CN111840656B

CN111840656B - 一种用于创面治疗的早期组织工程皮肤及其制备方法

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Publication number: CN111840656B
Application number: CN202010778602.5A
Authority: CN
Inventors: 吴训伟; 张群; 白福响; 温洁; 冷雪
Original assignee: Shandong University
Current assignee: Shandong University
Priority date: 2020-08-05
Filing date: 2020-08-05
Publication date: 2021-10-08
Anticipated expiration: 2040-08-05
Also published as: CN111840656A

Abstract

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种用于创面治疗的早期组织工程皮肤。研究发现：皮肤干细胞构建的短期培养的双层组织工程皮肤含有更多的活性细胞，凋亡通路激活较少，移植后的皮肤结构更好，还有皮脂腺和毛囊产生。研究表明，短期培养的双层组织工程皮肤在体内移植后能产生更好的皮肤结构，临床上可能有利于伤口更好的愈合。另外，短期培养的组织工程皮肤可大大缩短制备时间及成本，本研究为其临床应用提供了充分的理论及研究依据。

Description

一种用于创面治疗的早期组织工程皮肤及其制备方法

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种用于创面治疗的早期组织工程皮肤。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

由于事故、疾病、慢性伤口、急性创伤、烧伤等造成的皮肤损伤会损害皮肤屏障，严重的可能导致伤者永久残疾或死亡。皮肤移植是治疗大面积创面最有希望的方法，然而对于严重烧伤的病人来说，自体来源的皮肤非常有限，自体移植并不是最优的治疗选择。对于同种异体移植，外来组织还存在着潜在的免疫排斥问题。组织工程在20世纪80年代末正式引入后，在急性和慢性皮肤创伤的治疗中，组织工程皮肤替代物的使用为患者带来了新希望。制备组织工程皮肤的常用方法是在可生物降解的支架上植入细胞，包括表皮角质形成细胞、真皮成纤维细胞和/或干细胞。近几十年来，人类组织工程皮肤已经从简单的表皮替代物发展到具有表皮和真皮双层结构的复杂全层皮肤。自体细胞来源构建的双层组织工程皮肤非常适用于临床，因为它不仅包含皮肤的全层结构，在移植后还可形成永久性的融合而无免疫排斥反应。

然而，目前组织工程皮肤在应用和治疗上仍然存在诸多局限性：一方面，再生具有完整功能(保护、调节和感觉)的皮肤完全仍然具有挑战性。目前组织工程皮肤已经能够通过条件控制达到皮肤附件的再生，包括毛细血管网络、感觉神经支配、脂肪组织和色素生成，尽管如此，仍然无法完全重建完整的皮肤功能，尤其是功能性的毛囊和汗腺的再生。培养细胞无法在体外再生毛囊的重要原因是在培养过程中细胞失去了毛原性。对于再生医学研究来说，开发一个最佳的系统来维持细胞在体外的再生能力至关重要。另一方面，全层组织工程皮肤的构建需要培养大量的不同类型的细胞，培养过程复杂且耗时。发明人发现：使用以往的技术构建双层组织工程皮肤时，表皮和真皮细胞通常需要2到4周的扩增培养才能获得足够的数量，构建组织工程皮肤基本结构后还需要再培养3周或更长时间。在临床治疗中，耗时是组织工程皮肤应用的主要限制因素。

发明内容

为了克服上述问题，本发明提供了一种用于创面治疗的短期培养的组织工程皮肤，移植后采用本技术短期培养的双层组织工程皮肤(下称早期组织工程皮肤)较长期培养的组织工程皮肤(下称晚期组织工程皮肤)移植效果更好。研究发现：早期和晚期组织工程皮肤移植后均形成了正常结构的层状表皮，但早期组织工程皮肤形成的表皮中增殖标记物Ki-67和表皮干细胞标记物p63水平较高。早期组织工程皮肤的移植不仅真皮厚度更大、真皮细胞密度更大，且新生血管数量更多，而且只在早期组织工程皮肤移植后形成的皮肤中观察到了毛囊的形成。与晚期组织工程皮肤相比，早期组织工程皮肤表达高水平p63，但参与激活凋亡途径的基因表达水平较低。

