CN106806947A

CN106806947A - 一种低免疫原性组织工程皮肤构建方法

Info

Publication number: CN106806947A
Application number: CN201710026018.2A
Authority: CN
Inventors: 陈冬梅; 杨银学; 魏军; 刘晓明; 刘淑丹; 梁雪云; 杨婷婷; 张耀林; 马晓娜; 马海滨; 严秀蕊; 刘婷
Original assignee: General Hospital of Ningxia Medical University
Current assignee: General Hospital of Ningxia Medical University
Priority date: 2017-01-13
Filing date: 2017-01-13
Publication date: 2017-06-09

Abstract

本发明公开了一种低免疫原性组织工程皮肤构建方法，属于生物工程技术领域，该方法方法采用人表皮干细胞和胎儿来源的胎盘间充质干细胞作为种子细胞，以牛I型胶原构建的3D基质作为支架，利用气液界面分离培养法复合构建为一种有活性的低免疫原性全层组织工程皮肤。该方法基于胎盘间充质干细胞的免疫抑制作用，制备低免疫原性组织工程皮肤，用于异体皮肤移植免疫排斥作用的治疗，方法简便，重复性好。组织形态学显示该组织工程表皮具有完整表皮结构，其中包括基底层、角质层和多层不同分化程度的细胞，达到组织工程表皮的形态学要求。

Description

一种低免疫原性组织工程皮肤构建方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体地说，涉及一种低免疫原性组织工程皮肤构建方法，具体地说，涉及一种利用胎盘绒毛膜来源间充质干细胞制备低免疫原性组织工程皮肤的方法。

背景技术

皮肤移植，是指将自体健康部位皮肤、异体皮肤或者异种皮肤通过外科手术的方法移植至受损部位，从而快速有效地封闭受损创面，使患者避免减少脱水感染等的发生。目前临床上皮肤移植的主要方法有三种即自体皮肤移植、异种或同种异体皮肤移植以及人工合成皮肤代用品的移植。自体皮肤移植具有不发生免疫排斥反应的优点，但对于烧烫伤患者尤其是大面积烧烫伤患者来说，其来源往往绝对不足，且术后供皮部位可能存在不能自行愈合、感染或瘢痕形成风险，因此其应用受到一定的限制；异种或同种异体皮肤移植具有数量充足、来源相对广泛等优势，但皮肤移植后都会发生强烈的免疫排斥反应，移植皮肤都会很快被排异掉，因此起到覆盖创面的时间相对较短，满足不了烧烫伤患者整个治疗恢复的时间窗，因此此皮肤移植同样受到一定程度的限制；人工合成皮肤材料具有已商品化购买容易、不会发生免疫排斥等的优势也受到人们的关注，但其价格高昂，一般普通经济条件的家庭难以支付如此高额的医疗费用，应用同样受到一定的限制。鉴于以上三种移植方法的比较，降低异体或异种移植皮肤的免疫原性、延长移植皮肤的存活时间可能是比较行之有效的方法，但如何降低移植物的免疫原性是目前挽救大面积、重度烧烫伤患者生命亟待解决的问题。

组织工程皮肤构建的三要素为种子细胞、支架材料和组织构建。

组织工程表皮的种子细胞来源皮肤表皮结构基底层的表皮干细胞、黑色素细胞等，表皮干细胞在一定的微环境下可被诱导向角化细胞分化。其中，表皮干细胞具有强大的增殖和分化潜能，是皮肤及其附属器发生、修复、重建的关键源泉，且在体外培养时更容易保持表皮细胞表型。

支架材料是种子细胞黏附、生长、迁移、增殖和分化的载体，是组织工程皮肤的“真皮”部分。人工合成类支架材料降解速率和微结构容易在合成过程控制，因此容易大规模生产，但其最大缺点是缺乏细胞识别信号，不利于细胞黏附及特异基因激活。天然生物类材料来源的的组织工程产品支架具有良好的相容性和适宜的降解速度，但其缺点是力学能力差。目前多采用胶原、氨基多糖等，该类材料具有良好的力学性能、低免疫原性及天然胶原三维支架结构，是一种理想的组织工程支架材料。

