胶。本发明的透明质酸衍生物水凝胶不仅力学性能稳定、弹性高、孔径均匀，并且工艺简单、反应条件温和、成胶时间短，产物具有可注射性。该透明质酸衍生物水凝胶可用作3D肿瘤模型基质、组织工程支架材料、药物载体、创伤敷料等。

Description

一种透明质酸衍生物水凝胶及其制备方法
技术领域
本发明属于生物医用材料领域，具体涉及一种透明质酸衍生物水凝胶及其制备方法。
背景技术
水凝胶是一种亲水性极强、可吸水溶胀但不溶解的三维网络结构，具有良好的生物相容性及独特的吸水保水性能，这些性质使其在生物医学领域获得广泛关注。尤其是可注射性凝胶在生物活性分子缓释、细胞包埋、细胞支撑等方面备受瞩目。作为药物缓释载体，可注射性凝胶能够与组织很好地结合，可有效控制水凝胶和药物作用范围，能实现药物局部递送和病灶处精确地释放药物。在再生医学方面，可注射性水凝胶通过注射器将凝胶溶液送入体内特定部位，可以填满任何形状的受损部位，达到材料和周围组织密切接触的目的。这样可以避免外科手术过程中的高度创伤性，减少病人的痛苦，且费用较低。综合上述优点，可注射性水凝胶具有广阔的发展前景，将会在未来很长一段时间内成为人们的研究热点。
透明质酸是一种亲水性良好、带负电荷的一种线性粘多糖，在体内主要存在于结缔组织、上皮和神经组织中[G Kogan,L Soltés,R Stern,et al.Hyaluronic acid:anatural biopolymer with a broad range of biomedical and industrialapplications.Biotechnol Lett,2007；29:17-25.]，是细胞外基质的主要组成成分之一。透明质酸具有良好的亲水性、生物相容性和保水能力等性质，广泛应用于生物医用材料领域。由透明质酸制备而成的透明质酸水凝胶因具有生物相容性好、毒性低等优点，已被应用于药物控制释放、防术后粘连、软骨支架、角膜支架、黏膜填充剂、组织修复和再生等领域。但纯透明质酸水凝胶存在力学性能较差、易降解等缺点，因此寻找合适的物质对其交联改性以克服这些不足显得尤为重要。L-赖氨酸是一种碱性氨基酸，是人体必需氨基酸之一，安全无毒，常被用来合成聚氨基酸材料或侧链为氨基酸的聚合物材料。研究表明侧链为氨基酸的聚合物材料，因氨基酸同时保持了完整的氨基和羧基，且氨基和羧基处于同一个氨基酸单元中，仍具有很好的生物活性和生物相容性[J Romanski,M Karbarz,K Pyrzynska,etal.Polymeric hydrogels modified with ornithine and lysine:sorption andrelease of metal cations and amino acids.Journal of Polymer Science:PartA.Polymer Chemistry,2012,50:542-550；P Chen,XJ Liang,B Liang.Swelling behaviorof an ampholytic hydrogel containing free amino acid side chain.Journal ofFunctional Polymers,2013,26:241-247]，研究其凝胶性能将对理解蛋白质和多肽功能有很大帮助。
发明内容
本发明的目的在于提供一种透明质酸衍生物水凝胶及其制备方法，采用碳二亚胺法将甲基丙烯酸2-氨基乙基酯和L-赖氨酸接枝于透明质酸分子上，然后将得到的透明质酸衍生物与水溶性光引发剂在水中实施光化学聚合，即得到透明质酸衍生物水凝胶。该透明质酸衍生物水凝胶不仅力学性能稳定、弹性高、孔径均匀，并且工艺简单、反应条件温和、成胶时间短，产物具有可注射性。该透明质酸衍生物水凝胶可用作3D肿瘤模型基质、组织工程支架材料、药物载体、创伤敷料等。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种透明质酸衍生物水凝胶的制备方法，在透明质酸分子主链上修饰L-赖氨酸和甲基丙烯酸2-氨基乙基酯，得到双功能化透明质酸；然后将水溶性光引发剂加入到双功能化透明质酸溶液中，采用紫外光照射0.5min～10min，得到透明质酸衍生物水凝胶；其中，双功能化透明质酸溶液的质量浓度为0.5％～4％，水溶性光引发剂用量为双功能化透明质酸质量的0.05％～0.5％。