为实现上述技术目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一个方面，提供了早期组织工程皮肤在创面治疗中的应用，所述早期组织工程皮肤的培养时间为5～9天。

本发明研究发现：皮肤干细胞构建的早期双层组织工程皮肤含有更多的活性细胞，凋亡通路激活较少，移植后的皮肤结构更好，还有皮脂腺和毛囊产生。研究表明，短期培养的双层组织工程皮肤在体内移植后能产生更好的皮肤结构，临床上可能有利于伤口更好的愈合。另外，短期培养的组织工程皮肤可大大缩短制备时间及成本，本研究为其临床应用提供了充分的理论及研究依据。

本发明的第二个方面，提供了一种早期组织工程皮肤，所述早期组织工程皮肤的培养时间为5～9天。

本发明缩短了双层组织工程皮肤构建所需的培养时间，在短时间内制备出功能完善的组织工程皮肤，对其临床应用具有重要意义。

本发明的第三个方面，提供了一种早期组织工程皮肤的制备方法，其特征在于，包括：

制备无细胞胶原层；

在脱细胞胶原层的上方构建含有真皮干细胞的胶原基质；

建立表皮细胞层；

将组织工程皮肤培养5～9天。

上述方法能够简单快速地分离人皮肤表皮细胞和真皮干细胞，缩短了皮肤干细胞扩增所需的培养时间，而且这些人体皮肤细胞在培养体系中扩增后，仍然保持着它们产生带有毛囊的全层皮肤的潜力。

本发明的有益效果在于：

(1)本发明研究发现：移植后早期双层组织工程皮肤移植效果较好。早期和晚期组织工程皮肤的移植后均形成了正常结构的层状表皮，但早期组织工程皮肤形成的表皮中增殖标记物Ki-67和表皮干细胞标记物p63水平较高。早期组织工程皮肤的移植不仅真皮厚度更大、真皮细胞密度更大，且新生血管数量更多，而且只在早期组织工程皮肤移植后的皮肤中观察到了毛囊的形成。与晚期组织工程皮肤相比，早期组织工程皮肤表达高水平p63，但参与激活凋亡途径的基因表达水平较低。

(2)本发明的培养时间短(培养时间为5～9天)、方法简单、实用性强，易于推广。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为本发明实施例1中早期和晚期组织工程皮肤的制备流程。a，在六孔板的transwell中建立一个无细胞胶原层。b，在脱细胞胶原层的上方构建含有真皮干细胞的胶原基质。c，在培养箱中培养4天，胶原基质发生收缩。d，基质在第4天收缩完成且稳定后，将成人表皮干细胞添加到基质上层。e，向每个小室内添加表皮化培养基。每2天更换一次培养基，直到第11天。f，从第12天起，改为气液界面表皮化培养基：小室外加培养基，小室内部保持干燥。在培养过程中的四个不同时间点收集组织工程皮肤，其中5天组和9天组为早期组织工程皮肤组，14天组和21组为晚期组织工程皮肤组。

图2为本发明实施例1中早期和晚期组织工程皮肤移植后新形成的皮肤的整体效果。移植成功的区域显示出明显的色素沉着，白色虚线表示宿主小鼠皮肤和着色的人类移植皮肤区域的边界，早期组织工程皮肤在移植后能够比晚期移植产生更大的色素沉着区域。bar＝5mm，*p<0.05，**p<0.01，n＝3。

图3为本发明实施例1中早期和晚期组织工程皮肤移植后新形成的皮肤的表皮层情况对比。所有组均能形成正常表皮结构，但与晚期组织工程皮肤相比，早期组织工程皮肤移植后形成的表皮中有更多Ki-67和p63阳性表达的细胞。bar＝50μm，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，n＝3。