组织构建是组织工程的关键技术，在一定的微环境下，将培养的种子细胞与支架材料复合进行组织构建是组织工程表皮产品的关键步骤。体外构建的组织工程皮肤产品在功能上要接近生理皮肤，表皮细胞必须具有含角化的多层细胞结构，才能保证皮肤移植后具有抗感染、抗摩擦、保湿等防护功能。表皮细胞以单纯的浸没式培养只能形成多层结构，不能正常角化。而采用气-液分离培养的方式进行体外培养，类同于模拟人体在体条件，能够有效构建组织工程皮肤。

间充质干细胞具有抑制异体移植器官免疫排斥，降低移植物抗宿主疾病等的作用，这使其在器官移植领域越来越多的受到人们的关注。胎盘来源间充质干细胞是间充质干细胞家族成员之一，研究表明，胎盘间充质干细胞是免疫原性最低的干细胞之一，其除了具有低免疫原性以及抑制器官移植免疫排斥等间充质干细胞共性外，还具有来源丰富，分离纯化简单不存在伦理道德问题且不会对供体造成损害的优势而备受关注。PieternellaS等已证实，可从人胎盘组织的绒毛膜和基蜕膜中分离得到胎儿侧来源胎盘间充质干细胞(fetal Placental Mesenchymal Stem Cells,fPMSC)和母体侧来源胎盘间充质干细胞(maternal Placental Mesenchymal Stem Cells,mPMSC)。

发明内容

本发明的目的在于解决现有异体来源表皮干细胞构建组织工程皮肤模型在移植耐受过程中发生免疫排斥缺点，提供一种低免疫原性组织工程皮肤构建方法，该方法采用人类胎儿来源的胎盘间充质干细胞和表皮干细胞作为种子细胞，以牛I型胶原3D基质作为支架，使用气液界面分离法复合构建一种有活性的低免疫原性的全层组织工程皮肤。

其具体技术方案为：

一种低免疫原性组织工程皮肤构建方法，包括以下步骤：

步骤1、胎儿来源的胎盘间充质干细胞的分离培养

取新鲜胎盘组织，剪取部分胎儿侧胎盘组织，利用PBS漂洗胎盘组织3～5遍直至清洗液无色为止，利用眼科剪彻底剪碎组织，PBS重复洗液3遍，A型胶原酶和DNaseⅠ酶，37℃水浴消化，消化2小时，洗涤离心接种于10cm无菌培养皿中，置于37℃、5％CO₂条件下培养，第二天小心换液，以后每隔两天换液一次，此细胞即为P₀代，显微镜下观察细胞生长状态，待细胞达70％～80％融合密度时，利用Tryple消化后按1：3传代，继续培养至P₃代作为实验用细胞；

步骤2、表皮干细胞的分离和培养

取同种皮肤组织小块，含双抗的PBS反复冲洗，置DispaseⅡ中浸泡过夜，冷消化分离真皮、表皮，收集表皮皮片，剪为碎块，胰酶热消化，分离表皮干细胞，过滤并接种于I型牛胶原包被的培养皿中，通过专用选择培养基筛选表皮干细胞；

步骤3、复合胎儿来源的胎盘间充质干细胞的I型牛胶原3D支架制备

胶原配置：5-8mL 1.5mg/mL I型牛胶原溶液，0.4mL-1.2mL 10×DMEM，0.2mL-0.6mL NaHCO3，0.6mL-1.2mL 200mM Hepes，PH值在7.3-7.7，配制在低温下进行。将培养好的胎盘间充质干细胞，消化后，以6×10⁶密度重悬于1mL的matrigel中，并与配好的胶原充分混合，配制好后接种到24mm的transwell表面，1.0mL每孔，37℃条件下凝固30min，待胶原成固体后，缓慢添加含MMPs抑制剂marimastat 5nM的间充质干细胞培养基置于培养箱中过夜；

