CN101152167B - 一种治疗慢性宫颈炎的异甘草素阴道栓剂及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种治疗慢性宫颈炎的异甘草素阴道栓剂及制备方法。将异甘草素作为有效成份用于制备阴道栓剂。它由异甘草素、基质、稳定剂、缓冲剂、β-环糊精等按一定比例构成。本发明配方合理，使用方便，所得的药物组合物对慢性宫颈炎有很好的抗炎、镇痛、抗溃疡、促进宫颈上皮修复的作用，且具有操作简便、效果良好、毒副作用小等优点。

Description

一种治疗慢性宫颈炎的异甘草素阴道栓剂及制备方法

技术领域

本发明涉及制药领域，更具体涉及一种治疗慢性宫颈炎的异甘草素阴道栓剂，同时还涉及异甘草素阴道栓剂的制备方法。

背景技术

慢性子宫颈炎(宫颈糜烂)是子宫颈的慢性炎性损伤性疾病。其致病因素较多，有病毒和细菌的感染、化学物质刺激和机械性损伤等。宫颈糜烂可为真性糜烂、假性糜烂。在慢性子宫颈炎中，宫颈糜烂与宫颈愈复过程反复进行，使得慢性子宫颈炎成为一种难愈性炎症，其机制尚不清楚。目前临床上常采用各种物理治疗，如冷冻、电熨、激光、红外线等，是破坏宫颈糜烂面的柱状上皮，使其坏死脱落，由新生的鳞状上皮覆盖，但存在术后出血、感染、愈合时间长、颈管狭窄形成不育的可能，以及存在对经阴道分娩的影响不良反应多等问题，而且对患者的日常生活也带来了诸多不便。

异甘草素(isoliquiritigenin，ISL)，其化学结构为2’，4’，4’-三羟基查耳酮，为甘草中的一种有效单体，属黄酮类化合物。异甘草素具抗炎、镇痛、抗溃疡、抗病毒、抗肿瘤及雌激素样活性等多种药理作用。异甘草素具有较强的抗炎效应，作用机制可能与抑制COX-2表达有关(Hiroki et al.，1987)。采用二甲苯致小鼠耳廓肿胀、角叉菜胶致大鼠足跖肿胀动物模型及腹腔注射醋酸实验发现异甘草素能显著减轻二甲苯引起的小鼠耳廓肿胀，并可减轻足跖肿胀度及降低腹腔液的吸光度。异甘草素具还有较强的镇痛作用，灌胃给药能明显减少小鼠扭体反应次数，使小鼠热板法痛阈显著提高(Jing Yang，et al.，2007)。异甘草素具有较强的抗溃疡作用，对消化性溃疡和急慢性胃炎等具有较好的疗效。此外，异甘草素还具有抗病毒作用，对HIV增殖的抑制作用是甘草甜素(glycyrrhizin)的25倍(Watanabe et al.，1989)。

异甘草素以其突出的优点越来越受到人们的关注，刺激性试验和过敏性试验等安全性实验研究结果也表明异甘草素对家兔完整皮肤和破损皮肤均无明显刺激性，对家兔直肠黏膜无刺激性，对豚鼠也无致敏作用。因此，研究发明以异甘草素为主要成分的外用药对于慢性宫颈炎的治疗具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是在于提供一种治疗慢性子宫颈炎的异甘草素阴道栓剂，一种以异甘草素为有效成份制备的阴道栓剂，配方合理，用于慢性子宫颈炎的治疗，具有给药方便，药理活性强，有效率高，可达到90～95％，毒副作用小等特点。

本发明以异甘草素为有效成份加以药学上可接受的辅料制成治疗子宫颈炎的栓剂，其中异甘草素在栓剂中的重量百分比可以是0.01～2％，优选0.03～1.5％，最优选0.05～1.2％；药用辅料的重量百分比分别是98～99.99％，优选98.5～99.9％，最优选98.8～99.5％，具体如下：