图4为本发明实施例1中早期和晚期组织工程皮肤移植后新形成的皮肤的真皮层、血管及附属物情况对比。组织工程皮肤早期移植组形成的真皮厚度大于晚期组，真皮成纤维细胞密度较高，形成的真皮微血管数量多于晚期组。只在早期组织工程皮肤的移植组中观察到了成熟毛囊和皮脂腺的形成。bar＝50μm，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，n＝3。

图5为本发明实施例1中早期和晚期组织工程皮肤移植前蛋白表达及分子水平的差异。与其他组相比，组织工程皮肤5天组表达了最高水平的p63，随着体外培养时间的延长，p63的表达逐渐下调，被激活的Caspase-3的表达随着培养时间的延长而增加。qRT-PCR分析证实了western blot的分析结果：p63的晚期组中表达降低，Bax在晚期组中表达增加，而抗凋亡基因Bcl-2在晚期组中表达降低。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，n＝3。

图6是本发明实施例1中短期培养的组织工程皮肤的基本结构。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

本发明提供了早期组织工程皮肤在创面治疗中的应用，所述早期组织工程皮肤的培养时间为5～9天。

在一些实施例中，所述早期组织工程皮肤为双层组织工程皮肤。

在一些实施例中，所述双层组织工程皮肤包括：胶原层和表皮层。

在一些实施例中，所述胶原层包括：无细胞胶原层和真皮细胞胶原层。

在一些实施例中，所述早期组织工程皮肤的制备方法如下：

制备无细胞胶原层；

在脱细胞胶原层的上方构建含有真皮干细胞的胶原基质；

建立表皮细胞层；

将组织工程皮肤培养5～9天。

在一些实施例中，所述制备无细胞胶原层的具体步骤为：将MEM、牛I型胶原、FBS、L-谷氨酰胺和DMEM混合，然后将pH值调整到7.2～7.3，混匀，形成混合物；

在培养板中加入所述混合物，在37～37.5℃，5～5.5％的CO₂培养箱中培养，使混合物凝胶。

在一些实施例中，所述构建含有真皮干细胞的胶原基质的具体步骤为：将MEM、牛I型胶原、FBS、L-谷氨酰胺和DMEM混合，调节pH至7.2，添加成纤维细胞，混合；在凝胶化的脱细胞胶原基质上加入所述混合物，并在37～37.5℃、5～5.5％CO₂的培养箱中培养，使细胞基质完全凝胶化，加入成纤维细胞继续培养，使胶原基质发生收缩且趋于稳定。

在一些实施例中，所述建立表皮细胞层的具体步骤为：将表皮干细胞重悬于DMEM中，均匀缓慢的接种到收缩的胶原凝胶上，然后在37～37.5℃、5～5.5％CO₂的培养箱中孵育，使表皮干细胞完全粘附，表皮干细胞附着在基质上，形成一个汇合的细胞单层。

下面结合具体的实施例，对本发明做进一步的详细说明，应该指出，所述具体实施例是对本发明的解释而不是限定。

组织工程皮肤的制备

在之前的研究中，本发明建立了一种简单快速的方法来有效分离人皮肤表皮细胞和真皮干细胞，缩短了皮肤干细胞扩增所需的培养时间，而且这些人体皮肤细胞在培养体系中扩增后，仍然保持着它们产生带有毛囊的全层皮肤的潜力。在本研究中，本发明制备了皮肤干细胞，用以构建双层组织工程皮肤。双层组织工程皮肤包括胶原层和表皮层，其中胶原层又分为无细胞胶原层和真皮细胞胶原层，在胶原层顶部覆盖表皮细胞。制备方法如下(如图1所示)：

(1)在六孔板的transwell小室中建立一个无细胞胶原层，该胶原层主要有两个作用：一方面能够作为细胞层的附着基质，另一方面，防止细胞胶原过度收缩而从底膜分离。制备步骤为：在冰上制备混合0.57ml体积10×MEM，3.4ml体积2.5mg/ml牛I型胶原，0.83ml体积FBS，55μl体积200mM的L-谷氨酰胺和2.0ml体积的DMEM，然后用饱和NaHCO₃将pH值调整到7.2。使用冷却的吸管混匀，避免在混合时产生气泡。在6孔培养板中transwell的每个孔中加入1ml混合物，确保其覆盖整个transwell底部。然后将培养板在37℃，5％的CO₂培养箱中培养，混合物将在30分钟内凝胶。