步骤4、接种表皮干细胞

次日，吸弃培养板中平衡溶液待用，获取培养至70％～80％融和状态的P2代角质形成细胞，以Transwell培养小室作为气液分离支架，支架上，接种1×10⁶细胞数量于24mm的嵌套培养皿的上室中，更换含MMPs抑制剂marimastat 3nM-6nM的表皮干细胞培养基，上室中添加培养基Cnt-07,CELLnTEC 2ml，下室中添加培养基Cnt-07,CELLnTEC 3ml继续培养16h待细胞100％汇合成片；

步骤5、气液分离培养构建组织工程皮肤

更换添加MMPs抑制剂marimastat 3nM-6nM，角质细胞分化培养基Cnt-3D,CELLnTEC继续培养2天，接种后第5天，将24mm的嵌套培养皿上室中液体吸出，保持细胞表面干燥，下室添加角质细胞分化培养基Cnt-3D,CELLnTEC 0.6mL-1.2mL，液面不高于表皮细胞层，每天换液，至12天角化表皮结构形成，即完成组织工程皮肤的制备过程。

进一步，步骤1中的培养基添加Cnt-07,CELLnTEC。

进一步，所述的胎盘间充质干细胞源自健康孕妇生产娩出胎盘的胎儿侧绒毛膜层。

进一步，分化培养基中添加MMPs抑制剂有效减少了胎盘间充质干细胞造成的胶原支架和人工表皮产品的收缩。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

本发明采用胎盘间充质干细胞和表皮干细胞作为种子细胞，利用I型牛胶原和matrigel构成3D支架，结合CELLnTEC培养系统，能够维持表皮干细胞的增殖和分化，使用胎盘间充质干细胞，解决了单纯异体表皮细胞免疫排斥反应强烈的缺点，有效增加了异体人工表皮产品移植过程中的免疫耐受及存活时间。本发明利用通过分化培养基中添加3nM-6nM的MMPs抑制剂，有效减少了胎盘间充质干细胞造成的胶原支架和人工表皮产品的收缩。

附图说明

图1是间充质干细胞的表面标记鉴定,其中，A：间充质干细胞流式细胞检测前细胞状态；B：间充质干细胞流式细胞仪检测表面分子CD90/CD73/CD105表达；

图2是表皮干细胞的分离、培养和鉴定,其中，A,B：CK19表达鉴定，A:自然光下细胞生长状态；B:细胞免疫荧光CK19蛋白检测；C,D：P63表达鉴定，A:自然光下细胞生长状态；B:细胞免疫荧光P63蛋白检测；

图3是组织工程皮肤的鉴定,其中，A：组织工程皮肤3D培养图；B：组织工程皮肤HE染色；C：组织工程皮肤AKH1免疫组化染色鉴定；D：组织工程皮肤P63免疫组化染色鉴定；E：组织工程皮肤CK10免疫组化染色鉴定；F：组织工程皮肤E-Cadherin免疫组化染色鉴定；

图4是组织工程皮肤的移植,其中，A：PBS对照组；B：人工表皮移植组(epidermis)；C：间充质干细胞和表皮细胞联合移植组(fPMSC+epidermis)；

图5是组织工程皮肤移植后的愈合,其中，A：对照愈合组；B：人工表皮移植后愈合组(epidermis)；C：间充质干细胞和人工表皮联合移植后愈合组(fPMSC+epidermis)。

具体实施方式

下面结合具体附图和实施方案对本发明的技术方案作进一步详细地说明。

本发明利用胎盘间充质干细胞具有免疫调节的特点，采用其作为种子细胞，无血清系统培养，解决了依赖自体皮肤分离表皮干细胞来源有限的缺点。支架材料是组织工程的第二要素，本发明采用同种胶原和matrigel(比例8:1)作为支架材料，既具备了良好的皮肤支撑结构，为种子细胞提供良好的支架环境；又具备了良好的生物相容性、极低免疫原性和较好的力学强度，有效促进种子细胞的黏附与增殖。组织构建是组织工程的关键技术，本发明采用气-液分离的方法，模拟人体在体条件，可有效构建组织工程皮肤。