原料                重量百分比

异甘草素            0.01～2％

基质                84～94％

稳定剂              1～8％

缓冲剂              1～4％

β-环糊精           0.5～2％

具体制备步骤是：

①基质的制备：称取明胶一定量(400g～2000g)，加入等量的纯水(400g～2000g)，浸渍1小时置水浴中加热至80℃溶解，再加入甘油一定量(1400g～7000g)，搅拌，蒸去多余的水分；

②在基质中加入稳定剂、缓冲剂、β-环糊精，搅匀，温度控制在37～40℃，加入异甘草素，搅匀后在37～40℃灌入已灭菌并涂有润滑剂的阴道栓模中；

③冷却至通常室温，温度控制在15～25℃下，削去模口溢出部分，脱模，密封，得异甘草素栓剂成品；

④所述的基质对异甘草素生物活性有保护作用，基质中甘油、明胶、水的重量比是70∶20∶10，必要时可调整其比例；

所述基质为甘油、明胶、水按70∶20∶10重量比配制；

所述的稳定剂为蔗糖、甘露醇、乳糖、葡萄糖、海藻糖中的一种或二到五种或任意组合；

所述的缓冲剂为磷酸盐、乌头酸、柠檬酸、戊二酸、乙酸盐、枸橼酸盐中的一种或二到六种或任意组合。

本发明的优点：

1.异甘草素阴道栓剂使宫颈组织炎性细胞减少、COX-2含量下降，能显著改善宫颈炎症过程中病理组织形态学改变程度。

2.异甘草素阴道栓剂能显著减少炎性介质的产生，发挥有效的抗炎作用。

3.异甘草素阴道栓剂能使痛阈提高，发挥有效的镇痛作用。

4.异甘草素阴道栓剂对人体毒副作用小，基本无刺激性、使用安全，效果良好。

5.本发明采用常规阴道给药剂型，技术成熟，生产工艺简单易行。

6.本发明采用阴道给药方式，给药方便，无痛苦，没有后遗症。

具体实施方式

下面将描述本发明的实施例，但本发明的内容完全不限于此。

	异甘草素	基质	稳定剂	缓冲剂	β-环糊精
						实施例1	0.02％	90％	蔗糖6％	磷酸盐3.48％	β-环糊精0.5％
实施例2	0.04％	92％	葡萄糖2.16％	枸橼酸盐4％	β-环糊精1.8％

	异甘草素	基质	稳定剂	缓冲剂	β-环糊精
						实施例3	0.08％	88％	海藻糖8％	乙酸盐3.07％	β-环糊精0.85％
实施例4	0.10％	94％	葡萄糖3％	柠檬酸2.36％	β-环糊精0.54％
						实施例5	0.30％	91％	乳糖7％	戊二酸1.14％	β-环糊精0.56％
实施例6	0.90％	91％	甘露醇4.18％	柠檬酸2.1％	β-环糊精1.82％
						实施例7	1.3％	86％	甘露醇7.79％	乌头酸3.71％	β-环糊精1.2％
实施例8	1.5％	90％	乳糖5.9％	枸橼酸盐1％	β-环糊精1.6％
						实施例9	1.6％	92％	海藻糖3％	磷酸盐1.7％	β-环糊精1.7％
实施例10	1.7％	89％	蔗糖6％	戊二酸1.4％	β-环糊精1.9％

制备步骤是：

①基质的制备：称取明胶一定量(400g～2000g)，加入等量的纯水(400g～2000g)，浸渍1小时置水浴中加热至80℃溶解，再加入甘油一定量(1400g～7000g)，搅拌，蒸去多余的水分；