(2)在脱细胞胶原层的上方构建含有真皮干细胞的胶原基质。真皮干细胞调节至终浓度为2×10⁵个细胞/ml。将1.65ml10×MEM、6.5ml2.5mg/ml牛I型胶原、1.8mlFBS、165μl200mML-谷氨酰胺和2.0mlDMEM混合，然后用饱和NaHCO₃调节pH至7.2，添加6.75ml成纤维细胞，并将所有成分充分混合。在凝胶化的脱细胞胶原基质上的每个transwell小室中加入3ml混合物，并在37℃、5％CO₂的培养箱中培养。60分钟后，细胞基质完全凝胶化，在小室外的六孔板中加入10ml成纤维细胞培养基，并将2ml直接添加到小室中。培养箱中培养4天，胶原基质发生收缩且趋于稳定。

(3)建立表皮细胞层。基质在第4天收缩完成且稳定后，将成人表皮干细胞添加到基质上层。将2×10⁶的表皮干细胞重悬于100μl的DMEM中，均匀缓慢的接种到收缩的胶原凝胶上，然后在37℃(无培养基)、5％CO₂的培养箱中孵育60分钟，使表皮干细胞完全粘附。表皮干细胞附着在基质上，形成一个汇合的细胞单层。

(4)不同阶段的组织工程皮肤培养。向每个小室内添加12ml表皮化培养基(小室外10ml，小室内2ml)。每2天更换一次培养基，直到第11天。从第12天起，改为气液界面表皮化培养基：小室外加7ml培养基，小室内部保持干燥，将组织提升至气液界面，以实现完全分层。保持小室底部每隔一天与培养基接触培养，直到第21天培养结束。

实施例1：

早期组织工程皮肤：在培养过程中的第5天收集收集组织工程皮肤(组织工程皮肤5天组)进行移植并评价。

实施例2：

早期组织工程皮肤：在培养过程中的第9天收集收集组织工程皮肤(组织工程皮肤9天组)进行移植并评价。

对比例1：

晚期组织工程皮肤：在培养过程中的第14天收集收集组织工程皮肤(组织工程皮肤14天组)进行移植并评价。

对比例2：

晚期组织工程皮肤：在培养过程中的第21天收集收集组织工程皮肤(组织工程皮肤21天组)进行移植并评价。

组织工程皮肤的体内移植

在移植前，在全层皮肤上放置一层同等大小的硅胶膜，然后将皮肤全层翻转，表皮细胞层与硅胶膜接触，真皮细胞层在上。手术前，准备8周龄雌性免疫缺陷裸鼠，将小鼠用异氟烷吸入麻醉，将要移植的皮肤区域全层切除，避免伤及下面的肌肉组织。轻压控制出血，并将硅胶膜和全厚度的组织工程皮肤再次翻转，覆盖于伤口上。此时真皮胶原层在下，与肌肉组织接触，其上为表皮组织，再上为硅胶膜，暴露于空气中。将膜缝合到宿主皮肤上，使用无菌凡士林纱布覆盖并使用弹性自粘绷带包扎。

实验结果

早期组织工程皮肤的移植效果优于晚期组织工程皮肤

为了检测不同时期组织工程皮肤移植的效果，将每个时间点6片组织工程皮肤分别移植到6只免疫缺陷小鼠的背部。结果表明，组织工程皮肤5天组、组织工程皮肤9天组和组织工程皮肤14天组中6例(100％)全部产生色素沉着区，组织工程皮肤21天组中有5例(83％)最终均产生色素沉着区，早期组织工程皮肤与晚期组织工程皮肤在移植成功率方面无统计学差异。此外，在移植后4周测量色素沉着区域的面积大小，发现早期组织工程皮肤在移植后能够比晚期组织工程皮肤产生更大的色素沉着区域，表明早期组织工程皮肤的移植具有较好的移植效率(如图2所示)。