本发明进一步的改进在于，所述的双功能化透明质酸的制备方法如下：
1)将L-赖氨酸单盐酸盐与碱式碳酸铜加入到水中，得到溶液，将溶液煮沸2小时～4小时，热过滤，将滤液冷冻干燥，得到L-赖氨酸-铜络合物；其中L-赖氨酸单盐酸盐与碱式碳酸铜的摩尔比为1:1～4:1；溶液中L-赖氨酸单盐酸盐的质量浓度为0.5％～6％；
2)配制质量浓度为0.5％～2％的甲基丙烯酸2-氨基乙基酯改性的透明质酸水溶液，加入N-羟基琥珀酰亚胺、L-赖氨酸-铜络合物和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；然后将pH调至5.0～5.5，在室温下继续搅拌12小时～60小时，得到溶液；其中，N-羟基琥珀酰亚胺用量为透明质酸重复单元摩尔数的0.22～0.99倍，L-赖氨酸-铜络合物的用量为透明质酸重复单元摩尔数的2～10倍，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的用量为透明质酸重复单元摩尔数的0.2～0.9倍；
3)向步骤2)中溶液中加入NaCl，完全溶解后加入无水乙醇，所得沉淀物溶于与步骤2)溶液等体积量的水中，得到溶液A；其中，无水乙醇加入量为步骤2)中溶液体积的2倍；
将8-羟基喹啉溶于到氯仿中，得到溶液B；接着，将溶液B加入到溶液A中，搅拌12小时～48小时后过滤去除固体，水相用溶液B洗至无色，透析3天后进行冷冻干燥，得到双功能化透明质酸；其中，每100mL步骤2)中溶液中加入10g的NaCl；其中，8-羟基喹啉的摩尔量是L-赖氨酸-铜络合物中铜离子的1～5倍，氯仿的体积与A溶液的体积比为0.5:1～1.5:1。
本发明进一步的改进在于，采用浓度均为1mol/L的NaOH溶液或盐酸将pH调至5.0～5.5。
本发明进一步的改进在于，所述的透析采用截留分子量为3500Da的透析袋进行。
本发明进一步的改进在于，所述的冷冻干燥为零下20℃保持72小时、20℃保持4小时。
本发明进一步的改进在于，甲基丙烯酸2-氨基乙基酯改性的透明质酸的制备过程如下：将2-吗啉乙磺酸加入到水中，形成2-吗啉乙磺酸缓冲液，向2-吗啉乙磺酸缓冲液中加入NaCl后，形成溶液A，再向溶液A加入透明质酸，形成透明质酸溶液；其中，2-吗啉乙磺酸缓冲液的浓度为50mmol/L，溶液A中NaCl的浓度为0.5mol/L，每100mL透明质酸溶液中含有0.2～2g透明质酸；
然后向透明质酸溶液加入N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，接着将pH值调至5.0～5.5，反应1小时后加入甲基丙烯酸2-氨基乙基酯，室温下继续搅拌24小时～60小时；最后采用沉淀剂将反应产物沉淀出来，溶于水中后透析3天，经冷冻干燥后得到甲基丙烯酸2-氨基乙基酯改性的透明质酸；其中，N-羟基琥珀酰亚胺的用量为透明质酸重复单元摩尔数的1.2～2倍，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的用量为透明质酸重复单元摩尔数的2.4～4倍；甲基丙烯酸2-氨基乙基酯的用量为透明质酸重复单元摩尔数的0.1～1倍。
本发明进一步的改进在于，所述透明质酸分子量为30kDa～3000kDa。
本发明进一步的改进在于，所述沉淀剂为乙醇或丙酮。
本发明进一步的改进在于，所述水溶性光引发剂为2-羟基-4′-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮或1-羟基环己基苯基甲酮；紫外光辐照参数为：中心波长为365nm，光强为1200mJ/cm2～1500mJ/cm2，辐照距离为15cm。
一种透明质酸衍生物水凝胶，该水凝胶呈多孔结构，平均孔径为180μm，压缩模量为6.7kPa。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