②加入稳定剂、缓冲剂、β-环糊精，搅匀，温度控制在37～40℃，加入异甘草素，搅匀后在37～40℃灌入已灭菌并涂有润滑剂的阴道栓模中；

③冷却至通常室温，温度控制在15～25℃下，削去模口溢出部分，脱模，密封，得异甘草素栓剂成品；

④所述的基质对异甘草素生物活性有保护作用，基质中甘油、明胶、水的重量比是70∶20∶10，必要时可调整其比例；

药效学实验

1、异甘草素对白介素1β(IL-1β)诱导大鼠宫颈鳞状上皮细胞炎症的影响：

实验方法：

(1)细胞分离和培养

大鼠宫颈鳞状上皮细胞(RCEC)细胞分离和培养：处死大鼠，取宫颈部位的组织剪成1～2mm³的小块，用无菌Hank’s平衡液(含15mmol·L^-1HEPES，青霉素100kU·L^-1，链霉素100mg·L^-1，二性霉素0.25mg·L^-1，pH 7.4)洗涤3次，0.1％胶原酶(189kU·L^-1)在37℃消化50分钟，然后用0.2％胰蛋白酶37℃消化20分钟，Hank’s平衡液洗涤两次，用生长培养基悬浮，将来自两个动物宫颈的组织接种于60mm培养皿中，在34℃，5％CO₂培养箱中培养。生长培养基为A与B(1∶1)两部分组成，A与B成分如下：

(A)24小时条件培养基：DMEM培养基(含10％FBS)培养Swiss 3T3细胞24小时后的培养基；

(B)宫颈上皮细胞培养基(cervical epithelial growth medium，CEGM)：由HamF12和RPMI-1640(1∶1)组成，再添加7.5％猪血清、胰岛素(10μg·L^-1)、转铁蛋白(10mg·L^-1)、氢化可的松(6.5mg·L^-1)、霍乱毒素(0.1nmol·L^-1)、牛脑提取物(150mg·L^-1)。

3天后，弃去培养基，用D-Hanks轻轻漂洗除去组织碎片。然后加入CEGM培养，当细胞达到融合后，先用D-Hanks漂洗1小时，然后加入0.025％胰蛋白酶与0.5mmol·L^-1EDTA(1∶1)消化，用CEGM重新悬浮，然后接种到预先铺有胶原凝胶的100mm培养皿上。此二代培养物可以传代，先添加0.1％胶原酶0.005L在34℃孵育直到胶原完全液化(约1小时)，用D-Hanks洗涤细胞悬液，再用0.025％胰蛋白酶与0.5mmol·L^-1 EDTA(1∶1)在37℃消化10分钟，细胞悬液经洗涤后重新悬浮在CEGM中，接种于预先铺有胶原凝胶的培养板，实验用第2～3代细胞。台盼蓝检测细胞活率大于95％，细胞纯度鉴定采用免疫组化SABC法，将生长有细胞的盖玻片从培养板中取出，丙酮固定，以小鼠抗大鼠细胞角蛋白多抗为一抗，二氨基联苯胺(DAB)显色，胞浆被染成棕黄色者为阳性，实验同时设立阴性对照。显微镜下观察显色结果，细胞阳性率达95％以上。

(2)细胞分组和处理

将细胞悬液调到1×10⁹·L^-1，接种于24孔培养板中，培养液不含小牛血清。以每个细胞培养孔为一样本个体，随机分为正常对照组、炎症对照组，异甘草素0.01，0.1，1.0和10.0ng·ml^-1组，每种处理设3个复孔。异甘草素组分别加入异甘草素至终浓度0.01，0.1，1.0和10.0ng·ml^-1，正常对照组和炎症对照组添加培养液，置34℃，5％CO₂培养箱中培养24小时后，炎症对照组和异甘草素组加入终浓度为5ng·ml^-1的IL-1β，置34℃，5％CO₂培养箱中培养6小时。分别收集每组上清液用放射免疫分析法分别测定IL-8和PGE₂含量。此试验重复2次。

实验结果：

与炎症对照组比较，异甘草素0.01，0.1，1.0和10.0ng·ml^-1组IL-8和PGE₂含量明显降低，以10.0ng·ml^-1组作用最强。结果见表1。

表1异甘草素对大鼠宫颈鳞状上皮细胞分泌IL-8和PGE₂的作用(

n＝6)