移植不同时期的组织工程皮肤均能形成正常分化的表皮层，早期组移植后形成的表皮层中Ki-67和p63阳性表达率更高

为了进一步观察不同时期的组织工程皮肤移植后新形成的皮肤组织结构，对移植后4周表皮的组织学结构进行了评价。组织学分析显示，所有时期的组织工程皮肤移植后新产生的表皮结构都是正常的。虽然早期组织工程皮肤的表皮层只有单层细胞，但在移植后4周，依然能够产生正常分化和分层的表皮结构，在相同的情况下，早晚期组织工程皮肤移植后形成的表皮的总厚度相当，甚至有时早期组织工程皮肤比晚期移植形成的表皮层更厚。对Ki-67和p63阳性染色细胞的统计学分析表明，与晚期组织工程皮肤相比，早期组织工程皮肤移植后形成的表皮中有更多Ki-67和p63阳性表达的增殖细胞(如图3所示)。表明移植后早期组织工程皮肤表皮细胞具有更大的增殖和分化潜能。

早期组织工程皮肤移植形成的真皮较厚、含有更多的微血管，且仅早期组移植后形成的皮肤中可见毛囊

移植后4周早期组织工程皮肤移植形成的真皮结构与晚期组织工程皮肤移植形成的真皮结构相当。如图4所示，统计学分析数据表明，早期组织工程皮肤所形成的真皮比晚期组织工程皮肤所形成的真皮略厚，特别是组织工程皮肤21天组移植后所形成的真皮，厚度比其他各组都要薄，且真皮细胞含量最少。采用血管内皮细胞标志物染色，观察真皮血管形成情况，统计学分析表明移植后早期组织工程皮肤较晚期组织工程皮肤形成了更多的微血管。组织学分析表明，在移植后8周，早期组织工程皮肤移植后新生成的皮肤中观察到有毛囊形成。进一步研究发现，在组织工程皮肤5天组移植后形成的皮肤中，本发明发现6次移植中有4次(约65％)皮肤中存在毛囊(如图4所示)，在组织工程皮肤9天组移植后形成的皮肤中，本发明发现6次移植中只有1次(约16％)皮肤中存在毛囊。但是在晚期的组织工程皮肤移植后的皮肤中均没有发现毛囊，这些结果表明，与晚期组织工程皮肤相比，早期组织工程皮肤在移植后有更大的潜能发育形成成熟毛囊。

移植前早期组织工程皮肤高表达p63，且细胞凋亡较少

分别收集四组组织工程皮肤，用western blot分析p63及各种分化标志物和细胞凋亡标志物的表达情况。研究发现，与其他组相比，组织工程皮肤5天组表达了最高水平的p63，p63能够促进上皮分化，并且维持基础角质形成细胞的增殖。随着体外培养时间的延长，p63的表达逐渐下调，被激活的Caspase-3(C-Caspase-3)的表达随着培养时间的延长而增加，表明在体外培养过程中细胞凋亡被激活。RT-PCR分析证实了western blot的分析结果：Bax在晚期组织工程皮肤中表达增加，而抗凋亡基因Bcl-2在晚期组织工程皮肤中表达降低(如图5所示)。结果表明，与晚期组织工程皮肤相比，早期组织工程皮肤含有更多未分化细胞，p63表达水平更高，凋亡细胞更少。