(1)采用碳二亚胺法将甲基丙烯酸2-氨基乙基酯和L-赖氨酸接枝于透明质酸分子上，然后将得到的透明质酸衍生物与水溶性光引发剂在水中实施光化学聚合，即得到透明质酸衍生物水凝胶。用于改性透明质酸的L-赖氨酸安全无毒、生物相容性优异，且原料易得，保证了双功能化透明质酸良好的生物相容性。
(2)采用了光化学交联方法制备透明质酸衍生物水凝胶，具有工艺简单、反应条件温和、成胶速度快等特点，且可原位成胶，所成水凝胶具有可注射性。
(3)本发明的透明质酸衍生物水凝胶力学性能稳定、弹性优异，适用于多种生物医学用途，如用作药物缓释载体、组织工程支架、创伤敷料、三维肿瘤模型等。
进一步的，在实现L-赖氨酸改性透明质酸时，采用了L-赖氨酸-铜络合物，不仅有效保护了氨基酸基团，还具有反应位点可控、操作简便等优点。
附图说明
图1为双功能化的透明质酸衍生物的1H NMR谱。
图2为透明质酸衍生物水凝胶流变性能测试的频率扫描图。
图3为透明质酸衍生物水凝胶的压缩应力应变曲线。
图4为透明质酸衍生物水凝胶冻干后的扫描电镜照片。图4(a)的放大倍数为35倍，图4(b)的放大倍数为500倍。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步描述，但本发明并不限于此。
实施例1
1)将2-吗啉乙磺酸加入到水中，形成2-吗啉乙磺酸缓冲液，向2-吗啉乙磺酸缓冲液中加入NaCl后，形成溶液A，再向溶液A加入分子量为170kDa的透明质酸，形成透明质酸溶液；其中，2-吗啉乙磺酸缓冲液的浓度为50mmol/L，溶液A中NaCl的浓度为0.5mol/L，每100mL透明质酸溶液中含有1g透明质酸；
然后向透明质酸溶液依次加入N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，接着采用浓度均为1mol/L的NaOH溶液或盐酸将pH值调至5.0～5.5，反应1小时后加入甲基丙烯酸2-氨基乙基酯，室温下继续搅拌24小时；最后采用丙酮将反应产物沉淀出来，溶于水中后采用截留分子量为3500Da的透析袋进行透析3天，经冷冻干燥，具体为零下20℃保持72小时、20℃保持4小时，得到甲基丙烯酸2-氨基乙基酯改性的透明质酸；其中，N-羟基琥珀酰亚胺的用量为透明质酸重复单元摩尔数的2倍，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的用量为透明质酸重复单元摩尔数的4倍；甲基丙烯酸2-氨基乙基酯的用量为透明质酸重复单元摩尔数的0.5倍。
2)将L-赖氨酸单盐酸盐与碱式碳酸铜加入到水中，得到溶液，将溶液煮沸2小时，热过滤，滤渣用热水洗涤，洗涤液并入滤液，将滤液冷冻干燥，得到L-赖氨酸-铜络合物；其中L-赖氨酸单盐酸盐与碱式碳酸铜的摩尔比为1.5:1；溶液中L-赖氨酸单盐酸盐的质量浓度为5％。
3)配制质量浓度为1％的甲基丙烯酸2-氨基乙基酯改性的透明质酸水溶液，依次加入N-羟基琥珀酰亚胺、L-赖氨酸-铜络合物和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；然后采用浓度均为1mol/L的NaOH溶液或盐酸将pH调至5.0～5.5，在室温下继续搅拌24小时，得到溶液；其中，N-羟基琥珀酰亚胺用量为透明质酸重复单元摩尔数的0.44倍，L-赖氨酸-铜络合物的用量为透明质酸重复单元摩尔数的4倍，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的用量为透明质酸重复单元摩尔数的0.4倍；
4)向步骤3)中溶液中加入NaCl，完全溶解后加入无水乙醇，所得沉淀物溶于与步骤3)溶液等体积量的水中，得到溶液A；其中，无水乙醇加入量为步骤3)中溶液体积的2倍；