分组	剂量(ng·ml<sup>-1</sup>)	IL-8/pg.ml<sup>-1</sup>	PGE<sub>2</sub>/pg.ml<sup>-1</sup>
				正常对照组炎症对照组异甘草素组	-0.010.11.010.0	202.16±47.1911310.12±1102.12<sup>**</sup>7907.38±695.36<sup>#</sup>5004.17±734.20<sup>##</sup>3638.12±237.80<sup>##</sup>1510.67±187.18<sup>##</sup>	18.36±1.3258.75±3.03<sup>**</sup>43.12±2.51<sup>#</sup>31.00±1.12<sup>##</sup>27.00±0.91<sup>##</sup>14.00±0.10<sup>##</sup>

与正常对照组比较：^**P＜0.01；与炎症对照组比较，^#P＜0.05，^##P＜0.01。

结果表明，与炎症对照组比较，异甘草素各组都能显著降低大鼠宫颈鳞状上皮细胞分泌IL-8和PGE₂，说明异甘草素能抑制、减轻大鼠宫颈细胞炎症，且其作用呈浓度依赖性，以10.0ng·ml^-1组作用最强。

2、异甘草素在制备治疗慢性宫颈炎的阴道栓剂的应用研究：

(1)阴道刺激性试验：

实验方法：

1)分组：取健康、阴道无损家兔8只，由武汉大学实验动物中心提供许可证号：SCXK(鄂)2003-0004。按体重随机分为2组，每组4只，分别为异甘草素阴道栓剂组和基质对照组。

2)给药：

①用法用量：阴道给药，每日1次，每次一粒。

②给药：试验时取异甘草素阴道栓和基质各1粒，橄榄油润滑，分别置入试验组和基质组家兔阴道内。给药后持续观察4小时，发现药物脱落，及时送回。

③给药频率：每日1次，12天连续给药。

3)观察指标

①一般观察：每天进行一般状况观察，每次给药前观察家兔用药局部红肿、充血症状，给药后4小时持续观察。

②病理学检查：末次用药后48小时，空气栓塞法处死家兔，将卵巢、子宫连同阴道一并取出。肉眼观察用药局部充血、红肿、渗出、变性等现象，4％中性甲醛固定，常规组织切片，进行病理组织学检查。

实验结果：

1)一般观察：试验期间未见药物脱落现象。末次给药后48小时，取材组织肉眼未见明显刺激反应症状。

2)显微镜检：

①阴道组织结构正常，宫颈上皮由单层纤毛上皮形成，无炎细胞浸润，试验各组与基质组比较未见明显病理形态变化。

②子宫内膜完整光滑，内膜下血管无充血、扩张，亦无明显炎细胞浸润，试验各组与基质组比较无明显差异。

③卵巢皮质、髓质清晰，中间质发达，试验各组与基质组比较无明显差异。

结果表明本试验条件下，异甘草素阴道栓对家兔阴道粘膜无明显刺激作用。

(2)异甘草素阴道栓对实验性大鼠子宫颈炎的治疗作用：

实验方法：

1)大鼠子宫颈炎模型的建立

制备大鼠子宫颈炎模型：用阿拉伯树胶将苯酚混悬制备25％苯酚胶浆，向造模大鼠阴道深部注入0.4ml，三天一次，共三次。大鼠由武汉大学实验动物中心提供许可证号：SCXK(鄂)2003-0004。

2)分组及处理

将大鼠随机分为6组：正常对照组15只，阴性对照组15只，阳性对照组15只和异甘草素三个剂量组(各15只)。造模后第三天，开始阴道局部给药，1粒/天，连续12天。异甘草素治疗组分别给异甘草素2、4和8mg·kg^-1·d^-1。阳性对照组给聚甲酚磺醛5mg·kg^-1·d^-1，阴性对照组给空白基质栓剂。

3)大鼠一般状况观察

观察大鼠阴道口是否干燥，阴道有无流液(血)等。

4)子宫颈组织病理形态学观察

末次给药后24天处死动物，解剖取材阴道至子宫角处组织，用10％福尔马林固定，石蜡包埋，切片，HE染色。每个样本选取相同部位的同一张石蜡切片，在显微镜下观察子宫颈部位的粘膜及其粘膜下间质的病理形态学变化。随机选取非重叠的3个视野，采用计算机图像分析系统分析炎性细胞数量等。