实施例1胎盘间充质干细胞和表皮干细胞培养及分化各阶段培养基的组成及培养方法与结果

方法：胎盘间充质干细胞分离培养取新鲜胎盘组织(一般取分娩后24小时内胎盘组织，若不能及时分离培养暂时置于4℃冰箱，实验证明存放时间越短培养细胞状态越佳)置于事先30分钟紫外线消毒后的超净工作台上，利用剪刀分别小心剪取部分胎儿侧胎盘组织(剪取时注意尽量避开大血管，剪取大小约为2.0cm×1.0cm×0.5cm)分别置于两个无菌一次性培养皿中，利用PBS(添加1％Anti-Anti)漂洗胎盘组织3～5遍直至清洗液无色为止(目的是清洗掉组织中的血液成分，以免影响提取细胞质量)，将清洗后的胎盘组织分别置于新的无菌一次性培养皿中，利用眼科剪彻底剪碎组织，收集剪碎后的组织分别移至干净无菌的一次性50mL离心管中，加入40mL左右PBS颠倒混匀10次左右(进一步洗去组织块中的血液成分)，1500rpm快速离心10秒后使组织块沉淀，小心弃去洗液，再次加入适量的PBS重复上述操作，离心后同样弃去洗液，向两离心管分别加入30mL左右的DMEM并加入A型胶原酶和DNaseⅠ酶，封口膜封闭后将上述离心管移至37℃水浴锅中水浴消化，消化时间为2小时，期间每隔10分钟左右颠倒混匀3～5次使组织块与消化酶充分接触保证其完全消化，待消化完毕后将离心管置于离心机中按1500rpm的转速快速离心10秒，离心后将上清液移至另一干净无菌50mL离心管中，剩余沉淀加入适量PBS洗涤后同样按1500rpm离心10秒，将所得洗涤液也移至上述无菌离心管，最后将上述所得上清按1500rpm离心10分钟后弃去上清，利用PBS重悬沉淀物，先后用100μm、40μm细胞筛过滤沉淀，收集过滤后所得细胞悬液，1500rpm离心10分钟后弃去上清，利用完全培养基(DMEM+10％FBS+1％Anti-Anti)重悬沉淀后将细胞悬液分别接种于10cm无菌培养皿中，置于37℃、5％CO₂条件下培养，第二天小心换液，以后每隔两天换液一次，此细胞即为P₀代，显微镜下观察细胞生长状态，待细胞达70％～80％融合密度时，利用Tryple消化后按1：3传代，继续培养至P₃代作为实验用细胞。

表皮干细胞培养取环状切除术后小儿包皮(家属知情同意)，将组织先后在碘伏与75％的乙醇中消毒，并在含1％抗生素的PBS中进行漂洗；剔除皮下脂肪层、血管、结缔组织，剪成1cm×1cm小块，置于3.3mg/ml dispaseⅡ中4℃消化14hr，机械分开表皮与真皮层。将表皮置于离心管中，加入0.25％胰酶5ml，在37℃孵箱中消化15min。加DMEM+10％FBS终止消化，1500r/min×5min，弃上清，加入无血清角化培养基，在斡旋器上瞬时震荡6次。70μm无菌滤网过滤，吸取单细胞悬液，3×10⁶接种在已包被0.1％I型牛胶原的培养皿中，置37℃、体积分数为5％CO₂饱和湿度的培养箱中培养。待细胞长成70％～80％融和状态时，用Tryple消化细胞5min，PBS稀释消化液终止消化，吹打混悬，离心收集细胞，加培养基，转移至I型胶原包被好的培养皿内，继续培养至P2代，每两天换液，用作构建复合皮的种子细胞和进行细胞鉴定(K19及p63免疫细胞化学染色鉴定)。

结果：

采用Stemcell公司的MesenCultTM-XF Medium无血清培养基能够很好的实现胎盘间充质干细胞的增殖和纯化。接种后24小时换液，将细胞置于显微镜下观察，发现贴壁细胞数量较少，呈散在分布、形态不规则。随培养时间的延长，细胞数量逐渐增多，一周左右时已形成较多克隆样区域。fPMSC细胞呈短梭形或多边形，鱼鳞状，呈簇样生长(图1)。待细胞达70％～80％融合密度时传代，传代后细胞呈涡旋状生长。