将8-羟基喹啉溶于到氯仿中，得到溶液B；接着，将溶液B加入到溶液A中，搅拌24小时后过滤去除固体，水相用溶液B洗至无色，采用截留分子量为3500Da的透析袋透析3天后进行冷冻干燥，具体为零下20℃保持72小时、20℃保持4小时，得到双功能化透明质酸；其中，每100mL步骤3)中溶液中加入10g的NaCl；8-羟基喹啉的摩尔量是L-赖氨酸-铜络合物中铜离子的3倍，氯仿的体积与A溶液的体积比为1:1。
5)将水溶性光引发剂加入到双功能化透明质酸溶液中，采用紫外光照射2min，得到透明质酸衍生物水凝胶；其中，双功能化透明质酸溶液的质量浓度为3.5％，水溶性光引发剂用量为双功能化透明质酸质量的0.1％；水溶性光引发剂为2-羟基-4′-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮；紫外光辐照参数为：中心波长为365nm，光强为1300mJ/cm2，辐照距离为15cm。
参见图1，图中峰a和b为甲基丙烯酸2-氨基乙基酯的特征化学位移。其中a为中不饱和碳碳双键的质子化学位移，化学位移值为6.04ppm和5.64ppm；b为甲基质子的化学位移，其数值为1.82ppm。化学位移c、d和e为L-赖氨酸中的质子化学位移，其数值分别为1.62ppm、1.79ppm和2.78ppm。这些结果证实了双功能化透明质酸的成功合成。
由图2可以看出，该水凝胶的储能模量远远大于损耗模量，说明该凝胶具有良好的弹性，这两种模量值不随着频率改变而变化，说明该凝胶具有很好的结构稳定性。
由图3可以看出，该水凝胶的压缩曲线与回弹曲线基本重合，且压缩模量为6.7kPa，说明该凝胶具有较好的形变恢复能力和弹性性能。
由图4(a)和图4(b)可以看出，该水凝胶冻干样呈多孔结构，孔径均匀，孔壁光滑，平均孔径约为180μm。
实施例2
1)将2-吗啉乙磺酸加入到水中，形成2-吗啉乙磺酸缓冲液，向2-吗啉乙磺酸缓冲液中加入NaCl后，形成溶液A，再向溶液A加入分子量为30kDa的透明质酸，形成透明质酸溶液；其中，2-吗啉乙磺酸缓冲液的浓度为50mmol/L，溶液A中NaCl的浓度为0.5mol/L，每100mL透明质酸溶液中含有0.2g透明质酸；
然后向透明质酸溶液依次加入N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，接着采用浓度均为1mol/L的NaOH溶液或盐酸将pH值调至5.0～5.5，反应1小时后加入甲基丙烯酸2-氨基乙基酯，室温下继续搅拌50小时；最后采用乙醇将反应产物沉淀出来，溶于水中后采用截留分子量为3500Da的透析袋进行透析3天，经冷冻干燥，具体为零下20℃保持72小时、20℃保持4小时，得到甲基丙烯酸2-氨基乙基酯改性的透明质酸；其中，N-羟基琥珀酰亚胺的用量为透明质酸重复单元摩尔数的2倍，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的用量为透明质酸重复单元摩尔数的4倍；甲基丙烯酸2-氨基乙基酯的用量为透明质酸重复单元摩尔数的0.3倍。
2)将L-赖氨酸单盐酸盐与碱式碳酸铜加入到水中，得到溶液，将溶液煮沸2小时，热过滤，滤渣用热水洗涤，洗涤液并入滤液，将滤液冷冻干燥，得到L-赖氨酸-铜络合物；其中L-赖氨酸单盐酸盐与碱式碳酸铜的摩尔比为1:1；溶液中L-赖氨酸单盐酸盐的质量浓度为6％。
3)配制质量浓度为0.5％的甲基丙烯酸2-氨基乙基酯改性的透明质酸水溶液，依次加入N-羟基琥珀酰亚胺、L-赖氨酸-铜络合物和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；然后采用浓度均为1mol/L的NaOH溶液或盐酸将pH调至5.0～5.5，在室温下继续搅拌40小时，得到溶液；其中，N-羟基琥珀酰亚胺用量为透明质酸重复单元摩尔数的0.22倍，L-赖氨酸-铜络合物的用量为透明质酸重复单元摩尔数的5倍，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的用量为透明质酸重复单元摩尔数的0.7倍。
4)向步骤3)中溶液中加入NaCl，完全溶解后加入无水乙醇，所得沉淀物溶于与步骤3)溶液等体积量的水中，得到溶液A；其中，无水乙醇加入量为步骤3)中溶液体积的2倍；