病理形态学评分标准如下：

粘膜：鳞状上皮层次仅局部超过2-3层略有增厚为“+”，明显增厚为“++”，广泛增厚并使粘膜凹凸不平为“+++”：有些处柱状上皮可见有增生而出现鳞化趋势为“+”，明显鳞化为“++”，鳞化区域广泛甚至达宫腔为“+++”：仅见极少区域鳞状上皮出现糜烂而被邻近柱状上皮增生替代为“+”，柱状上皮增生明显替代鳞状上皮为“++”，鳞状上皮大片脱落由柱状上皮替代为“+++”；仅见极少区域糜烂突破基底膜为“+”，可见明显粘膜上皮变性坏死为“++”，粘膜溃疡伴有感染为“+++”。

炎细胞浸润：仅见粘膜及粘膜下浅层有少量炎细胞浸润为“+”，粘膜及粘膜下间质内均有中等量炎细胞浸润为“++”，粘膜下及间质内深层均见大量广泛炎细胞浸润为“+++”。

间质成纤维细胞增生：间质内仅见成纤维细胞略较正常对照组增多为“+”，成纤维细胞增生明显并有少量胶原纤维束为“++”，  成纤维细胞增生伴有大量胶原纤维束形成为“+++”。

综合宫颈总体病理改变程度分为如下4级：正常：六项中仅见浅层少量炎细胞浸润；轻度：六项中两项以上“+”；中度：六项中两项以上“+”，两项有“++”；重度：六项中一项有“+++”，两项有“++”，三项有“+”；或三项有“+++”。

5)子宫颈组织IL-8和PGE₂含量测定

从液氮中取出组织，称取3～5mg放微型匀浆器中，加无水乙醇0.4ml，轻研磨，再加生理盐水1.6ml，研磨制成匀浆，离心，取上清，置-30℃保存，然后统一按试剂盒说明书采用放射免疫分析法分别测定IL-8和PGE₂含量。

实验结果：

1.大鼠子宫颈组织一般状况观察

动物造模后，均可见活动减少，阴道外口有浓稠略黄分泌物。末次给药后24小时，阴性对照组大多数动物(约12只)阴道外口有浓稠略黄分泌物，异甘草素8mg·kg^-1治疗组仅个别动物阴道外口有少量分泌物，其余动物阴道外口均干燥、清洁，活动正常。

2.子宫颈组织病理形态学观察

造模大鼠子宫颈组织大量炎性细胞浸润，可见上皮糜烂与粘膜溃疡，并有糜烂部位柱状上皮替代鳞状上皮的趋势。粘膜下层毛细血管扩张充血，间质水肿，从粘膜至间质均可见大量炎性细胞浸润，并可见间质纤维组织增生。异甘草素2、4和8mg·kg^-1治疗组与阴性对照组相应部位比较，粘膜下炎性细胞浸润明显减轻，其中8mg·kg^-1治疗组的细胞形态与组织结构更接近正常对照组。结果见表2、3。

表2异甘草素阴道栓对实验性宫颈炎大鼠宫颈病理形态学变化的影响(

n＝15)

分组	剂量/mg.kg<sup>-1</sup>	病理形态学变化				Ridit值	95％可信区间
								正常	轻度	中度	重度
		正常组模型组聚甲酚磺醛异甘草素	------5248	1405135	12991110							041310	090200	0.1560.786<sup>**</sup>0.405<sup>#</sup>0.629<sup>#</sup>0.465<sup>#</sup>0.398<sup>##</sup>	0.073-0.4370.729-1.0330.305-0.5760.413-0.7350.364-0.6080.258-0.532

与正常组比较：^**P＜0.01；与模型组比较：^#＜0.05，^##P＜0.01

表3异甘草素阴道栓对实验性宫颈炎大鼠宫颈组织炎症细胞数的影响(

n＝15)

