CN102462864B - 一种组织工程皮肤构建新方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种组织工程皮肤构建方法，该方法采用人表皮干细胞、真皮成纤维细胞作为种子细胞，以经过人胎盘IV型胶原修饰的同种无细胞真皮基质作为支架，利用气液界面分离培养法复合构建为一种有活性的双层组织工程皮肤。该方法构建的组织工程皮肤更接近天然皮肤的结构，组织形态学显示该组织工程皮肤具有表皮和真皮双层结构，其中真皮胶原支架结构完整，表皮层中具有多层不同分化程度的细胞，达到组织工程皮肤的形态学要求。
Description
技术领域
本发明属于人体组织工程技术，具体涉及一种组织工程皮肤构建新方法，采用人类表皮干细胞、真皮成纤维细胞作为种子细胞，以经过人胎盘Ⅳ型胶原修饰的同种无细胞真皮基质作为支架，使用气液界面分离法复合构建一种有活性的双层组织工程皮肤。
背景技术
皮肤是人体最大的组织器官，是人体的外屏障，皮肤的完整性对于人类有着重要的作用。烧（创）伤等多种原因造成皮肤大面积缺损后，可导致人体严重的功能障碍，甚至危及生命。目前修复皮肤缺损最有效的方法是自体皮肤移植，但大面积烧伤自体皮源常常不能满足治疗需要，且这种方法在供皮区会造成新的损伤。同种异体皮、异种皮作为暂时性皮肤替代物虽然可以用于治疗皮肤缺损创面，但由于免疫排斥等因素无法达到自体皮一样的效果，而仅仅能起到覆盖保护创面的作用。组织工程技术是应用生命科学和工程学技术来构建人体组织或器官的一门新兴技术，随着组织工程技术的发展，组织工程皮肤作为永久性皮肤替代物，其研究得到了很大的发展。
组织工程皮肤构建的三要素为种子细胞、支架材料和组织构建。
组织工程皮肤的种子细胞来源有多种，如表皮干细胞、脂肪干细胞、骨髓间充质干细胞和胚胎干细胞等，它们在一定的微环境下均可被诱导向表皮细胞分化。其中，表皮干细胞具有强大的增殖和分化潜能，是皮肤及其附属器发生、修复、重建的关键源泉，且在体外培养时更容易保持表皮细胞表型；成纤维细胞是真皮的主要细胞成分，其分泌的胶原纤维和其他基质成分对表皮细胞的生长和创面愈合具有促进作用，是构建组织工程皮肤真皮的一类重要细胞。
支架材料是种子细胞黏附、生长、迁移、增殖和分化的载体，是组织工程皮肤的“真皮”部分。按化学性质支架材料分为人工合成类材料和天然生物类材料两种。人工合成类支架材料抗张强度高，降解速率和微结构容易在合成过程控制，因此容易大规模生产，但其最大缺点是缺乏细胞识别信号，不利于细胞黏附及特异基因激活。目前已有的组织工程产品多采用胶原海绵、氨基多糖等天然生物类材料，该类材料具有良好的相容性和适宜的降解速度，但其缺点是力学能力差。同种脱细胞真皮基质属于天然类材料，具有其它人工合成材料无法比拟的优点，它是将同种皮肤经过理化方法处理去除表皮层及真皮中细胞成分所得的产物，保留有弹力纤维、胶原纤维等维持力学支撑的基质成分，同种脱细胞真皮基质具有良好的力学性能、低免疫原性及天然胶原三维支架结构，是一种理想的组织工程支架材料。
组织构建是组织工程的最终目标，在一定的微环境下，将培养的种子细胞与支架材料复合进行组织构建是组织工程皮产品的关键步骤。体外构建的组织工程皮肤产品在功能上要接近生理皮肤，表皮细胞必须具有含角化的多层细胞结构，才能保证皮肤移植后具有抗摩擦、保湿等防护功能。表皮细胞以单纯的浸没式培养只能形成多层结构，不能正常角化。而采用气-液分离培养的方式进行体外培养，类同于模拟人体在体条件，能够有效构建组织工程皮肤。