实验结论

本发明的研究表明，短期培养的双层组织工程皮肤在体内移植后能产生更好的皮肤结构，临床上可能有利于伤口更好的愈合。本发明使用了一步法成功分离出了皮肤干细胞(包括头皮来源的真皮干细胞和表皮干细胞)，已经被证明具有生成包括毛囊和皮脂腺在内的全层皮肤的能力。在此基础上，用分离的皮肤干细胞构建双层组织工程皮肤。将早期(第5天和第9天)和晚期(第14天和第21天)收集的组织工程皮肤分别移植到免疫缺陷小鼠的背部，覆盖全层皮肤切除后的创面并缝合包扎固定。在移植后4周，移植组织工程皮肤后所形成皮肤能够与宿主小鼠皮肤很好的融合，并完全覆盖伤口区域。新形成的皮肤具有明显的色素沉着，且具有正常的表皮分化结构，保证了正常皮肤屏障功能的行使。不仅如此，各组皮肤的基底膜结构完整，真皮结构正常，早期组织工程皮肤移植形成的皮肤中还观察到了成熟的毛囊和皮脂腺。这些结果表明，早期组织工程皮肤只要培养5天就能够在移植后4周产生与晚期组织工程皮肤相似的皮肤结构。

进一步分析发现移植早期组织工程皮肤形成的皮肤有几个特征优于晚期组织工程皮肤形成的皮肤：(1)组织工程皮肤早期移植组的皮肤面积大于晚期组织工程皮肤，说明早期组织工程皮肤移植后的收缩程度可能小于晚期组织工程皮肤。移植皮肤的收缩是影响创面愈合效果的关键因素之一，减少移植后皮肤的收缩对伤口的护理非常重要；(2)组织工程皮肤早期移植组形成的真皮厚度大于晚期组，且真皮成纤维细胞密度较高。构建更好的真皮结构将显著提高皮肤伤口愈合的效率并能够有效的减少疤痕的形成；(3)组织工程皮肤早期移植组形成的真皮微血管数量多于晚期组。血管化不足是组织工程皮肤临床应用的一个主要威胁，它可能导致组织工程皮肤松动、易受感染或部分坏死最终导致移植失败。组织工程皮肤早期移植组血管化程度高，移植效率也高；(4)只在早期组织工程皮肤的移植组中观察到了成熟毛囊和皮脂腺的形成。重建功能完整的皮肤是使用组织工程皮肤类产品修复伤口的最终目的，早期组织工程皮肤移植后能够形成毛囊、皮脂腺等皮肤附属物，为其在临床上应用以达到重建功能性皮肤的目标提供了新希望。

目前，早期组织工程皮肤移植后在体内形成正常皮肤结构的研究还很少，缩短组织工程皮肤的制备时间，既能在一定程度上满足临床应用的要求，又能降低组织工程皮肤的生产成本。本研究首次证明早期组织工程皮肤可在体内移植后形成带毛发的皮肤，大大缩短了组织工程皮肤的制备时间，为其临床应用提供了充分的理论及研究依据。

最后应该说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。上述虽然对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

Claims

1.一种早期组织工程皮肤的制备方法，其特征在于，包括：

（1）制备无细胞胶原层，具体步骤为：将MEM、牛I型胶原、FBS、L-谷氨酰胺和DMEM混合，然后将pH值调整到7.2~7.3，混匀，形成混合物；在培养板中加入所述混合物，在37~37.5°C，5~5.5%的CO₂培养箱中培养，使混合物凝胶；

（2）在无细胞胶原层的上方构建含有真皮干细胞的胶原基质，具体步骤为：将MEM、牛I型胶原、FBS、L-谷氨酰胺和DMEM混合，调节pH至7.2，添加成纤维细胞，混合，添加至凝胶化的无细胞胶原层上，并在37~37.5°C、5~5.5%CO₂的培养箱中培养，使胶原基质完全凝胶化，加入成纤维细胞继续培养，使胶原基质发生收缩且趋于稳定；

（3）建立表皮细胞层，具体步骤为：将表皮干细胞重悬于DMEM中，均匀缓慢的接种到步骤（2）得到的收缩且趋于稳定的胶原基质上，然后在37~37.5°C、5~5.5% CO₂的培养箱中孵育，使表皮干细胞完全粘附，表皮干细胞附着在胶原基质上，形成一个汇合的细胞单层；

（4）继续培养5~9天，即得早期组织工程皮肤。

2.如权利要求1所述制备方法制备得到的早期组织工程皮肤。

3.如权利要求2所述的早期组织工程皮肤在制备创面治疗制品中的应用。