采用CELLnTEC公司的角化细胞选择培养基能够很好的实现人包皮角化细胞的增殖和纯化。在原代3×10⁶接种密度条件下，6-7天角化细胞能够生长至80％汇合，传代后，以1×10⁶密度接种，5天角化细胞能够生长至80％汇合，细胞传至2-3代增殖能力和纯度最佳，适合用于构建组织工程皮肤。此方法分离纯化的细胞具有角化细胞特征：呈铺路石样集落生长，免疫细胞化学染色结果显示，表达角化细胞标志角蛋白19和核蛋白p63，阳性细胞比例占90％以上(图2)。

实施例2胎盘间充质干细胞复合表皮干细胞组织工程皮肤构建及气液界面培养角质化层形成的方法与结果

方法：准备接种前1天，制备3D牛胶原支架。胶原配置(10ml)：7.5ml 1.5mg/mL I型牛胶原溶液，1mL 10×DMEM，0.5mL NaHCO₃，1mL 200mM Hepes，0.1mL 1M NaOH，配制在低温下进行，配制好后37℃条件下凝固30min。待胶原成固体后，缓慢添加PBS或基础培养基置于培养箱中过夜，平衡PH。次日，吸弃培养板中平衡溶液待用。获取培养至70％～80％融和状态的P2代角质形成细胞，接种8×10⁵细胞数量于24mm的嵌套培养皿的上室中，上室中添加培养基(Cnt-07,CELLnTEC)2ml，下室中添加培养基(Cnt-07,CELLnTEC)3ml继续培养2天待细胞100％汇合成片，更换角质细胞分化培养基(Cnt-3D,CELLnTEC)继续培养2天。第5天，将24mm的嵌套培养皿上室中液体吸出，保持细胞表面干燥，下室添加角质细胞分化培养基(Cnt-3D,CELLnTEC)0.6mL-1.2mL，液面不高于表皮细胞层，每天换液，至12天角化表皮结构形成。

结果：按上述方法能够获得直径大于6cm的组织工程表皮，组织学结果证明其具有完整的基底细胞层、角质层以及3-5层的颗粒细胞和棘细胞层。免疫组化染色显示基底层细胞表达P63蛋白，颗粒细胞和棘细胞层表达角蛋白10，角质层表达AKH1。以上结果均证明我们获得了具有完整组织结构的组织工程表皮(图3)。

实施例3利用小鼠皮肤移植免疫排斥模型验证低免疫原性人工皮肤的功能

方法：手术操作前手术区域紫外消毒车消毒30分钟，手术器械经高压灭菌60℃烘箱过夜烘干后备用。取C57BL/6小鼠，利用4％水合氯醛按1mL/100g剂量腹腔注射麻醉小鼠，待其昏迷后，在其背部略靠近左前肢处剪取直径约12mm的圆形全层皮肤缺损，分为手术对照组、人工表皮移植组、fPMSC复合人工皮肤组，进行人工皮肤移植，真皮面向下覆盖在缺损处，确保皮肤对位良好并避免接触部位有气泡残留，利用事先准备好的凡士林纱布小心覆盖创口后，创可贴小心包扎固定，确保移植皮肤无移位，将术后小鼠置于37℃电热板上待其复苏。术后从第3天开始每天拆包观察移植皮肤排斥情况并拍照记录，从手术之日起至移植皮肤50％的面积出现变硬、翘起、发黑、坏死的时间记为移植皮肤的存活时间，统计各组小鼠移植皮肤的存活时间。