将8-羟基喹啉溶于到氯仿中，得到溶液B；接着，将溶液B加入到溶液A中，搅拌24小时后过滤去除固体，水相用溶液B洗至无色，然后采用截留分子量为3500Da的透析袋透析3天后进行冷冻干燥，具体为零下20℃保持72小时、20℃保持4小时，得到双功能化透明质酸；其中，每100mL步骤3)中溶液中加入10g的NaCl；其中，8-羟基喹啉的摩尔量是L-赖氨酸-铜络合物中铜离子的1倍，氯仿的体积与A溶液的体积比为0.5:1。
5)将水溶性光引发剂加入到双功能化透明质酸溶液中，采用紫外光照射0.5min，得到透明质酸衍生物水凝胶；其中，双功能化透明质酸溶液的质量浓度为0.5％，水溶性光引发剂用量为双功能化透明质酸质量的0.05％；水溶性光引发剂为2-羟基-4′-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮；紫外光辐照参数为：中心波长为365nm，光强为1200mJ/cm2，辐照距离为15cm。
实施例3
1)将2-吗啉乙磺酸加入到水中，形成2-吗啉乙磺酸缓冲液，向2-吗啉乙磺酸缓冲液中加入NaCl后，形成溶液A，再向溶液A加入分子量为400kDa的透明质酸，形成透明质酸溶液；其中，2-吗啉乙磺酸缓冲液的浓度为50mmol/L，溶液A中NaCl的浓度为0.5mol/L，每100mL透明质酸溶液中含有2g透明质酸；
然后向透明质酸溶液依次加入N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，接着采用浓度均为1mol/L的NaOH溶液或盐酸将pH值调至5.0～5.5，反应1小时后加入甲基丙烯酸2-氨基乙基酯，室温下继续搅拌60小时；最后采用乙醇将反应产物沉淀出来，溶于水中后采用截留分子量为3500Da的透析袋进行透析3天，经冷冻干燥，具体为零下20℃保持72小时、20℃保持4小时，得到甲基丙烯酸2-氨基乙基酯改性的透明质酸；其中，N-羟基琥珀酰亚胺的用量为透明质酸重复单元摩尔数的1.6倍，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的用量为透明质酸重复单元摩尔数的3倍；甲基丙烯酸2-氨基乙基酯的用量为透明质酸重复单元摩尔数的0.1倍；
2)将L-赖氨酸单盐酸盐与碱式碳酸铜加入到水中，得到溶液，将溶液煮沸4小时，热过滤，滤渣用热水洗涤，洗涤液并入滤液，将滤液冷冻干燥，得到L-赖氨酸-铜络合物；其中L-赖氨酸单盐酸盐与碱式碳酸铜的摩尔比为2:1；溶液中L-赖氨酸单盐酸盐的质量浓度为4％；
3)配制质量浓度为1.5％的甲基丙烯酸2-氨基乙基酯改性的透明质酸水溶液，依次加入N-羟基琥珀酰亚胺、L-赖氨酸-铜络合物和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；然后采用浓度均为1mol/L的NaOH溶液或盐酸将pH调至5.0～5.5，在室温下继续搅拌60小时，得到溶液；其中，N-羟基琥珀酰亚胺用量为透明质酸重复单元摩尔数的0.99倍，L-赖氨酸-铜络合物的用量为透明质酸重复单元摩尔数的2倍，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的用量为透明质酸重复单元摩尔数的0.5倍；
4)向步骤3)中溶液中加入NaCl，完全溶解后加入无水乙醇，所得沉淀物溶于与步骤3)溶液等体积量的水中，得到溶液A；其中，无水乙醇加入量为步骤3)中溶液体积的2倍；
将8-羟基喹啉溶于氯仿中，得到溶液B；接着，将溶液B加入溶液A中，磁力搅拌35小时后过滤去除固体，水相用溶液B洗至无色，采用截留分子量为3500Da的透析袋进行透析3天后进行冷冻干燥，具体为零下20℃保持72小时、20℃保持4小时，得到双功能化透明质酸；其中，每100mL步骤3)中溶液中加入10g的NaCl；其中，8-羟基喹啉的摩尔量是L-赖氨酸-铜络合物中铜离子的2倍，氯仿的体积与A溶液的体积比为1:1。