目前组织工程皮肤已有多种产品，但大多数产品存在着皮肤薄弱、抗拉及抗摩擦能力差，应用时不易操作等缺点。经检索，目前以同种无细胞真皮作为支架，同时复合两种种子细胞的产品还未见报道。陆洪光等发明了一种用表皮干细胞体外制作组织工程皮肤的方法(专利申请号200710201677.1)，该方法以表皮干细胞作为种子细胞，以去表皮真皮作为支架材料，将培养的表皮干细胞膜片接种于去表皮真皮上，进行液下液面培养而得组织工程皮肤。该方法存在一些不足，一是采用的支架材料仅通过去表皮处理，没有经过脱细胞处理，会使支架材料中包含较多的细胞成分，用于临床容易导致免疫排斥反应的发生；二是仅仅用表皮干细胞作为种子细胞，缺少了成纤维细胞，影响了表皮干细胞的黏附与增殖，也将延缓缺损创面的愈合速度。成纤维细胞作为真皮中重要的细胞组成部分，可分泌多种细胞因子，如肝细胞生长因子、角质形成细胞生长因子、类胰岛素生长因子、TGF-β1、前列腺素等，对表皮细胞的生长、移行和分化均有促进作用。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的缺陷，提供一种组织工程皮肤构建新方法，使构建出的组织工程皮肤更接近天然皮肤的结构。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：一种组织工程皮肤构建新方法，采用人表皮干细胞和真皮成纤维细胞作为种子细胞，以经过人胎盘Ⅳ型胶原修饰的同种无细胞真皮基质作为支架，利用气液界面分离法复合构建为一种有活性的双层组织工程皮肤。
进一步，如上所述的组织工程皮肤构建新方法，具体包括如下步骤：
（1）表皮干细胞的分离和培养
取同种皮肤组织小块，含双抗的PBS反复冲洗，置DispaseⅡ中浸泡过夜，冷消化分离真皮、表皮，收集表皮皮片，剪为碎块，胰酶热消化，分离表皮干细胞，过滤并接种于Ⅳ型胶原包被的培养瓶中，通过差速粘附筛选表皮干细胞，加专用培养基培养；
（2）成纤维细胞的分离和培养
取步骤（1）中分离的真皮，PBS缓冲液冲洗，剪碎，真皮面向下散在接种于培养瓶，倒置一段时间后，加入成纤维细胞专用培养基培养；
（3）同种无细胞真皮的制备
采用高渗盐溶液-SDS-胰蛋白酶法制备同种无细胞真皮：取同种刃厚皮片，使其浸于NaCl溶液中恒温震荡，脱去表皮；在十二烷基硫酸钠-磷酸盐溶液中超声处理，破碎细胞；以胰蛋白酶消化，清除细胞残骸；最后以生理盐水清洗备用；
（4）IV型胶原修饰真皮支架
取步骤（3）所得的同种无细胞真皮，将IV型胶原铺于真皮支架的乳头层面上，并放置于培养箱中过夜；
（5）接种成纤维细胞
用丝裂霉素C处理步骤（2）所得第3或第4代成纤维细胞，接种于步骤（4）所得真皮支架上，加入含FBS的DMEM培养基，置培养箱中培养1～3天；
（6）接种表皮干细胞
将步骤（1）所得第2或第3代表皮干细胞接种于步骤（5）所得的真皮支架上，添加足量培养基使真皮支架完全浸没，置培养箱中培养1周，形成初期复合物；
（7）气液分离培养构建组织工程皮肤
以Transwell培养小室作为气液分离支架，将步骤（6）所得复合物转移至该气液分离支架上，添加培养基，培养基液面须与复合物最底部平齐，置培养箱中培养1周，即完成组织工程皮肤的制备过程。
上述制备过程中所使用的表皮干细胞专用培养基为含5%胎牛血清的KSFM培养基；成纤维细胞专用培养基为含10%胎牛血清的L-DMEM培养液；复合皮肤专用培养基为含10%胎牛血清的KSFM培养基。
本发明的有益效果如下：本发明采用表皮干细胞与成纤维细胞两种种子细胞，解决了单纯表皮细胞在支架材料上增殖缓慢的缺点。本发明采用同种脱细胞真皮作为支架材料，既具备良好的天然皮肤结构，为种子细胞提供良好的支架环境；又具备良好的生物相容性和极低免疫原性，有效避免了排斥反应的发生。经过人胎盘IV型胶原修饰，可以更好的促进种子细胞的黏附与增殖。本发明采用气-液分离的方法，模拟人体在体条件，可有效构建组织工程皮肤。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细的描述。