结果：移植皮肤存活情况统计

术后观察，小鼠精神状态佳，活动饮食良好，移植后24小时，各组小鼠均有不同程度的出汗现象，惧寒，各组小鼠均无死亡。移植术后第3天，人工表皮组移植皮肤出现部分发黑坏死现象，坏死面积约25％，第5天时，人工表皮组大部分小鼠移植皮肤发黑坏死面积已超过50％；fPMSC组移植皮肤状态良好，皮肤红润柔软，血供良好；第10天，人工表皮组移植皮肤出现较重程度的翘起、发黑或者坏死，且面积超过50％，fPMSC组小鼠移植皮肤状态基本良好，无发黑、翘起、坏死或者发黑、翘起、坏死面积不足50％(图4)。与人工表皮组比较：fPMSC组小鼠移植皮肤的存活时间明显延长，差异有统计学意义(P＜0.01)。HE染色法观察移植部位皮肤炎性细胞浸润情况。

移植术后第7天，各组取移植部位皮肤进行HE染色，结果显示：人工表皮组移植部位皮肤炎性细胞浸润最多，炎性细胞破坏移植皮肤导致移植皮肤发黑和坏死，fPMSC组移植组炎性细胞浸润最少，移植部位散在分布极少量炎性细胞，移植皮肤破坏程度最轻(图5)。

本发明构建所得的组织工程皮肤更接近天然皮肤的结构，组织形态学显示该组织工程皮肤具有表皮的多层结构，表皮层中具有多层不同分化程度的细胞，达到了组织工程皮肤的形态学要求。并且通过小鼠异体移植模型验证确定其具有延长异体移植物存活时间和抑制免疫细胞浸润的作用。

本发明通过支架材料中加入胎儿侧来源胎盘间充质干细胞，发挥免疫抑制作用，有效减少了异体来源表皮干细胞构建组织工程皮肤移植中的免疫排斥。本发明采用的胎盘间充质干细胞是免疫原性最低的干细胞之一，其除了具有低免疫原性以及抑制器官移植免疫排斥等间充质干细胞共性外，还具有来源丰富，分离纯化简单不存在伦理道德问题且不会对供体造成损害的优点。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。

Claims

1.一种低免疫原性组织工程皮肤构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1、胎儿来源的胎盘间充质干细胞的分离培养

取新鲜胎盘组织，剪取部分胎儿侧胎盘组织，利用PBS漂洗胎盘组织3～5遍直至清洗液无色为止，利用眼科剪彻底剪碎组织，PBS重复洗液3遍，A型胶原酶和DNase Ⅰ酶，37℃水浴消化，消化2小时，洗涤离心接种于10cm无菌培养皿中，置于37℃、5％CO₂条件下培养，第二天小心换液，以后每隔两天换液一次，此细胞即为P₀代，显微镜下观察细胞生长状态，待细胞达70％～80％融合密度时，利用Tryple消化后按1：3传代，继续培养至P₃代作为实验用细胞；

步骤2、表皮干细胞的分离和培养

取同种皮肤组织小块，含双抗的PBS反复冲洗，置Dispase Ⅱ中浸泡过夜，冷消化分离真皮、表皮，收集表皮皮片，剪为碎块，胰酶热消化，分离表皮干细胞，过滤并接种于I型牛胶原包被的培养皿中，通过专用选择培养基筛选表皮干细胞；

胶原配置：5-8mL 1.5mg/mL I型牛胶原溶液，0.4mL-1.2mL 10×DMEM，0.2mL-0.6mLNaHCO3，0.6mL-1.2mL 200mM Hepes，PH值在7.3-7.7，配制在低温下进行；将培养好的胎盘间充质干细胞，消化后，以6×10⁶密度重悬于1mL的matrigel中，并与配好的胶原充分混合，配制好后接种到24mm的transwell表面，1.0mL每孔，37℃条件下凝固30min，待胶原成固体后，缓慢添加含MMPs抑制剂marimastat 3nM-6nM的间充质干细胞培养基置于培养箱中过夜；

步骤4、接种表皮干细胞

步骤5、气液分离培养构建组织工程皮肤

2.根据权利要求1所述的低免疫原性组织工程皮肤构建方法，其特征在于，步骤2中的培养基添加Cnt-07,CELLnTEC。

3.根据权利要求1所述的低免疫原性组织工程皮肤构建方法，其特征在于，所述的胎盘间充质干细胞源自健康孕妇生产娩出胎盘的胎儿侧绒毛膜层。