5)将水溶性光引发剂加入到双功能化透明质酸溶液中，采用紫外光照射2min，得到透明质酸衍生物水凝胶；其中，双功能化透明质酸溶液的质量浓度为4％，水溶性光引发剂用量为双功能化透明质酸质量的0.1％；水溶性光引发剂为1-羟基环己基苯基甲酮；紫外光辐照参数为：中心波长为365nm，光强为1500mJ/cm2，辐照距离为15cm。
实施例4
1)将2-吗啉乙磺酸加入到水中，形成2-吗啉乙磺酸缓冲液，向2-吗啉乙磺酸缓冲液中加入NaCl后，形成溶液A，再向溶液A加入分子量为3000kDa的透明质酸，形成透明质酸溶液；其中，2-吗啉乙磺酸缓冲液的浓度为50mmol/L，溶液A中NaCl的浓度为0.5mol/L，每100mL透明质酸溶液中含有0.8g透明质酸；
然后向透明质酸溶液依次加入N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，接着采用浓度均为1mol/L的NaOH溶液或盐酸将pH值调至5.0～5.5，反应1小时后加入甲基丙烯酸2-氨基乙基酯，室温下继续搅拌24小时；最后采用丙酮将反应产物沉淀出来，溶于水中后采用截留分子量为3500Da的透析袋进行透析3天，经冷冻干燥，具体为零下20℃保持72小时、20℃保持4小时，得到甲基丙烯酸2-氨基乙基酯改性的透明质酸；其中，N-羟基琥珀酰亚胺的用量为透明质酸重复单元摩尔数的2倍，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的用量为透明质酸重复单元摩尔数的2.4倍；甲基丙烯酸2-氨基乙基酯的用量为透明质酸重复单元摩尔数的0.7倍。
2)将L-赖氨酸单盐酸盐与碱式碳酸铜加入到水中，得到溶液，将溶液煮沸3小时，热过滤，滤渣用热水洗涤，洗涤液并入滤液，将滤液冷冻干燥，得到L-赖氨酸-铜络合物；其中L-赖氨酸单盐酸盐与碱式碳酸铜的摩尔比为3:1；溶液中L-赖氨酸单盐酸盐的质量浓度为2％；
3)配制质量浓度为2％的甲基丙烯酸2-氨基乙基酯改性的透明质酸水溶液，依次加入N-羟基琥珀酰亚胺、L-赖氨酸-铜络合物和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；然后采用浓度均为1mol/L的NaOH溶液或盐酸将pH调至5.0～5.5，在室温下继续搅拌12小时，得到溶液；其中，N-羟基琥珀酰亚胺用量为透明质酸重复单元摩尔数的0.7倍，L-赖氨酸-铜络合物的用量为透明质酸重复单元摩尔数的8倍，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的用量为透明质酸重复单元摩尔数的0.2倍。
4)向步骤3)中溶液中加入NaCl，完全溶解后加入无水乙醇，所得沉淀物溶于与步骤3)溶液等体积量的水中，得到溶液A；其中，无水乙醇加入量为步骤3)中溶液体积的2倍；
将8-羟基喹啉溶于氯仿中，得到溶液B；接着，将溶液B加入溶液A中，磁力搅拌20小时后过滤去除固体，水相用溶液B洗至无色，采用截留分子量为3500Da的透析袋进行透析3天后进行冷冻干燥，具体为零下20℃保持72小时、20℃保持4小时，得到双功能化透明质酸；其中，每100mL步骤3)中溶液中加入10g的NaCl；其中，8-羟基喹啉的摩尔量是L-赖氨酸-铜络合物中铜离子的3倍，氯仿的体积与A溶液的体积比为1.5:1。
5)将水溶性光引发剂加入到双功能化透明质酸溶液中，采用紫外光照射10min，得到透明质酸衍生物水凝胶；其中，双功能化透明质酸溶液的质量浓度为2％，水溶性光引发剂用量为双功能化透明质酸质量的0.3％；水溶性光引发剂为1-羟基环己基苯基甲酮；紫外光辐照参数为：中心波长为365nm，光强为1300mJ/cm2，辐照距离为15cm。
实施例5
1)将2-吗啉乙磺酸加入到水中，形成2-吗啉乙磺酸缓冲液，向2-吗啉乙磺酸缓冲液中加入NaCl后，形成溶液A，再向溶液A加入分子量为1500kDa的透明质酸，形成透明质酸溶液；其中，2-吗啉乙磺酸缓冲液的浓度为50mmol/L，溶液A中NaCl的浓度为0.5mol/L，每100mL透明质酸溶液中含有1.5g透明质酸；