作为组织工程三要素之一，种子细胞的筛选与培养是构建组织工程皮肤重要的一步。表皮干细胞因其具有较大的增殖和分化潜能成为种子细胞的首选，但该细胞的特征之一是慢周期性，这会影响细胞的增殖速度，而体内体外的研究均表明表皮干细胞的分化月上皮-间充质相互作用有关，即和真皮成纤维细胞密切相关。所以，添加真皮成纤维细胞作为种子细胞可以促进表皮干细胞的增殖与分化。本发明即采用表皮干细胞与成纤维细胞共同作为种子细胞，解决了单纯表皮细胞在支架材料上增殖缓慢的缺点。
支架材料是组织工程的第二要素，本发明采用同种脱细胞真皮作为支架材料，既具备了良好的天然皮肤结构，为种子细胞提供良好的支架环境；又具备了良好的生物相容性和极低免疫原性，有效避免了排斥反应的发生。经过人胎盘IV型胶原修饰，可以更好的促进种子细胞的黏附与增殖。
组织构建是组织工程的最终目标，在一定的微环境下，将培养的种子细胞与支架材料复合进行组织构建是组织工程皮产品的关键步骤。本发明采用气-液分离的方法，模拟人体在体条件，可有效构建组织工程皮肤。
实施例1
（1）表皮干细胞的分离和培养
取2～4cm2同种皮肤组织(本实施例中取3cm2)，置于含双抗的PBS中反复冲洗，剪除脂肪和皮下组织，剪成0.5×0.5cm2的小块，移入DispaseⅡ（2.4U/ml）中，4℃过夜。分离真皮、表皮，收集表皮皮片并剪碎，37℃条件下置0.25%胰酶与0.02%的EDTA混合消化液内消化30分钟，血清终止，200目细胞筛子过滤。1000rpm离心5分钟，弃上清，表皮干细胞专用培养基重悬，调定细胞密度为（1～2）×106ml，接种于Ⅳ型胶原包被的培养瓶中，快速筛选15分钟后，弃去未贴壁细胞，更换新的培养基于CO2培养箱中培养，每3天换液1次，约7天细胞达80%汇合时，传代。所述的表皮干细胞专用培养基为含5%胎牛血清的KSFM培养基。
（2）成纤维细胞的分离和培养
以组织块法培养成纤维细胞：取步骤（1）中分离的真皮，PBS冲洗3次，剪成1mm3的小块，真皮面向下散在接种于培养瓶底部，37℃条件下倒置5小时，加入含10%胎牛血清的L-DMEM培养液，37℃、5%CO2饱和湿度条件下培养。
（3）同种无细胞真皮的制备
采用高渗盐溶液-SDS-胰蛋白酶法制备同种无细胞真皮：取-70℃条件下保存厚度为0.3mm的同种皮片，使用前从-70℃条件下取出后立即放入37±2℃的恒温水浴锅内复温，再浸入1mol/L NaCl溶液中，37℃条件下恒温震荡24小时脱表皮，磷酸盐缓冲液反复冲洗，置于含5g/L十二烷基硫酸钠-磷酸盐溶液（SDS）中4小时，磷酸盐缓冲液冲洗，0.25%胰蛋白酶消化1小时，生理盐水溶液反复冲洗后备用。
（4）IV型胶原修饰真皮支架
取步骤（3）所得的同种无细胞真皮，将IV型胶原（100μg/ml）铺于真皮支架的乳头层面上，并放置于培养箱中过夜；
（5）接种成纤维细胞
丝裂霉素C（10μg/ml～40μg/ml）处理步骤（2）所得第3或第4代成纤维细胞，以密度为5×104/ml接种于步骤（4）所得真皮支架上，加入成纤维细胞专用培养基（含10%胎牛血清的L-DMEM培养液），置37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养1～3天。
（6）接种表皮干细胞
将步骤（1）所得第2或第3代表皮干细胞以密度为1×106/ml接种于步骤（5）所得的真皮支架上，添加足量表皮干细胞专用培养基（含5%胎牛血清的KSFM培养基）使真皮支架完全浸没，于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养1周，形成初期复合物。
（7）气液分离培养构建组织工程皮肤
以Transwell培养小室作为气液分离支架，将步骤（6）所得复合物转移至该气液分离支架上，添加复合皮肤专用培养基（含10%胎牛血清的KSFM培养基），培养基液面须与复合物最底部平齐，于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养1周，即完成组织工程皮肤的制备过程。