分组	剂量/mg.kg<sup>-1</sup>	炎症细胞数
			正常组模型组聚甲酚磺醛异甘草素	------5248	98±26291±70<sup>**</sup>140±50<sup>##</sup>165±43<sup>#</sup>137±36<sup>##</sup>118±30<sup>##</sup>

与正常组比较：^**P＜0.01；与模型组比较：^#P＜0.05，^##P＜0.01

(3)对大鼠宫颈组织IL-8和PGE₂含量的影响

与阴性对照组比较，异甘草素2、4和8mg·kg^-1给药组大鼠子宫颈组织IL-8和PGE₂含量明显降低，以8mg·kg^-1给药组作用最强。结果见表4。

表4异甘草素阴道栓对实验性宫颈炎大鼠宫颈组织IL-8和PGE₂含量的影响(n＝8)

分组	剂量/mg·kg<sup>-1</sup>	IL-8/μg·kg<sup>-1</sup>	PGE<sub>2</sub>/μg.kg<sup>-1</sup>
				正常组模型组聚甲酚磺醛异甘草素	------5248	2.67±0.4686.40±7.81<sup>**</sup>77.76±7.84<sup>##</sup>67.20±8.82<sup>#</sup>56.87±7.75<sup>##</sup>37.64±6.58<sup>##</sup>	0.49±0.091.25±0.36<sup>**</sup>0.55±0.24<sup>##</sup>0.99±0.200.77±0.17<sup>#</sup>0.68±0.23<sup>##</sup>

与正常组比较：^**P＜0.01；与模型组比较：^#＜0.05，^##P＜0.01

结果显示应用外源性异甘草素能显著改善子宫颈炎大鼠宫颈组织病理形态学改变程度，可使大鼠宫颈组织炎性细胞减少、IL-8和PGE₂含量下降，以异甘草素8mg·kg^-1治疗组作用最强。表明异甘草素对实验性大鼠子宫颈炎有很好的治疗作用，其机制可能与下调IL-8和PGE₂介导的炎症反应有关。

Claims (9)

1.一种异甘草素在制备治疗慢性宫颈炎的阴道栓剂中的应用。

2.根据权利要求1所述的一种异甘草素在制备治疗慢性宫颈炎的阴道栓剂中的应用，其特征在于，所述的阴道栓剂含有以下重量百分比的原料：

原料          重量百分比

异甘草素      0.01～2％

基质          84～94％

稳定剂        1～8％

缓冲剂        1～4％

β-环糊精      0.5～2％；

所述的基质为甘油、明胶、水按70∶20∶10比例配制；

所述的稳定剂为蔗糖、甘露醇、乳糖、葡萄糖、海藻糖中的一种或二到五种或任意组合；

所述的缓冲剂为磷酸盐、乌头酸、柠檬酸、戊二酸、乙酸盐、枸橼酸盐中的一种或二到六种或任意组合。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述阴道栓剂由下述原料按重量百分比配制：异甘草素0.02％，甘油明胶90％，蔗糖6％，磷酸盐3.48％，β-环糊精0.5％。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述阴道栓剂由下述原料按重量百分比配制：异甘草素0.04％，甘油明胶92％，葡萄糖2.16％，枸橼酸盐4％，β-环糊精1.8％。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述阴道栓剂由下述原料按重量百分比配制：异甘草素0.08％，甘油明胶88％，海藻糖8％，乙酸盐3.07％，β-环糊精0.85％。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述阴道栓剂由下述原料按重量百分比配制：异甘草素0.10％，甘油明胶94％，葡萄糖3％，柠檬酸2.36％，β-环糊精0.54％。

7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述阴道栓剂由下述原料按重量百分比配制：异甘草素0.30％，甘油明胶91％，乳糖7％，戊二酸1.14％，β-环糊精0.56％。

8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述阴道栓剂由下述原料按重量百分比配制：异甘草素0.90％，甘油明胶91％，甘露醇4.18％，柠檬酸2.1％，β-环糊精1.82％。

9.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述阴道栓剂由下述原料按重量百分比配制：异甘草素1.3％，甘油明胶86％，甘露醇7.79％，乌头酸3.71％，β-环糊精1.2％。