然后向透明质酸溶液依次加入N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，接着采用浓度均为1mol/L的NaOH溶液或盐酸将pH值调至5.0～5.5，反应1小时后加入甲基丙烯酸2-氨基乙基酯，室温下继续搅拌40小时；最后采用丙酮将反应产物沉淀出来，溶于水中后采用截留分子量为3500Da的透析袋进行透析3天，经冷冻干燥，具体为零下20℃保持72小时、20℃保持4小时，得到甲基丙烯酸2-氨基乙基酯改性的透明质酸；其中，N-羟基琥珀酰亚胺的用量为透明质酸重复单元摩尔数的1.5倍，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的用量为透明质酸重复单元摩尔数的3.5倍；甲基丙烯酸2-氨基乙基酯的用量为透明质酸重复单元摩尔数的1倍。
2)将L-赖氨酸单盐酸盐与碱式碳酸铜加入到水中，得到溶液，将溶液煮沸2.5小时，热过滤，滤渣用热水洗涤，洗涤液并入滤液，将滤液冷冻干燥，得到L-赖氨酸-铜络合物；其中L-赖氨酸单盐酸盐与碱式碳酸铜的摩尔比为4:1；溶液中L-赖氨酸单盐酸盐的质量浓度为0.5％；
3)配制质量浓度为1％的甲基丙烯酸2-氨基乙基酯改性的透明质酸水溶液，依次加入N-羟基琥珀酰亚胺、L-赖氨酸-铜络合物和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；然后采用浓度均为1mol/L的NaOH溶液或盐酸将pH调至5.0～5.5，在室温下继续搅拌30小时，得到溶液；其中，N-羟基琥珀酰亚胺用量为透明质酸重复单元摩尔数的0.5倍，L-赖氨酸-铜络合物的用量为透明质酸重复单元摩尔数的10倍，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的用量为透明质酸重复单元摩尔数的0.9倍；
4)向步骤3)中溶液中加入NaCl，完全溶解后加入无水乙醇，所得沉淀物溶于与步骤3)溶液等体积量的水中，得到溶液A；其中，无水乙醇加入量为步骤3)中溶液体积的2倍；
将8-羟基喹啉溶于氯仿中，得到溶液B；接着，将溶液B加入溶液A中，磁力搅拌12小时后过滤去除固体，水相用溶液B洗至无色，采用截留分子量为3500Da的透析袋进行透析3天后进行冷冻干燥，具体为零下20℃保持72小时、20℃保持4小时，得到双功能化透明质酸；其中，每100mL步骤3)中溶液中加入10g的NaCl；其中，8-羟基喹啉的摩尔量是L-赖氨酸-铜络合物中铜离子的5倍，氯仿的体积与A溶液的体积比为1:1。
5)将水溶性光引发剂加入到双功能化透明质酸溶液中，采用紫外光照射6min，得到透明质酸衍生物水凝胶；其中，双功能化透明质酸溶液的质量浓度为1％，水溶性光引发剂用量为双功能化透明质酸质量的0.5％；水溶性光引发剂为2-羟基-4′-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮；紫外光辐照参数为：中心波长为365nm，光强为1400mJ/cm2，辐照距离为15cm。
本发明采用碳二亚胺法将甲基丙烯酸2-氨基乙基酯和L-赖氨酸修饰于透明质酸分子上，再与光引发剂一起经紫外光辐照交联形成透明质酸衍生物水凝胶。该水凝胶具有成胶快速、弹性性能优异、力学性能稳定、生物相容性良好等特点，并且制备工艺简单、反应条件温和、具有可注射性，有望在药物缓释载体、组织工程支架、创伤敷料、三维肿瘤模型等方面具有重要的应用前景。

Claims (9)

1.一种透明质酸衍生物水凝胶的制备方法，其特征在于：在透明质酸分子主链上修饰L-赖氨酸和甲基丙烯酸2-氨基乙基酯，得到双功能化透明质酸；然后将水溶性光引发剂加入到双功能化透明质酸溶液中，采用紫外光照射0.5min～10min，得到透明质酸衍生物水凝胶；其中，双功能化透明质酸溶液的质量浓度为0.5％～4％，水溶性光引发剂用量为双功能化透明质酸质量的0.05％～0.5％；
所述的双功能化透明质酸的制备方法如下：
1)将L-赖氨酸单盐酸盐与碱式碳酸铜加入到水中，得到溶液，将溶液煮沸2小时～4小时，热过滤，将滤液冷冻干燥，得到L-赖氨酸-铜络合物；其中L-赖氨酸单盐酸盐与碱式碳酸铜的摩尔比为1:1～4:1；溶液中L-赖氨酸单盐酸盐的质量浓度为0.5％～6％；