本发明构建所得的组织工程皮肤更接近天然皮肤的结构，组织形态学显示该组织工程皮肤具有表皮和真皮双层结构，其中真皮胶原支架完整，表皮层中具有多层不同分化程度的细胞，达到了组织工程皮肤的形态学要求。
在本发明中提及的所有文献都在本申请引用中作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，在不偏离本发明的权利要求精神基础上所作这些等价形式的修改，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (7)
1.一种组织工程皮肤构建新方法，其特征在于：采用人表皮干细胞和真皮成纤维细胞作为种子细胞，以经过人胎盘Ⅳ型胶原修饰的同种无细胞真皮基质作为支架，利用气液界面分离法复合构建为一种有活性的双层组织工程皮肤，具体包括如下步骤：
（1）表皮干细胞的分离和培养
取2～4cm2同种皮肤组织小块，含双抗的PBS反复冲洗，置DispaseⅡ中浸泡过夜，冷消化分离真皮、表皮，收集表皮皮片，剪为碎块，胰酶热消化，分离表皮干细胞，过滤并接种于Ⅳ型胶原包被的培养瓶中，通过差速粘附筛选表皮干细胞，加含5%胎牛血清的KSFM培养基培养；
（2）成纤维细胞的分离和培养
取步骤（1）中分离的真皮，PBS缓冲液冲洗，剪碎，真皮面向下散在接种于培养瓶，倒置5小时后，加入含10%胎牛血清的L-DMEM培养液培养；
（3）同种无细胞真皮的制备
采用高渗盐溶液-SDS-胰蛋白酶法制备同种无细胞真皮：取同种刃厚皮片，使其浸于NaCl溶液中恒温震荡，脱去表皮；在5g/L十二烷基硫酸钠-磷酸盐溶液中超声处理，破碎细胞；以0.25%胰蛋白酶消化，清除细胞残骸；最后以生理盐水清洗备用；
（4）IV型胶原修饰真皮支架
取步骤（3）所得的同种无细胞真皮，将IV型胶原铺于真皮支架的乳头层面上，并放置于培养箱中过夜；
（5）接种成纤维细胞
用丝裂霉素C处理步骤（2）所得第3或第4代成纤维细胞，接种于步骤（4）所得真皮支架上，加入含FBS的DMEM培养基，置培养箱中培养1～3天；
（6）接种表皮干细胞
将步骤（1）所得第2或第3代表皮干细胞接种于步骤（5）所得的真皮支架上，添加足量含5%胎牛血清的KSFM培养基使真皮支架完全浸没，置培养箱中培养1周，形成初期复合物；
（7）气液分离培养构建组织工程皮肤
以Transwell培养小室作为气液分离支架，将步骤（6）所得复合物转移至该气液分离支架上，添加含10%胎牛血清的KSFM培养基，培养基液面须与复合物最底部平齐，置培养箱中培养1周，即完成组织工程皮肤的制备过程。
2.如权利要求1所述的组织工程皮肤构建新方法，其特征在于：步骤（1）中所述的DispaseⅡ的浓度为2.4U/ml。
3.如权利要求1所述的组织工程皮肤构建新方法，其特征在于：步骤（4）中所述的IV型胶原的浓度为100μg/ml。
4.如权利要求1所述的组织工程皮肤构建新方法，其特征在于：步骤（5）中所述的丝裂霉素C的浓度为10μg/ml～40μg/ml；所述的FBS在DMEM培养基中的含量为10%；培养箱中的培养条件为37℃，5%CO2饱和湿度。
5.如权利要求1所述的组织工程皮肤构建新方法，其特征在于：步骤（6）中培养箱中的培养条件为37℃，5%CO2饱和湿度。
6.如权利要求1所述的组织工程皮肤构建新方法，其特征在于：步骤（7）中培养箱的培养条件为37℃，5%CO2饱和湿度。
7.如权利要求1所述的组织工程皮肤构建新方法，其特征在于：所述的同种皮肤组织源自健康儿童包皮环切术所切除的包皮组织。
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