2)配制质量浓度为0.5％～2％的甲基丙烯酸2-氨基乙基酯改性的透明质酸水溶液，加入N-羟基琥珀酰亚胺、L-赖氨酸-铜络合物和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；然后将pH调至5.0～5.5，在室温下继续搅拌12小时～60小时，得到溶液；其中，N-羟基琥珀酰亚胺用量为透明质酸重复单元摩尔数的0.22～0.99倍，L-赖氨酸-铜络合物的用量为透明质酸重复单元摩尔数的2～10倍，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的用量为透明质酸重复单元摩尔数的0.2～0.9倍；
3)向步骤2)中溶液中加入NaCl，完全溶解后加入无水乙醇，所得沉淀物溶于与步骤2)溶液等体积量的水中，得到溶液A；其中，无水乙醇加入量为步骤2)中溶液体积的2倍；
将8-羟基喹啉溶于到氯仿中，得到溶液B；接着，将溶液B加入到溶液A中，搅拌12小时～48小时后过滤去除固体，水相用溶液B洗至无色，透析3天后进行冷冻干燥，得到双功能化透明质酸；其中，每100mL步骤2)中溶液中加入10g的NaCl；其中，8-羟基喹啉的摩尔量是L-赖氨酸-铜络合物中铜离子的1～5倍，氯仿的体积与A溶液的体积比为0.5:1～1.5:1。
2.根据权利要求1所述的一种透明质酸衍生物水凝胶的制备方法，其特征在于，采用浓度均为1mol/L的NaOH溶液或盐酸将pH调至5.0～5.5。
3.根据权利要求1所述的一种透明质酸衍生物水凝胶的制备方法，其特征在于，所述的透析采用截留分子量为3500Da的透析袋进行。
4.根据权利要求1所述的一种透明质酸衍生物水凝胶的制备方法，其特征在于，所述的冷冻干燥为零下20℃保持72小时、20℃保持4小时。
5.根据权利要求1所述的一种透明质酸衍生物水凝胶的制备方法，其特征在于，甲基丙烯酸2-氨基乙基酯改性的透明质酸的制备过程如下：将2-吗啉乙磺酸加入到水中，形成2-吗啉乙磺酸缓冲液，向2-吗啉乙磺酸缓冲液中加入NaCl后，形成溶液A，再向溶液A加入透明质酸，形成透明质酸溶液；其中，2-吗啉乙磺酸缓冲液的浓度为50mmol/L，溶液A中NaCl的浓度为0.5mol/L，每100mL透明质酸溶液中含有0.2～2g透明质酸；
然后向透明质酸溶液加入N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，接着将pH值调至5.0～5.5，反应1小时后加入甲基丙烯酸2-氨基乙基酯，室温下继续搅拌24小时～60小时；最后采用沉淀剂将反应产物沉淀出来，溶于水中后透析3天，经冷冻干燥后得到甲基丙烯酸2-氨基乙基酯改性的透明质酸；其中，N-羟基琥珀酰亚胺的用量为透明质酸重复单元摩尔数的1.2～2倍，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的用量为透明质酸重复单元摩尔数的2.4～4倍；甲基丙烯酸2-氨基乙基酯的用量为透明质酸重复单元摩尔数的0.1～1倍。
6.根据权利要求5所述的一种透明质酸衍生物水凝胶的制备方法，其特征在于，所述透明质酸分子量为30kDa～3000kDa。
7.根据权利要求5所述的一种透明质酸衍生物水凝胶的制备方法，其特征在于，所述沉淀剂为乙醇或丙酮。
8.根据权利要求1所述的一种透明质酸衍生物水凝胶的制备方法，其特征在于，所述水溶性光引发剂为2-羟基-4′-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮或1-羟基环己基苯基甲酮；紫外光辐照参数为：中心波长为365nm，光强为1200mJ/cm2～1500mJ/cm2，辐照距离为15cm。
9.一种根据权利要求1所述的方法制备的透明质酸衍生物水凝胶，其特征在于，该水凝胶呈多孔结构，平均孔径为180μm，压缩模量为6.7kPa。
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